CN103550828B - 一种基于毛囊干细胞和硅凝胶敷料的皮肤重建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种皮肤重建的方法，所述方法以毛囊干细胞为种子细胞，以硅凝胶敷料作为新的细胞移植载体进行皮肤重建，包括以下步骤：1）培养扩增毛囊干细胞；2）培养真皮细胞；3）将步骤1）培养扩增的毛囊干细胞与步骤2）培养的真皮细胞混合；4）将步骤3）的混合细胞滴加于硅凝胶敷料上孵育；5）将步骤4）的细胞和硅凝胶敷料移植到需要皮肤重建的部位。本发明提供的方法不仅可以在大面积皮肤损伤的治疗中重建功能性皮肤，也可以在科研活动中为毛囊干细胞的多潜能性检测提供一种简便的验证方法。

Description

一种基于毛囊干细胞和硅凝胶敷料的皮肤重建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于毛囊干细胞和硅凝胶敷料的新型皮肤重建方法。

背景技术

皮肤是哺乳动物最大的器官，不仅可以起到隔绝外界病原等有害因素保护机体的屏障作用，同时皮肤中含有丰富的神经末梢可以迅速感知环境变化，此外，在体温调节和水分保持等方面皮肤也同样发挥着不可替代的作用。然而，现在面对诸如烧伤或传染性疾病导致的皮肤损伤等问题时，皮肤的修复和再生一直是困扰人类的一大难题。

毛囊作为皮肤的一个重要组成部分，在保护体表、感觉传导、毛色肤色决定、表皮再生等多方面也同样发挥着重要作用。因此，研究毛囊的结构及功能在皮肤的再生医学、美容、以及疾病治疗等方面有着不可忽视的意义。自1990年Cotsarelis等人发现毛囊干细胞位于毛囊隆突部以来，经过二十几年的深入研究，科研人员发现分离的单个毛囊干细胞就可以体外大量增殖，并分化形成皮肤表皮的各种细胞类群，说明位于毛囊隆突部的毛囊干细胞在构建毛囊的过程中起到了至关重要的作用。此外，多个研究组也已证明毛囊干细胞直接参与了创伤修复过程，能够形成新的表皮组织。综合这些结果不难看出，毛囊干细胞为皮肤再生研究提供了一个新的思考方向。

鉴于皮肤及毛囊重建有着重要的医学应用前景，目前已有多种方法来进行体外的毛囊重建及异种毛囊重建实验。例如，1993年首次报道的在毛囊重建实验中使用最为广泛的硅胶小室（Chamber）法，还有随后发展出来的皮下注射（Patch）法、夹层（Flap）法、以及新近报道的支架（Scaffold）方法等。虽然毛囊重建实验已有多种方法，但是这些方法或多或少存在硬件要求高、操作时间长、难度较高、毛囊再生效率低、可重复性差等缺点，比如硅胶小室（Chamber）法所用移植材料成本高，手术操作难度高，重建面积较小，伤口暴露时间长；皮下注射（Patch）法由于是皮下注射实现重建，因此，手术操作难度高，重建面积有限，效率低，重复性差；夹层（Flap）法由于是皮肤的分层操作，所以手术操作难度大，时间长，再生效率低，重复性差；支架（Scaffold）方法所用移植材料成本高、手术缝合操作时间较长，上述这些方法的缺点禁锢了毛囊干细胞在皮肤再生方面的研究和应用。虽然国内外已有商业出售的人工表皮，但是这种人工皮肤由于缺乏皮脂腺汗腺等附属结构，移植到患处后缺乏弹性，而且并不能发挥正常皮肤的完整功能。由此可见，建立一种有效而简单的皮肤重建方法是十分必要的。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种皮肤重建的方法。

本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。本发明提供了一种皮肤重建的方法，以毛囊干细胞为种子细胞，以硅凝胶敷料作为新的细胞移植载体进行皮肤重建，具体包括以下步骤：1）培养扩增毛囊干细胞；2）培养真皮细胞；3）将步骤1）培养扩增的毛囊干细胞与步骤2）培养的真皮细胞混合；4）将步骤3）的混合细胞滴加于硅凝胶敷料上孵育；5）将步骤4）的细胞和硅凝胶敷料移植到需要皮肤重建的部位。

优选地，其中所述步骤1）中的毛囊干细胞来源于哺乳动物毛囊隆突部，优选为大鼠触须。

优选地，所述步骤1）中的毛囊干细胞和成纤维细胞按2∶1-1∶2的比例接种到培养皿中培养。其中，发挥滋养作用的成纤维细胞过多或过少均会影响毛囊干细胞的生长状况，因此，毛囊干细胞和成纤维细胞的比例优选2∶1-1∶2之间。

