CN116970547B - 一种驯化无血清全悬浮hek293细胞的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,公开了一种驯化无血清全悬浮HEK293细胞的方法及其应用。该无血清全悬浮HEK293细胞株,名称为人胚肾293悬浮细胞293S‑NB,于2022年12月28日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC NO:63099;该细胞生长状态稳定,分散性好,细胞密度高,活率高,产毒能力强,可用于规模化生产,进而用于制备蛋白、扩增病毒和制备疫苗,并且该细胞培养所采用的无血清悬浮培养基不含血清,组份明确,有利于提高规模化生物制品的品质。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种驯化无血清全悬浮HEK293细胞的方法及其应用。
背景技术
HEK293细胞(human embryonic kidney 293cells)是来源于经5型腺病毒转化的人胚肾上皮样细胞的连续传代细胞系,其在体外培养中呈现贴壁依赖的生长特性,是Graham等在1977年建立的细胞系。HEK293细胞除被广泛用作细胞生物学和功能基因组学研究的细胞模型外,其作为重组蛋白和重组病毒载体的主要生产细胞的重要性也随着生物医药产业的发展和基因治疗的研究变得尤为重要。
现有的HEK293的培养是在基础培养基(DMEM)中添加5~10%牛血清进行贴壁培养,这种培养方式运用于生物制品生产,存在缺陷,首先血清的成分复杂、质量不稳定,存在批间差异性,且成本高。其次相对于悬浮培养的细胞来说,贴壁性质的细胞单位体积能生长的细胞数量少,较难实现规模化的生产。生物制品生产中细胞培养如能采用无血清全悬浮工艺,培养规模就容易线性放大,避免了细胞贴壁培养和使用牛血清带来的工艺缺陷,可提高病毒产量和产品质量,但是驯化无血清全悬浮培养型细胞株是目前最关键的技术瓶颈之一。
发明内容
本发明第一方面的目的,在于提供一种无血清全悬浮HEK293细胞株。
本发明第二方面的目的,在于提供一种驯化无血清全悬浮HEK293细胞的方法。
本发明第三方面的目的,在于提供一种无血清全悬浮HEK293细胞库。
本发明第四方面的目的,在于提供第一方面的无血清全悬浮HEK293细胞株和/或第三方面的细胞库的应用。
本发明第五方面的目的,在于提供一种疫苗用细胞基质。
本发明第六方面的目的,在于提供一种方法。
本发明第七方面的目的,在于提供一种疫苗。
本发明第八方面的目的,在于提供第七方面的疫苗的应用。
为了实现上述目的,本发明所采取的技术方案是:
本发明的第一个方面,提供一种无血清全悬浮HEK293细胞株,名称为人胚肾293悬浮细胞293S-NB,于2022年12月28日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC NO:63099。
本发明的第二个方面,提供一种驯化无血清全悬浮HEK293细胞的方法,包括如下步骤:1)消化HEK293贴壁细胞,离心,用无血清培养基重悬细胞,悬浮培养;2)将步骤1)得到的细胞进行传代培养,直至细胞活率高于90%,细胞密度大于2×106cells/mL;3)将步骤2)得到的细胞进行稀释传代培养,直至连续5代的比生长速率μ均大于0.34/d、连续5代的细胞活率均高于95%,得到无血清全悬浮HEK293细胞。
优选地,所述HEK293贴壁细胞为培养至汇合度为80~90%的细胞。
优选地,所述消化HEK293贴壁细胞的方法为用胰酶消化。
优选地,所述传代培养、稀释传代培养的方法为:离心,用无血清培养基重悬细胞,悬浮培养。
优选地,步骤1)、以及上述传代培养、稀释传代培养的方法中所述离心的条件为80~120g,23~27℃,3~7min;进一步为100g,25℃,5min。
优选地,步骤1)、以及上述传代培养、稀释传代培养的方法中所述无血清培养基为CelerTM-S001 HEK293细胞无血清培养基、HEK293 CD培养基、FreeStyleTM 293表达培养基中的至少一种;进一步为CelerTM-S001 HEK293细胞无血清培养基。
优选地,步骤1)、以及上述传代培养、稀释传代培养的方法中所述重悬细胞后的细胞密度为0.5~1.5×106cells/mL;进一步为1×106cells/mL。
