CN102618507B - 增加腺相关病毒靶向转导效率的重组腺相关病毒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了增加腺相关病毒靶向转导效率的重组腺相关病毒及其应用。所述重组腺相关病毒含有经过改造的腺相关病毒VP2蛋白以及腺相关病毒原始的VP1蛋白、VP2蛋白和VP3蛋白；其中，所述经过改造的腺相关病毒VP2蛋白是VP2衣壳蛋白的N末端插入一段FLAG标签序列。本发明进一步公开了所述重组腺相关病毒的构建方法及其在基因治疗和制备组织工程支架材料中的应用。本发明所构建的重组腺相关病毒含有FLAG表位，可有效感染靶向细胞并增强转导效率。本发明重组腺相关病毒比现有的病毒载体具有更高的转导效率与靶向性，能够应用于基因治疗、建立病毒投递系统及制备组织工程支架材料等方面。

Description

增加腺相关病毒靶向转导效率的重组腺相关病毒及其应用

技术领域

本发明涉及重组腺相关病毒，尤其涉及增加腺相关病毒(adeno-associated virus)靶向转导效率的重组四质粒腺相关病毒，本发明还涉及该重组四质粒腺相关病毒在建立病毒投递系统以及在组织工程学中的应用，属于重组腺相关病毒及其应用领域。

背景技术

基因治疗从基因角度是用正常有功能的基因置换或增补缺陷基因的方法，从治疗方面是将新的遗传物质转移至某个体的细胞内使其获得治疗效果。基因治疗作为治疗疾病的一种新手段，正愈来愈受到人们的重视和关注。从二十世纪八十年代末，美国国家卫生研究院的安德生(FrenchAnderson)、布里茲(Michael Blaese)、罗森堡(Steven Rosenberg)等科学家共同提出基因治疗的临床实验申请。到今日，可用于主要包括单基因遗传病、肿瘤、心血管疾病、神经疾病和其他如传染类疾病的各期临床治疗阶段，基因治疗已取得巨大的成就，但是其本身仍存在缺乏高效传递系统，缺少持续稳定的表达和宿主产生免疫反应等问题，针对与这些方面的策略改进，成为近来的研究热点。

病毒具备高效转导宿主细胞的能力，因而利用基因工程制备的重组病毒载体在针对多种疾病的基因治疗，尤其是单基因酶缺陷型遗传疾病的替代治疗中，成为携带外源目的基因在靶向组织中高效表达的重要手段。目前用于基因治疗的重组病毒载体主要包括腺病毒(adenovirus，Ad)、反转录病毒(retrovirus，RV)、慢病毒(lentivirus，LV)、腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)及单纯疱疹病毒(herpes simplex-virus，HSV)等，而其中的腺相关病毒因其无致病性、低免疫反应性、感染宿主谱广泛、转基因表达长效等优势，成为在基因治疗成为应用前景最好的载体之一。但AAV基因组存在包装容量有限、对多数组织转导率不尽如人意等主要缺点，成为困扰AAV在临床应用中的瓶颈问题。

应用现代分子生物学的手段对AAV进行改良，一直是主要的研究热点。随着AAV不同血清型的发现以及不同亚型的表面结合受体和组织感染嗜性的相对特异性，为不同靶向组织的基因治疗中寻求最佳的载体类型与组合，以及基因重组技术对AAV衣壳蛋白的改造提供了新的思路和方向。

组织工程是为达到组织重生用来创建人工器官的一种手段，它所涉及的领域从材料工程一直延伸到生命科学。一种优良的支架材料必须具备以下优点：(1)有易于设计和修饰的基本单元。(2)良好的生物相容性，无毒，无抗原性和无致癌性。(3)适当的生物降解性，降解产物可以被生理系统清除。(4)具有能特异促进或抑制细胞-材料相互作用的特性。(5)材料的生产、纯化和处理是容易的并可升级。(6)有与水溶液和生理条件的化学相容性。其中任何一点都会限制支架材料的潜在应用。近年来，医用生物性可吸收材料在临床上得到广泛的应用。它主要包括天然材料和合成高分子材料两大类。天然材料包括胶原蛋白，纤维蛋白，壳聚糖，明胶等。高分子材料如聚乳酸类，聚乙烯，聚氨酯等。这些材料虽然在临床应用广泛，但是也具有如降解速度难以控制，吸收性差，与周围组织相容性差等缺点。

