JP6758659B2 - 揺動プラットフォームバイオリアクターを用いた多能性幹細胞の増殖及び継代 - Google Patents
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Description
揺動プラットフォーム上の細胞培養容器と、
容器内での細胞凝集体の自動灌流と、
灌流中の細胞凝集体のメンブレンフリー濾過と
を含む方法を提供する。
揺動プラットフォームバイオリアクター上の細胞培養容器と、
容器内での凝集体形成と、
容器内での細胞凝集体の自動灌流と、
灌流中の細胞凝集体のメンブレンフリー濾過と、
閉鎖系での細胞凝集体の回収及び継代と
を含む方法を提供する。
揺動プラットフォームバイオリアクター上の細胞培養容器と、
該容器内での細胞凝集体の自動灌流と、
灌流中の細胞凝集体のメンブレンフリー濾過と
を含む方法を提供する。
揺動プラットフォームバイオリアクター上の細胞培養容器と、
該容器内での凝集体形成と、
該容器内での細胞凝集体の自動灌流と、
灌流中の細胞凝集体のメンブレンフリー濾過と、
閉鎖系での細胞凝集体の回収及び継代と
を含む方法を提供する。
材料:凝集体を、灌流あり(28−9376−52)及び灌流なし(CB0001L10−01)のXuri Cellbagにおいて培養した。供給用培地バッグは5LのHyclone Labtainer(SH30713.01)であった。廃棄バッグはGE Healthcare(MB0020L10−01)のMbagであった。Matrigel(商標)は、BD Biosciencesから購入した。Accutase(商標)は、MP Biomedical(CA、USA)及びInvitrogen(商標)(NY、USA)から購入し、mTeSRTM1培地は、STEMCELL(商標)Technology Inc.(Vancouver、BC、Canada)から購入した。Y−27632(ROCK阻害剤)はSigma Aldrich(St.Louis、MO)及びMillipore(登録商標)から購入した。CT2 hESCは、コネチカット大学医学センタ(University of Connecticut Health Center)のRen−He Xu氏より入手した。CHB10は、ボストン小児病院(Children’s Hospital Boston)のGeorge Daley氏より入手した。NL5 iPSCは、NIH(アメリカ国立衛生研究所)のGuokai Chen氏より入手した。
ヒト胚性幹細胞CT2(コネチカット大学のRen−He Xu氏より入手)及びヒト人工多能性幹細胞株NCRM5(NL5としても知られている、NIHのGuokai Chen氏より入手)を、フィーダーフリーの細胞ストックから適合させた懸濁液であり、バイオリアクター培養の前に小規模で少なくとも5回継代維持した。活発に増殖する小規模培養及び凍結ストック由来の細胞を、150mL容量を保持する改変Cellbagに播種した。単一細胞及び小型(<5細胞)クラスタは、およそ直径約100μmの凝集体を急速に形成し、これは4日間にわたっておよそ250μmの直径に増殖した。半分〜全部の培地交換を毎日行い、細胞を4日間の培養後に回収した。150mLの培養液で最大5.5倍の増殖が観察された。150mLの規模から回収した細胞をAccutase(商標)で解離させ、2L灌流バッグ内の1L容量に再播種した。細胞を、灌流条件下で4日間増殖させ、凝集体は直径300〜350umに増殖した。4日後に最大9倍の増殖(約400万細胞/mLに相当する)が得られた。細胞を、多分化能マーカーOct4、Tra−1−60及びSSEA3についてはフローサイトメトリーにより、胚様体形成については核型によって特徴づけた。結論として、本発明者らの結果は、Xuri(商標)細胞増殖システムW25における懸濁凝集体に適合させた多能性幹細胞株の増殖の成功を記載している。
H1及びCT2細胞の懸濁凝集体培養物を確立し、凍結ストックをそれぞれ製造した。標準的な細胞培養プレートにおいてよりも低接着プレートにおいて培養した場合、細胞が増殖し、多能性(Oct4、Tra−1−60及びSSEA3発現に基づく)を良好に維持することが判定された。懸濁凝集体培養物は、5週間連続して成長することが見出された。6ウェルプレート、T25及びT75フラスコにおいて凝集体形成及び増殖が成功したことが実証された。
CT2凝集体の連続継代の間、多能性マーカーは保持されることを見出した。
CT2及びH1懸濁凝集体の凍結保存細胞バンクを増殖させ、CHB10凍結保存細胞バンクも増殖させた。CT2及びCHB10についてのフローサイトメトリーは、高い多能性マーカー発現を示した。これらの細胞株の増殖率のモニタリングを続け、典型的には、3日で3〜4倍の増殖を観察し、4日で6〜8倍の増殖を観察した。これは、Matrigel(商標)で通常観察される成長速度よりも遅い。
