CN109337858B - 用于乙肝病毒感染的原代肝细胞来源的肝前体样细胞模型、制备方法及应用 - Google Patents

用于乙肝病毒感染的原代肝细胞来源的肝前体样细胞模型、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生命科学和医学中乙型肝炎病毒感染细胞模型领域，提供了一种用于乙肝病毒感染的原代肝细胞来源的肝前体样细胞模型、制备方法及应用，该肝前体样细胞模型由三维分化后的功能肝细胞组成，该三维分化后的功能肝细胞由人原代肝细胞在体外转化培养后得到的肝前体样细胞经三维培养和肝向成熟培养后得到。通过实验验证，本发明中的肝前体样细胞模型感染HBV后，能够高表达RXRA、HNF4A、NTCP等HBV感染相关基因，可用于乙肝病毒感染研究或和HBV共培养用于制备乙肝病毒感染细胞模型。

Description

用于乙肝病毒感染的原代肝细胞来源的肝前体样细胞模型、 制备方法及应用
技术领域
本发明涉及细胞改造技术领域，具体涉及一种人类原代肝细胞来源的肝前体样细胞(Hepatocyte-derived Liver Progenitor-like Cells，HepLPCs)，特别涉及利用该细胞在体外进行三维培养用于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染研究及其制备方法，属于生命科学和医学中乙型肝炎病毒感染细胞模型领域。
背景技术
乙型病毒性肝炎(viral hepatitis type B，简称乙肝)是由HBV引起的以肝脏病变为主的一种传染病，是全球性的公共卫生问题，也是我国的重要传染病之一。由于HBV的生活周期较为复杂，明确认识HBV的感染和复制规律对于防治乙型病毒性肝炎具有重要意义。而深入地对HBV生活周期进行医学研究，有赖于良好的细胞感染模型。
目前，可用于HBV研究的细胞主要有人或树鼩的原代肝细胞及少部分人肝癌细胞系。人或树鼩的原代肝细胞对HBV敏感，但是来源稀缺，分离及培养条件要求高，且难以在体外长期维持培养。人肝癌细胞系自然状态下对HBV不敏感，经过长期研究，科学家发现部分人肝癌细胞系可以通过过表达NTCP(HepG2-NTCP)或长期小分子肝向分化(HepRG，20-30天肝向分化)条件下实现HBV感染。但上述两种条件分别存在外源基因导入和时间成本高昂等缺点，且人肝癌细胞系遗传背景单一，无法模拟HBV感染细胞的异质性。
鉴于上述情况，迫切需要一种个体来源的，可长时间体外扩增培养，且在自然条件下能稳定有效感染HBV的细胞模型及其制备方法，以满足对乙型肝炎病毒相关医学研究及其药物开发的需要。
发明内容
本发明的目的在于，依托上述研究背景，提供一种人原代肝细胞来源的，用于乙型肝炎病毒感染研究肝前体样细胞模型、其建立方法以及在制备乙肝病毒感染细胞模型中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种乙肝病毒感染细胞模型、其制备方法以及在乙肝病在制备抗乙肝病毒药物中的用途。
本发明的第一方面，提供了一种肝前体样细胞模型，该肝前体样细胞模型由三维分化后的功能肝细胞(Three dimensional hepatic differentiated HepLPCs，3D-HepLPCs-Hep)组成，该三维分化后的功能肝细胞由人原代肝细胞(PHCs)在体外转化培养后得到的肝前体样细胞(HepLPCs)经三维培养和肝向成熟培养后得到。
本发明的第二方面，提供了上述肝前体样细胞模型的制备方法，包括以下步骤：
A.肝前体样细胞获得
将人原代肝细胞接种于胶原蛋白I或Matrigel基质包被的培养支持物(培养皿或培养板)中，经含血清的WE培养基贴壁培养后，更换成肝细胞转化增殖培养基(Transitionand Expansion Medium，TEM)，经过一定时间诱导培养后，将人原代肝细胞转化为可在体外扩增并传代的肝前体样细胞(HepLPCs)。
B.肝前体样细胞的三维培养及肝向成熟
将步骤A中得到的处于增殖状态的肝前体样细胞(HepLPCs)在胰蛋白酶TrypLEExpress中消化成单个细胞，经混合培养基重悬后，接种入低粘附细胞培养支持物中，一段时间后形成肝细胞球；然后将培养基更换为肝细胞分化培养基(Hepatic MaturationMedium，HMM)，培养一定时间进一步成熟，得到三维分化后的功能肝细胞。