针对这些缺点，研究人员提出了不同的研究策略。目前针对可吸收性材料的研究方向主要为：对于组织工程支架的改性和复合，改善现有材料的不足。可以通过支架上复合蛋白，也可以将基因整合与支架上。目前多采用质粒携带基因，但这种策略最大的弊端就是感染效率低下，局部作用特异性差，很难达到理想的治疗效果。

综上所述，构建一株能够有效增加腺相关病毒靶向转导效率的重组腺相关病毒对于基因治疗的临床应用以及组织工程材料的制备等方面将具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株有效增加腺相关病毒靶向转导效率的重组四质粒腺相关病毒；

本发明的目的之二是提供一种构建所述增加腺相关病毒靶向转导效率的重组四质粒腺相关病毒的方法；

本发明目的之三是将所构建的重组四质粒腺相关病毒应用于构建病毒投递系统及组织工程学支架材料等方面。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一株增加腺相关病毒靶向转导效率的重组四质粒腺相关病毒(FLAG-AAV.Luc)，该重组四质粒腺相关病毒含有经过改造的腺相关病毒VP2蛋白以及腺相关病毒原始的VP1蛋白、VP2蛋白和VP3蛋白；其中，所述的经过改造的腺相关病毒VP2蛋白是腺相关病毒原始的VP2衣壳蛋白的N末端插入一段FLAG标签序列；所述的编码腺相关病毒原始的VP2衣壳蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；所述的FLAG标签序列的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

本发明将所构建的重组四质粒腺相关病毒(FLAG-AAV.Luc)提交到专利认可的保藏机构进行保藏，其微生物保藏号是：CGMCC No.5827；分类命名是：重组四质粒腺相关病毒；保藏时间是：2012年3月5日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明首先在腺相关病毒VP2衣壳蛋白的N末端插入一段FLAG标签并构建到一个质粒表达载体中，然后应用镶嵌型衣壳的改良策略在AAV生产体系中同时提供改造后的VP2蛋白和三种原始的Cap蛋白(VP1，VP2，VP3)共同参与衣壳的组装，最终构建获得衣壳上带有FLAG标签的重组四质粒腺相关病毒。

本发明通过Western Blot对重组四质粒腺相关病毒进行鉴定，检测结果可见除了能检测到VP1，VP2，VP3三种衣壳蛋白外，FLAG-VP2蛋白也可以被检测到，实验结果说明本发明所构建的FLAG-AAV.Luc病毒由于含有FLAG-VP2融合蛋白带有所设计的FLAG表位，可以有效感染靶向细胞并增强转导效率。

本发明目的之二是提供一种构建所述重组四质粒腺相关病毒的方法，包括以下步骤：(1)构建表达FLAG-VP2融合蛋白的表达载体，其中FLAG标签位于VP2衣壳蛋白的N末端；(2)将所构建的表达FLAG-VP2融合蛋白的表达载体与pHelper、pAAV-RC和含有报告基因的pAAV载体质粒混匀，得到混合液；(3)将混合液感染细胞，培养细胞，收集病毒，即得。

其中，上述方法中步骤(2)所述的含有报告基因的pAAV载体质粒可选自pAAV-GFP、pAAV-Luc或pAAV-LacZ。

步骤(3)中所述的细胞优选是293T细胞。

为验证Anti-FLAG抗体是否可以有效捕获本发明所构建的带有FLAG标签的四质粒重组腺相关病毒，本发明建立了AAV的病毒投递系统；具体的，以固相表面为支持物，通过胶原覆盖，交联剂活化与特异性抗体交联，评估抗体捕捉效率。实验结果显示，本发明所构建的带有FLAG标签的四质粒重组腺相关病毒在该投递体系中比传统病毒具有更高的转导效率与靶向性。

本发明以生物性可吸收支架材料为依托，通过所构建的带有FLAG标签的重组四粒腺相关病毒可以被特异性抗体有效捕获这一特性，构建得到一种新的AAV的药物投递系统，结果显示以Anti-FLAG抗体交联胶原蛋白包被的多种组织工程材料能够在有效接种细胞的前提下显著提高新型FLAG表位AAV病毒的感染效率。将该投递系统应用与生物可吸收性支架材料，从而有效增加病毒介导的转基因的靶向性和转导效率，显示出此系统在组织工程学研究中具有很好的应用前景。

附图说明

图1 p3×FLAG-CMV-VP2质粒的PCR扩增后反应产物的1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；目的条带为引入Bgl II和Not I酶切位点的VP2片段，大小约为1.8kbp，DNA序列经测序证实完全正确。M：λ-DNA经Hind III水解后的Marker；1：为无模板对照；2和3分别为pAAV-RC和p3×FLAG-CMV-VP2质粒的扩增产物。