Vue Life 32c及びVue Life 72cバッグにおける播種及び増殖が成功したことを実証した。Vue Lifeバッグにおいて4日間に7倍の増殖を観察した。1つのVue Life72cバッグから別のVue Life 72cバッグへhESC凝集体を連続的に継代する能力を実証した。
VueLife 72バッグで5回連続継代が成功し、典型的な4日間の増殖は5〜7倍であり、生存率は>90%であった。
VueLifeバッグにおいて5継代の間継代した凝集体のフローサイトメトリー分析は、6ウェルプレートに維持された凝集体と比較して、同様に高レベルのOct4及びTra−1−60の発現を示している。しかし、Matrigel(商標)におけるCT2(既存対照に見られるレベル)と比較して、すべての凝集体において多能性マーカー発現量の全体的な低下があった。
CT2の増殖の成功(最大5.3倍)は4回の実験で実証された。細胞を改変Wavebagにおいて150mL容量で増殖させ、2/10プラットフォームにおいて維持した。Wavebagにおいて増殖させた凝集体のフローサイトメトリー分析は、Oct4、Tra−1−60及びSSEA3の発現> 95%を示し、多能性表現型を実証した。確立されたNL−5 iPSC懸濁凝集体に関する3回の実験で、Wavebagにおける凝集体形成を実証した。
Xuri W25システムにおいて改変Wavebagから1L灌流バッグへのCT2の連続移植を2回の実験で実証した。1L規模の灌流で最大9倍の増殖が観察され、3.8M/mLの細胞密度が達成された。8日間で約40倍の増殖が観察された。
改変Wavebagから改変Wavebagへ、改変WavebagからXuri W25システムの1Lバッグへの4連続継代におけるCT2の連続移植の成功を実証した。1Lバッグは灌流せず、バッチの半分の培地交換を行った。16日間で約256倍の増殖を観察した。潅流により、増殖率がより高くなることが予想される。Xuri W25灌流Cellbagにおける播種、供給(灌流)及び回収の実証を、閉鎖系、無菌プロセスで実施した。フローサイトメトリーの結果は、連続継代の間にXuri W25増殖細胞において正常レベルの多分化能が維持されることを示す。細胞は、連続継代後に正常な核型を保持した。
EBの結果は、Xuri W25増殖細胞が3つの胚葉すべてに分化する能力を保持していることを示す。細胞は、連続継代後に正常な核型を保持した。多能性幹細胞株CT2のさらなる増殖は、WAVE 2/10及びXuri W25システムにおいて実施して、成功した。
凝集体を最初に超低接着6ウェルプレートで確立し、3−5日間増殖させて、その後、凝集体を単一細胞/小型クラスタに解離させて新たなウェルに再播種した。播種密度は100Kから800K/mLの範囲であった。使用された揺動角度は15〜25度の範囲で、揺動速度は15〜25回/分であった。好ましい揺動角度は15〜20度の範囲であり、揺動速度は20rpmである。
供給バッグ内の培地を予熱する。
いったん予熱したら、供給バッグと回収バッグにチューブが取り付けられていることを確認する。
リアクターを一時停止し、12度の角度で停止するまで待つ。
トレイを持ち上げて60度の角度にする。
ガスの流れを止め、バッグを押して収縮させる。
凝集体を2分間沈殿させる。
上段のメニューバーから、マニュアル(Manual)→マニュアルの指令を実行(Execute manual instructions)を選択する。
培地制御(Media control)→回収(Harvest)→チューブ内径=3.2mm(Tube inner diameter=3.2mm)→挿入(Insert)を選択する。
ポンプの制御(Pump Control)→回収ポンプ始動(Start Harvest Pump)→限定範囲(Limited)→60秒間、200 rpm(60 sec duration,200 rpm)→挿入(Insert)を選択する。
実行する。
ポンプは約75mLを引き出す。200rpmを使用して、60秒ごとにおよそ75mLが除去される。ポンプの較正は変更可能であり、4日ごとの較正が推奨される。
閉じる(Close)をクリックする。
上段のメニューバーから、マニュアル(Manual)→マニュアルの指令を実行(Execute manual instructions)を選択する。
培地制御(Media control)→供給(Feed)→チューブ内径=3.2mm(Tube inner diameter=3.2mm)→挿入(Insert)を選択する。
ポンプの制御(Pump Control)→供給ポンプ始動(Start Feed Pump)→限定範囲(Limited)→65秒間、200 rpm(65 sec duration,200 rpm)→挿入(Insert)を選択する。