其中，混合培养基由肝细胞转化增殖培养基和肝细胞分化培养基以体积比为1:1的比例混合而成。所述肝细胞分化培养基包括基础支持物和小分子添加物两部分，所述基础支持物为添加有N2添加剂和B27添加剂的DMEM/F12培养基，所述小分子添加物由7～15μmol/Lγ分泌酶抑制剂DAPT、17～23ng/mL抑瘤素OSM、7～15μmol/L地塞米松以及7～15μmol/LATP竞争性ALK5抑制剂SB431542组成。
本发明所采用的人原代肝细胞可通过商业途径购买，如购买自Invitrogen公司，也可采用经典的两步灌流法自行分离，可参考文献(Maurel P.，Hepatocytes-Methods andProtocols，METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，ISSN 1064-3745)。
优选的，步骤A中，WE培养基中血清的体积百分比为8％～12％。人原代肝细胞贴壁后，细胞形态在3～5天发生改变，细胞拉长并可出现多个向外延伸的凸起，细胞核体积增大；5～7天细胞出现典型的上皮细胞形态并开始快速增殖；7～10天细胞可传代并持续增殖。
肝细胞转化增殖培养基包含基础支持物和小分子添加物两部分，所述基础支持物为改良型DMEM/F12培养基，该改良型DMEM/F12培养基中添加有N2添加剂、B27添加剂、0.5～1.5mmol/L丙酮酸钠以及5～50μg/mL抗坏血酸维生素C；小分子添加物由5～25ng/mL肝细胞生长因子HGF、5～25ng/mL表皮细胞生长因子EGF、5～20μmol/LROCK激酶抑制剂Y27632、1～5μmol/LWnt信号通路激动剂CHIR99021、0.5～2μmol/LTGF-β信号抑制剂A83-01、0.5～2μmol/L一磷酸鞘氨酸S1P以及2～10μmol/L吲哚乙酸LPA组成。
本发明中，用于步骤A中肝前体样细胞诱导培养的TEM培养基和步骤B中用于肝前体样细胞的三维培养及肝向成熟的HMM培养基中小分子添加物的组分为发明人通过实验筛选得到，分别为实现肝前体样细胞诱导培养和实现肝前体样细胞的三维转化必不可少的组分，缺少其中任一组分均无法实现相应功能，以最大程度降低细胞培养成本。
关于两种小分子添加物的组分含量，宜在上述所示的小范围内波动，波动范围过大，极容易导致无法起到相应作用或者对细胞产生毒副作用的情况发生。
在本发明中后续的优选实施例中，记载了两种培养基组分的优选情况，如下：
肝细胞分化培养基(TEM)包括基础支持物和小分子添加物两部分，基础支持物为添加有N2添加剂和B27添加剂的DMEM/F12培养基；小分子添加物由10μmol/Lγ分泌酶抑制剂DAPT、20ng/mL抑瘤素OSM、10μmol/L地塞米松以及10μmol/LATP竞争性ALK5抑制剂SB431542组成。
肝细胞转化增殖培养基(HMM)包含基础支持物和小分子添加物两部分，基础支持物为改良型DMEM/F12培养基，该改良型DMEM/F12培养基中添加有N2添加剂、B27添加剂、1mmol/L丙酮酸钠以及10μg/mL抗坏血酸维生素C；小分子添加物由20ng/mL肝细胞生长因子HGF、20ng/mL表皮细胞生长因子EGF、10μmol/LROCK激酶抑制剂Y27632、3μmol/LWnt信号通路激动剂CHIR99021、1μmol/LTGF-β信号抑制剂A83-01、1μmol/L一磷酸鞘氨酸S1P以及5μmol/L吲哚乙酸LPA组成。
优选的，步骤A中，贴壁后的人原代肝细胞在肝细胞转化增殖培养基中诱导培养7～14天得到肝前体样细胞，培养过程中隔天换液。
优选的，步骤B中，单个细胞接种入低粘附细胞培养支持物中48小时后形成肝细胞球，在肝细胞分化培养基培养8～10天后得到三维分化后的功能肝细胞，在分化培养过程中每天进行换液。
通过实验验证，三维分化后的功能肝细胞高表达RXRA、HNF4A、NTCP等HBV感染相关基因，以NTCP的表达量升高最为明显，参见说明书附图8。此外，采用TRIzol试剂提取六位不同捐献者来源的原代肝细胞(PHCs)、肝前体样细胞(HepLPCs)、三维分化后的功能肝细胞(3D-HepLPCs-Hep)的总RNA。使用SYBR Green PCR kit在
