CN115505559A - 用于病毒载体生产的hek293悬浮细胞系的开发方法 - Google Patents
用于病毒载体生产的hek293悬浮细胞系的开发方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115505559A CN115505559A CN202211213168.1A CN202211213168A CN115505559A CN 115505559 A CN115505559 A CN 115505559A CN 202211213168 A CN202211213168 A CN 202211213168A CN 115505559 A CN115505559 A CN 115505559A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- suspension
- hek293
- cells
- cell
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
- C12N5/0686—Kidney cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Abstract
本发明涉及一种用于病毒载体生产的悬浮HEK293细胞系的开发方法。该方法包括以下步骤:将HEK293贴壁细胞以有限稀释法进行克隆筛选,获得180~250个细胞克隆;评估克隆筛选获得的细胞克隆的生长速率和病毒载体转染效率,筛选出15~25组待扩大培养的细胞克隆;将各组待扩大培养的细胞克隆分别扩大培养,并以生长速率和病毒载体转染效率筛选,获得5~13组作为悬浮驯化的优选克隆细胞;将各组优选克隆细胞分别进行悬浮驯化;及将经悬浮驯化的各组细胞分别取各自的一部分以病毒载体转染效率筛选,制备适宜于悬浮培养的HEK293细胞。上述方法时间短且获得的细胞的病毒产量高,可实现生物药的规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,特别是涉及用于病毒载体生产的细胞系开发,具体涉及一种用于病毒载体生产的HEK293悬浮细胞系的开发方法。
背景技术
目前,基因细胞治疗药物的开发如火如荼,用于嵌合抗原受体-T细胞治疗(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,CAR-T)的病毒载体通常为慢病毒载体(LVVs),用于基因治疗的病毒载体通常为腺相关病毒载体(AAV)或腺病毒载体(ADV)。慢病毒载体的生产通常使用HEK293T细胞,腺相关病毒载体或腺病毒载体的生产通常使用HEK293细胞,基于腺病毒载体的疫苗(如新冠疫苗)也使用的是HEK293细胞。此外,一些溶瘤病毒载体(OV)的和外泌体的生产通常也使用HEK293细胞。
早期的病毒载体生产工艺均使用的是贴壁细胞生产工艺,且当前慢病毒载体的生产大多仍使用的是贴壁细胞,而AAV和OV的生产也有一半以上是使用的贴壁细胞工艺。然而,贴壁细胞生产病毒载体通常依赖于胎牛血清(FBS),这不仅增加了药物的安全风险(例如外源病毒因子污染等问题),也增加了生产成本,同时FBS的批间差异可能对病毒载体生产的工艺一致性造成挑战。对于贴壁细胞生产工艺,另一个巨大的挑战是其难以实现规模化放大生产(通常只能到数十升/批),这不仅增加了成本,也对工艺的稳定性和一致性造成巨大挑战。
随着生物技术以及生物工艺技术的进步,悬浮细胞生产工艺不断开发和优化。悬浮细胞生产工艺具有生产物料无动物源成分、易于规模放大(通常可达200L、500L、2000L)、成本低、生产工艺稳定性和一致性好、生产操作友好等优势。悬浮细胞生产工艺在整个生物制药行业应用广泛,尤其是抗体药物,已几乎全部使用悬浮细胞进行生产。一些慢病毒载体生产工艺逐渐使用悬浮HEK293T细胞,越来越多的AAV、ADV以及OV药物项目开始使用悬浮HEK293细胞进行病毒载体生产。
传统的HEK293细胞悬浮驯化策略为DMEM或EMEM和胎牛血清逐渐降低和替换,即血清浓度逐渐由10%降低至7.5%、5%、2.5%、1%,DMEM或EMEM也逐渐更换成悬浮培养的无血清培养基,然而此悬浮驯化过程漫长,通常需3~5个月完成。并且HEK293为人胚肾亚三倍体细胞,是一种染色体异质性很强的细胞。HEK293原始细胞生长缓慢,细胞转染效率不高,从而导致病毒载体滴度的单位产率较低。
发明内容
基于此,有必要提供一种悬浮HEK293细胞系开发时间短且病毒载体的产率高的用于病毒载体生产的HEK293悬浮细胞的开发方法。
用于病毒载体生产的HEK293悬浮细胞系的开发方法,包括以下步骤:
将HEK293贴壁细胞以有限稀释法进行克隆筛选,获得180个~250个细胞克隆;其中,所述克隆筛选的培养基包含VP-SFM培养基和Pro293培养基中的一种、体积百分含量为2%~10%的胎牛血清和2mM~8mM的GlutaMaxTM补充剂;
评估所述克隆筛选获得的细胞克隆的生长速率和病毒载体转染效率,筛选出15组~25组待扩大培养的细胞克隆;
将各组所述待扩大培养的细胞克隆分别扩大培养,其中,所述扩大培养的培养基包含VP-SFM培养基和Pro293培养基中的一种、体积百分含量为0%~2%的胎牛血清和2mM~8mM的GlutaMaxTM补充剂;在扩大培养过程中,以生长速率和病毒载体转染效率筛选,获得5组~13组优选克隆细胞;
将各组所述优选克隆细胞分别进行悬浮驯化,其中所述悬浮驯化采用无血清完全培养基进行培养,所述无血清完全培养基包含SFM4 HEK293、SFM4 Transfx293、HEK293MaxX、OPM 293 CD05、OptiVitro 293、HEK293-04 Prototype、HEK293-13 Prototype、HEKVip NX、HEK Vip NB、HEK TF和HEK GM中的一种和2mM~8mM的GlutaMaxTM补充剂;及
将经悬浮驯化的各组细胞分别取各自的一部分细胞,以病毒载体转染效率筛选,制备适宜于病毒载体生产用的HEK293悬浮细胞系。