更优选地，所述步骤1）中的毛囊干细胞和成纤维细胞按1∶1的比例接种到培养皿中培养。

优选地，所述毛囊干细胞是利用器官培养的方法，采用William’sE完全培养基对毛囊进行培养并分离纯化而制备的。

优选地，其中所述步骤2）中的真皮细胞来源于新生大鼠，优选出生后24小时内的大鼠。

优选地，步骤3）还包括在混合前，将毛囊干细胞和真皮细胞分别使用DMEM/F12重悬的步骤；

其中，所述DMEM/F12培养基是实验室常用的培养基，为DMEM培养基和F12培养基按1∶1的比例结合，称为DMEM/F12培养基。在本申请的一个优选的实施例中，所述DMEM/F12培养基购自Gibco公司。

优选地，步骤3）还包括混匀后，加入基质胶（Matrigel）的步骤；优选地，所述基质胶在冰上溶解；优选地，将所述基质胶与细胞混合液按体积比1∶2-1∶4混合；更优选地，所述基质胶与细胞混合液的体积之比为1∶3。其中，根据基质胶本身的性质，基质胶浓度越大凝结越明显，不利于细胞的均匀混合，浓度过低则不能有效辅助制成胶冻状，因此，基质胶与细胞混合液适宜体积比在1∶2-1∶4之间。

其中，所述基质胶购自BDBiosciences公司。

优选地，所述步骤3）中毛囊干细胞和真皮细胞的混合比例为1∶1-1∶10，优选1∶4-1∶6，更优选1∶5。

优选地，将所述步骤5）中的重悬液吹成胶冻状，优选地，在超净工作台中以0.2-0.5m/s的低风速将所述重悬液吹15-25分钟至形成胶冻状即可，优选地，在超净工作台中以0.3m/s的低风速将所述重悬液吹15-25分钟至形成胶冻状即可。

优选地，所述硅凝胶敷料为医用自粘性硅凝胶敷料，所述医用自粘性硅凝胶敷料优选为医用自粘性硅凝胶膜或医用自粘性硅凝胶贴。

在本发明的一个优选的实施方案中优选使用购自美国Biodermis公司的硅胶贴。

优选地，步骤5）中使用医用粘合剂将硅凝胶敷料与需要皮肤重建的部位粘合；优选地，所述粘合剂为软组织医用粘合剂，优选地，所述医用粘合剂为α-氰基丙烯酸正丁酯。

优选地，所述方法还包括用绿色荧光蛋白标记毛囊干细胞的步骤；

优选地，所述绿色荧光蛋白标记毛囊干细胞是通过慢病毒感染法。

此外，本发明提供了上述方法在皮肤损伤治疗中用于重建皮肤的用途；优选地，所述皮肤损伤包括烧伤或烫伤。

本发明还提供了上述方法重建的皮肤类产品，例如表皮。

在本发明的一个优选实施方案中，涉及的主要技术路线包括：

（1）大鼠隆突部毛囊干细胞复苏扩增及绿色荧光标记细胞

（2）新生大鼠真皮细胞的制备

（3）硅凝胶敷料和待移植细胞准备

（4）皮肤重建手术

（5）形态学观察

本发明具有以下的有益效果：

1.硅凝胶敷料的使用简化了手术操作并大大缩短伤口暴露时间，避免感染；

2.用含基质胶的-DMEM/12培养液作为移植细胞的支持环境，细胞移植后易存活，提高了皮肤重建的成功率；

3.本方法成本低，成功率高，硅凝胶敷料和医用粘合剂价廉易得，大大提高了操作的可重复性、可操作性；

4.利用毛囊干细胞和真皮细胞的移植，实现了裸鼠背部全皮缺失后的皮肤重建；

5.将毛囊干细胞用绿色荧光蛋白标记，便于对干细胞进行跟踪定位；

6.手术中利用医用粘合剂取代针线缝合固定硅凝胶敷料，将小鼠创伤降到最低，并排除缝合造成的伤口修复对毛囊重建过程的影响以及避免拆除缝合线的过程，进一步简化了手术操作。

此外，由于整个移植手术过程操作简单，耗时少，再加上毛囊干细胞在体外增殖能力强，以及真皮细胞容易获取等特点，因而，本发明具有较强的实际应用前景和科研价值，不仅可以在皮肤损伤的治疗中功能性皮肤的重建方面发挥作用，也可以在科学基础研究中为毛囊干细胞的多潜能性验证方面提供更简便易行的方法。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1是本发明中毛囊重建过程示意图，即绿色荧光蛋白（GFP）标记的毛囊干细胞与新生大鼠真皮细胞混合后滴加于硅胶贴上，然后移植到裸鼠的背部创口处。