Figure BDA0001806046470000041
96Real-Time PCRSystem中进行荧光定量PCR。结果显示，不同捐献者来源的细胞NTCP表达具有个体异质性，但3D-HepLPCs-Hep中NTCP表达基本稳定在PHCs的0.5倍水平，参见说明书附图9。说明经三维培养分化后的功能肝细胞可用于乙肝病毒感染研究或用于制备乙肝病毒感染细胞模型。
因此，本发明的第三方面，提供了肝前体样细胞模型在制备乙肝病毒感染细胞模型中的应用。
本发明的第四方面，提供了一种乙肝病毒感染细胞模型，该模型由肝前体样细胞模型和HBV病毒共培养而成，所述HBV病毒来自乙肝患者血清或HepG2.2.15细胞培养上清浓缩液，感染复数为300～350，优选300。
本发明的第五方面，提供了乙肝病毒感染细胞模型的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：A.将肝前体样细胞模型与乙肝患者血清或HepG2.2.15细胞培养上清浓缩液共培养于添加有体积分数为1％的二甲基亚砜和体积分数为4％的聚乙二醇8000的肝细胞转化增殖培养基中；B.感染24小时后，使用培养基清洗三至四遍，随后每24小时换液，收集上清液存储于-80℃环境中备用。
通过HBV相关指标检测实验，分别检测不同时间点收集到的上清液中HBV-DNA病毒滴度，并检测上清中分泌的HBeAg和HBsAg。同时采用Southernblot检测细胞中是否存在cccDNA来判断细胞是否被HBV感染。
结果显示，3D-HepLPCs-Hep(分化10天)可被HBV感染，且随着时间增加，上清中的HBV-DNA、HBsAg和HBeAg逐渐升高并达到稳定，该过程可被逆转录抑制剂恩替卡韦(ETV)或者NTCP竞争性抑制剂牛磺脱氧胆酸(TUDC)阻断。同时，不同捐献者来源的3D-HepLPCs-Hep中均能够检测到cccDNA存在，说明细胞被HBV感染。说明本发明中的肝前体样细胞模型能够完全用于制备乙肝病毒感染细胞模型。
本发明的第六方面，提供了乙肝病毒感染细胞模型在制备抗乙肝病毒药物中的用途。3D-HepLPCs-Hep可在体外被乙肝患者血清HBV或者HepG2.2.15细胞分泌的HBV感染，且可用于HBV cccDNA基因特异性sgRNA引导的CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗HBV感染的探索。
本发明的第七方面，提供了一种抗乙肝病毒药物组合物，其特征在于，包括抗乙肝病毒活性组分以及药学上可接受的药物载体，抗乙肝病毒活性组分为针对HBV cccDNA的Cas9/sgRNAs腺病毒或Cas9/sgRNAs腺病毒与恩替卡韦的联合。
本发明的有益保障及效果：
本发明提供的用于乙肝病毒感染的原代肝细胞来源的肝前体样细胞模型、制备方法及应用，具有如下技术效果：
(1)本发明肝前体样细胞模型由三维分化后的功能肝细胞(3D-HepLPCs-Hep)组成，该三维分化后的功能肝细胞由人原代肝细胞在体外转化培养后得到的肝前体样细胞(HepLPCs)经三维培养和肝向成熟培养后得到。细胞来源全新，与以往功能肝细胞由肝癌细胞分化而来完全不同，不仅染色体稳定，而且完全避免了致瘤风险；
(2)肝前体样细胞转化效率高，可实现个体细胞来源建系，构建HepLPCs异质性细胞库；
(3)HepLPCs无外源基因导入，为建立自然状态下HBV感染细胞模型提供基础；
(4)HepLPCs在低粘附状态下可形成三维肝细胞球，并在在肝细胞分化培养基的作用下快速获得肝功能，节约了时间成本；
(5)通过该体系运用探索腺病毒介导的HBV cccDNA基因特异性sgRNA引导的CRISPR/Cas9治疗HBV效果明显，并首次发现联合恩替卡效果更佳。
因此，本发明为乙肝病毒的感染、复制规律以及生活周期研究提供了新的方向，进而为乙型病毒肝炎的预防和治疗提供了有利的理论研究基础，具备广阔的临床应用前景。
附图说明
图1为原代肝细胞(PHCs)在商品化的肝细胞增殖培养基(Hepatocyte growthmedium，HGM，购自Lonza公司)和在改良的肝细胞转化增殖培养基(Transition andExpansion Medium，TEM)中培养第0天和第10天的明场照片，刻度杆表示200μm；