上述用于病毒载体生产的HEK293悬浮细胞系的开发方法采用贴壁培养克隆筛选、悬浮驯化、悬浮细胞克隆筛选而获得适宜于病毒载体生产的HEK293悬浮细胞系。具体的,采用有限稀释法进行克隆后以转染效率和细胞生长速率进行评估,获得待悬浮驯化的细胞克隆;悬浮驯化利用HEK293贴壁细胞能在有血清或无血清的VP-SFM培养基或Pro293培养基生长的特点进行快速悬浮驯化,其能够在3周~5周内将HEK293完成悬浮驯化,与传统悬浮驯化逐步减血清的方法需3~5个月相比,大大减少了悬浮驯化的时间。并且由于克隆筛选进行了转染效率评估,从而使得经克隆筛选和悬浮驯化的HEK293悬浮细胞系能以高密度高转染效率生产病毒载体,从而大大增加病毒产量。
在其中一个实施例中,在悬浮驯化之前,还包括从5组~13组优选克隆细胞中以生长速率和病毒载体转染效率筛选出3组~6组作为待悬浮驯化细胞。
在其中一个实施例中,所述克隆筛选的步骤包括:
将HEK293贴壁细胞以1个/孔的密度铺板进行初步培养,所述初步培养的孔数为900孔~2000孔;及
筛选出生长良好的180个~250个细胞克隆。
在其中一个实施例中,所述初步培养的步骤包括:
在将HEK293贴壁细胞贴壁培养6天~8天后,以一半体积的新鲜培养基进行换液,后续每3天~4天进行一次换液。
在其中一个实施例中,在评估病毒载体转染效率的步骤中,至少满足以下条件中的一个:
(1)转染试剂包括PEIpro、PEI MAX或VirusGen;
(2)转染试剂与病毒载体之比为(1~5):1,病毒载体的用量为0.5μg/cm2~2μg/cm2;
(3)病毒载体为AAV转移质粒或LV转移质粒。
在其中一个实施例中,所述悬浮驯化的步骤包括:
将各组所述优选克隆细胞的密度调整为0.8×106个/mL~1×106个/mL后,振荡培养,所述振荡培养的振幅为20mm~50mm、转速为95rpm~150rpm;及
在细胞密度低于1×106个/mL或细胞活率低于85%时,更换新鲜的所述无血清完全培养基。
在其中一个实施例中,在所述悬浮驯化过程中,细胞密度为0.5×106个/mL~6×106个/mL。
在其中一个实施例中,在所述将经悬浮驯化筛选出的各组细胞分别取各自的一部分细胞以病毒载体转染效率筛选的步骤中,至少满足以下条件中的一个:
(1)转染试剂包括PEIpro、PEI MAX或VirusGen;
(2)转染试剂与病毒载体之比为(1~5):1,病毒载体的用量为1μg/mL~4μg/mL;
(3)转染时的细胞密度为2×106个/mL~4×106个/mL。
在其中一个实施例中,在以病毒载体转染效率进行筛选的步骤中,转染所用的病毒载体上携带有报告基因。
在其中一个实施例中,所述报告基因为EGFP。
一种悬浮HEK293细胞的培养方法,包括以下步骤:
将上述的用于病毒载体生产的HEK293悬浮细胞系的开发方法获得的HEK293悬浮细胞系采用无血清完全培养基进行悬浮培养。
在其中一个实施例中,所述无血清完全培养基包含:SFM4HEK293、SFM4Transfx293、HEK293 MaxX、OPM 293 CD05、OptiVitro 293、HEK293-04 Prototype、HEK293-13 Prototype、HEK Vip NX、HEK Vip NB、HEK TF和HEK GM中的一种,3mM~5mM的GlutaMaxTM补充剂,和体积百分含量为0.1%~1%的抗细胞结团剂。
附图说明
图1为实施例1中贴壁克隆筛选阶段03G11的转染效率结果;
图2为实施例1中贴壁克隆筛选阶段06D08的转染效率结果;
图3为实施例1中贴壁克隆筛选阶段19C03的转染效率结果;
图4为实施例1中贴壁克隆筛选阶段01F10的转染效率结果;
图5为实施例1中贴壁克隆筛选阶段12D06的转染效率结果;
图6为实施例1中悬浮驯化的克隆细胞筛选阶段采用CD05培养基、PEIpro和VirusGEN分别作为转染剂、LV-EGFP转染编号为19C03的细胞的转染结果;
图7为实施例1中悬浮驯化的克隆细胞筛选阶段采用PEIpro作为转染剂、LV-EGFP作为转移质粒、Max X和CD05分别作为培养基转染编号为19C03的细胞的转染结果;
图8为实施例1中悬浮驯化的克隆细胞筛选阶段采用VirusGEN作为转染剂、LV-EGFP作为转移质粒、Max X和CD05分别作为培养基转染编号为19C03的细胞的转染结果;
图9为实施例1悬浮驯化的克隆细胞筛选阶段19C03的生长曲线;
图10为实施例2的HEK293贴壁细胞的转染效率结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将对本发明进行更全面的描述,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文中“可选地”表示举例。需要说明的是,如无特别指出,本文中的贴壁细胞培养均是在37℃、5%CO2条件下进行,悬浮驯化均在37℃、8%CO2条件下进行。
本申请一实施方式提供了一种用于病毒载体生产的HEK293悬浮细胞系的开发方法,该方法包括步骤S10、步骤S20、步骤S30、步骤S40和步骤S50。
具体地:
步骤S10:将HEK293贴壁细胞以有限稀释法进行克隆筛选,获得180个~250个细胞克隆。
具体地,克隆筛选的培养基包含VP-SFM培养基和Pro293培养基中的一种、体积百分含量为2%~10%的胎牛血清和2mM~8mM的GlutaMaxTM补充剂。在一些实施例中,克隆筛选的培养基由VP-SFM培养基和Pro293培养基中的一种、体积百分含量为5%~10%的胎牛血清和2mM~8mM的GlutaMaxTM补充剂组成。可选地,在克隆筛选的培养基中,GlutaMaxTM补充剂的浓度为2mM、4mM、6mM或8mM。可选地,在克隆筛选的培养基中,胎牛血清的体积百分含量为2%、4%、5%或8%。进一步地,克隆筛选的培养基包含VP-SFM培养基、体积百分含量为2%~10%的胎牛血清和3.5mM~4.5mM的GlutaMaxTM补充剂组成。可选地,克隆筛选的培养基由VP-SFM培养基和Pro293培养基中的一种、体积百分含量为10%的胎牛血清和3.5mM~4.5mM的GlutaMaxTM补充剂组成。在一个具体示例中,克隆筛选的培养基由VP-SFM培养基和Pro293培养基中的一种、体积百分含量为10%的胎牛血清和4mM的GlutaMaxTM补充剂组成。
