CN102344906B

CN102344906B - 一种毛囊干细胞的分离培养方法

Info

Publication number: CN102344906B
Application number: CN201010622708.2A
Authority: CN
Inventors: 段恩奎; 张守兵
Original assignee: Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Guangzhou Han Union Biological Technology Co ltd
Priority date: 2010-07-21
Filing date: 2010-12-24
Publication date: 2014-01-29
Anticipated expiration: 2030-12-24
Also published as: CN102344906A

Abstract

本发明提供一种毛囊干细胞的分离培养方法。本发明提供的方法是利用器官培养的方法，采用William’s E完全培养基对毛囊进行培养并分离纯化出毛囊干细胞。本发明仅用很小的皮肤材料，通过显微剥离技术，在体视镜下剥离出大鼠触须毛囊，然后对整个触须毛囊进行培养，毛囊干细胞从隆突部长出并形成克隆，此细胞的克隆形成效率高，易纯化，能长期传代并保持毛囊干细胞特性不变，用一根触须毛囊就能获得可以长期使用的足量的毛囊干细胞。

Description

一种毛囊干细胞的分离培养方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种毛囊干细胞的分离培养方法。

背景技术

干细胞生物学研究的开展与进步，大大促进了人们对于发育过程中许多基础生物学问题的理解，同时也带给人们一种全新的疾病治疗思路——干细胞移植。对于大面积皮肤烧(烫)伤和皮肤病治疗来说，干细胞移植具有长远的应用前景。表皮干细胞移植最早在1991年就已经用于临床，然而，其形成的皮肤不具有皮脂腺和毛囊，所以在功能上来说是不全的。

皮肤是哺乳动物自身与外部环境的屏障，具有抵御微生物感染、保持水分、调节体温、感觉、吸收、分泌与排泄等生理功能。毛囊是皮肤的附属物，其结构包括外根鞘、内根鞘、真皮乳头、皮脂腺和毛干等，目前认为毛囊干细胞存在于外根鞘的特定部位：隆突部。毛囊干细胞是皮肤中已知细胞类型中多潜能性较强的干细胞，小鼠体内实验证明，它能形成完整的表皮、皮脂腺和毛囊。

毛囊干细胞是成体干细胞的一种。相对胚胎干细胞和目前新兴起的诱导多能性干细胞来说，由于哺乳动物几乎所有体表都覆盖有毛囊，毛囊干细胞更容易从自身获得，不受伦理因素的制约，避免了异体干细胞移植带来的免疫排斥，因此具有很大的临床应用前景与价值。

毛囊干细胞移植首先要解决的问题就是如何获得足量毛囊干细胞。传统的毛囊干细胞分离方法主要是基于流式细胞仪的分选方法，例如2003年Trempus CS等最早用α6整合素抗体和CD34抗体分选出了小鼠毛囊干细胞，2006年Ohyama M等用多种抗体的组合分选出人毛囊干细胞。但是这种基于流式细胞仪分选的方法有很大的缺点，即需要大量皮肤用于制备单细胞悬液，这对于大面积皮肤损伤(烧伤或烫伤等)的患者来说是不可能的。此外，分选过程中，单个细胞在体外时间长，处于悬浮状态，细胞容易发生凋亡，细胞经过流式细胞仪时容易受到机械损伤，这些都导致分选到的毛囊干细胞不易成活，克隆形成效率极低。

如何利用尽可能少的皮肤组织高效获得足量的毛囊干细胞用于干细胞移植，是当前亟待解决的难题。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种毛囊干细胞的分离培养方法。

本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。

本发明提供的毛囊干细胞的分离培养方法，是利用器官培养的方法，采用William’s E完全培养基对毛囊进行培养并分离纯化出毛囊干细胞。

优选地，所述方法中所采用的William’s E完全培养基为在William’s E基本培养基中添加以下成分：10纳克/毫升的表皮生长因子，5微克/毫升的胰岛素，1微克/毫升的氢化可的松，5.8毫摩尔/升的L-谷酰胺，0.115微克/毫升的维生素A，1微克/毫升的维生素D2，1微克/毫升的转铁蛋白，100纳克/毫升的亚油酸，20微克/毫升的牛血清白蛋白，200单位/毫升的青霉素钠，200单位/毫升的硫酸链霉素；更优选地，所述William’s E完全培养基中还包括体积百分含量为15％的胎牛血清。