图2为肝前体样细胞(HepLPCs)的生长曲线，肝前体样细胞(HepLPCs)分别来自于三个不同的捐献者；
图3为肝前体样细胞(HepLPCs)的倍增时间结果，肝前体样细胞(HepLPCs)同样分别来自于三个不同的捐献者；
图4为Edu实验检测第10代肝前体样细胞(HepLPCs)增殖潜能结果图，刻度杆表示50μm；
图5为肝前体样细胞(HepLPCs)的典型核型图像，数据来自三个不同的捐献者，其中两个保持正常的二倍体核型，而第三个中一个细胞出现5号染色体上有三倍体；
图6为三维分化后的功能肝细胞(3D-HepLPCs-Hep)形成示意图，刻度杆表示50μm；
图7为肝前体样细胞(HepLPCs)三维球体形成和肝向分化的时间变化，刻度杆代表200μm；
图8为采用QPCR方法分析RXRA、HNF4A和NTCP在平面分化或三维分化中的表达情况，n.s.表示非显著，*表示P小于0.05，**表示P小于0.01，***P小于0.001；
图9为采用QPCR方法分析NTCP在原代肝细胞(PHCs)、肝前体样细胞(HepLPCs)、三维分化后的功能肝细胞(3D-HepLPCs-Hep)的表达情况，数据来自六个不同的捐献者；
图10为三维分化后的功能肝细胞(3D-HepLPCs-Hep)感染HBV病毒后，细胞上清中HBV-DNA、HBsAg、HBeAg分泌情况；
图11为采用Southern blot实验检测感染HBV病毒后的3D-HepLPCs-Hep细胞样本中cccDNA表达情况；
图12为HBV-sgRNAs CRISPR/Cas9腺病毒载体示意图；
图13为治疗后，细胞上清HBV-DNA、HBsAg、HBeAg分泌情况，n.s.表示非显著，*表示P小于0.05，**表示P小于0.01，***P小于0.001。
具体实施方式
以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，提取总RNA方法、实时荧光PCR法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais，T.(1989)MolecularCloning：A Laboratory Manual，2ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和分数按重量计算。
下列实施例中，所有试剂均可从商业途径获得，如下：Matrigel基质(Corning公司)，含10％血清的WE培养基(Invitrogen公司)，改良后DMEM/F12培养基(Invitrogen公司)，N2和B27添加剂(两者均购自Invitrogen公司)，丙酮酸钠(sodium pyruvate，购自Invitrogen公司)，抗坏血酸维生素C(ascorbic acid，购自Sigma-Aldrich公司)；肝细胞生长因子HGF、表皮细胞生长因子EGF(两者购自Peprotech公司)，ROCK激酶抑制剂Y27632、Wnt信号通路激动剂CHIR99021、TGF-β信号抑制剂A83-01(三者购自TargetMol公司)，一磷酸鞘氨酸S1P和吲哚乙酸LPA(两者购自Santa Cruz公司)，TrypLE Express(购自Invitrogen公司)，γ分泌酶抑制剂DAPT(购自TargetMol公司)，抑瘤素OSM(购自Peprotech公司)，地塞米松(购自Sigma-Aldrich公司)，ATP竞争性ALK5抑制剂SB431542(购自TargetMol公司)。
实施例1.肝前体样细胞HepLPCs的获得及相关特性鉴定
1、细胞培养板预包被
采用Matrigel基质进行包被，将冷冻保存的Matrigel基质放置4℃过夜，使其成为液态，用预冷的无血清培养基(如DMEM)按1:30稀释，加入培养孔中，以覆盖底面为宜，放置37℃一小时后即可使用。
2、肝前体样细胞HepLPCs获得
以2×104个细胞/cm2的密度将原代肝细胞(PHCs)接种于Matrigel包被的细胞培养6孔板(购自Corning公司)中，经含10％血清的WE培养基贴壁后，实验组更换成改良的肝细胞转化增殖培养基(Transition and Expansion Medium，TEM)培养，对照组更换成商品化的肝细胞增殖培养基(Hepatocyte growth medium，HGM，购自Lonza公司)。