优选地,步骤1)、以及上述传代培养、稀释传代培养的方法中所述悬浮培养的条件为35~39℃,4~6%CO2,90~160rpm培养2~5天;进一步为37℃,5%CO2,100~130rpm培养3~4天。
优选地,所述比生长速率的计算公式为:比生长速率(μ)=ln(N2/N1)/t;其中N1=t1的细胞密度,N2=t2的细胞密度;t=t2-t1。
优选地,所述驯化方法还包含如下步骤:将得到的无血清全悬浮HEK293细胞冻存。
优选地,所述细胞冻存密度为1~5×107cells/mL;进一步为1~3×107cells/mL。
优选地,所述冻存采用的冻存液包含无血清培养基和DMSO。
优选地,所述无血清培养基和DMSO的体积比为(8~10):1;进一步为9:1。
优选地,所述无血清培养基为CelerTM-S001 HEK293细胞无血清培养基、HE K293 CD培养基、FreeStyleTM 293表达培养基中的至少一种;进一步为CelerTM-S001HEK2 93细胞无血清培养基。
优选地,所述无血清全悬浮HEK293细胞为本发明第一个方面的无血清全悬浮HEK293细胞株。
本发明的第三个方面,提供一种无血清全悬浮HEK293细胞库,采用本发明第一个方面的无血清全悬浮HEK293细胞株构建得到。
优选地,所述构建方法为:采用无血清培养基对本发明第一个方面的无血清全悬浮HEK 293细胞株进行培养。
优选地,所述无血清培养基为CelerTM-S001 HEK293细胞无血清培养基、HE K293 CD培养基、FreeStyleTM 293表达培养基中的至少一种;进一步为CelerTM-S001HEK2 93细胞无血清培养基。
优选地,所述无血清全悬浮HEK293细胞株在所述无血清培养基中的密度为0.8~1.2×106cells/mL。
优选地,所述培养条件为35~39℃,4~6%CO2,90~160rpm培养2~5天;进一步为37℃,5%CO2,130~150rpm培养3~4天。
优选地,所述构建方法还包含如下步骤:将得到的细胞冻存。
优选地,所述细胞冻存密度为1~5×107cells/mL;进一步为1~3×107cells/mL。
优选地,所述冻存采用的冻存液包含无血清培养基和DMSO。
优选地,所述无血清培养基和DMSO的体积比为(8~10):1;进一步为9:1。
优选地,所述无血清培养基为CelerTM-S001 HEK293细胞无血清培养基、HE K293 CD培养基、FreeStyleTM 293表达培养基中的至少一种;进一步为CelerTM-S001HEK2 93细胞无血清培养基。
本发明第四个方面,提供第一个方面的无血清全悬浮HEK293细胞株和/或第三个方面的细胞库的应用:
本发明第一个方面的无血清全悬浮HEK293细胞株和/或第三个方面的细胞库在病毒扩增中的应用;
本发明第一个方面的无血清全悬浮HEK293细胞株和/或第三个方面的细胞库在制备用于病毒扩增的产品中的应用;
本发明第一个方面的无血清全悬浮HEK293细胞株和/或第三个方面的细胞库在制备蛋白中的应用;
本发明第一个方面的无血清全悬浮HEK293细胞株和/或第三个方面的细胞库在制备疫苗中的应用;
本发明第一个方面的无血清全悬浮HEK293细胞株和/或第三个方面的细胞库在作为和/或制备疫苗用细胞基质中的应用;
优选地,所述病毒包含腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、猪内源性逆转录病毒中的至少一种;进一步包含腺病毒。
本发明的第五个方面,提供一种疫苗用细胞基质,包含本发明第一个方面的无血清全悬浮HEK293细胞株和/或第三个方面的细胞库。
本发明的第六个方面,提供a1)~a3)中任一种方法:
a1)一种制备蛋白的方法,将外源基因转入本发明第一个方面的无血清全悬浮HEK293细胞株和/或第三个方面的细胞库中的细胞中,得到重组HEK293细胞,培养所述重组HEK293细胞,得到蛋白;
a2)一种扩增病毒的方法,将病毒接入本发明第一个方面的无血清全悬浮HEK293细胞株和/或第三个方面的细胞库中的细胞中,培养;
a3)一种制备疫苗的方法,将病毒接入本发明第一个方面的无血清全悬浮HEK293细胞株和/或第三个方面的细胞库中的细胞中,培养,得到的病毒液进行减毒或灭活处理。
优选地,a1)~a3)中所述培养的条件为35~39℃,4~6%CO2,90~160rpm;进一步为37℃,5%CO2,130~150rpm。