実行する。
ポンプは約75mLを加える。200rpmを使用して、60秒ごとにおよそ75mLが添加される。新鮮な培地をすべてバッグに移送し、チュービングが空であることを確実にするために、必要より5秒長く稼働させる。ポンプの較正は変更可能であり、4日ごとの較正が推奨される。
閉じるをクリックする。
ここに記載された増殖率は例であり、本発明、システム又はアプローチの性能又は固有の制限を定義することを意図するものではない。当業者は、使用される細胞株、使用される培地の配合、培地容量、培地交換及び灌流のスケジュール、初期播種密度及び使用される培養条件によって、増殖率が影響を受けることを認識するであろう。以下の実施例は、約600万細胞/mLの最大細胞濃度を記載しているが、これらの実施例に記載の方法を上記の文章で言及した変更と組合せて用いると、より高い細胞濃度が達成可能であると考えられる。これらの実施例は、Xuri Cellbag Waveモーションバイオリアクターシステムを利用しているが、当業者は、他の揺動プラットフォームも同様の性能を達成できることを認識するであろう。
3種の多能性幹細胞株(2種の胚性幹細胞株CT2、CHB10及び1種の人工多能性幹細胞株NL5)を、Matrigel(商標)の接着培養から、揺動培養システムにおける懸濁凝集体に適合させた。小規模で揺動を提供するために、細胞を6ウェルプレート又はTフラスコ中に維持し、標準の加湿CO2インキュベーター内に維持されたThermo Varimax試験管ロッカー又はBoekel Scientific Rocker II 260350揺動プラットフォームを用いて揺動させた。細胞株は、Xuri W25システムで増殖させる前に、安定した細胞培養を可能にするために数継代にわたって維持した。各細胞株について、好ましい細胞プレーティング濃度、揺動角度、揺動速度、Y27632 ROCK阻害剤の濃度及び継代中のAccutase(商標)曝露の長さに関して系統的に条件を試験した。3種の細胞株すべてが異なる培養条件を好むことに注目した。
PSC懸濁凝集体を、凝集体の密度及び直径に依存して、3〜5日ごとに継代した。凝集体は、直径約250〜400umになった時に継代した。凝集体の直径が大きくなると、中心が暗くなるか、又は凝集体に穴又は空き領域のように見えるものが発生することがある。細胞数は、3〜5日の培養中に約4〜12倍増加した。
一実施例では、CT2ヒト胚性幹細胞凝集体をAccutase(商標)を用いて解離させた。1日目にCT2凝集体を、72mLのmTeSR1+10uMのY27632 ROCK阻害剤中250,000細胞/mLでVueLife 72Cガス透過性バッグに播種した。VueLifeバッグを標準インキュベーター内に配置し、Thermo Varimax試験管揺動プラットフォームを用いて揺動させた。培養条件を、20回の揺動/分、揺動角度9度、37℃、5%CO2で構成した。完全な培地交換は、Y27632 ROCK阻害剤を含まない新鮮なmTeSR1で毎日行った。4日目に、凝集体をCellbagから回収し、Accutase(商標)で単一細胞/小型細胞塊に解離させた。解離した細胞をNucleocounter NC200を用いて計数した。合計8.67×107の生存細胞が全培養物に対して96.3%の生存率で回収され、4.8倍の増殖を示した。
多能性幹細胞懸濁凝集体をAccutase(商標)によって解離させた。Accutase処理した細胞産物は、大部分が2〜10個の小型細胞塊及び単一細胞で構成されていた。mTeSR1+1〜10uMのY27632ROCK阻害剤中、1LのXuri Cellbag中に全容量125mLから500mLで、又は2Lの Xuri Cellbag中に350mL〜1Lで、Xuri Cellbagに細胞を加えた。播種細胞濃度は、100,000〜2,000,000細胞/mLであった。この培地は、場合により0.2%のPluronic F68を含有した。最初の播種後2〜18時間かけて凝集体が自発的に確立された。
すべての多能性細胞株が同じ培養条件を好むわけではない。Xuri W25 システムにおけるPSC増殖に下記のパラメーターを使用したが、当業者は、他の容器において他の条件によりPSCの増殖が提供されることを認識するであろう:温度37℃、CO2レベル5%、周囲O2(約21%)又はそれ以下のO2レベル。すべての実験は、2.5〜6度の揺動角度及び12〜20rpmの揺動速度を用いて行ったが、当業者は、他の条件もまたPSC増殖をもたらすことを認識するであろう。
チュービングアセンブリの概念的構成を図23及び図24に示し、Xuri Cellbagのアセンブリの画像を図25に示す。このアセンブリは下記の機能を提供するが、これらに限定されるものではない:(1)細胞/細胞培養培地混合物の除去、(2)排出される細胞培養培地からの細胞凝集体分離、(3)細胞培養培地の添加、及び(4)細胞培養培地の除去。
