CN104830907A - 骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明适用于生物医药领域，提供了一种骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法。该方法利用携带低氧诱导因子1α的慢病毒感染骨髓充质干细胞、表达成骨基因，具体包括下述步骤：构建慢病毒表达载体Lenti-HIF-1α-eGFP；携带低氧诱导因子1α的慢病毒载体Lenti-HIF-1α-eGFP的包装；慢病毒载体Lenti-HIF-1α-eGFP感染骨髓间充质干细胞，获得能够表达成骨基因的感染骨髓间充质干细胞。

Description

骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法。

背景技术

因创伤、肿瘤、炎症等导致的大范围骨缺损是临床上长期面临的难题，严重危害人类健康。传统的治疗手段如自体骨移植存在骨量缺乏、同种异体骨移植有传播疾病可能、异种异体骨移植则会产生免疫排斥反应等问题，因此骨组织工程已成为治疗大范围骨缺损的新策略。目前在动物实验中，组织工程骨修复小范围骨缺损时，骨折的愈合效果很好，但是在修复大范围骨缺损时，中心部分经常发生缺血坏死。因此，单纯的使用组织工程骨治疗大范围骨缺损困难重重。近年的研究表明，将具有促成骨作用的基因(如骨形态发生蛋白2)通过基因转染的方法整合到种子细胞中，可以诱导其向成骨方向分化，提高成骨活性。

骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中的一类具备多方向分化潜能的非造血干细胞，在一定的诱导条件下能向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等方向分化。而且骨髓间充质干细胞在临床上已被应用于治疗移植物抗宿主病和同种异体造血干细胞移植，其生物安全性已得到证实。然而骨髓间充质干细胞不易于外源基因导入，因此选择合适的基因转染技术至关重要。

低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1alpha，HIF-1α)作为低氧反应的一种核转录调节因子，通过对其下游靶基因的诱导表达，调控血管生成、能量代谢、细胞增殖迁移分化等反应。

把目的基因转移到靶细胞中的方法有很多，目前应用的基因载体分为两大类:非病毒载体和病毒载体。非病毒载体主要包括脂质体、聚合物等，这类载体的优点是可以大量生产，毒性反应及免疫抑制方面也相对较安全，但其转染效率低、表达量低、体内应用较困难。病毒载体主要有3种：反转录病毒、慢病毒和腺病毒。反转录病毒载体的缺点是负载容量小、整合的随机性有潜在的危险性、只能感染分裂期细胞，有临床试验结果表明，反转录病毒有诱发白血病的风险，其生物安全性受到广泛地质疑。腺病毒载体和慢病毒载体是现在使用最为广泛的两种方法。腺病毒载体可以感染分裂期及分裂期细胞，但是不能将目的基因整合到靶细胞的基因组中，因此不能持续稳定的表达外源基因。慢病毒载体是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)改造获得的，慢病毒载体系统包括表达载体及包装质粒。目前，还没有使用低氧诱导因子1α重组慢病毒感染骨髓间充质干细胞表达成骨基因的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法，旨在提供一种利用携带低氧诱导因子1α的慢病毒感染骨髓充质干细胞、构建感染骨髓间充质干细胞珠、表达成骨基因的问题。

本发明是这样实现的，一种骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法，所述方法利用携带低氧诱导因子1α的慢病毒感染骨髓充质干细胞、表达成骨基因，具体包括下述步骤：

构建慢病毒表达载体Lenti-HIF-1α-eGFP：从Hela细胞中提取总RNA，反转录成cDNA，分别设计含酶切位点BamHⅠ的引物HIF-1α-F和含酶切位点和PspXⅠ的引物HIF-1α-R，利用上述引物对cDNA进行PCR扩增获得扩增基因片段—低氧诱导因子1α基因；将慢病毒包装质粒载体Lenti-eGFP与所述扩增基因片段分别进行酶切处理，将酶切处理产物连接后转化处理，将转化产物扩增后进行质粒抽提，得到慢病毒表达载体Lenti-HIF-1α-eGFP；

