CN111154713B - 人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株及其应用 - Google Patents

人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体为一种人胚肾上皮细胞293T‑Clone3单克隆细胞株及其应用。本发明的单克隆细胞株细胞株保藏号为：CCTCC NO：C2019262，具有高的转染效率，转染效率高于商品化的AAV293，转染效率均达到90％以上，每个150mm皿包装的AAV的上清与细胞的总病毒基因拷贝数均在1011以上，最高可达1012，上清中的病毒基因拷贝数均在1011以上，而AAV293包装出来的病毒基因拷贝数在109‑1011。相较于AAV293，本发明的人胚肾上皮细胞293T‑Clone3单克隆细胞株更能满足实验需求。

Description

人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及单克隆细胞株技术领域，具体为一种人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株及其应用。
背景技术
基因治疗是以改变人的遗传物质为基础，将外源正常基因或有治疗作用的基因导入靶细胞，以纠正或补偿基因缺陷和异常引起的疾病，从而达到治疗疾病的目的。而AAV具有宿主范围广、安全性高、免疫原性低、表达时间长等优势，同时AAV具有多种血清型，而不同血清型的衣壳蛋白识别细胞表面的受体不同，因而在不同组织中的侵染效率不同，可实现对特定细胞类型的高效转导。因此AAV已经被广泛应用于基础研究和临床试验中，成为最常用的基因治疗载体之一。
AAV包装系统包括载体质粒、包装质粒和辅助质粒，以及能够能产生病毒颗粒的包装细胞。携带有外源基因的载体质粒在包装质粒、辅助质粒和包装细胞的辅助下，经过病毒包装产生有感染能力的病毒颗粒，收集并纯化后可直接用于感染目的细胞，通过整合到细胞基因组而实现外源基因的的稳定表达。
由于现有AAV生产所用的包装细胞系一般从ATCC(美国模式菌种收集中心)处获得，直接使用或者再次经过其他改造后使用，但所使用的细胞仍然是具有异质性的一群细胞组成的细胞系，也即是由具有不同AAV包装效率的一群细胞组成，因而可能会导致整体的AAV生产效率不高，而用于临床治疗需要足够数量即高滴度的AAV。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供了一种可提高AAV包装效率、包装病毒滴度高的单克隆细胞株，并在GMP条件下建立了三级细胞库。
本发明提供的人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株，保藏号为：CCTCC NO：C2019262，以下或称为293T-C3细胞，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；邮编：430072；培养物名称：人胚肾上皮细胞293T-Clone3，保藏日期为：2019.11.13。
该293T-C3细胞属于人胚肾上皮细胞，培养方法：在DMEM(GIBCO，货号11965-084)培养基中加入10％胎牛血清(Biological Industries，货号04-001-1ACS)，在37℃，体积分数5％的CO2条件下培养。
保存条件：气相液氮(-196℃)下保存。
上述293T-C3细胞的获得方法，包括如下步骤：
1、将从ATCC购买293T细胞进行培养，然后经过细胞消化程序将其分散成单个细胞，利用细胞培养基将细胞稀释(稀释比例以96孔板的每个孔最多含1个细胞为准)后加入到96孔板中进行培养；挑选孔内仅有单个细胞的进行扩大培养，培养数周后形成单克隆细胞株。
2、用获得的单克隆细胞株分别包装不同AAV血清型，并测定包装效率、病毒滴度和感染靶细胞效率，得到转染效率以及包装病毒滴度最高的单克隆细胞株。
所得到的人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株可用于包装病毒。
进一步的，上述人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株可用于包装腺相关病毒。
进一步的，上述应用包括如下步骤：
将人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株在150mm皿中铺板，然后将AAV包装质粒、辅助质粒和表达质粒按摩尔比1:1:1混合，得到混合质粒，再用PEI转染试剂将混合质粒共转染至293T-Clone3单克隆细胞，PEI转染试剂与混合质粒的质量比为1：2，进行培养，培养至72小时后收获上清和细胞。
进一步的，所述AAV包装质粒为pAAV1、pAAV2、pAAV3、pAAV5、pAAV6和pDG8质粒。
进一步的，所述辅助质粒为pHelper质粒。
进一步的，所述表达质粒为pAAV-CB-EGFP质粒。
3、建立该单克隆细胞的三级细胞库并进行质检