优选地,a2)~a3)中所述病毒的接入量为2~5MOI。
优选地,a2)~a3)中所述病毒包含腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、猪内源性逆转录病毒中的至少一种;进一步包含腺病毒。
本发明的第七个方面,提供一种疫苗,通过本发明第六个方面的制备疫苗的方法得到。
术语“疫苗”是指含有有效诱导受试者的抗特定病原体或疾病的治疗程度的免疫性的活性组分的试剂或组合物,在此是治疗性地针对感染病毒所引发的疾病。疫苗可以包括药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。
本发明的第八个方面,提供本发明第七个方面的疫苗在制备药物中的应用。
优选地,所述药物用于治疗或者预防病毒相关疾病。
术语“病毒相关疾病”是指因感染病毒所引发的疾病,本发明对于病毒的具体类型不做严格限定,例如,可以为狂犬病毒、流感病毒、冠状病毒、法氏囊病毒、登革热病毒、肠道病毒、脑炎病毒、痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、反向病毒、披膜病毒、黄病毒、肠道病毒、细小核糖核酸病毒、嵌沙样病毒、疱疹病毒、腺病毒、牛痘病毒、SARS病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、慢病毒、罗斯河病毒、西尼罗河病毒、黄热病毒、FSME病毒、甲型肝炎病毒。
本发明的疫苗可以通过标准途径给药,所述途径包括但不限于胃肠外(例如,静脉内、椎管内的、皮下或肌肉内)、口服、粘膜(例如鼻内)或局部途径。
本发明的有益效果是:
本发明通过发明人的大量创造性劳动,首次构建得到无血清全悬浮HEK293细胞株,名称为人胚肾293悬浮细胞293S-NB,于2022年12月28日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC NO:63099;该细胞生长状态稳定,分散性好,细胞密度高,活率高,产毒能力强,可用于规模化生产,进而用于制备蛋白、扩增病毒、作为和/或制备疫苗用细胞基质和制备疫苗,并且该细胞培养所采用的无血清悬浮培养基不含血清,组份明确,有利于提高规模化生物制品的品质。
本发明提供了一种驯化无血清全悬浮HEK293细胞的方法,传统的驯化方法是两步法驯化,首先通过先将贴壁培养驯化为在带血清的培养基中悬浮培养,其次对适应含血清培养基中悬浮培养的细胞进行降血清驯化,直至细胞可在无血清培养基中稳定生长,而本发明提供的是一步法驯化,将贴壁细胞直接驯化为可在无血清培养基中稳定生长、且细胞增殖密度高、活率好,适合规模化培养,该驯化方法操作简单,无需特殊设备,且传代次数少,驯化过程无需用到血清,可大幅节约成本,减少污染风险。
附图说明
图1是HEK293贴壁细胞在倒置显微镜下的形态图,比例尺为100μm。
图2是293S-NB悬浮细胞在倒置显微镜下的形态图;其中,A是10(目镜)×10(物镜)下293S-NB悬浮细胞在倒置显微镜下的形态图;B是10(目镜)×20(物镜)下293S-NB悬浮细胞在倒置显微镜下的形态图;C是10(目镜)×40(物镜)下293S-NB悬浮细胞在倒置显微镜下的形态图;比例尺均为100μm。
图3是293S-NB悬浮细胞的生长曲线图。
图4是293S-NB悬浮工作细胞库的细胞生长曲线图。
图5是感染Ad5-X后68h贴壁细胞和悬浮细胞的单细胞产量对比图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等,如无特别说明,为从商业途径得到的试剂和材料。
1实验细胞:本实施例中的HEK293购自ATCC。
2实验病毒:本实施例中用到的病毒为Ad5-X,由广州恩宝生物医药科技有限公司提供(已在专利文献CN114717251A中公开,具体为Ad5-S33)。
3主要试剂:
DMEM:Thermo Fisher Scientific,货号:C11965500BT;
1×重组胰蛋白酶:上海源培生物,货号:S342KJ;
PBS:Hyclone,货号:SH30256.01;
新生牛血清:浙江天杭,货号:22011-B615;
CelerTM-S001 HEK293细胞无血清培养基:上海倍锦生物,货号:FG0104003。
4实验设备:
生物安全柜:Thermo,型号:1379;