携带低氧诱导因子1α的慢病毒载体Lenti-HIF-1α-eGFP的包装：将慢病毒表达载体Lenti-HIF-1α-eGFP与病毒包装质粒Lenti Pac HIV共转染至293Ta细胞中，进行病毒包装，获得携带低氧诱导因子1α的慢病毒载体Lenti-HIF-1α-eGFP，收集病毒原液，并对病毒滴度进行监控；

慢病毒载体Lenti-HIF-1α-eGFP感染骨髓间充质干细胞：获取骨髓间充质干细胞，当骨髓间充质干细胞融合度达70％时，当病毒滴度以MOI为50时加入慢病毒载体Lenti-HIF-1α-eGFP进行慢病毒感染，获得能够表达成骨基因的感染骨髓间充质干细胞。

本发明提供的骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法，操作简单，从Hela细胞中扩增出低氧诱导因子1α基因片段，然后利用慢病毒载体将低氧诱导因子1α导入至骨髓间充质干细胞基因组DNA中，无明显的毒性反应，细胞生长良好；由于慢病毒载体自带增强型绿色荧光蛋白，荧光显微镜下可观察见骨髓间充质干细胞能大量表达低氧诱导因子1α(荧光强)。获得的感染骨髓间充质干细胞能够很好地表达低氧诱导因子1α基因，可提高成骨因子的表达水平。

附图说明

图1是本发明实施例提供的骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法流程示意图；

图2是本发明实施例提供的低氧诱导因子1α基因琼脂糖凝胶电泳鉴定图；

图3是本发明实施例提供的Lentil-eGFP-HIF-1α重组载体琼脂糖凝胶电泳鉴定图；

图4是本发明实施例提供的骨髓间充质干细胞形态学观察结果图；

图5是本发明实施例提供的采用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标记物结果图；

图6是本发明实施例提供的携带低氧诱导因子1α的慢病毒感染48h时大鼠骨髓间充质干细胞形态图；

图7是本发明实施例提供的RT-qPCR分析目的基因感染骨髓间充质干细胞后在1，4，7，14d成骨相关基因的表达结果统计图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

慢病毒载体是由人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus，HIV)改造获得的，慢病毒载体系统包括表达载体及包装质粒，慢病毒表达载体即通常所说的穿梭载体，包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。在HIV的基础上删除了vif、vpr、vpu和nef 4个辅助基因，同时用表达水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的质粒和双嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白Env的质粒，分别取代表达HIV本身包膜蛋白Env的质粒，使HIV-1载体颗粒包上了VSV或双嗜性MLV的包膜。包膜的更换进一步降低了慢病毒载体恢复成野生型病毒的可能，使HIV载体感染宿主的范围不再仅限于CD4+细胞，而扩大到几乎能感染所有组织来源的细胞。VSV的包膜赋予慢病毒载体颗粒高度的稳定性，使其能够通过超速离心而浓缩，达到高滴度。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

慢病毒载体是应用最广泛的转基因载体之一，具有下列优点：(1)可实现目的基因高效转染靶细胞基因组DNA中并能长期稳定表达；(2)能将目的基因插入到靶细胞基因组DNA中构建稳定的转化细胞株从而实现长期表达；(3)慢病毒包装工艺相对简单；(4)慢病毒载体经改构后，不在宿主细胞繁殖，不易诱发免疫反应，不会导致宿主细胞死亡，被它感染的细胞能连续传代，生物安全性高；(5)可以感染分裂期细胞和非分裂期细胞；(6)可转移的基因片段容量大，最大可达到9kb。为了获得稳定的整合低氧诱导因子1α的种子细胞株，本发明实施例选择慢病毒载体作为基因转染载体，将外源基因导入骨髓间充质干细胞中。

本发明实施例提供了一种骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法，所述方法利用携带低氧诱导因子1α的慢病毒感染骨髓充质干细胞、表达成骨基因，具体包括下述步骤，如附图1所示：