肝细胞转化增殖培养基包含基础支持物和小分子添加物两部分，基础支持物为改良型DMEM/F12培养基，该改良型DMEM/F12培养基中添加有N2添加剂、B27添加剂、1mmol/L丙酮酸钠以及10μg/mL抗坏血酸维生素C；小分子添加物包括20ng/mL肝细胞生长因子HGF、20ng/mL表皮细胞生长因子EGF、10μmol/L ROCK激酶抑制剂Y27632、3μmol/L Wnt信号通路激动剂CHIR99021、1μmol/L TGF-β信号抑制剂A83-01、1μmol/L一磷酸鞘氨酸S1P以及5μmol/L吲哚乙酸LPA。
培养过程中隔天换液，在细胞培养箱中培养10天，于第10天在显微镜下观察细胞生长情况。实验结果如图1所示，TEM培养条件下细胞扩增，而HGM培养条件下细胞大部分死亡(见图1)。
3、HepLPCs的生长曲线和倍增时间测定
将三个捐献者捐献的原代肝细胞(PHCs)采用步骤2中的方法进行转化增殖培养，转化成能够传代培养的肝前体样细胞HepLPCs。
将传代过程中的1000个HepLPCs接种于Matrigel包被的细胞培养6孔板中，加入TEM培养。分别于培养后第1天，第2天，第3天，第4天，第5天用TrypLE Express消化成单个细胞，血球技术板计数并绘制生长曲线，用在线倍增时间计算工具http://www.doubling-time.com/compute.php.计算倍增时间。
结果如图2和图3所示，转化自三个捐献者原代肝细胞的HepLPCs均生长迅速，无明显个体差异(见图2)，倍增时间均约为24小时，也不存在个体差异(见图3)。
4、EdU细胞增殖实验检测HepLPCs增殖潜能
将传至第10代的HepLPCs，用EdU细胞增殖检测试剂盒(Cell-LightTM EdU
Figure BDA0001806046470000071
In Vitro Imaging Kit，购自RiboBio公司)检测，检测过程按照说明书进行操作，使用荧光显微镜拍照。
结果如图4所示，HepLPCs在第10代时依然能够保持旺盛的增殖能力，可实现个体细胞来源建系。
5、HepLPCs核型分析
将处于指数生长期的第10代的HepLPCs与100ng/mL秋水仙素在细胞培养箱中37℃温育40分钟，然后PBS清洗3遍，使用Accutase消化成单细胞。后续核型操作实验及分析由Biocytogen公司核型分析部门完成，至少计数来自40个中期停滞细胞的染色体。
结果如图5显示，HepLPCs具有稳定的核型，仅有第三位捐献者来源的细胞出现少部分异常，其5号染色体增加1条。
实施例2HepLPCs的三维培养及肝向成熟
1、HepLPCs三维成球培养
将2×106个处于增殖状态的HepLPCs在胰蛋白酶TrypLE Express中消化成单个细胞，然后经混合培养基重悬，该混合培养基由TEM培养基与HMM培养基等体积混合而成，而后接种于低粘附的细胞培养6孔板(购自Corning公司)中；待细胞形成细胞球后，将培养基改为肝细胞分化培养基(Hepatic Maturation Medium，HMM)，在HMM培养基中继续进行分化8-10天进一步成熟，成为三维分化后的功能肝细胞(3D-HepLPCs-Hep)。在培养过程中，于不同时间点用光学显微镜拍照记录。
肝细胞分化培养基HMM包括基础支持物和小分子添加物两部分，基础支持物为添加有N2添加剂和B27添加剂的DMEM/F12培养基；小分子添加物包括10μmol/Lγ分泌酶抑制剂DAPT、20ng/mL抑瘤素OSM、10μmol/L地塞米松以及10μmol/L ATP竞争性ALK5抑制剂SB431542。在分化培养过程中需每天进行换液。
三维成球培养的示意图如图6所示，实际结果如图7所示，HepLPCs细胞6小时内开始聚集，48小时后形成细胞球，接种入HMM培养基10天后分化成熟，成为三维分化后的功能肝细胞(3D-HepLPCs-Hep)。
2、三维肝向分化过程中HBV感染相关基因变化
采用TRIzol试剂盒(购自Invitrogen公司)分别提取平面分化(Monor-Diff)和三维分化(3D-Diff)细胞的总RNA；然后使用SYBR Green PCR kit(购自Roche公司)在
Figure BDA0001806046470000081