在一些实施例中,克隆筛选的步骤包括;将HEK293贴壁细胞以1个/孔的密度铺板进行初步培养,初步培养的孔数为900孔~2000孔;及筛选出生长良好的100个~250个细胞克隆。在本文中,“生长良好的细胞”是指细胞处于指数生长期且活率大于90%的细胞。进一步地,初步培养的步骤包括:在将HEK293细胞贴壁培养6天~8天后,以一半体积的新鲜培养基(此处的新鲜培养基时是指未使用的克隆筛选的培养基)进行换液,后续每3天~4天进行一次换液。
在一些实施例中,通过克隆筛选获得细胞克隆为190个~230个。在一个可选地具体示例中,通过克隆筛选获得细胞克隆为195个、200个、205个、215个、220个或225个。进一步地,过克隆筛选获得细胞克隆为195个~215个。
在本实施方式中,HEK293贴壁细胞为ATCC:CRL1573。
在一些实施例中,在将HEK293贴壁细胞以有限稀释法进行克隆筛选的步骤之前,还包括将冻存的HEK293细胞复苏并连续传代培养三代以上的步骤。可选地,将冻存的HEK293细胞复苏的步骤包括:使用VP-SFM培养基和Pro293培养基中的一种并添加1%的FBS和3.5mM~4.5mM的GlutaMax复苏冻存的HEK293细胞。
步骤S20:评估克隆筛选获得的细胞克隆的生长速率和病毒载体转染效率,筛选出15组~25组待扩大培养的细胞克隆。
在一些实施例中,在评估病毒载体转染效率的步骤中,至少满足以下条件中的一个:(1)转染试剂包括PEIpro、PEI MAX或VirusGen;(2)转染试剂与病毒载体之比为(1~5):1,病毒载体的用量为0.5μg/cm2~2μg/cm2;(3)病毒载体为AAV转移质粒或LV转移质粒。进一步地,病毒载体携带有报告基因。可选地,报告基因为EGFP。可以理解的是,在其他实施例中,报告基因不限于EGFP,还可以是其他基因。可以理解的是,在其他实施例中,病毒载体并不限于AAV或LV,还可以是其他载体,例如ADV、OV等。
在一些实施例中,采用扩增倍数评估生长速率。可以理解的是,在其他实施例中,评估生长速率的方式不限于上述,还可以是其他方式。可以理解的是,在通过生长速率和病毒载体转染效率筛选待扩大培养的细胞克隆时,是筛选出生长速率较快且转染效率较好的细胞克隆。
步骤S30:将15组~25组待扩大培养的细胞克隆分别扩大培养,在扩大培养过程中,以生长速率和病毒载体转染效率筛选,获得5组~13组优选克隆细胞。
具体地,扩大培养的培养基包含VP-SFM培养基和Pro293培养基中的一种、体积百分含量为0%~2%的胎牛血清和2mM~8mM的GlutaMaxTM补充剂。在一些实施例中,扩大培养的培养基由VP-SFM培养基和Pro293培养基中的一种、体积百分含量为0%~2%的胎牛血清和2mM~8mM的GlutaMaxTM补充剂的组成。可选地,在扩大培养的培养基中,胎牛血清的体积百分含量为0%、0.5%、1.0%或2.0%;在扩大培养的培养基中,GlutaMaxTM补充剂的浓度为2.0mM、4mM、6mM或8mM。进一步地,扩大培养的培养基由VP-SFM培养基和Pro293培养基中的一种、体积百分含量为0.5%~1.5%的胎牛血清和3mM~5mM的GlutaMaxTM补充剂的组成。在一个可选地具体示例中,扩大培养的培养基由VP-SFM培养基、体积百分含量为1%的胎牛血清和4mM的GlutaMaxTM补充剂的组成。
在一些实施例中,步骤S30中的生长速率和病毒载体转染效率的评估方式如上文步骤S20所述。
进一步地,将筛选转染效率为75%以上以及细胞生长速度排名前25的细胞作为待悬浮驯化细胞。在一些实施例中,将筛选转染效率为77.02%~93.38%以及细胞生长速度排名前25的细胞作为待悬浮驯化细胞。进一步地,将转染效率80%以上的细胞作为待悬浮驯化细胞。
在一些实施例中,将转染效率由高到底进行排序,筛选出转染效率的前15组~25组细胞作为待悬浮驯化细胞。在一个可选地具体示例中,筛选出转染效率的前15组、前18组、前20组、前22组或前25组细胞作为待悬浮驯化细胞。
在一些实施例中,采用六孔板、T25瓶、T75瓶、T175瓶、T225瓶依次扩大培养。
步骤S40:将各组优选克隆细胞作为待悬浮驯化细胞分别进行悬浮驯化。
具体地,悬浮驯化采用无血清完全培养基进行培养。
在一些实施例中,悬浮驯化采用的无血清完全培养基包含:SFM4 HEK293、SFM4Transfx293、HEK293 MaxX、OPM 293 CD05、OptiVitro 293、HEK293-04 Prototype、HEK293-13 Prototype、HEK Vip NX、HEK Vip NB、HEK TF和HEK GM中的一种和2mM~8mM的GlutaMaxTM补充剂。进一步地,悬浮驯化采用的无血清完全培养基还包含体积百分含量为0.05%~1%的抗细胞结团剂。进一步地,悬浮驯化采用的无血清完全培养基由SFM4HEK293、SFM4 Transfx293、HEK293 MaxX、OPM 293 CD05、OptiVitro 293、HEK293-04Prototype、HEK293-13 Prototype、HEK Vip NX、HEK Vip NB、HEK TF和HEK GM中的一种,2mM~8mM的GlutaMaxTM补充剂,体积百分含量为0.05%~1%的抗细胞结团剂组成。