S01.构建慢病毒表达载体Lenti-HIF-1α-eGFP：从Hela细胞中提取总RNA，反转录成cDNA，分别设计含酶切位点BamHⅠ的引物HIF-1α-F和含酶切位点和PspXⅠ的引物HIF-1α-R，利用上述引物对cDNA进行PCR扩增获得扩增基因片段—低氧诱导因子1α基因；将慢病毒包装质粒载体Lenti-eGFP与所述扩增基因片段分别进行酶切处理，将酶切处理产物连接后转化处理，将转化产物扩增后进行质粒抽提，得到慢病毒表达载体Lenti-HIF-1α-eGFP；

S02.携带低氧诱导因子1α的慢病毒载体Lenti-HIF-1α-eGFP的包装：将慢病毒表达载体Lenti-HIF-1α-eGFP与病毒包装质粒Lenti Pac HIV共转染至293Ta细胞中，进行病毒包装，获得携带低氧诱导因子1α的慢病毒载体Lenti-HIF-1α-eGFP，收集病毒原液，并对病毒滴度进行监控；

S03.慢病毒载体Lenti-HIF-1α-eGFP感染骨髓间充质干细胞：获取骨髓间充质干细胞，当骨髓间充质干细胞融合度达70％时，当病毒滴度以MOI为50时加入慢病毒载体Lenti-HIF-1α-eGFP进行慢病毒感染，获得能够表达成骨基因的感染骨髓间充质干细胞。

本发明实施例上述步骤S01中，从Hela细胞中提取总RNA，反转录生成cDNA。以cDNA为模板，设计PCR引物。作为具体优选实施例，根据GenBank中已公布的大鼠HIF-1α基因序列(GenBank：AF057308.1)设计引物，设计含酶切位点BamHⅠ的引物HIF-1α-F和含酶切位点和PspXⅠ的引物HIF-1α-R，引物信息如下，其中，下划线处分别表示BamHⅠ和PspXⅠ酶切位点。

具体的，所述引物HIF-1α-F的序列为：5’-ACT AGA TGC TTT ATT GGA TCC GGT ACC ATG GAG GGC GCC GGC GGC GCG AA-3’；所述引物HIF-1α-R的序列为：5’-AGC TGG GTT GCG GCC GCA CTC GAG CTA AATAAT TCC TAC TGC TTG AAA AA-3’。

利用上述引物对cDNA进行PCR扩增，收集扩增基因片段即低氧诱导因子1α基因。为了验证PCR扩增基因片段为低氧诱导因子1α基因，可将PCR扩增基因片段进行琼脂糖凝胶电泳检测。本发明实施例中，所述PCR扩增基因片段经琼脂糖凝胶电泳检测后，大小在2000-2500bp之间，与Genebank中低氧诱导因子1α基因阅读框长度2208bp相符，如附图2所示，其中，条带1为Marker6000；条带2为低氧诱导因子1αPCR产物。

作为具体实施例，将所述扩增基因片段与慢病毒载体Lenti-eGFP用BamHⅠ和PspXⅠ分别进行酶切处理，并用凝胶电泳分离酶切产物，切胶回收目的片段。使用T4DNAligase连接上述PCR扩增基因片段与慢病毒载体Lenti-eGFP，取10μL连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH-5α，涂布至含抗生素LB平板，37℃恒温培养箱过夜。第2天挑取单菌落进行PCR鉴定，挑选阳性克隆接种到10mL含抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床培养12-16h，抽提质粒，得到慢病毒表达载体Lenti-HIF-1α-eGFP。

进一步的，为了验证病毒表达载体Lenti-HIF-1α-eGFP的准确性，可对抽提质粒分别用Acc65Ⅰ和XhoⅠ酶切后进行凝胶电泳鉴定。本发明实施例中，经过Acc65Ⅰ酶切后，切出2个片段，大小分别为6984bp，3841bp，经过XhoⅠ酶切后，切出3个片段，大小分别是8639bp，2144bp，42bp，具体见附图3所示，其中，条带1为Marker 6000；条带3为Lentil-eGFP-HIF-1α经Acc65Ⅰ酶切后的电泳结果；条带4为Lentil-eGFP-HIF-1α经XhoⅠ酶切后的电泳结果；条带5为Marker 15000，由此可见，成功构建了病毒表达载体Lenti-HIF-1α-eGFP。