96Real-Time PCR System(购自Roche公司)中进行荧光定量PCR。
结果如图8所示，HBV感染相关基因RXRA、HNF4A和NTCP表达在三维分化条件下都有所上升，以NTCP的升高最为明显。
3、不同捐献者来源3D-HepLPCs-Hep的NTCP表达情况
采用TRIzol试剂(购自Invitrogen公司)提取6位不同捐献者来源的原代肝细胞(PHCs)，HepLPCs，3D-HepLPCs-Hep的总RNA。使用SYBR Green PCR kit(购自Roche公司)在
Figure BDA0001806046470000091
96Real-Time PCR System(购自Roche公司)中进行荧光定量PCR。
结果如图9所示，不同捐献者来源的细胞NTCP表达具有个体异质性，但3D-HepLPCs-Hep中NTCP表达基本稳定在PHCs的0.5倍水平。
实施例3 3D-HepLPCs-Hep感染HBV及应用研究
1、乙肝病毒感染细胞模型的制备
将3D-HepLPCs-Hep与乙肝患者血清或HepG2.2.15细胞培养上清浓缩液共培养于添加有体积分数为1％的二甲基亚砜和体积分数为4％的聚乙二醇8000的肝细胞转化增殖培养基中；感染24小时后，使用培养基清洗三至四遍，随后每24小时换液，收集上清液存储于-80℃环境中备用。
2、HBV相关指标检测
分别取上述收集的第2天、第4天、第6天、第8天、第10天的上清，用ABI 7500(购自Life Technologies Corporation)实时荧光PCR法检测上清中HBV-DNA病毒滴度，用Architect i2000SR分别通过architect HBeAg Reagent kit(6c32)和architect HBsAgKit(6c36)检测上清中分泌的HBeAg和HBsAg。
结果如图10所示，3D-HepLPCs-Hep(分化10天)可被HBV感染，且随着时间增加，上清中的HBV-DNA、HBsAg和HBeAg逐渐升高并达到稳定，该过程可被逆转录抑制剂恩替卡韦(ETV)或者NTCP竞争性抑制剂牛磺脱氧胆酸(TUDC)阻断。
3、共价闭合环状DNA(cccDNA)的Southern blot检测
Southern blot检测细胞中是否存在cccDNA是判断细胞被HBV感染的金标准。收集上述被感染后10天的细胞，用改良的Hirt提取法抽提病毒DNA。根据cccDNA的天然特性，DNA样品先在95℃加热10分钟，一组进行EcoRI酶切线性化cccDNA,一组不进行酶切。后续凝胶电泳和Southern blot步骤参照文献方式进行(Gao W,Hu J.Formation ofhepatitis Bvirus covalently closed circular DNA:removal ofgenome-linkedprotein.J Virol2007；81:6164-6174.)。
结果如图11显示，与原代肝细胞相比，三个捐献者来源的3D-HepLPCs-Hep中均能够检测到cccDNA存在。
4、HBV cccDNA基因特异性sgRNA引导的CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗HBV感染的探索
如上所述建立HBV感染细胞模型，然后用ETV、CAS9/HBV(针对HBV cccDNA的Cas9/sgRNAs的腺病毒)或ETV联合CAS9/HBV治疗15天。两个经验证的sgRNA序列来自已发表文献(Ramanan V,Shlomai A,Cox DB et al.CRISPR/Cas9cleavage ofviral DNA efficientlysuppresses hepatitis B virus.Sci Rep 2015；5:10833.)，插入图12所示的载体腺病毒穿梭载体pAdeno-U6-spgRNA v2.0-CMV-3Flag-spCas9/HBV中。