在其中一个实施例中,悬浮驯化采用的无血清完全培养基包含SFM4 HEK293、2mM~8mM的GlutaMaxTM补充剂和体积百分含量为0.05%~1%的抗细胞结团剂。在一些实施例中,无血清完全培养基由SFM4 HEK293、2mM~8mM的GlutaMaxTM补充剂和体积百分含量为0.05%~1%的抗细胞结团剂组成。可选地,无血清完全培养基中GlutaMaxTM补充剂的浓度为2mM、4mM、6mM、8mM;无血清完全培养基中的抗细胞结团剂的体积百分含量为0.05%、0.1%、0.2%0.5%或1%。进一步地,无血清完全培养基由SFM4 HEK293、3.5mM~4.5mM的GlutaMaxTM补充剂和体积百分含量为0.1%~0.5%的抗细胞结团剂组成。在一个可选地具体示例中,无血清完全培养基由SFM4 HEK293、4mM的GlutaMaxTM补充剂和体积百分含量为0.1%的抗细胞结团剂组成。
在其中一个实施例中,悬浮驯化采用的无血清完全培养基包含OPM 293CD05、2mM~8mM的GlutaMaxTM补充剂和体积百分含量为0.05%~1%的抗细胞结团剂。可以理解的是,在一些实施例中,悬浮驯化采用的无血清完全培养基中的抗细胞结团剂可以省略。
在一些实施例中,悬浮驯化的步骤包括:将各组优选克隆细胞的细胞密度调整为0.8×106个/mL~1×106个/mL后,各组优选克隆细胞分别振荡培养,其中,振荡培养的振幅为25mm~50mm、转速为100rpm~150rpm;及在细胞密度低于1×106个/mL或细胞活率低于85%时,更换新鲜的(或称未使用过的)无血清完全培养基。进一步地,在悬浮驯化过程中,细胞密度为0.5×106个/mL~6×106个/mL。各组均取20mL~30mL于125mL摇瓶中进行振荡培养。
在一些实施例中,在悬浮驯化之前,还包括从5组~13组优选克隆细胞中以生长速率和病毒载体转染效率筛选出3组~6组作为待悬浮驯化细胞。如此设置,减少悬浮驯化量。此时,悬浮驯化时,则将再次筛选而获得的3组~6组作为待悬浮驯化细胞。当然,生长速率和病毒载体转染效率参照上文。
在一些实施例中,在悬浮驯化之前,还包括将待悬浮驯化细胞扩大培养的步骤。可选地,采用六孔板、T25瓶、T75瓶、T175瓶、T225瓶依次扩大培养。
步骤S50:将经悬浮驯化的各组细胞分别取各自的一部分细胞后,以病毒载体转染效率筛选,制备适宜于病毒载体生产用的HEK293悬浮细胞系。
在一些实施例中,在细胞活率在90%以上时进行转染。例如,在细胞活率在90%、95%或98%时进行转染。进一步地,在细胞活率在95%以上时进行转染。
在一些实施例中,在步骤S50的以病毒载体转染效率筛选的步骤中,至少满足以下条件中的一个:
(1)转染试剂包括PEIpro、PEI MAX或VirusGEN;
(2)转染试剂与病毒载体之比为(1~5):1,病毒载体的用量为1μg/mL~4μg/mL;
(3)转染时的密度为2×106个/mL~4×106个/mL。
在其中一个实施例中,转染试剂为PEIpro,转染试剂与AAV转移质粒之比为(2):1,AAV转移质粒的用量为1~2μg/mL,转染时的细胞密度为2×106个/mL~4×106个/mL。进一步地,转染试剂为PEIpro,转染试剂与AAV转移质粒之比为2:1,AAV转移质粒的用量为1~2μg/mL,转染时的细胞密度为2×106个/mL~4×106个/mL。
在一些实施例中,步骤S50中的病毒载体携带有报告基因。报告基因如上述,此处不再赘述。
在一些实施例中,筛选转染效率为85%以上的细胞作为适宜于悬浮培养的HEK293细胞。进一步地,筛选转染效率为90%以上的细胞作为适宜于悬浮培养的HEK293细胞。
上述用于病毒载体生产的HEK293悬浮细胞系的开发方法至少包括以下优点:
(1)采用贴壁克隆筛选以转染效率和细胞生长速度进行评估以及悬浮克隆进一步以转染效率和生长速度进行评估,获得了可以高密度生长、高转染效率的克隆细胞,从而为高滴度病毒载体(AAV、LV、OV、ADV)的生产奠定坚实基础。
(2)本申请采用快速悬浮驯化的策略,可以在3~5周获得完成贴壁细胞悬浮驯化,相对于传统的HEK293细胞2~4个月的悬浮驯化,大大缩短悬浮驯化周期。
(3)本申请克隆筛选的用于病毒载体生产的HEK293悬浮细胞系,可在国产无血清培养基高密度生长,且可以使用生物反应器线性放大生产,因而可实现生物医药(包括AAV病毒载体、LV病毒载体、溶瘤病毒、腺病毒载体及基于腺病毒载体的疫苗、外泌体)的规模化生产。
(4)本申请提供的用于病毒载体生产的悬浮HEK293细胞系的开发方法具有成本低廉的特点,不需要额外的复杂的大型克隆筛选设备(如ClonePix、Nanocell)或复杂的克隆筛选技术(如AI)等就可以获得高密度、高转染效率的克隆细胞。
(5)本申请开发的HEK293悬浮细胞系可使用国产无动物源成分、无蛋白成分的化学成分限定的培养基进行高密度生长,不仅确保了生物医药生产的安全性(相对于含人源蛋白或血清的培养基),也大大降低的生物医药的制造成本(通常为进口培养基的1/3),也大大缩短了生物物料的采购周期(本土化生产)。
(6)HEK293为人胚肾亚三倍体细胞,是一种染色体异质性很强的细胞。HEK293原始细胞生长缓慢,细胞转染效率不高,从而导致病毒载体滴度的单位产率较低,然而上述方法在克隆筛选后还进行了病毒载体转染效率评估,并对培养基和转染条件进行了优化,从而使得克隆筛选和悬浮驯化的HEK293悬浮细胞系能以高密度高转染效率生产病毒载体,从而大大增加病毒产量。
(7)上述方法操作简便,利于工业化生产。
此外,本申请一实施方式还提供了一种HEK293细胞的悬浮培养方法,该方法包括以下步骤:将上述任一实施例的用于病毒载体生产的HEK293悬浮细胞系的开发方法获得的HEK293悬浮细胞系采用无血清完全培养基进行悬浮培养。
在一些实施例中,悬浮培养所用的无血清完全培养基包含:SFM4HEK293、SFM4Transfx293、HEK293 MaxX、OPM 293 CD05、OptiVitro 293、HEK293-04 Prototype、HEK293-13 Prototype、HEK Vip NX、HEK Vip NB、HEK TF和HEK GM中的一种,3mM~5mM的GlutaMaxTM补充剂,和体积百分含量为0.1%~1%的抗细胞结团剂。