优选地，所述培养毛囊的条件如下：37℃、5％CO₂和100％湿度。

优选地，所述方法还包括采用消化液纯化通过器官培养法获得的毛囊干细胞的步骤；优选地，所述消化液为含有质量百分含量为0.1％的胰酶和0.008％的EDTA的磷酸缓冲液；优选地，所述纯化步骤如下：在室温下(20～30℃，优选为25℃左右)，用消化液消化从毛囊长出的细胞(包括毛囊干细胞以及成纤维细胞等杂细胞，消化液覆盖细胞即可，大约消化3-5分钟，如果需要获得极高纯度的毛囊干细胞，可以适当延长消化时间)后，成纤维细胞等杂细胞脱落，用磷酸缓冲液洗掉成纤维细胞，再加入消化液，于37℃下继续消化3-5分钟，用磷酸缓冲液收集消化下来的毛囊干细胞，1000转/分钟离心5分钟后，传代或冻存。

优选地，所述方法还包括传代和增殖纯化的毛囊干细胞的步骤；优选地，所述传代和增殖的条件如下：William’s E完全培养基，37℃、5％CO₂、100％湿度，2-3天更换一次培养液。

优选地，所述方法还包括鉴定所制备的毛囊干细胞的步骤；更优选地，所述鉴定方法选自细胞形态结构鉴定、mRNA水平鉴定和蛋白质水平鉴定。

优选地，所述方法中的毛囊来自哺乳动物皮肤；更优选地，所述毛囊来自哺乳动物触须，优选为大鼠触须。

本发明还提供了上述方法所制备出的毛囊干细胞。

综上所述，本发明通过显微剥离技术在体视镜下剥离出大鼠触须毛囊，利用器官培养的方法，将触须毛囊用William’s E完全培养基进行培养，毛囊贴壁后，毛囊干细胞从隆突部长出并形成克隆，此细胞的克隆形成效率高，易纯化，纯度几乎达到100％，能长期传代并保持特性不变。由于开始培养时毛囊干细胞在其原来的微环境中生长，没有受到损伤，克服了传统的流式细胞仪分选方法对毛囊干细胞造成严重机械损伤而导致克隆形成效率极低的缺点，并且培养基中添加了有利于毛囊干细胞稳定增殖的因子，只需要很小的皮肤组织，甚至用一根触须毛囊就获得了可以长期使用的足量的毛囊干细胞。完全培养基中血清浓度经过优化，体积百分含量为15％时毛囊干细胞生长最好。

在一个优选实施方案中，本发明提供的主要技术路线包括：

(1)显微剥离出毛囊；

(2)用合适培养基进行器官培养；

(3)对形成的克隆进行纯化；

(4)毛囊干细胞的传代；

(5)毛囊干细胞的鉴定

本发明所具有的主要特点及所能达到的有益效果为：需要的皮肤材料少，只用几根毛囊甚至一根即可；开始时细胞在其原来的微环境中生长，对细胞损伤小，克隆形成效率高；能够稳定传代，可以获得足量毛囊干细胞。

由此可见，本发明避免了传统的先分离后培养策略给细胞带来的损害，采用先培养后纯化的策略，所以只用少量毛囊就能获得大量毛囊干细胞。具体地说，本发明利用器官培养方法，从各种不同类型的培养基中筛选出了最合适的培养基和生长因子，仅用很小一块皮肤组织，显微剥离出毛囊，对整个毛囊直接进行培养，待毛囊干细胞形成克隆后，对其纯化并传代。由于干细胞离体后是在其原来的毛囊微环境中生长，生长状态好，成活率高，易于形成克隆，经过纯化，可以达到极高的纯度，并且能够长期传代而保持特性不变。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1是本发明所提供的技术路线图。

图2是毛囊照片；其中A为剥离前(带真皮鞘)，B为剥离后。

图3是从毛囊隆突部长出的克隆；其中A是40倍放大，可以看到整个克隆；B说明只有隆突部长出了克隆；C是A的部分放大，放大倍数100倍。

图4是毛囊干细胞的纯化；在室温下，用消化液消化，待成纤维细胞脱落后，洗掉成纤维细胞，转到37℃培养箱中继续消化，大约3分钟后毛囊干细胞开始脱落，其中A是消化前毛囊干细胞和成纤维细胞的共培养；B是室温消化后成纤维细胞全部脱落，只剩下毛囊干细胞克隆。

图5是毛囊干细胞的传代和增殖；其中A是从一根毛囊获得的第八代毛囊干细胞生长第五天时的照片，放大倍数100倍；B是第十代毛囊干细胞的生长曲线，共3次重复，500个细胞生长15天，可以达到接近10⁷数量级；C是第十代毛囊干细胞的克隆形成效率，接种1000个细胞，形成了491个克隆，克隆形成效率为49.1％。

图6是毛囊干细胞的结构。用PI染细胞核后发现，此细胞的细胞核在整个细胞体积中占很大的比例，即核质比很大，符合干细胞的基本特征。A是用PI染细胞核，B是明视场，C是两者合并的照片。

图7是利用Real-time PCR技术，在mRNA水平上对第7代和第12代毛囊干细胞进行鉴定。其中A为第7代和第12代克隆形态照片；B为在mRNA水平上，检测了第7代、第12代毛囊干细胞和新生大鼠成纤维细胞中K14(基底层角质细胞的标志分子)、K15、α6-整合素(均为毛囊干细胞的标志分子)和P63(基底层角质干细胞的标志分子)的表达，表明与新生大鼠成纤维细胞相比，上述基因在第7代和第12代毛囊干细胞中高表达。

图8是利用免疫荧光技术，在蛋白质水平上对毛囊干细胞进行鉴定；其中A和B分别为毛囊干细胞的标志分子α6-整合素和基底层角质干细胞的标志分子P63，每幅图从左到右依次为靶蛋白(绿色)、PI染细胞核(红色)、两者合并、明视场、全部合并的照片。图中，HFSC为毛囊干细胞(hairfollicle stem cell)，Fb为成纤维细胞(Fibroblast)。结果表明，与成纤维细胞相比，α6-整合素和P63在毛囊干细胞中高表达。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

以下实施例中使用的磷酸缓冲液除非特别指出，均为pH值为7.3的磷酸缓冲液，其配方如下(1L)：0.2g KCl，0.24g KH₂PO4，8g NaCl，1.44g无水Na₂HPO₄。

实施例1：用器官培养法从单根大鼠触须分离毛囊干细胞

本实施例以单根大鼠触须为例详细说明本发明所提供的分离毛囊干细胞的方法，具体的技术路线参见图1。实验动物的饲养和使用按照中国科学院动物研究所动物与医学伦理委员会的规定执行。

一.大鼠触须毛囊的显微剥离

取一小块成年Wistar大鼠(中国科学院动物研究所)触须部皮肤，用75％酒精消毒3-5分钟；在体视镜下，用镊子夹住触须毛囊靠近表皮的峡部，向真皮方向用力撕出毛囊；用29G针头固定住毛囊，用解剖刀小心划破真皮鞘，并将毛囊剥离出来，切断真皮乳头和真皮鞘间的连接。图2示出了毛囊照片，其中A为剥离前(带真皮鞘)，B为剥离后。

二.培养毛囊的培养基筛选和优化

本发明人尝试了例如以下多种培养基对分离的毛囊进行培养：

1)Epidermal Keratinocyte Medium，Calcium-Free，miliipore公司，货号CNT-02C；

2)Epidermal Keratinocyte Medium，Non-Def，millipore公司，货号CNT-57；

3)Keratinocyte-SFM，Invitrogen公司，货号10744-019；

4)文献：张艺，杨恬，毛囊Bulge细胞培养与生物学特性的研究，第三军医大学学报，2004年26卷16期，文章编号：1000-5404(2004)16-1499-02中公开的培养基；其中，用到的基本培养基分别为DMEM培养基，Hyclone公司，货号SH30021.01B；F12培养基，Hyclone公司，货号SH30026.01B；各种因子按照该文献添加；

5)表皮角质细胞培养基，Cascade公司，货号M-EPI-500，该基本培养基中加入添加剂HKGS，Cascade公司，货号S-001-5；

6)文献：Wu WY and Morris RJ.2005.Method for the harvest and assayof in vitro clonogenic keratinocytes stem cells from mice.Methods Mol Biol289：79-86中公开的William’s E完全培养基。

结果显示，仅有William’s E完全培养基能够成功且稳定的培养出毛囊干细胞。

在此基础上，对William’s E完全培养基中的胎牛血清含量进行了优化，具体试验的胎牛血清体积百分含量分别为10％、15％和20％。结果显示，William’s E完全培养基中的胎牛血清含量为10％和20％时，毛囊干细胞克隆生长状态很不好，常分泌出明亮的丝状物缠绕在克隆上方，增殖很慢甚至不增殖，而胎牛血清含量为15％时，细胞生长状态最好。

三.用William’s E完全培养基培养毛囊

1.配制William’s E完全培养基。向William’s E基本培养基(购自Gibco公司)中添加以下因子，各种因子的最终浓度为：10纳克/毫升的表皮生长因子，5微克/毫升的胰岛素，1微克/毫升的氢化可的松，5.8毫摩尔/升的L-谷酰胺，0.115微克/毫升的维生素A，1微克/毫升的维生素D2，1微克/毫升的转铁蛋白，100纳克/毫升的亚油酸，20微克/毫升的牛血清白蛋白，200单位/毫升的青霉素钠，200单位/毫升的硫酸链霉素。向添加因子后的William’s E培养基中加体积百分含量为15％的胎牛血清，即为William’s E完全培养基。

2.将毛囊转入6孔培养板，加William’s E完全培养基，37℃、5％CO₂、100％湿度的培养箱中培养。毛囊一般在第3-7天贴壁，然后毛囊干细胞会从隆突部爬出，细胞边缘明亮，紧密排列，为典型角质细胞特征，如图3所示，其中A是40倍放大，可以看到整个克隆；B说明只有隆突部长出了克隆；C是A的部分放大，放大倍数100倍；本实施例中用到的所有毛囊干细胞均来源于这一根毛囊。同时，可能会有成纤维细胞爬出。

将取自同一只大鼠的30根触须随机分为3组，每组10根，用上述方法分别培养，发现3组中能够贴壁并形成克隆的毛囊数量分别为：10、5、7，表明有73％的毛囊能够成功贴壁并形成毛囊干细胞克隆。

四.毛囊干细胞的纯化

毛囊干细胞具有贴壁紧的特点，利用这一特点，在室温25℃左右，用消化液(含有质量百分含量为0.1％的胰酶和0.008％的EDTA的磷酸缓冲液)消化时，成纤维细胞会被消化下来，而干细胞克隆仍贴在培养板上。用磷酸缓冲液小心将消化下来的成纤维细胞收集起来，离心后可以传代或冻存，以备用于与毛囊干细胞的共培养，为干细胞提供与体内相似的模拟环境，有利于干细胞的生长。再向培养板中加消化液，转到37℃培养箱继续消化3-5分钟，用磷酸缓冲液收集消化下来的毛囊干细胞，离心后可以传代或冻存。

图4示出了纯化前后的培养细胞，其中A为消化前毛囊干细胞和成纤维细胞的共培养照片；B为室温消化后成纤维细胞全部脱落，只剩下毛囊干细胞克隆照片。从图8中重新贴壁后的细胞形态以及免疫荧光染色结果可以看出，纯化后的干细胞纯度很高，接近100％。

五.毛囊干细胞的传代和增殖

纯化后，极低密度接种干细胞时(例如只接种几个毛囊干细胞甚至1个)，要想让单个的干细胞增殖并重新形成克隆(干细胞能够自我更新，即理论上，单个干细胞就能够重新形成克隆)，需要加成纤维细胞共培养，成纤维细胞为干细胞增殖提供适当的微环境，若没有成纤维细胞提供微环境，毛囊干细胞就会发生分化。

因此，将单根毛囊生长出的毛囊干细胞和成纤维细胞按照1∶1的比例接种到10cm培养皿中，加William’s E完全培养基，37℃、5％CO₂、100％湿度的培养箱中培养，2-3天更换培养液，大约2周后细胞长满，可继续传代或在液氮中冻存备用。此细胞克隆效率高，第八代毛囊干细胞的照片如图5中的A所示，B是第十代毛囊干细胞的生长曲线，共3次重复，500个细胞生长15天，可以达到接近10⁷数量级；C是第十代毛囊干细胞的克隆形成效率，接种1000个细胞，形成了491个克隆，克隆形成效率为49.1％，可以长期稳定传代并保持细胞和克隆形态不变。由此，从一根毛囊就获得了可以长期使用的足量的毛囊干细胞。

六.毛囊干细胞的鉴定

分别从细胞形态结构以及mRNA水平和蛋白质水平上对毛囊干细胞进行鉴定。

1.细胞形态结构鉴定

用溴化丙锭(PI)染细胞核，具体方法如下：1)细胞贴壁1小时后，用质量百分含量为4％的多聚甲醛固定10分钟；2)用磷酸缓冲液洗三遍；3)10微克/毫升的PI(磷酸缓冲液配制，购买自北京中杉金桥生物技术有限公司)在室温25℃左右染核10分钟；4)用磷酸缓冲液洗三遍。染色结果发现，毛囊干细胞具有很大的核质比，即细胞核在细胞中所占的比例很大，这些都符合干细胞的基本特征，具体照片如图6所示，其中A是用PI染细胞核，B是明视场，C是两者合并的照片。

2.mRNA水平鉴定

在mRNA水平，参照文献Zhao P，De A，Hu Z，Li J，Mulders SM，Sollewijn Gelpke MD，Duan EK，Hsueh AJ.Gonadotropin stimulation ofovarian fractalkine expression and fractalkine augmentation of progesteronebiosynthesis by luteinizing granulosa cells.Endocrinology.2008Jun；149(6)：2782-9中描述的TRIzol法及Real time-PCR实验步骤，提取第7代和第12代毛囊干细胞及新生大鼠成纤维细胞的总mRNA，通过Real-time PCR进行鉴定，所使用的引物序列见表1，即选用了以下国际上鉴定毛囊干细胞常用标志分子的基因：基底层角质细胞的标志分子K14、毛囊干细胞的标志分子K15和α6-整合素、基底层角质干细胞的标志分子P63，检测其相对表达量，以持家基因Actin的表达做为内参。结果表明，与新生大鼠成纤维细胞相比，上述标志分子的基因均在第7代和第12代毛囊干细胞中高表达，具体如图7所示。

表1 Real-time PCR用到的引物序列

基因	正向引物	反向引物
			K14	CAGCCCCTACTTCAAGACCA	AATCTGCAGGAGGACATTGG
K15	CTGGCAATGAGAAGGTGA	TCTTGAAGTAATGGCTGTAGTC
			ITGA6	AGCCCCAGGGACTTACAACT	CTTCATAGGGCCCATCTTCA
P63	CTTCCATCAAGAAACGGAGA	TGATCTTGAGCAGCATTTCA
			Actin	TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC	TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG

3.蛋白质水平鉴定

在蛋白质水平上，参照Li J，Miao C，Guo W，Jia L，Zhou J，Ma B，Peng S，Liu S，Cao Y，Duan E.Enrichment of putative human epidermal stem cellsbased on cell size and collagen type IV adhesiveness.Cell Res.2008Mar；18(3)：360-71中描述的免疫荧光实验步骤，利用免疫荧光方法进行对毛囊干细胞进行鉴定。其中所使用的一抗分别为小鼠抗大鼠α6-整合素抗体(购买自Serotec公司)和小鼠抗大鼠P63抗体(购买自Santa Cruz公司)，用到的荧光素标记的山羊抗小鼠二抗购买自北京中杉金桥生物技术有限公司。结果表明，与成纤维细胞相比，该干细胞高表达以上蛋白，例如第3代干细胞的结果见图8。

Claims

1.一种毛囊干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述方法是利用器官培养的方法，采用William’s E完全培养基对毛囊进行培养并分离纯化出毛囊干细胞;

其中，所述方法中所采用的William’s E完全培养基为在William’s E基本培养基中添加以下成分：10纳克/毫升的表皮生长因子，5微克/毫升的胰岛素，1微克/毫升的氢化可的松，5.8毫摩尔/升的L-谷酰胺，0.115微克/毫升的维生素A，1微克/毫升的维生素D2，1微克/毫升的转铁蛋白，100纳克/毫升的亚油酸，20微克/毫升的牛血清白蛋白，200单位/毫升的青霉素钠，200单位/毫升的硫酸链霉素；

其中，所述William’s E完全培养基中还包括体积百分含量为15%的胎牛血清。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养毛囊的条件如下：37℃、5%CO₂和100%湿度。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，所述分离纯化毛囊干细胞是采用消化液纯化通过器官培养法获得的毛囊干细胞。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法中，所述分离纯化毛囊干细胞是采用消化液纯化通过器官培养法获得的毛囊干细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述消化液为包含质量百分含量为0.1%的胰酶和0.008%的EDTA的磷酸缓冲液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述纯化步骤如下：在20～30℃下，用消化液消化从毛囊长出的细胞，清洗，再用该消化液于37℃下继续消化3-5分钟，用磷酸缓冲液收集消化的毛囊干细胞，离心后进行传代或冻存。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括传代和增殖纯化的毛囊干细胞的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述传代和增殖的条件如下：William’s E完全培养基，37℃、5%CO₂、100%湿度，2-3天更换一次培养液。

9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括鉴定所制备的毛囊干细胞的步骤。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述鉴定方法选自细胞形态结构鉴定、mRNA水平鉴定和蛋白质水平鉴定。

11.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法中的毛囊来自哺乳动物皮肤。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述毛囊来自哺乳动物触须。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述触须为大鼠触须。