多能性幹細胞培養は、頻繁な培地交換を必要とする。閉鎖系培地交換を、2つの方法、すなわち1)マニュアルプロセス又は2)自動プロセスを用いて、揺動プラットフォームからCellbagを取り外す必要なく実施した。
使用済み培地の除去及びCellbag内の細胞の保持のために、Cellbag内に浮遊膜を含む灌流Cellbagを用いて、自動PSC増殖を達成した。このプロトコルは、すべてのタイプの灌流容器、例えば、灌流のための浮遊膜を有するCellbagに適用可能である。例えば、典型的には350mL〜1Lの容量を培養し、2Lの浮遊膜灌流Cellbagで灌流する。連続的及び不連続的な灌流のためのプロトコルを以下に記載する。
代替的に、容器から凝集体を回収し、開放系において継代した。この方法は、2つの方法で実施した:1)容器からの細胞の全培養容量の収集、又は2)バッグ内で凝集体が重力沈降した後で、Xuri Cellbagから大部分の培地を除去し、その後、バッグ内においてPBSで洗浄するか、又はバッグの外側で洗浄/ Accutase(商標)処理するためにバッグから収集する。
一実施例では、懸濁凝集多能性幹細胞のフィルターレスバッグから浮遊膜灌流バッグへの連続継代を行った。1回目の継代を250mL容量で増殖させ、2回目の継代を1L容量で増殖させた。CT2ヒト胚性幹細胞凝集体をAccutase(商標)を用いて解離させた。各継代において、細胞を、mTeSR1+10uMのY27632 ROCK阻害剤中400,000細胞/mLで、1Lの非灌流又は2Lの灌流Xuri Cellbagに播種した。培養条件を、20回の揺動/分、揺動角度5度、37℃、5%CO2で構成した。直径約100〜150umの凝集体が翌朝までに形成された。使用済み培地の半量を、フィルターレスバッグ中のY27632 ROCK阻害剤を含まない新鮮培地と毎日交換し、連続灌流プロトコルを使用し、Xuri W25ソフトウェア制御を用いて浮遊膜灌流Cellbagにおいて1日あたり500mLの培地を交換した。凝集体を、播種後4日目にAccutase(商標)を用いて単一細胞/小型細胞塊に解離することによって継代した。解離した細胞をNucleocounter NC200を用いて計数した。継代1において、合計6.96×108の生存細胞が全培養物に対して99.4%の生存率で回収され、7倍の増殖を示した(図26)。継代2において、合計2.23×109の生存細胞が全培養物に対して93.5%の生存率で回収され、5.6倍の増殖を示した。8日間かけて、全体で39.2倍の増殖があった。
一実施例では、懸濁凝集多能性幹細胞の4継代にわたる連続的継代を、1L及び2LのXuri Cellbagで行った。2回の継代を150mL容量で増殖させ、続いて1回を400mL容量で、1回を1L容量で継代した。CT2ヒト胚性幹細胞凝集体をAccutase(商標)を用いて解離させた。各継代において、細胞を、mTeSR1+10uMのY27632 ROCK阻害剤中 400,000細胞/mLでXuri Cellbagに播種した。培養条件を、20回の揺動/分、揺動角度5度、37℃、5%CO2で構成した。直径約100〜150umの凝集体が翌朝までに形成された。使用済み培地の半量を、Y27632 ROCK阻害剤を含まない新鮮な培地と毎日交換した。凝集体を、播種後4日目にAccutase(商標)を用いて単一細胞/小型細胞塊に解離することによって継代した。解離した細胞をNucleocounter NC200を用いて計数した。継代1において、合計2.19×108の生存細胞が全培養物に対して99.1%の生存率で回収され、3.7倍の増殖を示した(図27)。継代2において、合計4.17×108の生存細胞が全培養物に対して97.8%の生存率で回収され、7倍の増殖を示した。継代3において、合計5.64×108の生存細胞が全培養物に対して97.2%の生存率で回収され、3.5倍の増殖を示した。継代4において、合計1.25×109の生存細胞が全培養物に対して94.4%の生存率で回収され、3.1倍の増殖を示した。全体的な増殖は、16日間で279倍であった。連続継代間の凝集体形態を図28に示す。