上述步骤S02中，作为优选实施例，所述慢病毒载体Lenti-HIF-1α-eGFP的包装方法如下：

(1)取细胞状态良好，处于对数生长期的293Ta细胞，接种于6孔细胞培养板，37℃、体积分数为5％CO²饱和湿度细胞培养箱中培养；

(2)取慢病毒表达载体Lenti-HIF-1α-eGFP 1μL，加入5.0μL LentiPac-HIV混合包装质粒，以Opti-MEMI稀释至200μL；

(3)以Opti-MEMI稀释30μL EndoFectin转染试剂至400μL，室温培养20min后，边轻柔进行涡旋，边往步骤(2)中加入稀释的EndoFectin转染试剂200μL；

(4)将上述混合液体加入到6孔细胞培养板中，轻柔涡旋平板使复合物分散，放置在37℃、体积分数为5％CO²饱和湿度细胞培养箱中继续培养；

(5)培养12h后，吸出旧培养基，加入含体积分数为5％胎牛血清、青霉素和链霉素的新鲜DMEM培养基，再加入4μL TiterBoost试剂，在37℃、体积分数为5％CO2饱和湿度细胞培养箱中继续培养；

(6)转染48h后收集培养基，以500r/min离心10min去除细胞碎片，获得含慢病毒载体Lenti-HIF-1α-eGFP的培养基。

为了检测慢病毒载体Lenti-HIF-1α-eGFP的包装效果，本发明实施例可采用Lenti-eGFP阳性对照质粒与慢病毒表达载体Lenti-HIF-1α-eGFP作为平行对照进行试验，即从第(2)步开始，分别取慢病毒表达载体Lenti-HIF-1α-eGFP、Lenti-eGFP阳性对照质粒进行平行试验，具体操作同上述步骤，此处不再赘述。

本发明实施例中，优选采用PEG8000浓缩法对收集的病毒原液进行浓缩，用浓缩后的慢病毒感染293Ta细胞48h后，用孔稀释法测定病毒滴度可为5×10⁷TU/mL。

上述步骤S03中，作为优选实施例，所述骨髓间充质干细胞采用全骨髓贴壁培养法进行分离、培养、纯化获得。具体的，所述骨髓间充质干细胞采用全骨髓贴壁培养法进行分离、培养、纯化的方法为：取四周龄的雄性SD大鼠，体质量90-100g，将大鼠脱颈处死，无菌条件下取出双侧股骨和胫骨；从股骨干和胫骨干中间剪断，用5mL无菌注射器抽取SD大鼠骨髓间充质干细胞完全培养液反复冲洗骨髓腔，将冲洗液反复吹打混匀，制成细胞悬液后转移至60mm培养皿中，置于37℃、体积分数5％CO²、饱和湿度的细胞培养箱内培养；48h后首次换液，以后每2d换液1次；五六天细胞生长融合达80％以上，以0.25％Trypsin-EDTA消化后按1∶3的比例传入25cm²培养瓶中；用上述方法传代2次，获得第3代骨髓间充质干细胞备用。

本发明实施例中，为了获得优质的骨髓间充质干细胞，可对获得的骨髓间充质干细胞进行检测。所述检测可为骨髓间充质干细胞形态学观察、骨髓间充质干细胞表面标记物检测。

具体实施例中，所述骨髓间充质干细胞形态学观察的结果为，将骨髓间充质干细胞接种于培养皿后，镜下可见大量大小不一的圆形细胞悬浮于培养液中。培养24h后开始有细胞贴壁生长，呈多边形、梭形。通过换液去除未贴壁细胞后，可见短梭形、星形细胞分散在培养皿贴壁生长。培养5d后，大部分细胞贴壁生长，为多边形、星形，细胞排列较整齐，融合成片生长，融合率达80-90％，如附图4A所示；消化传代至第2代后，细胞基本贴壁生长，为短梭形，排列方向不一致，如附图4B所示；消化传代至第3代后，细胞形态基本一致，细胞融合成片生长，为长梭形，朝向同一方向排列，呈“鱼群”样，如附图4C所示。