图2 p3×FLAG-CMV-VP2质粒图谱。

图3 FLAG-AAV.Luc病毒的Western blot鉴定结果；红色为Anti-FLAG抗体杂交信号，绿色为-B1抗AAV衣壳蛋白抗体杂交信号；M：蛋白质分子量Marker；1：FLAG-AAV.Luc病毒；2：空白非杂交Loading对照；3：传统三质粒AAV.Luc病毒。

图4四质粒重组病毒的投递系统的建立以及感染效率的鉴定结果。

图5四质粒重组病毒的投递系统的建立以及感染效率的鉴定结果。

图6有FLAG标签的四质粒重组病毒在可吸收材料中的应用效果实验结果(以PLGA为固相材料)。

图7有FLAG标签的四质粒重组病毒在可吸收材料中的应用效果(以明胶海绵为支架材料所进行的平行实验)。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

1.实验材料：

1.1细胞：

293T细胞，HeLa细胞均为本发明人实验室留存。其中293T细胞源自HEK-293细胞株，反式表达腺病毒E1基因，当共转染三个AAV制备质粒(一个包含ITR及外源基因的载体质粒，一个含有编码Rep和Cap蛋白的pAAV-RC，另外一个含有腺病毒来源辅助基因的pHelper)时，可以产生高滴度、有感染活力的腺相关病毒颗粒。

1.2质粒及载体

p3×FLAG-CMV-10表达载体购自SIGMA公司。包装病毒所需质粒pHelper、pAAV-RC和含报告基因的载体质粒pAAV-GFP，pAAV-Luc和pAAV-LacZ均购自Stratagene公司。

1.3引物

VP2基因引物上下游引物由GENtle软件设计。

2.实验试剂：

Taq DNA 高保真聚合酶：        大连TaKaRa公司

dNTP：                        大连TaKaRa公司

Not I Bgl II EcoR V BamH I    大连TaKaRa公司

等限制性内切酶：

HEPES(羟乙基哌嗪乙磺酸)：     北京博大泰克生物基因技术有限公司

细菌培养用胰蛋白胨：          英国OXFOID公司

细菌培养用酵母提取物：        英国OXFOID公司

Luciferase  细胞裂解液和底    美国Promega公司

物：

蛋白上样缓冲液：              北京博大泰克生物基因技术有限公司

氯化铯：                        MERCK

DNaseI：                        MERCK

异丙醇：                        北京现代东方精细化学品有限公司

SDS(十二烷基硫酸钠)：           上海生工生物工程有限公司

EDTA(乙二胺四乙酸)：            上海生工生物工程有限公司

氯化钾：                        上海生工生物工程有限公司

磷酸二氢钾：                    上海生工生物工程有限公司

磷酸氢二钠：                    北京益利精细化学品有限公司

磷酸二氢钠：                    上海生工生物工程有限公司

甘氨酸：                        北京益利精细化学品有限公司

Tween20：                       美国Sigma公司

预染蛋白Maker：                 美国NEB公司

Anti-AAV Capsids  Clone  B1     美国PROGEN公司

antibody：

Anti-FLAG antibody：            美国Sigma公司

APS(过硫酸铵)：                 北京欣经科生物技术有限责任公司

Triton X-100：                  美国Sigma公司

脱脂奶粉：                      北京欣经科生物技术有限责任公司

丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺(29∶1)： 北京鼎国生物技术有限责任公司

0.22um硝酸纤维素膜：            美国Millipore公司

超速离心管：                    Beckman Coulter公司

Slide-A-Lyzer 透析卡：          Thermo

脱氧胆酸(deoxycholate，DOC)：    北京欣经科生物技术有限责任公司

rAAV病毒：                       本元正阳生物技术有限责任公司

质粒小量快速提取试剂盒：         北京博大泰克生物基因技术有限公司

DNA片段回收纯化试剂盒：          北京博大泰克生物基因技术有限公司

质粒大量快速提取试剂盒：         美国QIAGEN公司

QPCR试剂盒：                     大连TaKaRa公司

TEMED(N，N，N′，N′-四甲基乙二  北京欣经科生物技术有限责任公司胺)：

DMEM：                            美国HyClone公司

新生牛血清：                      中国杭州四季青公司

胎牛血清：                        中国杭州四季青公司

胰蛋白酶：                        美国HyClone公司

青/链霉素：                       北京欣经科生物技术有限责任公司

EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基胺丙       美国sigma公司

基)碳化二亚胺盐酸盐)：

SPDP(3-(2-吡啶二巯基)丙酸Thermo

N-羟基琥珀酰亚胺酯)：

3.所有主要试剂的配制：

3.1质粒提取常用试剂：

LB培养液：

称取细菌培养用胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g溶于950ml去离子水中，调pH值至7.0，再加水定容至1000ml，高压灭菌，4℃保存。氨苄青霉素以及卡那霉素均配制成浓度为100mg/ml的贮液，通过0.22μm滤器除菌，分装。使用时每100ml LB培养液加入100μl氨苄青霉素或者卡那霉素。