CO2振荡培养箱:知楚仪器,型号:ZCLY-180V;
倒置显微镜:重庆奥特光学,型号:BDS400;
细胞计数仪:Count star,型号:IC1000;
医用离心机:可成仪器,型号:L5-4KR;
程序降温盒:Easyinno,型号:EC06 2ml普款;
超低温冰箱:青岛海尔,型号:DW-86W100J;
液氮罐:青岛海尔,型号:YDS-175-216-FZ。
5计算公式:
比生长速率(μ)=ln(N2/N1)/t;
其中N1=t1的细胞密度,N2=t2的细胞密度;t=t2-t1。
实施例1无血清全悬浮HEK293细胞的构建方法
1.无血清全悬浮HEK293细胞的构建方法,包括如下步骤:
1)复苏并培养HEK293细胞,得到汇合度为80~90%的HEK293贴壁细胞,用含酚红的胰蛋白酶-EDTA(0.25%)进行消化,取适量消化下来的细胞于离心管中,用100g,25℃离心5min,丢弃上清;
2)用CelerTM-S001 HEK293细胞无血清培养基重悬,重悬至密度为1×106cells/mL,取80mL于250mL培养瓶中,放于37℃,5%CO2,100rpm的振荡培养箱中培养;
3)培养3天后进行传代:采取1mL细胞悬液进行细胞计数,收集所有培养体系与离心管中,用100g,25℃离心5min,丢弃上清,根据计数的结果加入适量的CelerTM-S001HEK293细胞无血清培养基,使得细胞密度维持在1×106cells/mL,体积为100mL,根据培养体积选择合适的培养瓶进行培养,放于37℃,5%CO2,130rpm的振荡培养箱中培养;
4)重复步骤3),直至细胞活率90%以上,细胞密度达到2×106cells/mL以上,进行稀释传代:培养3天后采取1mL细胞悬液进行细胞计数,根据计数的结果取适量细胞悬液,加入适量的CelerTM-S001 HEK293细胞无血清培养基,使得细胞密度维持在1×106cells/mL,体积为100mL,根据培养体积选择合适的培养瓶进行培养,放于37℃,5%CO2,130rpm的振荡培养箱中培养;
5)重复步骤4)中的稀释传代步骤,直至连续5代的比生长速率μ均大于0.34/d、细胞活率均高于95%;
6)以3×107cells/mL密度冻存步骤5)得到的适应CelerTM-S001 HEK293细胞无血清培养基的细胞。冻存液的成分是CelerTM-S001 HEK293细胞无血清培养基:DMSO为9:1(v/v)。将冻存管放于程序降温盒,于-80℃超低温冰箱保存,次日转移冻存管至液氮罐中保存。此细胞株命名为293S-NB。该细胞株名称为人胚肾293悬浮细胞293S-NB,于2022年12月28日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC NO:63099,分类命名为人胚肾293悬浮细胞。
2.结果
1)细胞形态观察
293S-NB细胞形态如图2所示:293S-NB在倒置显微镜下,呈现细胞膜透亮,未见结团现象,未见贴壁细胞,单个细胞悬浮状态;而HEK293贴壁细胞形态如图1所示:呈现贴壁生长的上皮细胞样形态。
2)细胞生长增殖
将冻存的293S-NB细胞复苏后,细胞的生长情况(培养条件为37℃,5%CO2,130rpm)如表1和图3所示:细胞复苏后3天可进入对数生长期,最高细胞密度可达9.75×106cells/mL,即293S-NB细胞冻存后可复苏,复苏后细胞细胞增殖可观。
表1 293S-NB细胞生长情况表
实施例2 293S-NB的应用
1扩大培养
1)取一支冻存的293S-NB细胞,于37℃水浴锅融化约2min,融化过程中摇动冻存管,将融化后的细胞液转移至含10mL CelerTM-S001 HEK293细胞无血清培养基的离心管中,以25℃、100g离心5min,弃上清,用10mL CelerTM-S001 HEK293细胞无血清培养基重悬后转移至125mL培养瓶中,再补加CelerTM-S001 HEK293细胞无血清培养基至30mL,放于37℃、5%CO2、130rpm的振荡培养箱培养;
2)培养3~4天后采取培养瓶中的细胞悬液进行细胞计数,当细胞密度达2×106cells/mL以上,且细胞活率不低于90%,细胞无异常状态(如大量残渣、死细胞了、结团、污染等),则可进行稀释传代:根据细胞计数的结果,取适量的细胞悬液加入新的培养瓶中,补加CelerTM-S001 HEK293细胞无血清培养基,使得细胞密度为1×106cells/mL,放于37℃、5%CO2、130~150rpm的振荡培养箱培养;
