CN103396985A - 诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法与应用，包括肝细胞生长因子（HGF）、成纤维细胞生长因子-4（FGF-4）和基础培养基。本发明所述的方法包括如下步骤：选取第5—10代的人脐带间充质干细胞，以5×103/cm2的细胞密度接种于6孔培养板中，过夜培养，次日待细胞贴壁，去除正常生长培养基，换为肝细胞诱导分化培养基（IMDM培养基中含有HGF40ng/ml、FGF-410ng/ml及1%胎牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素和1μg/ml两性霉素），置于37℃，5%CO2培养箱中培养21天，每3天换液一次。经过本发明所述方法的诱导，人脐带间充质干细胞在体外可以分化为肝细胞，为采用细胞替代或者基因治疗方法治疗多种肝损伤疾病提供了重要的细胞来源。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用诱导剂HGF和FGF联合高效诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法和应用。
背景技术
肝脏疾病是危害全世界人民健康的疾病，尤其我国是病毒性肝炎的高发区，由病毒性肝炎导致的重症肝炎死亡率可达50%—70%或更高。肝移植是终末期肝病有效的治疗手段，虽然劈离式、活体劈离式等各种肝移植术可以最大限度的利用供肝，但其操作复杂、患者需终生免疫，临床应用受到了极大的限制；并且由于肝源的缺乏，使得一部分患者在等待中死亡；而对于肝脏细胞体外分离培养方法、肝细胞再生及在肝脏损伤修复中的作用都尚待进一步的阐明。因此，寻求非肝源干细胞并促进其向肝细胞定向分化是亟待解决的重要问题。
肝组织工程的首要问题是寻找来源充足并有稳定的肝特异性功能的种子细胞。成熟肝脏细胞具有诸多不足而不能成为满意的细胞来源，例如，从肝功能衰竭获取肝脏细胞难度较大、异基因肝脏细胞可能产生免疫排斥反应、体外培养易失去活性与功能等。在过去30年中，研究者们发现肝干/祖细胞不但存在于原前肠胚层而且来源于囊胚内细胞群；既可自胎儿、新生儿、成体肝脏分离出，也可存在于肝外组织。
近年来，干细胞疗法成为组织胚胎学、医学伦理学等方面最为关注的焦点之一，又由于成体干细胞可塑性和横向分化的发现，干细胞临床应用成为当今干细胞组织工程、再生医学解决重要疾病的研究方向，于是，人们希望从间充质干细胞中找到解决肝脏疾病的治疗方案。
高浓度的肝细胞生长因子（HGF)可以体外诱导大鼠骨髓细胞分化为肝细胞，并表达ALB、CK18、CK8等。同时，大鼠和人的多能成体前体细胞在添加有HGF或成纤维细胞生长因子-4（FGF-4）的培养基中进行培养，均可向肝细胞方向分化。
本发明建立了一种新的诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的方法，联合使用肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子-4，与目前的常用诱导方法相比，极大的提高了诱导效率，有助于为细胞移植治疗肝损伤提供更多更具活性的的种子细胞来源。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种有效的诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法。
本发明的另一目的在于提供所述诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法的应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：一种诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的方法，包括以下步骤：
（1）配制诱导培养基：在IMDM培养基中添加40ng/ml 的HGF、10ng/ml 的FGF-4、1%的胎牛血清、100 U/ml的青霉素、100 ug/ml的链霉素和1 μg/ml的两性霉素；
（2）选取第5—10代的人脐带间充质干细胞，以5×103/cm2的细胞密度接种于6孔培养板中，过夜培养；
（3）待细胞贴壁后，去除正常生长培养基，换为肝细胞诱导培养基，置于37℃，5% CO2培养箱中；
（4）每3天换液一次，诱导培养21天，收获诱导后的细胞。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）所用的人脐带间充质干细胞来源于免疫系统尚未发育完善的新生儿脐带，所以人脐带间充质干细胞作为组织工程的种子细胞在进行移植后引起免疫排斥机率相对较小，而且由于脐带传统上作为医疗废弃物，所以脐带间充质干细胞的来源也具有易获得性。
（2）所用诱导方法同时使用了HGF和FGF-4两种生长因子，并且优化了组合作用浓度，达到了诱导效率的最佳化。本发明是一种高效的将人脐带间充质干细胞诱导分化为肝细胞的方法，为治疗肝脏损伤提供了稳定可靠的移植细胞的来源。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是免疫荧光技术分析肝细胞特异性蛋白的表达，其中a、c、e为诱导组，b、d、f为诱导组。
图2 是Real-time PCR分析肝细胞特异性基因mRNA的表达。
具体实施方式
一、人脐带间充质干细胞制备。
无菌条件下取得人脐带，6 小时内分离细胞。0.25% 碘伏浸泡3 min后，用生理盐水洗去表面及血管内血凝块（尽量完全将血块去除以减少血细胞污染），借助手术镊子将脐带撕开，去除血管，挑取华尔通胶质（又称脐带基质），剪成1～2 mm3 大小得组织块，并均匀加到24孔板里，用含有10% (v/v) FBS，5 ng/ml bFGF，216 μg/ml 谷氨酸盐，2 mg/ml NaHCO3，100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素，1 μg/ml两性霉素B的L-DMEM培养液培养，混匀板里组织块，置CO2 培养箱（37℃，5% CO2）中培养。期间不能摇晃培养板。大约10天后，用倒置显微镜观察细胞，可见有梭形细胞从组织块中游离出来。待原代细胞长满至90%时传代，先去除（尽量除尽）板中组织块，PBS洗一次，再用0.25%的胰蛋白酶和EDTA的混合消化液于37℃培养箱中消化2～5 min，倒置显微镜下观察，见到细胞皱缩，聚集并开始有部分悬浮时，立即加入含有10% FBS的L-DMEM培养液中止消化，用移液器将细胞吹打至悬浮，转至离心管中，1054 rpm离心5 min，取沉淀的细胞，用生长培养液吸打混匀后计数，以1～2×105 接种至25 cm2 的培养瓶中（从第二代起以3×105 接种），2～3天换液，待细胞长满95%时，照上述方法进行传代。