LB固体培养基：

称取1.5g琼脂粉溶于100ml LB中，高压灭菌，待温度降至50℃时，在超净工作台中，根据需要加入氨苄青霉素或卡那霉素，铺于培养皿中，自然冷却。封口膜封口，于4℃倒置储存备用。

3.2DNA电泳常用试剂：

50xTAE：

称取Tris盐242g、冰乙酸57.1ml、0.5mol/L EDTA(pH 8.0)100ml，用去离子水定容至1000ml，使用时，稀释到1×TAE。

6x凝胶加样缓冲液：

溴酚蓝0.25％、二甲苯氰FF0.25％，蔗糖水溶液40％(w/v)，4℃保存。

溴化乙锭溶液：

称取溴化乙锭1g，加100ml去离子水，于室温保存在棕色瓶中。使用终浓度为0.5μg/ml。

3.3质粒转染常用试剂：

0.25M CaCl ₂ 溶液：

称取27.75g无水CaCl₂溶于100ml去离子水中，用0.2μm滤膜过滤分装，保存在-20℃冰箱待用。

2xHBS溶液：

称取NaCl 16.36g、Na₂HPO₄·12H₂O 0.54g、HEPES 11.92g溶于1000ml去离子水，1M NaOH调节pH值到7.1。

1M NaOH：

称取4g NaOH溶解至80ml去离子水中，溶解后定容至100ml。

1M HCl：

先用量筒量取8.36ml浓盐酸(或直接用天平称9.86g)，倒入已经装有大约50-70ml蒸馏水的烧杯中，要不断搅拌，待冷却后转移到容量瓶中定容至100ml。

3.4 CsCl密度梯度离心液

1M Tris-HCl(pH 8.0)：

称取Tris盐12.1g，调PH值至8.0，定容至100ml，高压灭菌，4℃保存。

0.5M EDTA(pH 8.0)：

称取18.6g EDTA溶解至80ml去离子水中，溶解后定容至100ml。

DNase I buffer：

含40mM Tris盐、1mM CaCl₂、10mM MgSO₄，调PH值至8.0，定容至200ml，高压灭菌，4℃保存。

HNE buffer：

含50mM Hepes、0.15M NaCl和25mM EDTA定容至200ml，高压灭菌，4℃保存。

1.25g/ml CsCl：

称取5g CsCl溶解至18ml HNE buffer中，溶解后定容至20ml，高压灭菌。

1.50/ml CsCl：

称取10g CsCl溶解至18ml HNE buffer中，溶解后定容至20ml，高压灭菌。

透析液：

含NaCl 2mM、HEPES 10mM，用NaOH调PH值至7.8，用去离子水定容至1000ml，高压灭菌。

20×AAV病毒储存液：

称取1.015g MgCl₂ 6H₂O，加入25ml甘油用透析液溶解并定容至50ml，高压灭菌，4℃保存。

3.5SDS-PAGE电泳：

10％ APS：

称取0.1g过硫酸铵，去离子水溶解并定容至1ml，4℃保存，1周内使用。

10％SDS：

称取5g SDS，去离子水溶解并定容至40ml加热至68℃助溶，加浓HCl调pH至7.2，加去离水定容至50ml。

1.5M Tris·HCl(pH8.8)：

称取45.43g Tris盐，去离子水溶解后，用浓HCl调节pH值至8.8，最后用去离子水定容至250ml，4℃保存。

1.0M Tris·HCl(pH6.8)：

称取30.29g Tris盐，去离子水溶解后，用浓HCl调节pH 至6.8，最后用去离子水定容至250ml。4℃保存。

10×电泳缓冲液(使用时稀释至1×)：

称取30.5g Tris盐、144.8g甘氨酸、10g SDS去离子水定容至1000ml。

3.6细胞培养常用试剂：

DMEM培养液：

购买的DMEM培养液根据需要加入不同比例的血清，4℃保存。

0.25％胰酶消化液：

称取胰酶0.25g溶于100ml D-Hank’s液中，0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