3)重复步骤2),期间根据需求更换培养瓶的规格和数量,直至获得约3000mL培养体积的细胞悬液,细胞密度约为5×106cells/mL,细胞活率为95%以上,则可进行冻存;
4)细胞冻存:将所有的细胞悬液转移至离心瓶中,以25℃、100g离心5min,弃上清,用冻存液重悬细胞沉淀,混匀后进行采样计数,根据计数的结果补加冻存液至细胞密度为3×107cells/mL,以1mL/管分装至冻存管中;将冻存管放入程序降温盒中,及时转移程序降温盒至超低温冰箱中保存,次日将冻存管转移至液氮罐中保存。定义为293S-NB工作细胞库。
2细胞的产毒能力
准备3瓶体积为300mL,细胞密度为2×106cells/mL的293S-NB细胞悬液;3瓶细胞数为3×106cells的HEK293贴壁细胞于T75瓶中,培养体系为20mL。以3MOI(IFU/cell)的接种量接入Ad5-X,放于37℃、5%CO2、140rpm的振荡培养箱培养,在68h收获所有培养体系,冻融离心后收集上清,进行病毒颗粒数检测。
3结果
1)细胞生长增殖
将293S-NB工作细胞库的冻存细胞复苏后,细胞的生长情况如表2和图4所示:细胞进入对数生长期的时间更短(1天),最高细胞密度可达1.18×107cells/mL。
表2 293S-NB工作细胞库的细胞生长曲线
2)细胞的产毒能力
通过HPLC进行病毒颗粒数检测,结果如表3和图5所示:293S-NB可用于病毒生产,在染毒后68h可获得的单细胞产量为1.99×105VP的病毒,高于贴壁细胞的单细胞产量2.11×104VP。
表3.感染Ad5-X后68h贴壁细胞和悬浮细胞的产毒量
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种无血清全悬浮HEK293细胞株,名称为人胚肾293悬浮细胞 293S-NB,于2022年12月28日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC NO:63099。
2.一种无血清全悬浮HEK293细胞库,采用权利要求1所述的无血清全悬浮HEK293细胞株构建得到。
3.权利要求1所述的无血清全悬浮HEK293细胞株或权利要求2所述的细胞库在(1)~(5)中任一项中的应用;
(1)病毒扩增;
(2)制备用于病毒扩增的产品;
(3)制备蛋白;
(4)制备疫苗;
(5)作为和/或制备疫苗用细胞基质。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于:
所述病毒为腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、猪内源性逆转录病毒中的至少一种。
5.一种疫苗用细胞基质,包含权利要求1所述的无血清全悬浮HEK293细胞株或权利要求2所述的细胞库。
6.一种制备蛋白的方法,将外源基因转入权利要求1所述的无血清全悬浮HEK293细胞株或权利要求2所述的细胞库中的细胞中,得到重组HEK293细胞,培养所述重组HEK293细胞,得到蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:
所述培养的条件为35~39℃,4~6%CO2,90~160rpm。
8.a1)~a2)中任一种方法:
a1)一种扩增病毒的方法,将病毒接入权利要求1所述的无血清全悬浮HEK293细胞株或权利要求2所述的细胞库中的细胞中,培养;
a2)一种制备疫苗的方法,将病毒接入权利要求1所述的无血清全悬浮HEK293细胞株或权利要求2所述的细胞库中的细胞中,培养,得到的病毒液进行减毒或灭活处理。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于:
a1)、a2)中所述培养的条件为35~39℃,4~6%CO2,90~160rpm。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于:
a1)、a2)中所述病毒为腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、猪内源性逆转录病毒中的至少一种。
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