具体的，采用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标记物，操作如下：(1)取传自3代生长良好的骨髓间充质干细胞，培养至对数生长期后，用0.25％Trypsin-EDTA消化细胞，PBS洗涤细胞，1000r/min离心5min，计数后调整细胞浓度为5×109L^-1；(2)取细胞悬液100μL，分别加入FITC-CD90及FITC-CD105抗体20μL，避光室温孵育20min，孵育完毕后PBS洗涤细胞2遍，1000r/min离心5min。重置细胞于400μL PBS中，采用流式细胞仪上机进行细胞检测，使用BeckmanCoulter软件采集数据。按本发明上述实施例处理，去大鼠骨髓间充质干细胞进行实验操作，采用流式细胞仪检测结果显示，第3代大鼠骨髓间充质干细胞表面标记物CD90与CD105表达为阳性，阳性率分别为99.8％、97.3％，见附图5所示，其中，图中A为FITC-CD90表达阳性率为99.8％；B为FITC-CD105表达阳性率为97.3％。

本发明实施例中，在获得感染骨髓间充质干细胞后，还包括对感染骨髓间充质干细胞的感染效果进行检测，具体的，慢病毒对骨髓间充质干细胞感染效率检测方法为：用MOI＝50的病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞48h后，倒置荧光显微镜下观察，本发明实施例观察结果为：约80％细胞荧光表达呈阳性，见附图6所示，其中，图中A为骨髓间充质干细胞生长状况良好，未见细胞死亡(倒置显微镜，×100)；B为约80％骨髓间充质干细胞表达荧光(荧光显微镜，×100)；C为高倍镜下可见荧光表达效果好(荧光显微镜，×400)。

此外，在获得感染骨髓间充质干细胞后，还包括采用荧光定量PCR检测骨髓间充质干细胞中成骨基因mRNA的表达-即骨形态发生蛋白2、骨质蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶mRNA的表达水平。作为优选实施例，为了评价所述感染骨髓间充质干细胞成骨因子的表达水平，分成三组进行平行实验并检测骨髓间充质干细胞中骨形态发生蛋白2、骨质蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶mRNA的表达水平：用所述携带低氧诱导因子1α的慢病毒感染骨髓间充质干细胞作为实验组、用不携带低氧诱导因子1α的慢病毒感染骨髓间充质干细胞作为空载体组、不进行处理的骨髓间充质干细胞作为空白对照组。具体操作为：

将第3代骨髓间充质干细胞按每孔1×10⁶接种至6孔板内，待细胞融合度达70％时以MOI值为50进行慢病毒感染，实验分为3组：用携带低氧诱导因子1α的慢病毒感染骨髓间充质干细胞作为实验组、用不携带低氧诱导因子1α的慢病毒感染骨髓间充质干细胞作为空载体组、不进行处理的骨髓间充质干细胞作为空白对照组。在感染48h后倒置荧光显微镜下观察实验组荧光分布情况，评估慢病毒对骨髓间充质干细胞的感染效率。分别于感染后1，4，7，14d用Trizol法提取各组骨髓间充质干细胞的总RNA，反转录为cDNA，设计引物如下表1所示，用RT-qPCR法检测成骨基因骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶的表达水平。为消除样品量的差异，引入内参基因GAPDH进行校正。记录Ct值(基本循环数)，即每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经过的循环数。根据内参基因GAPDH的循环数计算出ΔCt(基本循环与内参循环数差值)，依据2^-ΔΔCt相对定量法：ΔΔCt＝(Ct_目的基因-Ct_管家基因)_实验组-(Ct_目的基因-Ct_管家基因)_对照组，计算出目的基因的相对拷贝数。上述计算可采用统计学分析，即：应用SPSS 13.0软件包作统计学处理，计量资料采用表示。采用ANOVA方差分析目的基因在不同时间点的表达水平有无显著性意义，当P<0.05为差异有显著性意义。

