CN114395522A - 一种hek293t细胞悬浮和无血清培养的快速驯化方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种HEK293T细胞的驯化方法及其应用,包括一种HEK293T细胞的悬浮和无血清培养的驯化方法、所述驯化方法获得的细胞系以及所述细胞系的应用。所述驯化方法传代次数少,驯化效率高,获得的细胞活率高,分散性好,生长状态稳定,可满足商业化、规模化生产的需求。
Description
技术领域
本发明涉及一种HEK293T细胞的驯化方法及其应用,具体涉及一种HEK293T细胞的悬浮和无血清培养的快速驯化方法、以及所述驯化方法获得的细胞系及其应用,属于生物技术领域。
背景技术
随着科学技术的发展,越来越多的基因治疗/细胞治疗技术从实验室走向临床,从学术走向商业化生产,2017年两款CAR-T药物Kymriah和Yescarta被FDA批准上市,分别用于治疗治疗复发性或难治性儿童、青少年B-细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)以及在接受至少两种其它治疗方案后无响应或复发性的成人大B细胞淋巴瘤患者及特定类型非霍奇金淋巴瘤患者。然而两款药物价格昂贵,分别为47.5万美元、37.3万美元。即使引入国内以后治疗费用也是居高不下,2020年2月14日,复星凯特提交的益基利仑赛注射液上市申请获得国家药监局受理,该药物复星凯特从Kite Pharma引进的Yescarta,定价为120万人民币,普通人仍然难以负担。同年国家药品监督管理局(NMPA)批准了药明巨诺靶向CD19的CAR-T产品瑞基奥仑赛注射液(relma-cel,商品名:倍诺达)的新药上市申请(NDA),定价未知。
可见基因治疗/细胞治疗价格昂贵,想要惠及更多的人群,提高工艺水平、降低费用是关键。对于目前的基因/细胞治疗来说,病毒通常是首选的载体之一。目前病毒载体放大生产经历了四个发展阶段:从最开始实验室小规模生产常用的滚瓶培养-细胞工厂-固定床反应器培养-悬浮培养技术,每一个新的培养方式都明显放大了病毒载体培养规模。目前固定床反应最大面积达到500m2,悬浮培养较为常规的体积达到2000L。悬浮培养技术也因为更高的流程优化潜力而更受药企关注。
HEK293细胞系作为常用的病毒生产载体具有如下特点:
1)转染效率高;
2)可悬浮培养;
3)表达蛋白结构最接近其在人体构象;
4)HEK293细胞在培养体系中能够快速增长,高密度培养;
5)HEK293细胞与神经元细胞一样。对外界环境较为敏感,利用这一点可用于药物发现及细胞毒性测试。
HEK293T细胞系是在HEK239细胞中转入SV40T-antigen基因形成的高转衍生株。除了具有上述功能外,还可使包含SV40ori的质粒能够在该细胞系中显著扩增,从而促进表达载体的扩增,促进蛋白的表达。HEK293T细胞除了可用于各类基因表达以及蛋白生产,还常用于高滴度逆转录病毒及其他病毒生产。
HEK293T细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞,目前的主要工艺是在细胞培养过程添加血清,细胞就血清中的贴壁因子而贴壁生长的,但是众所周知,使用血清带来各种弊端,如:价格昂贵,潜在的致病因子风险,难以规模化生产,生产工艺不可控等问题。
然而,经过无血清驯化后的细胞,会从贴壁生长转到悬浮生长,但是大多数经过悬浮驯化的细胞在悬浮培养过程中仍然会聚团,不利于质粒的转染进而影响病毒的产量。因此高效驯化无血清全悬浮培养型细胞株是解决上述问题的关键。
发明内容
针对以上技术问题,本发明提供以下技术方案:
本发明的第一方面,提供一种HEK293T细胞的悬浮和无血清培养的驯化方法,所述驯化方法主要步骤为(1):HEK293T细胞在血清浓度递减的培养液中多次处理,步骤(2):在低浓度血清培养基中培养,获得HEK293TY细胞系。
优选的,所述多次处理步骤不超过3次,更优选为2次。
优选的,所述步骤(1)中,血清的起始浓度为8-12%(体积)。
优选的,所述血清浓度递减的数值为3-5%(体积)。每次递减的数值可以是3-5%(体积)中的任一数值,例如3%,3.25%,3.5%,3.75%,4%,4.25%,4.5%,4.75%,5%等等。每次递减的数值可以相同或者不同。例如第一血清浓度为10%(体积),第二血清浓度为5%(体积),或者,又例如第一血清浓度为12%(体积),第二血清浓度为7%(体积),第三血清浓度为3.5%(体积)。又例如,第一血清浓度为8%(体积),第二血清浓度为4%(体积)。
优选的,所述步骤(1)中的末次处理血清浓度不低于1%(体积)。
优选的,所述步骤(2)中低浓度血清中是指血清浓度小于1%(体积),可以是小于1%的任意数值,例如,0.75%,0.5%,0.25%,0.15%,0.1%等等。
优选的,所述驯化方法的步骤(2)还包括对贴壁细胞洗脱吹散的步骤。
优选的,所述驯化方法还包括步骤(3):对步骤(2)获得的HEK293TY细胞系在无血清培养基中扩大培养。
更优选的,步骤(3)包括以无血清培养基中对细胞系进行重复培养。
进一步优选的,所述重复培养至少2次。更优选的,可以是3次、4次、5次,等等。
优选的,所述重复培养后获得的活细胞密度大于2.5×106个/ml。
在一个进一步的实施方案中,所述的驯化方法,包括步骤(1)、HEK293T细胞在血清浓度递减的培养液中多次处理:
a、复苏HEK293T细胞,在包含第一浓度血清的培养液中处理HEK293T细胞;所述处理包括例如混匀等;
b、离心,弃上清;
c、在包含第二浓度血清的培养液中处理步骤b所得沉淀,所述处理包括例如混匀,静置。
其中,所述第一浓度血清和第二浓度血清根据上述限定依次进行浓度递减。
优选的,所述步骤c之后,可选的,将HEK293T细胞在包括第三浓度血清的培养液中处理。
优选的,所述步骤(2)包括:
d、将步骤c获得的细胞在包含低浓度血清的培养基中培养;
e、将步骤d获得的悬浮细胞移至离心管;
f、将步骤d获得的贴壁细胞洗脱吹散后移至步骤e相同的离心管。
更优选的,步骤(2)还包括:
g、将步骤f获得的细胞,离心,弃上清,在无血清培养基中进行培养。
优选的,上述培养液或者培养基选自:DMEM培养基、VP-SFM培养基。
优选的,所述驯化方法还包括步骤(3):对步骤(2)获得的HEK293TY细胞系进行无血清培养基增殖培养,其包括:
h、将步骤g获得的HEK293TY细胞系在无血清培养基中培养,当活细胞密度大于2×106个/ml时,加入无血清培养基进行稀释,使得培养器皿中最终活细胞密度控制在1.0×106个/ml-1.2×106个/ml。
i、步骤h配置的培养器皿重新放入培养箱,进行细胞培养。
优选的,重复步骤h-i,使得培养器皿中活细胞密度大于2.5×106个/ml。
优选的,步骤(3)还包括:
j、当培养器皿中活细胞密度大于2.5×106个/ml,用无血清培养基进行稀释,使得培养器皿中最终活细胞密度控制在1.0×106个/ml-1.2×106个/ml。
优选的,还包括步骤k:重复步骤h-j,获得培养细胞。
经上述增殖培养后,培养器皿中细胞活率可大于95%,活细胞密度大于2.5×106个/ml且细胞无结团现象。
优选的,所述增殖培养基包括FreeStyle293培养基,Dynamis培养基、TransproCD01培养基。
更优选的,向所述增殖培养基内加入GlutaMAX。
优选的,还包括步骤(4):将上述获得的适应无血清培养基悬浮培养生长的细胞系低温冻存。
在具体的一个实施方式中,所述驯化方法包括:
a、取一支1ml冻存HEK293T细胞于水浴锅37℃复苏,逐滴加入10ml含有10%FBS的DMEM溶液中;
b、充分混匀步骤a中的溶液,200rpm离心10分钟,弃上清;
c、用10ml含有5%FBS的DMEM重悬混匀步骤b中所得沉淀,静置20分钟;
d、将步骤c中细胞转移至T25细胞培养瓶培养,每瓶中加入终浓度为0.75%FBS的DMEM basic培养基10ml;
e、将T25培养瓶放入37℃,5%CO2的培养箱中培养3天,
f、显微镜下观察培养瓶内细胞可同时看见悬浮与贴壁细胞,首先将T25培养瓶中的悬浮细胞转移至离心管,然后将T25培养瓶中的贴壁细胞用1ml TrypLE洗脱吹散并转移至相同离心管。
g、将步骤f中细胞200rpm离心10分钟,弃上清,并用FreeStyle293培养基重悬于125ml锥形细胞培养瓶内,使细胞密度为1×106/ml。命名该悬浮培养细胞为HEK293TY细胞。
h、步骤g驯化后的HEK293TY重悬于FreeStyle293培养基10ml于125ml锥形细胞培养瓶后,放于37℃,5%CO2的培养箱摇床中,120rpm培养3天,将细胞取样计数,当活细胞密度大于2×106个/ml时,加入FreeStyle293培养基,使得培养瓶中最终活细胞密度控制在1.0×106个/ml-1.2×106个/ml,当活细胞密度低于2×106个/ml时,加入2ml FreeStyle293培养基次日观察;
i、将步骤h新配培养瓶重新放入培养箱,按照37℃,5%CO2,120rpm条件培养;
j、重复步骤h-i,当培养瓶中溶液到达25ml,活细胞密度大于2.5×106个/ml时,取12ml转移至新的125ml培养瓶培养,并将所有培养瓶中溶液用FreeStyle293培养基稀释,使得培养瓶中最终活细胞密度控制在1.0×106个/ml-1.2×106个/ml;
k、重复步骤h-j。
更优选的,h-k步骤中向所述培养基内加入GlutaMAX。
培养瓶中细胞活率可大于95%,培养液体积达到25ml,活细胞密度大于2.5×106个/ml且细胞无结团现象。
l、以活细胞密度1×107个/ml冻存k步骤得到的适应100%FreeStyle293悬浮培养生长条件的HEK293TY细胞于-80℃医用低温冰箱中,次日转移冻存管至液氮罐中保存。
其中所述步骤a-l中百分比浓度均为体积浓度。
本发明的第二方面,提供一种上述驯化方法获得的HEK293TY细胞系,其中,所述HEK293TY细胞系可以在无血清培养基中培养,并成悬浮分散状。
优选的,所述培养的HEK293TY细胞系基本没有贴壁聚集状。
优选的,所述培养的HEK293TY细胞系蛋白表达以及病毒包装滴度高于贴壁HEK293T细胞。
本发明的第三方面,提供一种上述驯化方法获得的HEK293TY细胞系的应用。优选的,所述应用包括外源基因导入,蛋白表达,制备包装病毒,例如慢病毒以及腺相关病毒等等。
本发明的悬浮和无血清的驯化方法及其获得的细胞系的优点在于:
1)本发明的驯化方法与现有其他技术相比,在培养前对HEK293T进行血清浓度递减的处理,传代次数少,驯化效率高,获得的细胞活率高,生长状态稳定,大幅节省实验耗材。
2)本发明的方法步骤简单,将悬浮驯化和无血清驯化同步进行,对降血清程序和细胞生长条件进行了整体优化,一周左右时间驯化HEK293TY在100%无血清培养基中可正常传代,另一周左右时间驯化HEK293TY适应100%无血清培养,活细胞密度可大于2.5×106个/ml,并达到可冻存标准。最终获得的细胞株生长状态稳定,分散性好,完全适应在无血清且化学成分确定的培养基中进行悬浮培养,与商品化的悬浮细胞相比,在病毒产量上更有优势,可以拥有更高的转染效率,为未来工业化的实现提供保障。
3)经过驯化获得的细胞系,与驯化前的细胞系相比,在功能方面没有减弱,但在形态学方面有比较大的改变。驯化后的细胞由原来的贴壁聚集生长变为悬浮分散生长,细胞形态由原来贴壁的片状变成光滑的圆形。通过驯化获得了新的生长特性的细胞系,让该细胞有了工业放大的可能。
4)本发明中的HEK293TY细胞为适应悬浮无血清培养的HEK293TY细胞系,分散性好,生长状态稳定性高,由于细胞悬浮生长,因此不会受到空间的限制,可以在大型的发酵罐中培养,可满足商业化、规模化生产的需求。
5)本发明制备的细胞系可以无血清悬浮培养,减少了外源杂质的引入,便于下游纯化及检测,减少了质检项目,大大降低了质检的成本。
附图说明
图1为悬浮驯化后的HEK293TY细胞在显微镜下的形态观察结果。
图2为传统方法用10%FBS培养的细胞在显微镜下的形态观察结果。
图3为HEK293TY细胞增殖培养后的细胞在显微镜下的形态观察结果。
图4为未经驯化的细胞在无血清培养基增殖培养后的细胞在显微镜下的形态观察结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
在下述每一实施例中,主要的材料是从以下所指出的几家公司获得:
1.实验材料
1.1实验细胞:本实验中的HEK293T购自ATCC(CRL-3216)。
1.2实验试剂:DMEM培养基购自Thermo Fisher Scientific,Freestyle293培养基购自Thermo Fisher Scientific,胎牛血清购自Biological Industries
实施例1:HEK293TY细胞系制备方法
一、方法步骤:
a、取一支1ml冻存HEK293T细胞于水浴锅37℃复苏,逐滴加入10ml含有10%FBS的DMEM溶液中;
b、充分混匀步骤a中的溶液,200rpm离心10分钟,弃上清;
c、用10ml含有5%FBS的DMEM重悬混匀步骤b中所得沉淀,静置20分钟;
d、将步骤c中细胞转移至T25细胞培养瓶培养,每瓶中加入终浓度为0.75%FBS的DMEM basic培养基10ml;
e、将T25培养瓶放入37℃,5%CO2的培养箱中培养3天,至显微镜下观察同时可见悬浮与贴壁细胞,将T25培养瓶中的悬浮细胞转移至离心管;
f、将T25培养瓶中的贴壁细胞用1ml TrypLE洗脱吹散并转移至相同离心管。
g、将步骤f中细胞200rpm离心10分钟,弃上清,并用FreeStyle293培养基重悬于125ml锥形细胞培养瓶,使细胞密度为1×106/ml。命名该悬浮培养细胞为HEK293TY细胞。
h、步骤g驯化后的HEK293TY重悬于FreeStyle293培养基10ml于125ml锥形细胞培养瓶后,放于37℃,5%CO2的培养箱摇床中,120rpm培养3天,将细胞取样计数,然后向培养瓶内加入一定量新鲜的FreeStyle293培养基稀释细胞,使得培养瓶中最终活细胞密度控制在1.0×106个/ml-1.2×106个/ml;
i、将步骤h新配培养瓶重新放入培养箱,按照37℃,5%CO2,120rpm条件培养;
j、重复步骤h-i,当培养瓶中溶液到达25ml,活细胞密度大于2.5×106个/ml时,取12ml转移至新的125ml培养瓶培养,并将所有培养瓶中溶液用FreeStyle293培养基稀释,使得培养瓶中最终活细胞密度控制在1.0×106个/ml-1.2×106个/ml;
k、重复步骤h-j,至培养瓶中细胞活率大于95%,培养液体积达到25ml,活细胞密度大于2.5×106个/ml且细胞无结团现象;
l、以活细胞密度1×107个/ml冻存k步骤得到的适应100%FreeStyle293悬浮培养生长条件的HEK293TY细胞于-80℃医用低温冰箱中,次日转移冻存管至液氮罐中保存;
h-k步骤中向所述培养基内加入GlutaMAX。
其中所述步骤a-l中百分比浓度均为体积浓度。
二、结果
经过步骤a-g驯化培养后,HEK293TY适合在无血清培养基中培养,活细胞密度可达0.5×106个/ml,细胞活率大于90%。细胞状态如图1所示,此时的细胞主要是悬浮状态的细胞,较少的贴壁细胞,贴壁细胞仅占10%。而传统方法的用10%FBS培养后,消化后活细胞密度为2.3×106/ml,细胞活率为98.7%,传统方法制备的活性HEK293T细胞以贴壁细胞为主。
经过扩大培养后,细胞活率大于95%,活细胞密度大于2.5×106个/ml,且细胞无结团现象,细胞状态见图3。而起始细胞株HEK293T未经驯化,并不适合在无血清培养基中培养,经扩大培养后,细胞活率为89.3%,活细胞密度1.08×106/ml,且细胞结团严重,细胞状态见图4。
如表1所示,上述方法重复4个批次经增殖培养后,细胞密度和活性细胞基本在很小的范围内波动。
表1:重复培养后的细胞密度和细胞活率
NO. | 活细胞密度 | 细胞活率 |
1 | 2.53×10<sup>6</sup>/ml | 96.5% |
2 | 2.65×10<sup>6</sup>/ml | 97.3% |
3 | 2.48×10<sup>6</sup>/ml | 96.9% |
4 | 2.61×10<sup>6</sup>/ml | 96.8% |
可见,本发明的方法驯化后的HEK293TY适合在无血清培养基中培养,并且细胞成悬浮分散状态,得到活率高且分散性良好的细胞。上述方法获得的细胞系性能稳定,结果可重复,操作简单。
如表2所示,加入GlutaMAX培养的细胞,活细胞密度会更高,细胞活率也会更优于不加GlutaMAX。
表2:对比(±)GlutaMAX细胞密度和细胞活率
本发明中,对降血清程序和细胞生长条件进行了整体优化,一周左右时间驯化HEK293TY在100%FreeStyle293培养基中可正常传代,另一周左右时间驯化HEK293TY适应100%FreeStyle293培养,活细胞密度大于2.5×106个/ml,并达到可冻存标准。最终获得的细胞株生长状态稳定,分散性好,完全适应在无血清且化学成分确定的培养基中进行悬浮培养,为未来工业化的实现提供保障。
实施例2:HEK293TY细胞系制备方法
根据实施例1的驯化方法,调整血清的起始浓度和递降浓度,例如起始血清浓度为12%,第二血清浓度为7%(体积),第三血清浓度为3.5%(体积)。又例如,第一血清浓度为8%(体积),第二血清浓度为4%(体积)。经过多次浓度递降后,血清浓度在末次处理步骤中大于1%(体积)。而在步骤(2)中采用0.5%或0.25%低浓度血清进行培养。
上述多种血清起始和递降方案获得的HEK293TY性能和实施例1基本相同,适合在无血清培养基中培养,并且细胞成悬浮分散状态,得到活率高且分散性良好的细胞。
实施例3:HEK293TY用于包装病毒
一、方法步骤:
1、将本发明获得的HEK293TY细胞按照0.5~0.8×106/ml接种细胞培养2天后,将细胞准备包装病毒
2、按照PEI转染的方法包装GFP病毒,转染72h收集细胞悬液,1500g离心5min,收集上清,测定病毒滴度。
3、同时以贴壁293T细胞包装GFP病毒作为参照,转染前一天,将细胞按照8×104个细胞/cm2接种细胞,转染当天,同样按照PEI的转染方式进行包装GFP病毒,72h后收集细胞上清,1500g离心5min,然后收集上清,测定病毒滴度。
4、以某商业化HEK293悬浮细胞按照步骤1、2同样的方式进行包装GFP病毒作为参照。
二、结果
表3:细胞包装病毒结果
细胞 | 病毒滴度(IU/ml) |
HEK293TY | 8.1×10<sup>9</sup> |
HEK293T | 9.3×10<sup>8</sup> |
某商业化HEK293悬浮细胞 | 4.6×10<sup>9</sup> |
上述数据显示:
1、悬浮驯化的HEK293TY细胞包装GFP病毒的滴度显著性高于贴壁HEK293T细胞;
2、悬浮驯化的HEK293TY细胞包装GFP病毒的滴度也显著性高于某商业化的HEK293悬浮细胞
上述结果表明,不同反应体系下,本发明筛选到的细胞株包装病毒的能力均优于商品化某HEK293悬浮细胞以及起始细胞株HEK293T。
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外,本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合,只要其不违背本发明的思想,其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种HEK293T细胞的悬浮和无血清培养的驯化方法,其特征在于,所述驯化方法包括步骤(1):HEK293T细胞在血清浓度递减的培养液中多次处理,步骤(2):在低浓度血清培养基中培养,获得HEK293TY细胞系。
2.如权利要求1所述的驯化方法,其特征在于,所述步骤(1)中,血清的起始浓度为8-12%(体积)。
3.如权利要求1-2任一所述的驯化方法,其特征在于,所述血清浓度递减的数值为3-5%(体积)。
4.如权利要求1-3任一所述的驯化方法,其特征在于,所述步骤(2)中低浓度血清是指血清浓度小于1%(体积)。
5.如权利要求1-4任一所述的驯化方法,其特征在于,所述步骤(2)还包括对贴壁细胞洗脱吹散的步骤。
6.如权利要求1-5任一所述的驯化方法,其特征在于,所述驯化方法还包括步骤(3):将步骤(2)获得的HEK293TY细胞系在无血清培养基中增殖培养。
7.如权利要求6所述的驯化方法,其特征在于,所述步骤(3)包括在无血清培养基中对细胞系进行重复培养。
8.如权利要求7所述的驯化方法,其特征在于,所述重复培养至少2次。
9.权利要求1-8任一所述的驯化方法获得的HEK293TY细胞系。
10.权利要求9所述的HEK293TY细胞系的应用,其特征在于,所述应用包括外源基因导入,蛋白表达,制备包装病毒。
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