上述HEK293细胞的悬浮培养方法获得的HEK293细胞的病毒载体的产率高。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明,则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明,均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规条件,例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
一、贴壁克隆筛选
1、使用VP-SFM培养基(Thermo)并添加1%的FBS(Thermo)和4mM的GlutaMax(Thermo)复苏冻存的HEK293细胞(ATCC:CRL1573)。
2、连续传代3次以上后使用细胞有限稀释法以1个/孔铺96孔细胞培养板,共铺板1920个孔,细胞培养基为VP-SFM+10%FBS+4mM GlutaMax,于37℃、5%CO2培养箱进行贴壁培养。培养7天按一半培养基体积进行换液,并进行观察,96孔细胞培养板共长出克隆数204个,对单克隆集落的孔进行编号标记,后续每3天进行换液。
3、通过对步骤2获得的204个克隆的转染效率和细胞生长速率(按照扩增倍数,具体步骤可参见下文步骤4)评估,共筛选出22个克隆。在此步骤中,采用携带EGFP的AAV转移质粒使用PEIpro进行转染,具体步骤包括:以5×104个细胞/cm2进行接种,24h后进行转染,质粒为pAAV-EGFP,用量为0.5μg/cm2,转染试剂为PEIpro(Polyplus),转染试剂/质粒用量比为2:1,转染48h后使用流式细胞检测仪(CytoFlex S,Beckman)进行转染效率检测。
4、将步骤3获得的22个克隆逐步按六孔板、T25瓶、T75瓶、T175瓶、T225瓶依次扩大培养,通过转染效率和细胞生长速率评估共筛选11个克隆细胞(冻存),并最终将其中排名前5的进行下一步的悬浮驯化。其中,转染效率和细胞生长速率评估的操作包括:
细胞生长速率(扩增倍数)评估的操作方法:以5×104个细胞/cm2接种六孔板或T25、T75,当细胞汇合度达80%或培养72h后使用胰酶消化细胞,使用CountStar Rigel S2细胞计数仪进行细胞计数,通过总细胞数除以接种细胞总数获得扩增倍数。
转染效率的操作方法:96孔板培养的贴壁细胞,将汇合度达80%左右的孔使用胰酶消化,分别使用48孔板、24孔板、6孔板、T25瓶、T75瓶进行扩增,以5×104个细胞/cm2进行接种,24h后进行转染,质粒为pAAV-EGFP,用量为0.5μg/cm2,转染试剂为PEIpro(Polyplus),转染试剂/质粒用量比为2:1,转染48h后使用流式细胞检测仪(CytoFelx S,Beckman)进行转染效率检测。
转染效率和细胞生长速率评估的部分结果如图1~图5、表1和表2所示。
表1贴壁细胞克隆筛选转染效率排名(pAAV-EGFP)
克隆编号 | 排名 | 转染效率 |
03G11 | 1 | 95.56% |
06D08 | 3 | 91.21% |
19C03 | 2 | 89.50% |
01F10 | 4 | 88.52% |
12D06 | 5 | 85.42% |
表2贴壁细胞生长排名(扩增倍数)
克隆编号 | 扩增倍数 | 排名 |
06D08 | 3.31 | 1 |
12D06 | 3.09 | 2 |
19C03 | 2.89 | 3 |
01F10 | 1.86 | 4 |
03G11 | 1.69 | 5 |
二、悬浮驯化
对贴壁培养筛选出的5个高转染效率克隆进行悬浮驯化:悬浮驯化前使用完全培养基VP-SFM+1%FBS+4mM GlutaMax以T75、T175、T225进行扩大培养,在使用悬浮无血清驯化培养前一代扩增使用VP-SFM+4mM GlutaMax进行扩增培养。收集贴壁扩增的细胞,使用SFM4 HEK293(Cytiva)+4mM GlutaMax+0.1%(v/v)Anti-clumping agent(Thermo)无血清培养基调整细胞密度8×105个细胞/mL,接种125mL细胞培养摇瓶,接种体积为20mL。然后使用细胞培养摇床进行振荡培养,转速为125rpm(25mm),温度37℃,CO2浓度设置为8%,后续每3~4天取样进行活细胞计数(ViCell XR,Beckman)并离心换液。如此反复操作直到细胞活率维持90~95%以上,细胞为单个细胞悬液,且细胞培养3~4天后细胞密度可达2×106个细胞/mL以上时按250mL细胞培养摇瓶、500mL细胞培养摇瓶、1000mL细胞培养摇瓶进行扩大培养和冻存。
三、悬浮驯化的克隆细胞筛选
由于使用SFM4 HEK293(Cytiva)+4mM GlutaMax+0.1%Anti-clumping agent(Thermo)培养基虽然可以完成贴壁细胞克隆悬浮驯化,但由于细胞生长密度不高,且考虑到供应链的问题,后续细胞培养更换为国产培养基进行实验(步骤一最终筛选得到的克隆细胞总共进行了11种培养基测试:SFM4 HEK293、SFM4 Transfx293、HEK293 MaxX、OPM 293CD05、OptiVitro 293、HEK293-04 Prototype、HEK293-13 Prototype、HEK Vip NX、HEK VipNB、HEK TF、HEK GM)。
复苏冻存的5个悬浮克隆细胞(步骤一最终筛选得到),分别使用培养基OPM 293CD05(上海奥浦迈生物)、HEK293 MaxX(上海迈邦生物)进行培养,均补加4mM GlutaMax(Thermo)。由于去掉了抗结团剂Anti-clumping agent,细胞培养过程中有细胞会产生结团,细胞培养4天后将摇瓶中的细胞转至50mL离心管,按40mL每管进行分装,室温静置10min后使用无菌移液管从液面往下取一半细胞悬液到新的离心管中,轻轻混匀后取0.6mL细胞悬液使用细胞计数仪进行活细胞计数(ViCell XR,Beckman),根据活细胞密度使用完全培养基调整细胞接种密度为8~10×105个细胞/mL,如此反复进行细胞处理和扩增培养直至细胞活率维持92~95%以上,活细胞密度大于3×106个细胞/mL,且细胞无明显结团。其中,悬浮振荡培养条件:转速为140rpm(25mm),温度37℃,CO2浓度设置为8%,后续悬浮振荡条件设置均按此操作。