スライサーは、様々な生体適合性材料で構成することができる。この材料は、滅菌に適していなければならず、細胞サンプルの流動の間に受ける応力に耐えられる機械的強度を有していなければならない。多能性幹細胞凝集体の継代について試験した2つの材料は、ニッケル合金とケイ素であった。当業者は、他の材料が、凝集体の継代のための所望のスライサー性能を可能にする特性を有することを認識するであろう。スライサーは、例えば、正方形又は六角形の格子のような多角形格子様のパターンで設計され、格子壁の間に50μmから400μmの間の間隔を有する(図29〜31)。いくつかの実験において、スライサーを疎水性材料でコーティングして、せん断及び汚損を低減した。以下に記載する多能性幹細胞凝集体の継代実験のために、100umの間隔を有する正方形及び六角形の格子を使用した。スライサーを、閉鎖系において、チュービングを通り、スライサーを越える凝集体の無菌流動を可能にするチュービングと一直線になるように取り付けた。スライサーは、限定するものではないが、接着剤、溶融ポリマー流、又は締付けを含む様々な締結機構によって閉鎖系に一体化することができる。好ましい方法において、ポンプ及びインラインコロニカルバッグによって駆動される循環ループを介して、凝集体を懸濁液中に維持する(図32)。スライサーに通じるチュービングは、主循環ループに接続され、循環ループ内の細胞凝集体の分画は、循環ループを制御するポンプよりも低速で作動する第2のポンプを介してスライサーに送達される。スライスされた凝集体は別の容器に収集されても、又は同じ容器に再導入されてもよい。
凝集体は、100mL〜1Lの容量からなる流動流の中でスライサーを通過した。酵素継代と比較したスライサーの利点は、時間、労力及び試薬の削減である。約100umの寸法への縮小スライスの成功は、一方向又は双方向の流れでスライサーを1以上回通過することによって達成された。流速はせん断を最小にするように制御した。サイズ縮小、細胞生存率の維持及びその後の増殖のための凝集体スライス性能を、15〜150mL /分の流速でスライサーを通過した多能性幹細胞凝集体に対して実証した。当業者であれば、他の流速でも良好な性能を達成できることを理解するであろう。スライサーを通過するために使用された細胞凝集体濃度は、スライスされた細胞凝集体の高い生存率での回収に影響を及ぼすように決定した。スライサーの汚損は、細胞の回収率及び生存率を低下させる可能性がある。約3×106細胞/mL未満の細胞凝集体濃度をスライスすることにより、約3×106細胞/mLを超える細胞濃度よりも高い生存率サンプルが高い回収率で生成されることが判明した。例えば図32に示す混合装置を使用することによって、フローストリーム中の凝集体の均一な懸濁液を維持することで汚損を最小限に抑え、高い細胞生存率及び回収率をもたらす。スライスした凝集体の試料画像を図33に示す。スライス後の凝集体の形態は、不規則形状、立方体形状及び球形を含む。100umのスライサーの場合、凝集体の1以上の寸法は、直径約100umに縮小される。スライスした凝集体をmTeSR1及び場合により1〜10uMのY27632 ROCK阻害剤中で培養し、増殖させた。Y27632 ROCK阻害剤は、単一多能性細胞の生存率を維持するために一般的にY27632 ROCK阻害剤のような薬剤を必要とする酵素的に継代された多能性幹細胞凝集体とは異なり、スライスされた多能性幹細胞凝集体の増殖には必要ではなかった。スライスされた凝集体の形態は、連続揺動培養条件下で急速に球形に再形成された。スライスされた凝集体の増殖速度は、酵素的に継代された細胞の増殖速度と同様であった(図16及び17)。凝集体は、酵素継代に必要なPBS洗浄を行わずにスライサーによって継代することができ、したがって、スライスによる継代は、酵素継代よりも少ない時間と少ない全体努力で行われる。当業者であれば、スライサーの機能及び性能は、Xuri Cellbagバイオリアクタープラットフォームに依存せず、例えば、限定するものではないが、他の揺動運動プラットフォーム又は攪拌タンクバイオリアクターを含む他のタイプのバイオリアクターとも適合可能であることを認識するであろう。
一実施例では、CT2ヒト胚性幹細胞凝集体を、壁間に100umの間隔を有するニッケル合金六角格子スライサーを用いて継代した。細胞を、250mLのmTeSR1+3uMのY27632 ROCK阻害剤中 460,000細胞/mLでXuri Cellbagに播種した。培養条件を、20回の揺動/分、揺動角度4度、37℃、5%CO2で構成した。潅流条件は、50分間かけてバイオリアクターから15mLの使用済み培地を除去し、続いて非灌流バッグにおける重力沈降のためのチュービングアセンブリを用いて125mL/日を補充するように、1分間にY27632 ROCK阻害剤を含まない15mLの新鮮なmTeSR1を添加するように設計した。5日目に、凝集体をCellbagから回収し、Accutase(商標)で単一細胞/小型細胞塊に解離させた。解離した細胞をNucleocounter NC200を用いて計数した。合計6.9×108の生存細胞が全培養物に対して91.9%の生存率で回収され、6.0倍の増殖を示した。