本发明实施例中，以大鼠骨髓间充质干细胞中作为对象，荧光定量PCR检测骨髓间充质干细胞中骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶mRNA的表达水平，结果显示为：与空载体组及空白对照组相比，实验组各成骨因子表达水平显著增高，其P值分别为0.037，0.047，0.038，0.033，均小于0.05。其中，实验组大鼠骨髓间充质干细胞中骨形态发生蛋白2的表达水平在转染后1，4，7，14d分别为空载体组的2.96倍、6.85倍、6.48倍、6.17倍，见附图7A所示；实验组大鼠骨髓间充质干细胞中骨钙蛋白的表达水平在转染后1，4，7，14d分别为空载体组的2.50倍、5.33倍、7.13倍、7.07倍，见附图7B所示；实验组大鼠骨髓间充质干细胞中骨桥蛋白的表达水平在转染后1，4，7，14d分别为空载体组的2.44倍、4.98倍、6.27倍、7.32倍，见附图7C所示；实验组大鼠骨髓间充质干细胞中碱性磷酸酶的表达水平在转染后1，4，7，14d分别为空载体组的2.27倍、4.43倍、5.81倍、5.38倍，见附图7D所示。空载体组与空白对照组相比，各成骨因子表达水平差异无显著性意义(P>0.05)。

本发明实施例提供的骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法，从Hela细胞中扩增出低氧诱导因子1α基因片段，然后利用慢病毒载体将低氧诱导因子1α导入至大鼠骨髓间充质干细胞基因组DNA中，未见到明显的毒性反应，细胞生长良好；由于慢病毒载体自带增强型绿色荧光蛋白，荧光显微镜下观察见骨髓间充质干细胞能大量表达低氧诱导因子1α(荧光强)；通过全骨髓贴壁培养法分离培养出大鼠骨髓间充质干细胞，形态学观察到细胞的生长形态变化情况与文献相符，同时流式细胞仪检测了分离得到的骨髓间充质干细胞表面标记物CD90与CD105表达呈阳性(分别为99.8％、97.3％)，证明成功的获得大鼠骨髓间充质干细胞；使用荧光定量PCR法对携带低氧诱导因子1α的慢病毒感染过的骨髓间充质干细胞的cDNA进行检测分析发现实验组成骨因子骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶表达水平显著高于空载体组及空白对照组(P<0.05)，表明在体外实验中低氧诱导因子1α可以提高骨髓间充质干细胞中成骨因子的表达水平，提高其成骨活性。

表1

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法，其特征在于，所述方法利用携带低氧诱导因子1α的慢病毒感染骨髓充质干细胞、表达成骨基因，具体包括下述步骤：

构建慢病毒表达载体Lenti-HIF-1α-eGFP：从Hela细胞中提取总RNA，反转录成cDNA，分别设计含酶切位点BamHⅠ的引物HIF-1α-F和含酶切位点和PspXⅠ的引物HIF-1α-R，利用上述引物对cDNA进行PCR扩增获得扩增基因片段—低氧诱导因子1α基因；将慢病毒包装质粒载体Lenti-eGFP与所述扩增基因片段分别进行酶切处理，将酶切处理产物连接后转化处理，将转化产物扩增后进行质粒抽提，得到慢病毒表达载体Lenti-HIF-1α-eGFP；

携带低氧诱导因子1α的慢病毒载体Lenti-HIF-1α-eGFP的包装：将慢病毒表达载体Lenti-HIF-1α-eGFP与病毒包装质粒Lenti Pac HIV共转染至293Ta细胞中，进行病毒包装，获得携带低氧诱导因子1α的慢病毒载体Lenti-HIF-1α-eGFP，收集病毒原液，并对病毒滴度进行监控；