1、转染效率评估
分别使用OPM 293 CD05和HEK293 MaxX两种培养基以8×105个细胞/mL接种,振荡培养3天后使用完全培养基将细胞密稀释为3×106个细胞/mL,24h后分别使用AAV转移质粒(pAAV-EGFP)和LV转移质粒(LV-EGFP)进行转染,转染48h后使用流式细胞检测仪(CytoFelxS,Beckman)进行转染效率检测,结果如图6~图8及表3所示。在表3中,CD05指培养基OPMHEK293 CD05,MaxX指培养基HEK293 MaxX;LV-EGFP和pAAV-EGFP转染条件:细胞转染密度4×106个细胞/mL,质粒用量2μg/mL,PEIpro用量4μL/mL,VirusGEN用量6μl/mL;NA是由于确定最终使用19C03用于未来的病毒载体生产,其它克隆细胞未进一步考察。
表3 5个悬浮细胞克隆、2种培养基、2种转染试剂测试转染效率汇总
2、细胞生长曲线评估
分别使用OPM 293 CD05和HEK293 MaxX两种培养基以8×105个细胞/mL接种250mL细胞(克隆编号:19C03)培养摇瓶,接种体积60mL,然后分别不同时间点取样进行活细胞计数,并绘制细胞生长曲线,结果如图9所示。
实施例2
对复苏冻存的HEK293细胞采用携带EGFP的AAV转移质粒使用PEIpro进行转染,具体步骤包括:以5×104个细胞/cm2进行接种,24h后进行转染,质粒为pAAV-EGFP,用量为0.5μg/cm2,转染试剂为PEIpro(Polyplus),转染试剂/质粒用量比为2:1,转染48h后使用流式细胞检测仪(CytoFelx S,Beckman)进行转染效率检测,结果如图10所示。
由图10可知,没有经过克隆筛选和悬浮驯化后的HEK293细胞的转染效率只有45.81%。因此,与没有经过克隆筛选和悬浮驯化后的HEK293细胞相比,经过克隆筛选和悬浮驯化后的HEK293细胞的转染效率大大提高。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式,便于具体和详细地理解本申请的技术方案,但并不能因此而理解为对申请专利保护范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本申请的保护范围。应当理解的是,在本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上,通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案,均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此,本申请专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准,说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.用于病毒载体生产的HEK293悬浮细胞系的开发方法,其特征在于,包括以下步骤:
将HEK293贴壁细胞以有限稀释法进行克隆筛选,获得180个~250个细胞克隆;其中,所述克隆筛选的培养基包含VP-SFM培养基和Pro293培养基中的一种、体积百分含量为2%~10%的胎牛血清和2mM~8mM的GlutaMaxTM补充剂;
评估所述克隆筛选获得的细胞克隆的生长速率和病毒载体转染效率,筛选出15组~25组待扩大培养的细胞克隆;
将各组所述待扩大培养的细胞克隆分别扩大培养,其中,所述扩大培养的培养基包含VP-SFM培养基和Pro293培养基中的一种、体积百分含量为0%~2%的胎牛血清和2mM~8mM的GlutaMaxTM补充剂;在扩大培养过程中,以生长速率和病毒载体转染效率筛选,获得5组~13组优选克隆细胞;
将各组所述优选克隆细胞作为待悬浮驯化细胞分别进行悬浮驯化,其中所述悬浮驯化采用无血清完全培养基进行培养,所述无血清完全培养基包含SFM4 HEK293、SFM4Transfx293、HEK293 MaxX、OPM 293 CD05、OptiVitro 293、HEK293-04 Prototype、HEK293-13 Prototype、HEK Vip NX、HEK Vip NB、HEK TF和HEK GM中的一种和2mM~8mM的GlutaMaxTM补充剂;及
将经悬浮驯化的各组细胞分别取各自的一部分细胞,以病毒载体转染效率筛选,制备适宜于病毒载体生产用的HEK293悬浮细胞系。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在悬浮驯化之前,还包括从5组~13组优选克隆细胞中以生长速率和病毒载体转染效率筛选出3组~6组作为待悬浮驯化细胞。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述克隆筛选的步骤包括:
将HEK293贴壁细胞以1个/孔的密度铺板进行初步培养,所述初步培养的孔数为900孔~2000孔;及
筛选出生长良好的180个~250个细胞克隆。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述初步培养的步骤包括:
在将HEK293贴壁细胞贴壁培养6天~8天后,以一半体积的新鲜培养基进行换液,后续每3天~4天进行一次换液。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在评估病毒载体转染效率的步骤中,至少满足以下条件中的一个:
(1)转染试剂包括PEIpro、PEI MAX或VirusGen;
(2)转染试剂与病毒载体之比为(1~5):1,病毒载体的用量为0.5μg/cm2~2μg/cm2;