1xPBS(0.05M，pH 7.4)：

称取Na₂HPO₄·12H₂O 3.58g、KH₂PO₄·2H₂O 0.24g、NaCl 8g、KCl 0.2g溶于1000ml去离子水，1M HCl调节pH值至7.4，高压灭菌后超净台内放置，冷却后保存于4℃。

青霉素-链霉素双抗：

400万单位青霉素和400万硫酸链霉素共同加入40ml生理盐水中，混匀，经0.2μm滤膜过滤，分装保存在-20℃冰箱待用，应用时以1∶1000加入新鲜培养基中。

3.7交联用试剂的配制

胶原：

取1mg胶原，溶解于0.1M乙酸溶液，室温放置1-3小时，使其充分溶解。4℃保存。

SPDP：

取2mgSPDP溶解于320μlDMSO，终浓度为20mM。

EDAC：

取100mgEDAC溶于1ml的去离子水，终浓度为0.1mg/ml。

实施例重组四质粒腺相关病毒(FLAG-AAV.Luc)的构建及鉴定

1.重组表达质粒p3×FLAG-CMV-VP2的构建及鉴定

1.1以pAAV-RC为模板，通过PCR扩增VP2序列，引物分别为：

表1引物序列

两斜体字部分分别为人工加入的EcoR V 和BamH I酶切位点。

1.2用EcoR V和BamH I分别双酶切空载体p3×FLAG-CMV-10和PCR扩增的VP2序列，将VP2序列以正确读码框与p3×FLAG-CMV-10载体连接，获得表达FLAG与VP2融合蛋白的质粒p3×FLAG-CMV-VP2。

1.3获得的重组质粒载体的鉴定。

通过PCR扩增获得AAV病毒的VP2序列(图1)，图1中箭头所指处为相应序列的目的条带，切胶将PCR产物用胶回收试剂盒回收，然后再通过酶切，连接，转化，筛选等一系列分子克隆技术，获得p3×FLAG-CMV-VP2质粒，根据测序结果分别绘制质粒图谱(图2)，鉴定结果表明本发明所构建的p3×FLAG-CMV-VP2融合蛋白的真核表达载体成功，并且可用于后续的病毒包装。

2.FLAG-AAV.Luc重组病毒的构建与鉴定

2.1.rAAV的制备

2.1.1磷酸钙转染

(1).待293T细胞生长至70％融合度时进行质粒转染，转染前4小时换10％血清的新鲜培养基。

(2).在一个无菌离心管，加入适量2×HBS(pH 7.05)溶液。

(3).在另一个无菌离心管中加入适量0.25M CaCl₂溶液。并按照所需浓度向CaCl₂溶液中分别加入pHelper、pAAV-RC和pAAV载体质粒(pAAV-GFP或pAAV-Luc或pAAV-LacZ)，以及第四质粒p3×FLAG-CMV-VP2混匀待用。

(4).用无菌滴管吸取CaCl₂和质粒混和液，逐滴滴入HBS溶液中，并同时低速晃动离心管避免产生大的Ca₃(PO₄)₂沉淀。

(5).加液完毕，可见呈白色透明的云雾状混悬液，即含三种质粒或四种质粒的Ca₃(PO₄)₂沉淀液。取出293T细胞，加入混悬液，混匀。

(6).放入37℃5％CO₂孵箱培养过夜。第二天，吸弃旧培养基，换含2％血清的新鲜培养基继续培养。72h后收集细胞，处理后进行病毒颗粒CsCl密度梯度离心纯化。

2.1.2 CsCl密度梯度离心

(1).利用移液管直接吹散细胞，收集细胞及培养基于干净的50ml大离心管中，3000rpm，离心15min，弃上清。

(2).每管加入10mM Tris-HCl(pH 8.0)3ml重悬沉淀，将沉淀转移至15ml离心管，37℃水浴和-80℃反复冻融3次。

(3).超声130w，80％AMP，超声10s暂停10s，共6个循环。

(4).加入适量DNase I 2000u/ml和加入10％脱氧胆酸(deoxycholate，DOC)500μl，37℃水浴孵育1小时。

(5).在加入0.05％Trypsin-EDTA，37℃水浴中作用0.5h。

(6).4℃7000rpm，离心10min，吸取上清液即细胞裂解液。

将细胞裂解液加入超速离心管中，然后从离心管底部依次加入1.25g/mlCsCl和1.50g/ml CsCl，超速离心机内65000rpm，4℃离心3h。

用注射器的针头从距离心管底部0.5cm处扎破管壁，分段收集并编号。

2.1.3病毒收集液的荧光素酶活性检测及透析

(1).分别取适量不同编号的病毒收集液感染24孔板中的293细胞，感染24h后，弃上清，每孔加入200μl荧光素酶细胞裂解液，充分裂解细胞后取50μl加入到15μl荧光素酶底物中，置入荧光素酶检测仪中检测荧光素酶的活性。