用腺病毒骨架质粒pPE3-GFP包装腺病毒(购自Obio Technology公司)，然后将腺病毒加入HBV感染细胞模型中，在感染复数60条件下持续8小时，恩替卡韦(ETV，0.5μM，购自TargetMol公司)在整个15天的治疗过程中继续加入。分别收集第5天、第10天、第15天培养上清，用ABI 7500(购自Life Technologies Corporation)实时荧光PCR法检测上清中HBV-DNA病毒滴度，用Architect i2000SR分别通过architect HBeAg Reagent kit(6c32)和architect HBsAg Kit(6c36)检测上清中分泌的HBeAg和HBsAg。
结果如图13所示，Cas9/sgRNAs组能明显降低三个指标，联合ETV治疗效果更佳，提示Cas9/sgRNAs腺病毒联合ETV是一种很有潜力的HBV治疗手段。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (6)

1.一种肝前体样细胞模型，其特征在于，所述肝前体样细胞模型由三维分化后的功能肝细胞组成，该三维分化后的功能肝细胞由人原代肝细胞在体外转化培养后得到的肝前体样细胞经三维培养和肝向成熟培养后得到，
所述的肝前体样细胞模型的建立方法包括以下步骤：
A. 肝前体样细胞获得
将人原代肝细胞接种于胶原蛋白I或Matrigel基质包被的培养支持物中，经含血清
的WE培养基贴壁培养后，更换成肝细胞转化增殖培养基，经过一定时间诱导培养后，将所述人原代肝细胞转化为可在体外扩增并传代的肝前体样细胞，
B. 肝前体样细胞的三维培养及肝向成熟
将步骤A中得到的处于增殖状态的所述肝前体样细胞在胰蛋白酶中消化成单个细
胞，经混合培养基重悬后，接种入低粘附细胞培养支持物中，一段时间后形成肝细胞球；然后将培养基更换为肝细胞分化培养基，培养一定时间进一步成熟，得到所述三维分化后的功能肝细胞，
其中，所述混合培养基由所述肝细胞转化增殖培养基和所述肝细胞分化培养基以体积比为1:1的比例混合而成，
所述肝细胞转化增殖培养基包含基础支持物和小分子添加物两部分，所述基础支持物为改良型DMEM/F12培养基，该改良型DMEM/F12培养基中添加有N2添加剂、B27添加剂、0.5~1.5mmol/L丙酮酸钠以及5~50μg/mL抗坏血酸维生素C；所述小分子添加物由5~25 ng/mL肝细胞生长因子HGF、5~25ng/mL表皮细胞生长因子EGF、5~20μmol/L ROCK激酶抑制剂Y27632、1~5μmol/L Wnt信号通路激动剂CHIR99021、0.5~2μmol/L TGF-β信号抑制剂A83-01、0.5~2μmol/L一磷酸鞘氨酸S1P 以及2~10μmol/L吲哚乙酸 LPA组成，
所述肝细胞分化培养基包括基础支持物和小分子添加物两部分，所述基础支持物为
添加有N2添加剂和B27添加剂的DMEM/F12培养基，所述小分子添加物由7~15μmol/L γ分泌酶抑制剂DAPT、17~23 ng/mL抑瘤素OSM、7~15μmol/L地塞米松以及7~15μmol/L ATP竞争性ALK5抑制剂SB431542组成。
2.根据权利要求1所述的肝前体样细胞模型，其特征在于：
其中，步骤A中，所述WE培养基中血清的体积百分比为8%~12%。
3.根据权利要求1所述的肝前体样细胞模型，其特征在于：
其中，步骤A中，贴壁后的人原代肝细胞在所述肝细胞转化增殖培养基中诱导培养7~14天得到所述肝前体样细胞，培养过程中隔天换液。
4.根据权利要求1所述的肝前体样细胞模型，其特征在于：
其中，步骤B中，所述单个细胞接种入低粘附细胞培养支持物中48小时后形成肝细胞球，在所述肝细胞分化培养基培养8~10天后得到所述三维分化后的功能肝细胞，
在分化培养过程中每天进行换液。
5.一种乙肝病毒感染细胞模型，其特征在于，该模型由权利要求1所述的肝前体样细胞模型和HBV病毒共培养而成，所述HBV病毒来自乙肝患者血清或HepG2.2.15细胞培养上清浓缩液，感染复数为300~350，
所述的乙肝病毒感染细胞模型的制备方法包括如下步骤：
A. 将所述肝前体样细胞模型与所述乙肝患者血清或HepG2.2.15细胞培养上清浓缩
液共培养于添加有体积分数为1%的二甲基亚砜和体积分数为4%的聚乙二醇8000的肝细胞转化增殖培养基中；
B. 感染24小时后，使用培养基清洗三至四遍，随后每24小时换液，收集上清液
存储于-80℃环境中备用。
6.权利要求5所述的乙肝病毒感染细胞模型在制备抗乙肝病毒药物中的用途。
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