一実施例では、懸濁凝集多能性幹細胞の3継代にわたる連続的継代を、1LのXuri Cellbagで行った。2回の継代を250mL容量で増殖させ、続いて1回を500mL容量で継代した。CT2ヒト胚性幹細胞凝集体を、壁間に100umの間隔を有するニッケル合金六角格子スライサーを用いて継代した。各継代において、スライスした凝集体を、1LのXuri Cellbag内のmTeSR1+2〜5uMのY27632 ROCK阻害剤に播種した。培養条件を、20回の揺動/分、揺動角度4度、37℃、5%CO2で構成した。潅流条件は、50分間かけてバイオリアクターから15mLの使用済み培地を除去し、続いて非灌流バッグにおける重力沈降のためのチュービングアセンブリを用いて125mL/日を補充するように、1分間にY27632 ROCK阻害剤を含まない15mLのmTeSR1を添加するように設計した。凝集体の一部を、4又は5日目に、計数のためにAccutase(商標)を用いて単一細胞/小型細胞塊に解離することによって継代した。解離した細胞をNucleocounter NC200を用いて計数した。継代1において、合計1.22×108の生存細胞を播種し、3.12×108の生存細胞が全培養物に対して96.8%の生存率で回収され、2.6倍の増殖を示した(図34)。継代2において、合計1.15×108の生存細胞を播種し、6.93×108の生存細胞が全培養物に対して91.9%の生存率で回収され、6倍の増殖を示した。継代3において、合計3.48×108の生存細胞を播種し、1.88×109の生存細胞が全培養物に対して92%の生存率で回収され、5.4倍の増殖を示した。14日間かけて、全体で83倍の増殖があった。
一実施例では、懸濁凝集多能性幹細胞の3継代にわたる連続的継代を行った。2回の継代を250mL容量で増殖させ、続いて1回を500mL容量で継代した。CT2ヒト胚性幹細胞凝集体を、壁間に100umの間隔を有するニッケル合金正方格子スライサーを用いて継代した。各継代において、スライスした凝集体をXuri Cellbag内のmTeSR1+2〜5uMのY27632 ROCK阻害剤に播種した。培養条件を、20回の揺動/分、揺動角度4度、37℃、5%CO2で構成した。潅流条件は、50分間かけてバイオリアクターから15mLの使用済み培地を除去し、続いて非灌流バッグにおける重力沈降のためのチュービングアセンブリを用いて125mL/日を補充するように、1分間にY27632 ROCK阻害剤を含まない15mLのmTeSR1を添加するように設計した。凝集体の一部を、5日目に、計数のためにAccutase(商標)を用いて単一細胞/小型細胞塊に解離することによって継代した。解離した細胞をNucleocounter NC200を用いて計数した。継代1において、合計1.14×108の生存細胞を播種し、5.13×108の生存細胞が全培養物に対して97.5%の生存率で回収され、4.5倍の増殖を示した(図35)。継代2において、合計1.82×108の生存細胞を播種し、1.13×109の生存細胞が全培養物に対して97.4%の生存率で回収され、6.2倍の増殖を示した。10日間かけて、全体で28倍の増殖があった。
一実施例では、懸濁凝集多能性幹細胞の2継代にわたる連続的継代を行った。両方の継代を250mL容量で増殖させた。CT2ヒト胚性幹細胞凝集体を、壁間に100umの間隔を有するケイ素六角形格子スライサーを用いて継代した。各継代において、スライスした凝集体を、1LのXuri Cellbag内のmTeSR1+2〜5uMのY27632 ROCK阻害剤に播種した。培養条件を、20回の揺動/分、揺動角度4度、37℃、5%CO2で構成した。潅流条件は、50分間かけてバイオリアクターから15〜30mLの使用済み培地を除去し、続いて非灌流バッグにおける重力沈降のためのチュービングアセンブリを用いて125mL/日を補充するように、1〜2分間にY27632 ROCK阻害剤を含まない15〜30mLのmTeSR1を添加するように設計した。凝集体の一部を、4又は5日目に、計数のためにAccutase(商標)を用いて単一細胞/小型細胞塊に解離することによって継代した。解離した細胞をNucleocounter NC200を用いて計数した。継代1において、合計5.74×107の生存細胞を播種し、3.15×108の生存細胞が全培養物に対して93.8%の生存率で回収され、5.5倍の増殖を示した(図36)。継代2において、合計1.95×108の生存細胞を播種し、1.04×109の生存細胞が全培養物に対して97.8%の生存率で回収され、5.4倍の増殖を示した。9日間かけて、全体で29.4倍の増殖があった。