将获得的人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株扩大培养，冻存足够数量的细胞，保存为主细胞库；然后从主细胞库中任取一支，继续扩大培养，再次冻存足够数量的细胞，保存为工作细胞库。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
相比于现有技术，本发明筛选出的人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株对不同血清型AAV转染效率均达到90％以上，而AAV293细胞的包装效率为75-80％，且转染后细胞状态变差。每个150mm皿包装出来的病毒滴度可以达到1011以上，相较于AAV293细胞包装效率至少提高2倍，有的甚至达到40倍。
附图说明
图1为实施例1获得293T-C3细胞的流程图。
图2：A为293T-C3细胞包装的AAV1血清型病毒转染48h后的细胞形态(左：可见光，右：荧光)，B为A为293T-C3细胞包装的AAV1血清型病毒转染48h后的细胞流式图；C为AAV293细胞包装的AAV1血清型病毒转染48h后的细胞形态(左：可见光，右：荧光)，D为AAV293细胞包装的AAV1血清型病毒转染48h后的细胞流式图。
图3：A为293T-C3细胞包装的AAV2血清型病毒转染48h后的细胞形态(左：可见光，右：荧光)，B为A为293T-C3细胞包装的AAV2血清型病毒转染48h后的细胞流式图；C为AAV293细胞包装的AAV2血清型病毒转染48h后的细胞形态(左：可见光，右：荧光)，D为AAV293细胞包装的AAV2血清型病毒转染48h后的细胞流式图。
图4：A为293T-C3细胞包装的AAV3血清型病毒转染48h后的细胞形态(左：可见光，右：荧光)，B为A为293T-C3细胞包装的AAV3血清型病毒转染48h后的细胞流式图；C为AAV293细胞包装的AAV3血清型病毒转染48h后的细胞形态(左：可见光，右：荧光)，D为AAV293细胞包装的AAV3血清型病毒转染48h后的细胞流式图。
图5为实施例3中三级细胞库建立流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株的获得
(1)将从ATCC购买的293T细胞进行培养，待长满时，分至多个细胞培养瓶进行培养。
(2)待其中一瓶细胞密度约70-80％时，弃上清，用PBS洗一遍，然后加入适量胰酶消化液在培养箱中进行消化处理，将其分散成单个细胞。
(3)在显微镜下观察消化至单个细胞后，加入完全培养基终止消化，然后1000rpm离心5min。
(4)弃上清，用完全培养基重悬细胞并用台盼蓝计数。
(5)利用细胞培养基将细胞稀释(稀释比例以96孔板的每个孔至多含1个细胞为准)后加入到96孔板中进行培养；
(6)第二天在显微镜下观察96孔板，将含有1个细胞的孔做标记；待做标记的细胞在孔内长满后，将其扩大培养至细胞培养瓶。
(7)将扩大的细胞进行冻存保种。
实施例2
1.人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株的病毒包装测试
用实施例1获得的一个人胚肾上皮细胞293T-C3单克隆细胞株(以下简称293T-C3细胞)和AAV293分别包装血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、和pDG8，并测定包装出来的AAV的病毒滴度。具体步骤如下：
(1)将293T-C3在5个150mm皿中铺板，然后将AAV包装质粒(pAAV1、pAAV2、pAAV3、pAAV5、pAAV6和pDG8质粒)、辅助质粒(pHelper质粒)和表达质粒(pAAV-CB-EGFP质粒)按摩尔比1:1:1混合，得到混合质粒，再用PEI转染试剂将其共转染至293T-C3细胞，PEI转染试剂与混合质粒的质量比为1:2，8-10小时后细胞换液，继续培养至48小时后在显微镜下拍照，对比例采用AAV293细胞，部分结果如图2-4所示，发现293T-C3细胞包装AAV转染效率均达到90％以上，而AAV293的包装效率为75-80％，且转染后细胞状态变差。293T包装继续培养至72小时后分别收获上清和细胞。
(2)将收获的细胞和上清分别进行前处理。
细胞前处理方法为：将收获的细胞沉淀加入Lysis buffer(1mL/150mm皿)，反复冻融三次后，加入1μL的Benozonase核酸酶，37℃水浴30分钟；然后4℃3000rpm离心10min；该上清即为需要的病毒原液。
上清前处理方法为：将上清经0.45μm滤膜过滤后，加入25％体积的PEG8000，4℃搅拌1小时，放置3小时或过夜；然后4℃下2818g离心15min；弃上清，用Lysis buffer重悬沉淀(1mL/150mm皿)，即为需要的病毒原液。
(3)前处理后的病毒原液进行碘克沙醇密度梯度离心
在高速离心管中分别依次加入各浓度(60％、40％、25％和15％)的碘克沙醇2mL，最后加入病毒原液至离心管口；18℃40000rpm离心16小时，将介于60％和40％之间的病毒吸出并用Lysis buffer稀释；4℃下用超滤柱离心浓缩至1-2mL，然后用0.22μm滤过过滤后进行分装，保存至-80℃。
2.Q-PCR测定病毒的滴度
(1)提取AAV基因组。