慢病毒载体Lenti-HIF-1α-eGFP感染骨髓间充质干细胞：获取骨髓间充质干细胞，当骨髓间充质干细胞融合度达70％时，当病毒滴度以MOI为50时加入慢病毒载体Lenti-HIF-1α-eGFP进行慢病毒感染，获得能够表达成骨基因的感染骨髓间充质干细胞。

2.如权利要求1所述的骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法，其特征在于，构建慢病毒表达载体Lenti-HIF-1α-eGFP的步骤中，所述引物HIF-1α-F的序列为：5’-ACT AGA TGC TTT ATT GGA TCC GGT ACC ATG GAG GGCGCC GGC GGC GCG AA-3’；所述引物HIF-1α-R的序列为：5’-AGC TGG GTTGCG GCC GCA CTC GAG CTA AAT AAT TCC TAC TGC TTG AAA AA-3’。

3.如权利要求1所述的骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法，其特征在于，在获得感染骨髓间充质干细胞后，还包括采用荧光定量PCR检测骨髓间充质干细胞中骨形态发生蛋白2、骨质蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶mRNA的表达水平。

4.如权利要求3所述的骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法，其特征在于，为了评价所述感染骨髓间充质干细胞成骨因子的表达水平，分成三组进行平行实验并检测骨髓间充质干细胞中骨形态发生蛋白2、骨质蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶mRNA的表达水平：用所述携带低氧诱导因子1α的慢病毒感染骨髓间充质干细胞作为实验组、用不携带低氧诱导因子1α的慢病毒感染骨髓间充质干细胞作为空载体组、不进行处理的骨髓间充质干细胞作为空白对照组。

5.如权利要求1-3任一所述的骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞采用全骨髓贴壁培养法进行分离、培养、纯化获得。

6.如权利要求5所述的骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞采用全骨髓贴壁培养法进行分离、培养、纯化的方法为：将大鼠脱颈处死，无菌条件下取出双侧股骨和胫骨；从股骨干和胫骨干中间剪断，用5mL无菌注射器抽取SD大鼠骨髓间充质干细胞完全培养液反复冲洗骨髓腔，将冲洗液反复吹打混匀，制成细胞悬液后转移至60mm培养皿中，置于37℃、体积分数5％CO²、饱和湿度的细胞培养箱内培养；48h后首次换液，以后每2d换液1次；五六天细胞生长融合达80％以上，以0.25％Trypsin-EDTA消化后按1∶3的比例传入25cm²培养瓶中；用上述方法传代2次，获得第3代骨髓间充质干细胞备用。

7.如权利要求1-3所述的骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法，其特征在于，所述慢病毒载体Lenti-HIF-1α-eGFP的包装方法如下：

(1)取细胞状态良好，处于对数生长期的293Ta细胞，接种于6孔细胞培养板，37℃、体积分数为5％CO²饱和湿度细胞培养箱中培养；

(2)取慢病毒表达载体Lenti-HIF-1α-eGFP 1μL，加入5.0μL LentiPac-HIV混合包装质粒，以Opti-MEMI稀释至200μL；

(3)以Opti-MEMI稀释30μL EndoFectin转染试剂至400μL，室温培养20min后，边轻柔进行涡旋，边往步骤(2)中加入稀释的EndoFectin转染试剂200μL；

(4)将上述混合液体加入到6孔细胞培养板中，轻柔涡旋平板使复合物分散，放置在37℃、体积分数为5％CO²饱和湿度细胞培养箱中继续培养；

(5)培养12h后，吸出旧培养基，加入含体积分数为5％胎牛血清、青霉素和链霉素的新鲜DMEM培养基，再加入4μL TiterBoost试剂，在37℃、体积分数为5％CO2饱和湿度细胞培养箱中继续培养；

(6)转染48h后收集培养基，以500r/min离心10min去除细胞碎片，获得含慢病毒载体Lenti-HIF-1α-eGFP的培养基。