一実施例では、懸濁凝集多能性幹細胞の2継代にわたる連続的継代を行った。1回の継代を250mL容量で増殖させ、続いて1回を300mL容量で継代した。CT2ヒト胚性幹細胞凝集体を、壁間に100umの間隔を有し、疎水性材料でコーティングされたケイ素六角形格子スライサーを用いて継代した。各継代において、スライスした凝集体を、1L Xuri Cellbag内のY27632 ROCK阻害剤を含まないmTeSR1に播種した。培養条件を、20回の揺動/分、揺動角度4度、37℃、5%CO2で構成した。潅流条件は、100分間かけてバイオリアクターから30mLの使用済み培地を除去し、続いて非灌流バッグにおける重力沈降のためのチュービングアセンブリを用いて培地の半分/日を補充するように、2分間にY27632 ROCK阻害剤を含まない30mLのmTeSR1を添加するように設計した。凝集体の一部を、4又は5日目に、Accutase(商標)を用いて単一細胞/小型細胞塊に解離することによって継代した。解離した細胞をNucleocounter NC200を用いて計数した。継代1において、合計4.9×107の生存細胞を播種し、2.9×108の生存細胞が全培養物に対して92.9%の生存率で回収され、5.9倍の増殖を示した(図37)。継代2において、合計1.45×108の生存細胞を播種し、1.11×109の生存細胞が全培養物に対して98.4%の生存率で回収され、7.7倍の増殖を示した。9日間かけて、全体で45倍の増殖があった。Y27632 ROCK阻害剤を含まない培地においてスライス直後及び増殖後の凝集体の形態を図38に示す。
一実施例では、CT2細胞を、6ウェルプレートに懸濁凝集体として5継代にわたって維持し、Xuri Cellbag中に3継代にわたって維持した。増殖細胞を、Oct4、SSEA4及びTra−1−60の発現についてはフローサイトメトリーにより、胚様体からの3つの胚葉分化については核型により分析した。細胞を4%パラホルムアルデヒド中で固定し、0.1%Triton X−100中で透過性にし、その後、AlexaFluor 647とコンジュゲートしたOct4抗体(BD Pharmingen)及びR−フィコエリトリン(PE)とコンジュゲートしたTra−1−60抗体(BD Pharmingen)又はフルオロセインイソチオシアネート(FITC)とコンジュゲートしたSSEA4抗体(BD Pharmingen又はCell Signaling)を用いて、フローサイトメトリーにより分析した。図8に示す結果は、6ウェルプレートで懸濁凝集体として5継代及びXuri Cellbagで懸濁凝集体として3連続継代の後の多能性マーカーの維持を実証する。図8Aは、細胞の前方散乱及び側方散乱特性を示し、図8Bは、Oct4及びTra−1−60の軸を示し、図8Cは、Xuri Cellbagにおいて3継代にわたって増殖させた凝集体におけるOct4及びTra−1−60の発現を示し、図8Dはアイソタイプ抗体による染色を示し、図8EはSSEA3の軸を示し、図8FはXuri Cellbagにおいて3継代にわたって増殖させた凝集体におけるSSEA3の発現を示す。このデータは、6ウェルプレート及びXuri Cellbagにおいて揺動条件下で維持された懸濁凝集体中の、複数継代にわたる多能性の維持を実証している。
[実施態様1]
揺動プラットフォームバイオリアクター上の細胞培養容器を含む閉鎖系での細胞凝集体の増殖、
容器内での凝集体形成、
容器内での細胞凝集体の自動灌流、
灌流中の細胞凝集体のメンブレンフリー濾過、並びに
閉鎖系での細胞凝集体の回収及び継代、
の方法。
[実施態様2]
増殖させる細胞凝集体が、植物、動物、昆虫又は微生物由来である、実施態様1に記載の方法。
[実施態様3]
増殖させる細胞凝集体が、多能性幹細胞又は分化ヒト細胞を含む、実施態様1又は2に記載の方法。
[実施態様4]
灌流中、細胞凝集体が細胞凝集体の重力沈降によって濾過膜の不在下でバッグ内に保持される、実施態様1、2又は3に記載の方法。
[実施態様5]
自動灌流が人間の介入なしに閉鎖系において実施される、実施態様1乃至実施態様4のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様6]
連続継代を行うことによって、細胞凝集体又はその子孫の1以上回のさらなる増殖をさらに含む、実施態様1乃至実施態様5のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様7]
細胞凝集体又はその子孫の1以上回のさらなる増殖が、膜フィルターを有する第2の容器への継代によって実施される、実施態様6に記載の方法。
[実施態様8]
細胞凝集体の連続継代が、閉鎖系においてスライサー格子を使用する無酵素継代によって可能になる。実施態様6に記載の方法。
[実施態様9]
細胞凝集体が、約20〜約500μmの間隔のブレードを有するスライサー格子で解離される、実施態様8に記載の方法。
[実施態様10]
細胞凝集体が、約100μmの間隔のブレードを有するスライサー格子で解離される、実施態様8又は9に記載の方法。