(3)病毒载体为AAV转移质粒或LV转移质粒。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述悬浮驯化的步骤包括:
将各组所述优选克隆细胞的密度调整为0.8×106个/mL~1×106个/mL后,振荡培养,所述振荡培养的振幅为20mm~50mm、转速为95rpm~150rpm;及
在细胞密度低于1×106个/mL或细胞活率低于85%时,更换新鲜的所述无血清完全培养基。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,在所述悬浮驯化过程中,细胞密度为0.5×106个/mL~6×106个/mL。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在所述将经悬浮驯化筛选出的各组细胞分别取各自的一部分细胞以病毒载体转染效率筛选的步骤中,至少满足以下条件中的一个:
(1)转染试剂包括PEIpro、PEI MAX或VirusGen;
(2)转染试剂与病毒载体之比为(1~5):1,病毒载体的用量为1μg/mL~4μg/mL;
(3)转染时的细胞密度为2×106个/mL~4×106个/mL。
9.根据权利要求1~8中任一项所述的方法,其特征在于,在以病毒载体转染效率进行筛选的步骤中,转染所用的病毒载体上携带有报告基因,所述报告基因为EGFP。
10.一种悬浮HEK293细胞的培养方法,其特征在于,包括以下步骤:
将权利要求1~9任一项所述用于病毒载体生产的HEK293悬浮细胞系的开发方法获得的HEK293悬浮细胞系采用无血清完全培养基进行悬浮培养,所述无血清完全培养基包含:SFM4HEK293、SFM4 Transfx293、HEK293 MaxX、OPM 293 CD05、OptiVitro 293、HEK293-04Prototype、HEK293-13 Prototype、HEK Vip NX、HEK Vip NB、HEK TF和HEK GM中的一种和3mM~5mM的GlutaMaxTM补充剂。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211213168.1A CN115505559A (zh) | 2022-09-30 | 2022-09-30 | 用于病毒载体生产的hek293悬浮细胞系的开发方法 |
PCT/CN2022/127878 WO2023072178A1 (en) | 2021-10-27 | 2022-10-27 | Methods for developing a cell line for producing virus in suspension cell culture |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211213168.1A CN115505559A (zh) | 2022-09-30 | 2022-09-30 | 用于病毒载体生产的hek293悬浮细胞系的开发方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115505559A true CN115505559A (zh) | 2022-12-23 |
Family
ID=84508988
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211213168.1A Pending CN115505559A (zh) | 2021-10-27 | 2022-09-30 | 用于病毒载体生产的hek293悬浮细胞系的开发方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115505559A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023072178A1 (en) * | 2021-10-27 | 2023-05-04 | Porton Advanced Solutions Ltd. | Methods for developing a cell line for producing virus in suspension cell culture |
CN116970547A (zh) * | 2023-02-24 | 2023-10-31 | 广州恩宝生物医药科技有限公司 | 一种驯化无血清全悬浮hek293细胞的方法及其应用 |
CN117089514A (zh) * | 2023-10-13 | 2023-11-21 | 思鹏生物科技(苏州)有限公司 | 提升hek293细胞系aav生产效率的细胞筛选驯化方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109280636A (zh) * | 2017-07-21 | 2019-01-29 | 上海恒润达生生物科技有限公司 | 一种悬浮驯化293t细胞的方法 |
CN110713971A (zh) * | 2019-11-06 | 2020-01-21 | 深圳市菲鹏生物治疗股份有限公司 | 一种无血清悬浮培养型293t细胞、其制备方法以及病毒的包装方法 |
CN113717927A (zh) * | 2021-08-31 | 2021-11-30 | 宜明(北京)细胞生物科技有限公司 | 一种hek-293细胞无血清和悬浮培养的制备方法及其应用 |
CN113981007A (zh) * | 2021-10-27 | 2022-01-28 | 苏州博腾生物制药有限公司 | 基于hek293t克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法 |
CN114395522A (zh) * | 2021-12-23 | 2022-04-26 | 宜明(苏州)细胞生物科技有限公司 | 一种hek293t细胞悬浮和无血清培养的快速驯化方法及其应用 |