(2).将荧光素酶活性高的收集液合并后，用注射器将其加入到透析卡中，3h换一次透析液，共换三次，最后一次透析过夜。

(3).第二天，收病毒分装于1.5ml EP管中，加入20×AAV病毒储存液，-20℃保存待用。

2.2.本发明重组病毒FLAG-AAV.Luc的鉴定

为检测制备的FLAG-AAV.Luc病毒中是否携带改造后的VP2衣壳蛋白，病毒加热变性后做Western Blot检测。分别用Anti-FLAG抗体以及AAV衣壳蛋白的特异性抗体(Clone B1)鉴定病毒衣壳蛋白以及FLAG标签蛋白的表达情况。

2.2.1传统三质粒病毒与四质粒包装病毒感染情况

传统的三质粒包装病毒(pHelper、pAAV-RC和pAAV载体质粒)与本发明所构建的四质粒包装病毒经氯化铯密度梯度离心，取少量分段收集液感染293T细胞24小时后检测Luc蛋白表达情况，可见采用四质粒包装系统可以生产出有感染活性的病毒颗粒，所测荧光值最高的收集液是病毒颗粒富集区。

2.2.2病毒鉴定结果

本发明所构建的四质粒包装病毒热变性后，进行8％SDS-PAGE，然后将样本转于NC膜上，首先加入FLAG抗体和IRDye 700标记的二抗(红色)用Odyssey红外成像仪成像，病毒中都能检测到单一的一条目的条带，分别为FLAG-VP2蛋白。然后在同一张NC膜上再次加入AAV衣壳蛋白的特异性抗体(Clone B1)和IRDye800CW标记的二抗(绿色)，可见除VP1，VP2，VP3三种衣壳蛋白外，FLAG-VP2蛋白也可以被检测到(图3)。试验结果表明本发明所构建的FLAG-AAV.Luc病毒由于含有FLAG-VP2融合蛋白，带有所设计的FLAG表位，可以有效感染靶向细胞(图3)。

试验例1带有FLAG标签的四质粒重组病毒的投递系统的建立以及感染效率的鉴定

1.抗体交联系统的建立与优化

实验方法：首先，对抗体交联系统可行性进行评估。初步验证该系统是否可以携带足够数量的抗体以及该系统的稳定性。以酶标板表面为固相支持物，经胶原蛋白铺板后，用交联剂SPDP进行活化，然后与辣根过氧化物酶二抗进行交联。此后分别用PBS冲洗1-3次，用DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒显色，检测吸光度值。

2.抗体交联体系的初步建立

为验证Anti-FLAG抗体是否可以有效捕获本发明所构建的带有FLAG标签的四质粒病毒，本发明以康宁48孔板表面为基础，通过胶原进行包被，然后用交联剂SPDP抗体交联至表面，然后再进行病毒的孵育，制备初步病毒投递系统雏形。

实验方法：

1胶原预处理：每1mg胶原加入0.1mgEDAC.37℃ 10mins，然后再用胶原包被48孔板。

2每孔加入10ul胶原溶于90ul PBS(100ul的体系足够覆盖整个孔，这样会使胶原分布均匀)。紫外下室温过夜。

3胶原活化：每孔加入50ul20mM的SPDP室温孵育4小时。

4每孔500ulPBS洗1次，每次10分钟。

51％BSA封闭室温下2小时。

6孵育一抗：每孔5mg一抗溶于100ul PBS中。4℃孵育过夜。

7每孔500ul PBS洗1次，每次10分钟。

81ul病毒(10^8-10^9vg)溶于100ul PBS室温孵育4小时。

9每孔500ul PBS洗1次，每次10分钟。

10以Hela细胞为代表，每孔铺入大约10^6个细胞左右。48小时后，比较病毒感染效率。

实验结果：通过以上的技术路线对48孔板进行包被，实验组的设计分别是未加入一抗的空白对照组，加入非特异性IgG组和加入Anti-FLAG抗体组。每孔铺入相同数量的细胞48小时后，用50μl细胞裂解液裂解细胞，测定荧光素酶的活性。