[実施態様11]
細胞凝集体が、チュービング及び細胞凝集物の混合用装置にインラインのスライサー格子で解離される、実施態様8に記載の方法。
[実施態様12]
スライサーが、疎水性材料でコーティングされるか、又は疎水性材料を含む、実施態様8に記載の方法。
[実施態様13]
細胞凝集体の連続継代が、閉鎖系容器において酵素の存在下の細胞凝集体の解離によって可能になる、実施態様6に記載の方法。
[実施態様14]
増殖した各細胞凝集体の平均直径が、約800μm以下のサイズである、実施態様1乃至実施態様13のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様15]
増殖した各細胞凝集体の平均直径が、約500μm以下のサイズである、実施態様1乃至実施態様14のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様16]
培養容器の容量が約50mL〜約100Lである、実施態様1乃至実施態様15のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様17]
培養容器の容量が約100mL〜約10Lである、実施態様16に記載の方法。
[実施態様18]
閉鎖系のバイオリアクターに付随するスライサー格子によってサイズが縮小された細胞凝集体を継代する方法。
[実施態様19]
細胞凝集体が100mLを超える容量で継代される、実施態様18に記載の方法。
[実施態様20]
細胞凝集体が、約20〜約500μmの間隔のブレードを有するスライサー格子で解離される、実施態様18又は19に記載の方法。
[実施態様21]
細胞凝集体が、約100μmの間隔のブレードを有するスライサー格子で解離される。実施態様18、19又は20に記載の方法。
[実施態様22]
細胞凝集体が、チュービング及び細胞凝集物の混合用装置にインラインのスライサー格子で解離される、実施態様18乃至実施態様21のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様23]
スライサーが、疎水性材料でコーティングされるか、又は疎水性材料を含む、実施態様18乃至実施態様22のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様24]
継代前の各細胞凝集体の平均直径が約800μm以下のサイズである、実施態様18乃至実施態様23のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様25]
継代前の各細胞凝集体の平均直径が約500μm以下のサイズである、実施態様24に記載の方法。
Claims (11)
- 閉鎖系での細胞凝集体の増殖方法であって、
揺動プラットフォームバイオリアクター上の細胞培養容器の設置と、
容器内での凝集体形成と、
容器内での細胞凝集体の自動灌流と、
灌流中の細胞凝集体のメンブレンフリー濾過であって、灌流中、細胞凝集体が細胞凝集体の重力沈降によって濾過メンブレンの不在下でバッグ内に保持される、メンブレンフリー濾過と、
閉鎖系での細胞凝集体の回収及び継代と
を含む方法。 - 増殖させる細胞凝集体が、多能性幹細胞又は分化ヒト細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 連続継代を行うことによって、細胞凝集体又はその子孫の1回以上のさらなる増殖をさらに含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 細胞凝集体又はその子孫の1回以上のさらなる増殖が、膜フィルターを有する第2の容器への継代によって実施される、請求項3に記載の方法。
- 細胞凝集体の連続継代が、閉鎖系においてスライサー格子を使用する無酵素継代によって実施される、請求項3に記載の方法。
- 細胞凝集体が、約20〜約500μmの間隔のブレードを有するスライサー格子で解離される、請求項5に記載の方法。
- 細胞凝集体が、約100μmの間隔のブレードを有するスライサー格子で解離される、請求項5又は6に記載の方法。
- 細胞凝集体が、チュービング及び細胞凝集物の混合用装置にインラインのスライサー格子で解離される、請求項5に記載の方法。
- スライサーが、疎水性材料でコーティングされるか、又は疎水性材料を含む、請求項7に記載の方法。
- 細胞凝集体の連続継代が、閉鎖系容器において酵素の存在下の細胞凝集体の解離によって実施される、請求項5に記載の方法。
- 増殖した各細胞凝集体の平均直径が、約800μm以下のサイズである、請求項1乃至請求項10のいずれか1項に記載の方法。
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