-
2022
- 2022-09-30 CN CN202211213168.1A patent/CN115505559A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109280636A (zh) * | 2017-07-21 | 2019-01-29 | 上海恒润达生生物科技有限公司 | 一种悬浮驯化293t细胞的方法 |
CN110713971A (zh) * | 2019-11-06 | 2020-01-21 | 深圳市菲鹏生物治疗股份有限公司 | 一种无血清悬浮培养型293t细胞、其制备方法以及病毒的包装方法 |
CN113717927A (zh) * | 2021-08-31 | 2021-11-30 | 宜明(北京)细胞生物科技有限公司 | 一种hek-293细胞无血清和悬浮培养的制备方法及其应用 |
CN113981007A (zh) * | 2021-10-27 | 2022-01-28 | 苏州博腾生物制药有限公司 | 基于hek293t克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法 |
CN114395522A (zh) * | 2021-12-23 | 2022-04-26 | 宜明(苏州)细胞生物科技有限公司 | 一种hek293t细胞悬浮和无血清培养的快速驯化方法及其应用 |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023072178A1 (en) * | 2021-10-27 | 2023-05-04 | Porton Advanced Solutions Ltd. | Methods for developing a cell line for producing virus in suspension cell culture |
CN116970547A (zh) * | 2023-02-24 | 2023-10-31 | 广州恩宝生物医药科技有限公司 | 一种驯化无血清全悬浮hek293细胞的方法及其应用 |
CN116970547B (zh) * | 2023-02-24 | 2024-04-09 | 广州恩宝生物医药科技有限公司 | 一种驯化无血清全悬浮hek293细胞的方法及其应用 |
CN117089514A (zh) * | 2023-10-13 | 2023-11-21 | 思鹏生物科技(苏州)有限公司 | 提升hek293细胞系aav生产效率的细胞筛选驯化方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN115505559A (zh) | 用于病毒载体生产的hek293悬浮细胞系的开发方法 | |
CN110272864B (zh) | 一种适应无血清悬浮培养的Vero33细胞株及其驯化方法和应用 | |
CN107190024A (zh) | 一种稳定表达ns1蛋白细胞株的构建方法 | |
CN102321587B (zh) | 肺癌药物筛选细胞株的建立 | |
CN108342362A (zh) | 一种用于扩增重组犬腺病毒cav2的稳定细胞系mdck及其构建方法 | |
CN113604425B (zh) | 一种适应无血清培养基环境的wayne293 lvpro细胞及其应用 | |
CN111154713B (zh) | 人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株及其应用 | |
CN106867967A (zh) | Midkine稳定低表达的LM3细胞系及其构建方法 | |
CN108179137B (zh) | 一种血清8型的重组腺相关病毒的制备方法 | |
CN112029803A (zh) | 一种慢病毒过表达病毒载体及其制备方法、用途 | |
CN115960177A (zh) | 腺相关病毒突变体及其应用 | |
Huang et al. | Combination of baculovirus-mediated gene delivery and packed-bed reactor for scalable production of adeno-associated virus | |
CN116694575B (zh) | 悬浮培养Marc145细胞的方法 | |
WO2023072178A1 (en) | Methods for developing a cell line for producing virus in suspension cell culture | |
JP2022539210A (ja) | マルチパラレルバイオリアクター中で接着性細胞を培養するための方法 | |
CN110699326A (zh) | 一种永生化人肝星状细胞株及其制备方法 | |
CN116515728A (zh) | 无弹状病毒的Sf9-PT细胞及其应用 | |
CN112680529B (zh) | 一种生物型人工肝治疗所需的c3a细胞的质量控制方法及其应用 | |
WO2007040242A1 (ja) | 単離されたヒト細胞、その取得方法及び用途 | |
CN107964535A (zh) | 一种cho单克隆细胞株的筛选方法和应用 | |
CN114525238A (zh) | 一株牛皮肤成纤维永生化细胞系的建立方法及应用 | |
CN107663523A (zh) | 一种优化的鸡α干扰素基因真核表达重组质粒及其制备方法与应用 | |
CN114250193A (zh) | 一种人胚胎肾细胞系及其应用 | |
CN108103027B (zh) | 高效率血细胞重编程同时实现基因编辑的方法 | |
CN112522204A (zh) | 一种重组marc-145细胞及其构建方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |