CN113717927B - 一种hek-293细胞无血清和悬浮培养的制备方法及其应用 - Google Patents

一种hek-293细胞无血清和悬浮培养的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种HEK‑293细胞无血清和悬浮培养的制备方法及其应用，包括一种HEK‑293细胞的无血清和悬浮培养的制备方法、所述制备方法获得的细胞系以及所述细胞系的应用。所述制备方法传代次数少，驯化效率高，获得的细胞活率高，分散性好，生长状态稳定，可满足商业化、规模化生产的需求。

Description

一种HEK-293细胞无血清和悬浮培养的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种HEK-293细胞无血清和悬浮培养的制备方法，所述制备方法获得的细胞系及其应用。
背景技术
HEK 293细胞系，又称hek293、293细胞，是1973年产生的人胚肾293细胞。顾名思义，它们是一种典型的细胞系，起源于人体胚胎肾细胞，是一个衍生自人胚胎肾细胞的细胞系，具有转染效率高，易于培养等特点，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。
HEK 293细胞系可用于多种研究。例如，它可用于研究药物对钠通道的影响、可确定的RNA干扰系统和蛋白质中的核输出信号等。更具体地说，HEK 293细胞被用于腺病毒载体的繁殖。利用病毒进化目标基因并将其转移到细胞中是一种有效的方法。然而，由于病毒作为病原体的特性，它们也会带来风险。因此，为了繁殖这种病毒载体，需要一种能够表达缺失基因的细胞系。由于HEK293细胞含有许多腺病毒基因，因此利用它们来传播这些基因所在的腺病毒载体是非常理想的。
单层贴壁培养293细胞，一般使用一定浓度的胎牛血清(FBS)，FBS不仅价格昂贵，而且有污染外源微生物和致病因子的风险，使得质量难以控制，且产量有限，难以实现规模化生产。因此采用无血清全悬浮工艺优势明显。因此高效驯化无血清、悬浮培养型293细胞株是目前最关键的技术瓶颈之一，建立和鉴定无血清、悬浮生长并且产毒能力高的293细胞株是一项很有意义的工作。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供下述技术方案：
本发明第一方面，提供一种HEK-293细胞的无血清和悬浮培养的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)、无血清驯化；和(2)、悬浮驯化。
优选的，所述步骤(1)包括a、HEK-293细胞复苏；b、HEK-293细胞在血清浓度梯度递减的悬浮培养基中培养；c、HEK-293细胞在低浓度血清的悬浮培养基中培养，获得适合低血清浓度培养的细胞。
更优选的，所述步骤(1)b中的血清的起始浓度为8-12％(体积)，进一步优选的，所述血清浓度梯度递减的数值为2-5％(体积)。每次递减的数值可以是2-5％(体积)中的任一数值，例如2％，2.25％，2.5％，2.75％，3％，3.25％，3.5％，3.75％，4％，4.25％，4.5％，4.75％，5％等等。每次递减的数值可以相同或者不同。例如第一血清浓度为10％(体积)，第二血清浓度为5％(体积)，第三血清浓度为2％(体积)，或者，又例如第一血清浓度为12％(体积)，第二血清浓度为7％(体积)，第三血清浓度为3％(体积)。又例如，第一血清浓度为8％(体积)，第二血清浓度为5％(体积)，第三血清浓度为2.5％(体积)。
更优选的，所述步骤(1)c中低血清浓度为血清浓度不超过2.5％，例如，可以是2.5％，2.0％等。
更优选的，所述步骤(1)(c)包括在血清浓度梯度递减的悬浮培养基中培养，所述的浓度梯度递减为血清浓度逐渐降低，至接近于0％。例如，2.0％，1％，0.5％，0.2％依次递减，又如，2％，1.5％，1.0％，0.5％依次递减，或者2.5％，2％，1.3％，0.7％，0.15％依次递减，或者其他类似的浓度的递减方式。
更优选的，所述步骤(2)包括将步骤(1)获得的细胞在无血清培养基中悬浮驯化。
进一步优选的，所述步骤(2)包括a、将细胞在无血清培养基中培养，利用外力使细胞悬浮；b、筛选悬浮细胞，摇床培养，获得HEK-293XS细胞系。
更优选的，所述基础培养基包括但不仅限于：DMEM等等。
更优选的，所述悬浮培养基包括但不仅限于：FreeStyleTM 293培养基等等。
优选的，所述制备方法还包括步骤(3)、细胞冻存。
更优选的，所述步骤(3)包括：a、离心，收集驯化后的细胞，用冻存液将细胞沉淀密度调整为0.5×107～1.5×107个/ml；b、将冻存管放于程序降温盒中于-80±5℃中预冻24～72h后，转入液氮中保存。
在一个优选的实施方式中，所述制备方法包括：
(1)、无血清驯化：
a、HEK-293细胞复苏：取冻存的HEK-293细胞水浴融化，置于含有10％血清中的DMEM溶液中培养；
b、HEK-293细胞在血清浓度梯度递减的悬浮培养基中培养：血清浓度依次为5％，2％，当细胞融合度为75％-85％时，更换血清浓度递减的培养基。优选的，如有悬浮细胞，观察悬浮细胞的活力，悬浮细胞活率不低于60％时，离心，去上清并与Tryple消化的贴壁细胞混合，继续培养。
c、HEK-293细胞在低浓度血清，并且血清浓度梯度递减的悬浮培养基中培养，获得适合低血清浓度培养的细胞：所述血清浓度依次为2.0％，1％，0.5％，0.2％，当细胞融合度为75％-85％时，更换血清浓度递减的培养基。优选的，如有悬浮细胞，观察悬浮细胞的活力，悬浮细胞活率不低于60％时，离心，去上清并与Tryple消化的贴壁细胞混合，继续培养。
(2)悬浮驯化：
a、将(1)驯化后细胞在无血清培养基中培养，利用外力使细胞悬浮：在无血清培养基中培养，当细胞融合度为75％-85％时，用外力轻拍培养器皿让细胞悬浮。
b、筛选悬浮细胞，摇床培养，获得HEK-293XS细胞系：将悬浮细胞在无血清悬浮培养基中培养，每2～3天用无血清悬浮培养基将细胞密度调整为6×105～8×105个细胞/ml，6～8天后转至更大体积的培养器皿中，每2～3天用无血清悬浮培养基将细胞密度调整为6×105～8×105个细胞/ml，并在转速逐渐提高的方式下培养，每个转速下维持3～7天生长时间，当细胞生长至2.4×106～3.2×106个细胞/ml时，用无血清悬浮培养基将细胞密度调整为6×105～8×105个细胞/ml，转至更大体积的培养器皿中，摇床上培养，体积保持200～400ml，生长2～3天密度达到3×106～10×106个细胞/ml时收集细胞。
(3)、细胞冻存：
a、离心，收集驯化后的HEK-293XS细胞系，用冻存液将细胞沉淀密度调整为0.5×107～1.5×107个/ml；
b、将冻存管放于程序降温盒中于-80±5℃中预冻24～72h后，转入液氮中保存。
进一步优选的，在一个具体的实施方式中，所述制备方法包括：
(1)、无血清驯化：
a、HEK-293细胞复苏：
取一支冻存HEK-293细胞，投入37℃的水浴中融化，摇动令其尽快融化于45ml含有10％FBS的DMEM溶液中；充分混匀，300g离心5min，弃上清；按照1.0～1.1×107/皿，所得沉淀用10ml含有10％FBS的DMEM培养基重悬，混匀后培养；
b、将HEK-293细胞在血清浓度梯度递减胎牛血清DMEM培养基中培养：
至细胞融合度约80％时，弃上清，用Tryple消化传代至细胞培养皿中。此时将培养基更换为含5％FBS的DMEM培养基中，于37℃，5％CO2培养箱中培养，观察细胞生长状态，一周更换三次新鲜培养基。如有悬浮细胞，观察悬浮细胞的活力，悬浮细胞活率不低于60％时，离心，去上清并与Tryple消化的贴壁细胞混合，继续培养。至细胞融合度不低于80％时，将培养基梯度更换为含2％FBS的DMEM培养基，培养方式同上。
c、293细胞在含低浓度血清FreeStyleTM 293培养基中培养：
细胞融合度不低于80％时，弃上清，用Tryple消化传代至细胞培养皿中，将培养基更换为含2％FBS的FreeStyleTM 293培养基，于37℃，5％CO2培养箱中培养，观察细胞生长状态，一周更换三次新鲜培养基。观察悬浮细胞的活力，悬浮细胞活率不低于60％时，离心，去上清并与Tryple消化的贴壁细胞混合，继续培养。细胞融合度不低于80％时，依次梯度更换为含1％FBS、0.5％FBS、0.2％FBS的悬浮293细胞培养基中，培养方式同上。
(2)、悬浮驯化：
a、将步骤(1)获得的细胞重悬于无血清FreeStyleTM 293培养基中培养，外力使细胞悬浮；
将每培养皿传代至T75瓶中。培养期期间每天观察细胞，一旦细胞汇合至80％用手掌轻拍细胞瓶让细胞悬浮，避免气泡产生，用吸管吹落瓶壁上的细胞，同时将细胞吹散，期间根据需要增加培养瓶的数量。
b、筛选悬浮细胞，摇床培养
培养约7天，将培养瓶置于摇床上60rpm，每2～3天用无血清的悬浮细胞培养基，将细胞密度调整为6×105～8×105个细胞/ml。培养约7天后将细胞转移至125ml锥形细胞培养瓶中，每2～3天用悬浮293细胞培养基将细胞密度调整为6×105～8×105个细胞/ml，90、105、125、200rpm的转速逐渐提高，每个转速下维持3～7天生长时间。
当细胞生长至2.4×106～3.2×106个细胞/ml时，用悬浮细胞培养基将细胞密度调整为6×105～8×105个细胞/ml，转移至1L锥形细胞培养瓶中，放在200rpm摇床上培养，体积保持200～400ml，生长2～3天密度达到3×106～10×106个细胞/ml时收集细胞。
(3)、细胞冻存：
a、300g离心10min，收集用上述方法驯化后的HEK-293XS细胞,用冻存液将细胞沉淀密度调整为1×107个/ml，贴签。
b、将冻存管放于程序降温盒中于-80±5℃中预冻24～72h后，转入液氮中保存。
其中上述步骤中溶液百分比浓度均为体积浓度。
本发明的第二方面，提供一种上述制备方法获得的细胞系。
优选的，所述细胞系适应无血清培养。
优选的，所述细胞系适应悬浮生长培养。
优选的，所述细胞系悬浮生长的密度能达到3.0×106～10×106。
本发明的第三方面，提供上述细胞系的应用。
优选的，所述应用包括外源基因导入，蛋白表达，制备包装病毒等等。
本发明的无血清和悬浮培养的制备及其获得的细胞系的特点在于：
1)本发明的制备方法传代次数少，驯化效率高，大幅节省实验耗材。
2)本发明对降血清程序和细胞生长条件进行了整体优化，293XS在100％无血清培养基中可正常传代，并且适应200rpm转速下高活率培养，并达到可冻存标准。
3)本发明中的HEK-293XS细胞为适应无血清悬浮培养的HEK-293细胞，分散性好，胞浆丰富，偶有结团现象，重复度高，细胞倍增时间约为22h，最终细胞生长状态稳定，分散性好，完全适应在无血清且化学成分确定的培养基中进行悬浮培养，可用于规模化生产。
4)本发明获得的细胞系转染病毒时可以拥有更高的转染效率和产毒能力，无论是转染效率还是病毒滴度都远高于对照，适合规模化生产。
附图说明
图1为293XS细胞形态在倒置显微镜下的形态图。
图2为293XS细胞倍增时间。
图3为对照细胞株293F细胞倍增时间。
图4为293XS和293F病毒滴度结果，其中，图4-1,4-2分别为293XS转染0时和24h时的病毒滴度，图4-3,4-4分别为293F转染0时和24h时的病毒滴度。
具体实施方式
为了更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。
在下述每一实施例中，主要的设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
1.实验材料
1.1实验细胞：本实验中的HEK-293购自ATCC。
1.2主要试剂：DMEM：Thermo Fisher Scientific，型号C11965500BT；悬浮细胞培养基：Gibco，型号12338-018；HEPES：Gibco，型号15630-080；PBS：天津灏洋华科生物科技有限公司，型号PB2004Y；FBS：Biological Industries，04-001-1ACS；DMSO：Miltenyi，170-076-303。
1.3实验仪器：生物安全柜：苏净安泰空气技术有限公司，型号：BSC-1300IIA2；CO2培养箱：松下健康医疗器械株式会社，型号：MCO-18AC；超级恒温水槽：上海精宏实验设备有限公司，型号：DKB-501S；离心机：北京白洋医疗器械有限工司，型号：BY-L600；冰箱：青岛海尔股份有限公司，型号：BCD-252WDBD；立式超低温保存箱：青岛海尔特种电器有限公司，型号：DW-86L388A；倒置显微镜：OLYMPUS CORPORATION，型号：CKX31SF；液氮罐：Taylor-Wharton，型号：XT34；电动移液器：Brand，型号：26300。
2.统计分析
实验数据用均值±标准差(Mean±SD)表示。两组数据用非配对t检验(Non-pairedt test)，以P<0.05为有显著性统计学意义。
实施例1HEK-293细胞的无血清和悬浮培养的制备
一、制备方法：
(1).无血清驯化：
a、HEK-293细胞复苏
取一支冻存HEK-293细胞，投入37℃的水浴中融化，摇动
令其尽快融化于45ml含有10％FBS的DMEM溶液中；充分混匀，300g离心5min，弃上清；按照1.0～1.1×107/皿，所得沉淀用10ml含有10％FBS的DMEM培养基重悬，混匀后培养；
b、将HEK-293细胞在浓度梯度递减胎牛血清DMEM培养基中培养
至细胞融合度约80％时，弃上清，用Tryple消化传代至细胞培养皿中。此时将培养基更换为含5％FBS的DMEM培养基中，于37℃，5％CO2培养箱中培养，观察细胞生长状态，一周更换三次新鲜培养基。如有悬浮细胞，观察悬浮细胞的活力，悬浮细胞活率不低于60％时，离心，去上清并与Tryple消化的贴壁细胞混合，继续培养。至细胞融合度不低于80％时，将培养基梯度更换为含2％FBS的DMEM培养基，培养方式同上。
c、HEK-293细胞在低浓度血清FreeStyleTM 293培养基中培养
细胞融合度不低于80％时，弃上清，用Tryple消化传代至细胞培养皿中，将培养基更换为含2％FBS的无血清293细胞培养基，于37℃，5％CO2培养箱中培养，观察细胞生长状态，一周更换三次新鲜培养基。观察悬浮细胞的活力，悬浮细胞活率不低于60％时，离心，去上清并与Tryple消化的贴壁细胞混合，继续培养。细胞融合度不低于80％时，依次梯度更换为含1％FBS、0.5％FBS、0.2％FBS的悬浮293细胞培养基中，培养方式同上。
其中所述步骤a-c中溶液百分比浓度均为体积浓度。
(2)悬浮驯化：
a、将步骤(1)驯化后的细胞重悬于无血清FreeStyleTM 293培养基中培养，外力使细胞悬浮；
将每培养皿传代至T75瓶中。培养期期间每天观察细胞，一旦细胞汇合至80％用手掌轻拍细胞瓶让细胞悬浮，避免气泡产生，用吸管吹落瓶壁上的细胞，同时将细胞吹散，期间根据需要增加培养瓶的数量。
b、筛选悬浮细胞，摇床培养
培养约7天，将培养瓶置于摇床上60rpm，每2～3天用无血清的悬浮293细胞培养基，将细胞密度调整为6×105～8×105个细胞/ml。培养约7天后将细胞转移至125ml锥形细胞培养瓶中，每2～3天用悬浮293细胞培养基将细胞密度调整为6×105～8×105个细胞/ml，90、105、125、200rpm的转速逐渐提高，每个转速下维持3～7天生长时间。
当细胞生长至2.4×106～3.2×106个细胞/ml时，用悬浮293XS细胞培养基将细胞密度调整为6×105～8×105个细胞/ml，转移至1L锥形细胞培养瓶中，放在200rpm摇床上培养，体积保持200～400ml，生长2～3天密度达到3×106～10×106个细胞/ml时收集细胞。
(3)细胞冻存：
a、300g离心10min，收集用权利要求2所述方法驯化后的HEK-293XS细胞,用冻存液将细胞沉淀密度调整为1×107个/ml，贴签。
b、将冻存管放于程序降温盒中于-80±5℃中预冻24～72h后，转入液氮中保存。
二、结果
1、细胞形态观察
主要观察细胞的一般形态，如大体的形态、染色质和核仁大小、多少等。
如图1所示：本发明制备得到的HEX-293XS细胞系在倒置显微镜下，正常生长状态下的细胞成单个细胞，悬浮生长，胞浆丰富，偶有结团现象，未见贴壁细胞。
2、细胞生长增殖
表1：细胞生长增殖对比
Figure GDA0003869649750000091
293XS细胞倍增时间为约22h，见图2。
293F细胞约为24h，293XS细胞倍增速度高于293F细胞，见图3。
细胞悬浮生长的密度能达到3.0×106～10×106。
上述方法经扩大培养后，细胞密度和活性细胞基本在很小的范围内波动，重复度高。其生长形态也一致，正常生长状态下的细胞成单个细胞，悬浮生长，胞浆丰富，偶有结团现象。
实施例2：细胞病毒包装和产毒能力
一、方法步骤：
准备293XS细胞与对照293F细胞各一瓶，转染前细胞密度为2.0×106个/ml，体积30ml，总细胞数6.0×108。按照四质粒系统进行慢病毒转染，四质粒用量比例为：GFP:MDL:Rev:VSVG＝7.5:5:5:2.5，每瓶质粒总用量为60μg。转染24h后检测转染效率，转染72h后收毒超离纯化后用500μL冻存液回溶，进行滴度检测。
二、检测结果：
293XS VS 293F细胞包装GFP慢病毒24h转染效率和纯化后病毒滴度结果。
图4-1、4-2、4-3、4-4分别为293XS、293F转染0时，24h后的流式图。
表2：细胞系病毒转染效率及病毒滴度
样品名称 24h转染效率 TU滴度
LV-GFP-293XS 86.4％ 9.68×10<sup>6</sup>
LV-GFP-293F 31.3％ 4.65×10<sup>5</sup>
293XS和293F在转染0时转染的效率都是0.0％，24h后293XS的转染细胞率是86.4％，293F转染细胞率是31.3％。纯化后，293XS病毒的滴度是9.68×106，293F病毒的滴度4.65×105。
本发明从HEK-293细胞适应2.0％FBS DMEM培养基悬浮培养后转为FreeStyle293培养基继续驯化并扩大培养体积，最终得到活率高，且分散性良好的细胞。
本发明中，对降血清程序和细胞生长条件进行了整体优化，293XS在100％FreeStyle 293培养基中可正常传代，并且适应200rpm转速下高活率培养，并达到可冻存标准。最终细胞生长状态稳定，分散性好，完全适应在无血清且化学成分确定的培养基中进行悬浮培养，可用于规模化生产。
本发明中293XS在正常生长时的细胞状态和生长密度均达到理想状态，包装GFP慢病毒24h转染效率和纯化后病毒均优于一商业化悬浮细胞293F，显示出应用于规模化生产的优势。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用于以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的是指和范围。

Claims (5)

1.一种HEK-293细胞的无血清和悬浮培养的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)、无血清驯化；和(2)、悬浮驯化，
所述步骤(1)包括a、HEK-293细胞复苏；b、将HEK-293细胞在血清浓度梯度递减的DMEM培养基中培养，所述血清浓度从起始浓度8-12％(体积)递减至不超过2.5％；c、将HEK-293细胞在血清浓度梯度递减的低浓度血清的FreeStyleTM 293培养基中培养获得适合低血清浓度培养的细胞，所述FreeStyleTM 293培养基中的血清浓度从不超过2.5％逐渐降低至接近于0％；
所述步骤(2)包括a、将步骤(1)获得的细胞在FreeStyleTM 293培养基中培养，利用外力使细胞悬浮；b、筛选悬浮细胞，摇床培养，获得HEK-293XS细胞系：将悬浮细胞在FreeStyleTM293培养基中培养，每2～3天用FreeStyleTM293培养基将细胞密度调整为6×105～8×105个细胞/ml，6～8天后转至更大体积的培养器皿中，每2～3天用FreeStyleTM 293培养基将细胞密度调整为6×105～8×105个细胞/ml，并在转速从90rpm逐渐提高到200rpm的方式下培养，每个转速下维持3～7天生长时间，当细胞生长至2.4×106～3.2×106个细胞/ml时，用FreeStyleTM 293培养基将细胞密度调整为6×105～8×105个细胞/ml，转至更大体积的培养器皿中，摇床上培养，体积保持200～400ml，生长2～3天密度达到3×106～10×106个细胞/ml时收集细胞。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)b中血清浓度梯度递减的数值为2-5％(体积)。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括步骤(3)、细胞冻存。
4.权利要求1-3任一所述的制备方法获得的细胞系。
5.权利要求4所述的细胞系的应用，其特征在于，所述应用包括外源基因导入，蛋白表达，制备包装病毒。
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