取10μL病毒至1.5mL EP管，然后加入79μL的ddH2O、10μL DNaseⅠbuffer和1μL的DNaseⅠ，37℃水浴放置1小时。然后加入300μL proteinK buffer和5μL的proteinase K，50℃水浴放置2小时。按体积比1:1加入DNA提取液，颠倒混匀20-30秒，15000g离心10min。离心后取上清至新的1.5mL离心管，按体积比1:1加入氯仿，颠倒混匀后，15000g离心10min。离心后取上清至新的1.5mL EP管，加入1μL glycogen和40μL 3mol/L NaAcetate，混匀后放置-80℃过夜。4℃20000g离心20min，将出现白色沉淀，弃上清，用100μL ddH2O重悬沉淀，即为病毒基因组。
(2)通过Q-PCR检测病毒滴度(每毫升病毒拷贝数)
将相应表达质粒从100ng/μL10倍稀释至8个梯度作为标准曲线，病毒基因组同样10倍稀释至8个梯度作为待检测样品。按Zxchame Universal SYBR qPCR Master Mix说明书所需量加入引物、SYBR和模板后在ABI StepOne仪器上进行检测(三孔重复)。根据标准曲线和样品Ct值计算病毒基因拷贝数(vg/mL)结果如表1和表2所示。
表1收获的病毒上清和细胞中总基因拷贝数比较
Figure BDA0002372547160000071
由表1可以看出，在选择包装的三种AAV血清型AAV1、AAV2和pDG8中，每个150mm皿病毒上清与细胞的总病毒基因拷贝数：
1、AAV1在293T-C3细胞中的包装效率是AAV293细胞中的约4倍；
2、AAV2在293T-C3细胞中的包装效率是AAV293细胞中的2倍；
3、pDG8在293T-C3细胞中的包装效率是AAV293细胞中的40倍。
3、293T-C3包装出来的AAV的基因拷贝数均在1011以上，甚至在不同的AAV血清型中达到了1012。
表2收获的病毒上清中基因拷贝数比较
Figure BDA0002372547160000081
由表2可以看出，在选择包装的5种AAV血清型AAV1、AAV3、AAV5、AAV6和pDG8中，每个150mm皿病毒上清中的基因拷贝数：
1、AAV1、AAV5和AAV6在293T-C3细胞中的包装效率是AAV293细胞中的约2倍；
2、AAV3和pDG8在293T-C3细胞中的包装效率是AAV293细胞中分别为10倍和80倍；
3、293T-C3包装出来的病毒基因拷贝数均在1011以上，而AAV293包装出来的病毒基因拷贝数在109-1011。
实施例3 293T-C3三级细胞库建立
1、三级细胞库的建立
(1)如图5所示，将上述筛选出的293T-C3细胞扩大培养，直至可以按1x107/支冻存30支左右，然后将细胞上清弃掉，用PBS洗一遍，加入消化液在培养箱中消化1分钟；加入培养基终止消化并重悬并计数，1000rpm离心5分钟；按每支1x107细胞加入对应量的冻存液重悬，然后每支冻存管加入1mL细胞，放入程序降温冻存盒中，放入-80℃过夜后，转入气相液氮罐，作为种子库并做好记录。
(2)从上述冻存的种子库细胞中取出一支细胞，扩大培养，然后按上述方法进行扩增冻存，冻存50支作为主细胞库，并作好记录。
(3)从上述冻存的主细胞库细胞中取出一支细胞，扩大培养，然后按上述方法进行扩增冻存，冻存100支作为工作细胞库，并作好记录。
(4)采用细菌培养法对293T-C3细胞进行血培养(厌氧)+药敏检测，培养48小时内无厌氧菌和需氧菌生长，细菌内毒素检测项目的检测结果为：内毒素含量0.215EU/ml，回收率:88.45％。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (7)

1.人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株，其特征在于，保藏编号为：CCTCC NO：C2019262。
2.如权利要求1所述的人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株在包装腺相关病毒中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
将人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株在150mm皿中铺板，然后将AAV包装质粒、辅助质粒和表达质粒按摩尔比1:1:1混合，得到混合质粒，再用PEI转染试剂将混合质粒共转染至293T-Clone3单克隆细胞进行培养，收获上清和细胞。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述AAV包装质粒为pAAV1、pAAV2、pAAV3、pAAV5、pAAV6和pDG8质粒。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述辅助质粒为pHelper质粒。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述表达质粒为pAAV-CB-EGFP质粒。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，PEI转染试剂与混合质粒的质量比为1：2。
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