二、人脐带间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞。
选取第5－10代的间充质干细胞，以5×103/cm2的细胞密度接种于6孔或24孔培养板中，过夜培养，次日待细胞贴壁，弃正常生长培养基，换为肝细胞方向诱导分化培养基IMDM培养基（即含1%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 ug/ml链霉素、HGF 40ng/ml、FGF-4 10ng/ml和1 μg/ml两性霉素的IMDM培养液）置37℃，5% CO2培养箱中培养21天，每3天换液一次。
三、免疫荧光技术鉴定肝细胞方向分化。
诱导培养基培养21天后，0.25％胰蛋白酶消化，分化诱导培养基重悬后以1×104/cm2分化接种于24孔培养板中，置37℃，5% CO2培养箱中过夜培养，以正常生长培养基中培养的未分化细胞作为阴性对照。
（1）次日弃培养基，500 μl PBS冲洗三次，4%多聚甲醛室温固定15 分钟。
（2）500 μl PBS再冲洗三次，0.1% Triton X-100渗透10分钟。
（3）500 μl PBS再冲洗三次，滴加1%羊血清于37℃ 封闭30分钟。
（4）500 μlPBS再冲洗三次，加鼠抗人单克隆抗体α-fetoprotein (AFP)，albumin (ALB) 和cytokeratin 18 (CK-18) 于37℃孵育1小时。
（5）500 μl PBS再冲洗三次，加FITC或PE标记的二抗于37℃闭光孵育1小时。
（6）500 μl PBS再冲洗三次，加DAPI于37℃反应5分钟染细胞核。
（7）500 μl PBS再冲洗二次，加500 μl PBS后细胞置荧光显微镜下观察并拍摄图片。
四、Real Time PCR技术鉴定肝细胞方向分化。
用实时定量聚合酶链式反应（Real-Time PCR）技术鉴定，分为人脐带间充质干细胞总RNA抽提、总RNA定量与分析、总RNA的反转录和实时定量聚合酶链式反应（Real-Time PCR）等步骤。
Claims (7)
1.一种诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法，其特征在于所用的培养基含有肝细胞生长因子（HGF）、成纤维细胞生长因子-4（FGF-4）和IMDM基础培养基。
2.根据权利要求1 所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法，其特征在于，HGF的浓度为40ng/ml，FGF-4的浓度为10ng/ml。
3.根据权利要求1或2所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法，其特征在于，IMDM基础培养基中含有1%胎牛血清。
4.根据权利要求1或2 所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法，其特征在于，IMDM基础培养基中含有100 U/ml青霉素、100 ug/ml链霉素和1 μg/ml两性霉素。
5.根据权利要求1 所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法，其特征在于，所述的人脐带间充质干细胞的细胞表面标志分子为通过免疫荧光染色的方法进行检测，人脐带间充质干细胞不表达造血标志分子CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR，而强表达间充质干细胞表面特异性抗原CD44、CD73、CD90和CD105。
6.一种诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）配制诱导培养基：在IMDM培养基中添加40ng/ml 的HGF、10ng/ml 的FGF-4、1%的胎牛血清、100 U/ml的青霉素、100 ug/ml的链霉素和1 μg/ml的两性霉素；
（2）选取第5—10代的人脐带间充质干细胞，以5×103/cm2的细胞密度接种于6孔培养板中，过夜培养；
（3）待细胞贴壁后，去除正常生长培养基，换为肝细胞诱导培养基，置于37℃，5% CO2培养箱中；
（4）每3天换液一次，诱导培养21天，收获诱导后的细胞。
7.一种含有诱导剂HGF和FGF的培养基在诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化中应用。
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| CN (1) | CN103396985A (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106075586A (zh) * | 2016-07-19 | 2016-11-09 | 东华大学 | 基于成体干细胞‑再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法 |
| CN106119187A (zh) * | 2016-07-01 | 2016-11-16 | 深圳市茵冠生物科技有限公司 | 用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的培养基 |
| CN108823148A (zh) * | 2018-07-23 | 2018-11-16 | 广东唯泰生物科技有限公司 | 一种脂肪间充质干细胞诱导分化为肝脏样细胞的方法 |