实验结果显示，通过特异性单抗Anti-FLAG建立的AAV的病毒投递系统能有效的增加病毒的感染效率。结果可见交联反应对AAV的基础感染活性无显著影响，而经Anti-FLAG抗体固相化的AAV感染策略可在一定程度上增加其对感染靶细胞的效率。并且在加载FLAG-AAV.Luc病毒2小时后，接种HeLa细胞，48小时后检测报告基因荧光素酶的活性。结果显示，经抗体固化的新型AAV可增加感染效率3倍以上，并且该效应依赖于特异性的抗原抗体反应(图4-5)。

实验例2本发明带有FLAG标签的四质粒重组病毒在可吸收材料中的应用

1.PLGA

实验方法：

以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid)，PLGA)(购于山东省医疗器械厂)为固相材料，用EDAC活化1mg/ml胶原包被，室温下干燥。20mM的SPDP室温孵育4小时，PBS冲洗后进行抗体固定化。用非特异性抗体IgG(50mg/ml)为阴性对照组，Anti-FLAG单抗(50mg/ml)为阳性对照组，4℃孵育过夜。PBS冲洗后分别室温下孵育AAV.LacZ和FLAG-AAV.LacZ2小时。PBS冲洗后，加入Hela细胞悬液，附着2小时后，加入10％FBS培养48小时后，用β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒染色，显微镜下采图。

具体实验组别见表2。

表2

图6A	图6B	图6C	图6D
				IgG	Anti-FLAG单抗	IgG	Anti-FLAG单抗
AAV.LacZ	AAV.LacZ	FLAG-AAV.LacZ	FLAG-AAV.LacZ

以活化的PLGA为固相表面，分别孵育交联Anti-FLAG特异性抗体和非特异性混合IgG抗体，并分别加载FLAG-AAV.LacZ或传统的AAV.LacZ。接种Hela细胞48小时后，进行LacZ染色比较转导效率的差异。

实验结果：

病毒感染48小时后，进行β-半乳糖苷酶染色。光镜下采图显示，与非特异性抗体组比较，Anti-FLAG单抗组能有效捕捉本发明所构建的含有FLAG标签的四质粒病毒(图6)。结果显示组织工程材料经特异性的抗体交联修饰后能够富集和固化FLAG-AAV.LacZ病毒，且有效提高对前脂肪细胞等接种细胞的转导效率。

2明胶海绵

实验方法：

以可吸收性明胶海绵为固相材料，用EDAC活化1mg/ml胶原包被，室温下干燥。20mM的SPDP室温孵育4小时，PBS冲洗后进行抗体固定化。用非特异性抗体IgG(50mg/ml)为阴性对照组，Anti-FLAG单抗(50mg/ml)为阳性对照组，4℃孵育过夜。PBS冲洗后分别室温下孵育AAV.LacZ和FLAG-AAV.LacZ2小时。PBS冲洗后，加入Hela细胞悬液，附着2小时后，加入10％FBS培养48小时后，用β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒染色，显微镜下采图。具体实验组别见表3。

表3

图7A	图7B	图7C	图7D
				IgG	Anti-FLAG单抗	IgG	Anti-FLAG单抗
AAV.LacZ	AAV.LacZ	FLAG-AAV.LacZ	FLAG-AAV.LacZ

以活化的明胶海绵为固相表面，分别孵育交联Anti-FLAG特异性抗体和非特异性混合IgG抗体，并分别加载FLAG-AAV.LacZ或传统的AAV.LacZ。接种Hela细胞48小时后，进行LacZ染色比较转导效率的差异。

实验结果：

病毒感染48小时后，进行β-半乳糖苷酶染色。光镜下采图显示，与非特异性抗体组比较，Anti-FLAG单抗组能有效的捕捉本发明所构建的含有FLAG标签的四质粒病毒(图7)。结果显示以Anti-FLAG抗体交联胶原蛋白包被的多种组织工程材料能够在有效接种细胞的前提下显著提高新型FLAG表位AAV病毒的感染效率。

综上所述。采用本发明重组四质粒所构建的病毒投递系统在组织工程学应用中有可观的前景。

<110>  首都医科大学

 

<120>  增加腺相关病毒靶向转导效率的重组腺相关病毒及其应用

 

<130>  DQXL-0018

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  1797

<212>  DNA

<213>  adeno-associated virus

 

<400>  1

acggctccgg gaaaaaagag gccggtagag cactctcctg tggagccaga ctcctcctcg       60

 

ggaaccggaa aggcgggcca gcagcctgca agaaaaagat tgaattttgg tcagactgga      120

 

gacgcagact cagtacctga cccccagcct ctcggacagc caccagcagc cccctctggt      180

 

ctgggaacta atacgatggc tacaggcagt ggcgcaccaa tggcagacaa taacgagggc      240

 

gccgacggag tgggtaattc ctcgggaaat tggcattgcg attccacatg gatgggcgac      300

 

agagtcatca ccaccagcac ccgaacctgg gccctgccca cctacaacaa ccacctctac      360

 

aaacaaattt ccagccaatc aggagcctcg aacgacaatc actactttgg ctacagcacc      420

 

ccttgggggt attttgactt caacagattc cactgccact tttcaccacg tgactggcaa      480

 

agactcatca acaacaactg gggattccga cccaagagac tcaacttcaa gctctttaac      540

 

attcaagtca aagaggtcac gcagaatgac ggtacgacga cgattgccaa taaccttacc      600

 

agcacggttc aggtgtttac tgactcggag taccagctcc cgtacgtcct cggctcggcg      660

 

catcaaggat gcctcccgcc gttcccagca gacgtcttca tggtgccaca gtatggatac      720

 

ctcaccctga acaacgggag tcaggcagta ggacgctctt cattttactg cctggagtac      780

 

tttccttctc agatgctgcg taccggaaac aactttacct tcagctacac ttttgaggac      840

 

gttcctttcc acagcagcta cgctcacagc cagagtctgg accgtctcat gaatcctctc      900

 

atcgaccagt acctgtatta cttgagcaga acaaacactc caagtggaac caccacgcag      960

 

tcaaggcttc agttttctca ggccggagcg agtgacattc gggaccagtc taggaactgg     1020

 

cttcctggac cctgttaccg ccagcagcga gtatcaaaga catctgcgga taacaacaac     1080

 

agtgaatact cgtggactgg agctaccaag taccacctca atggcagaga ctctctggtg     1140

 

aatccgggcc cggccatggc aagccacaag gacgatgaag aaaagttttt tcctcagagc     1200

 

ggggttctca tctttgggaa gcaaggctca gagaaaacaa atgtggacat tgaaaaggtc     1260

 

atgattacag acgaagagga aatcaggaca accaatcccg tggctacgga gcagtatggt     1320

 

tctgtatcta ccaacctcca gagaggcaac agacaagcag ctaccgcaga tgtcaacaca     1380

 

caaggcgttc ttccaggcat ggtctggcag gacagagatg tgtaccttca ggggcccatc     1440

 

tgggcaaaga ttccacacac ggacggacat tttcacccct ctcccctcat gggtggattc     1500

 

ggacttaaac accctcctcc acagattctc atcaagaaca ccccggtacc tgcgaatcct     1560

 

tcgaccacct tcagtgcggc aaagtttgct tccttcatca cacagtactc cacgggacag     1620

 

gtcagcgtgg agatcgagtg ggagctgcag aaggaaaaca gcaaacgctg gaatcccgaa     1680

 

attcagtaca cttccaacta caacaagtct gttaatgtgg actttactgt ggacactaat     1740

 

ggcgtgtatt cagagcctcg ccccattggc accagatacc tgactcgtaa tctgtaa        1797

 

 

<210>  2

<211>  66

<212>  DNA

<213>  artifial sequence

 

<400>  2

gactacaaag accatgacgg tgattataaa gatcatgaca tcgattacaa ggatgacgat       60

 

gacaag                                                                  66

 

 

<210>  3

<211>  36

<212>  DNA

<213>  artifial sequence

 

<400>  3

tcgatagatc tgatatcggc tccgggaaaa aagagg                                 36

 

 

<210>  4

<211>  25

<212>  DNA

<213>  artifial sequence

 

<400>  4

cgggatcctt acagattacg agtca                                             25

Claims (6)

1.增加腺相关病毒靶向转导效率的重组四质粒腺相关病毒，其特征在于：其微生物保藏号是：CGMCC No.5827。

2.权利要求1所述重组四质粒腺相关病毒在制备基因治疗药物中的用途。

3.权利要求1所述重组四质粒腺相关病毒在制备组织工程支架材料中的用途。

4.一种病毒投递系统或载体，其特征在于：含有权利要求1所述的重组四质粒腺相关病毒。

5.一种基因治疗投递系统或载体，其特征在于：含有权利要求1所述的重组四质粒腺相关病毒。

6.一种组织工程材料或支架，其特征在于：含有权利要求1所述的重组四质粒腺相关病毒。