| US10385113B2 (en) | 2016-03-30 | 2019-08-20 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Engineered FGF compositions and methods of use thereof |
| CN113789296A (zh) * | 2021-09-15 | 2021-12-14 | 淮安市第一人民医院 | 高效诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法及应用 |
| US11267855B2 (en) | 2018-03-16 | 2022-03-08 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Engineered FGF1 and FGF2 compositions and methods of use thereof |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101984048A (zh) * | 2010-11-24 | 2011-03-09 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 一种培养间充质干细胞的培养基 |
| CN102168065A (zh) * | 2011-02-17 | 2011-08-31 | 暨南大学 | 一种体外诱导人脐带间充质干细胞成为肝细胞的方法与应用 |
| CN102250829A (zh) * | 2011-06-29 | 2011-11-23 | 天津和泽干细胞科技有限公司 | 人脐带间充质干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法 |
-
2013
- 2013-08-08 CN CN2013103424434A patent/CN103396985A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101984048A (zh) * | 2010-11-24 | 2011-03-09 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 一种培养间充质干细胞的培养基 |
| CN102168065A (zh) * | 2011-02-17 | 2011-08-31 | 暨南大学 | 一种体外诱导人脐带间充质干细胞成为肝细胞的方法与应用 |
| CN102250829A (zh) * | 2011-06-29 | 2011-11-23 | 天津和泽干细胞科技有限公司 | 人脐带间充质干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KUAN-DER LEE ET AL: "In Vitro Hepatic Differentiation of human Mesenchymal Stem Cell", 《HEPATOLOGY》 * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10385113B2 (en) | 2016-03-30 | 2019-08-20 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Engineered FGF compositions and methods of use thereof |
| CN106119187A (zh) * | 2016-07-01 | 2016-11-16 | 深圳市茵冠生物科技有限公司 | 用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的培养基 |
| CN106119187B (zh) * | 2016-07-01 | 2019-07-16 | 深圳市茵冠生物科技有限公司 | 用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的培养基 |
| CN106075586A (zh) * | 2016-07-19 | 2016-11-09 | 东华大学 | 基于成体干细胞‑再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法 |
| CN106075586B (zh) * | 2016-07-19 | 2019-05-24 | 东华大学 | 基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法 |
| US11267855B2 (en) | 2018-03-16 | 2022-03-08 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Engineered FGF1 and FGF2 compositions and methods of use thereof |
| CN108823148A (zh) * | 2018-07-23 | 2018-11-16 | 广东唯泰生物科技有限公司 | 一种脂肪间充质干细胞诱导分化为肝脏样细胞的方法 |
| CN113789296A (zh) * | 2021-09-15 | 2021-12-14 | 淮安市第一人民医院 | 高效诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法及应用 |
| CN113789296B (zh) * | 2021-09-15 | 2023-07-18 | 淮安市第一人民医院 | 高效诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法及应用 |
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