图2是手术后4周裸鼠背部明显长出的新毛；B图是A图所示裸鼠背部的俯拍图，可见绿色虚线框所示的创伤愈合区域中已长出不同于裸鼠自身畸形毛发的新毛；C图为A图的局部放大图。

图3是手术后4周在荧光体视镜下拍到的裸鼠背部创伤愈合区域的局部放大图，可见图2B中长毛区域相较于外周的非创伤皮肤呈现明显绿色，说明这一区域正是由毛囊干细胞参与重建的皮肤组织；B图为A图中白色虚线框的局部放大图，可见毛干基部有绿色亮斑，说明此毛囊是由移植的绿色荧光蛋白标记的毛囊干细胞重建而来。

图4是手术后4周裸鼠背部创口及附近皮肤冰冻切片后，在荧光显微镜下观察到的由绿色荧光蛋白标记的毛囊干细胞分化形成的表皮、毛囊、和皮脂腺结构。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

以下实施例中，新生大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，是出生后24小时内的，不区分雌雄；裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，是大于7周龄的雌鼠。

实施例1大鼠隆突部毛囊干细胞制备

皮肤重建所需要的毛囊干细胞的来源有多种途径，例如根据毛囊干细胞标记分子以流式细胞分选的手段获得，或通过组织器官培养的方法获得。

本实施例以成年大鼠触须毛囊干细胞为例，详细说明制备作为本发明毛囊重建的种子细胞的方法，具体如下。实验动物的饲养和使用按照中国科学院动物研究所动物与医学伦理委员会的规定执行。

1.大鼠触须毛囊的显微剥离：取一小块成年Wistar大鼠（中国科学院动物研究所）触须部皮肤，用75%酒精消毒3-5分钟；在体视镜下，用镊子夹住触须毛囊靠近表皮的峡部，向真皮方向用力撕出毛囊；用29G针头固定住毛囊，用解剖刀小心划破真皮鞘，并将毛囊剥离出来，切断真皮乳头和真皮鞘间的连接。

2.用William’sE完全培养基培养毛囊：（1）配制William’sE完全培养基。向William’sE基本培养基（购自Gibco公司）中添加以下因子，各种因子的最终浓度为：10纳克/毫升的表皮生长因子，5微克/毫升的胰岛素，1微克/毫升的氢化可的松，5.8毫摩尔/升的L-谷氨酰胺，0.115微克/毫升的维生素A，1微克/毫升的维生素D2，1微克/毫升的转铁蛋白，100纳克/毫升的亚油酸，20微克/毫升的牛血清白蛋白，200单位/毫升的青霉素钠，200单位/毫升的硫酸链霉素。向添加因子后的William’sE培养基中加体积百分含量为15%的胎牛血清，即为William’sE完全培养基。（2）将毛囊转入6孔培养板，加William’sE完全培养基，37℃、5%CO₂、100%湿度的培养箱中培养。毛囊一般在第3-7天贴壁，然后毛囊干细胞会从隆突部爬出，细胞边缘明亮，紧密排列，为典型角质细胞特征。

3.毛囊干细胞的纯化：毛囊干细胞具有贴壁紧的特点，利用这一特点，在室温25℃左右，用消化液（含有质量百分含量为0.1%的胰蛋白酶和0.008%的EDTA的磷酸盐缓冲液）消化时，成纤维细胞会被消化下来，而干细胞克隆仍贴在培养板上。用磷酸盐缓冲液小心将消化下来的成纤维细胞收集起来，离心后可以传代或冻存，以备用于与毛囊干细胞的共培养，为干细胞提供与体内相似的模拟环境，有利于干细胞的生长。再向培养板中加消化液，转到37℃培养箱继续消化3-5分钟，用磷酸盐缓冲液收集消化下来的毛囊干细胞，离心后可以传代或冻存。

4.毛囊干细胞的传代和增殖：将单根毛囊生长出的毛囊干细胞和成纤维细胞按照1∶1的比例接种到10cm培养皿中，加William’sE完全培养基，37℃、5%CO₂、100%湿度的培养箱中培养，2-3天更换培养液，大约2周后细胞长满，可继续传代或在液氮中冻存备用。

实施例2干细胞荧光标记

1.毛囊干细胞的准备：复苏实施例1中制备并冻存的成年大鼠触须毛囊干细胞，按照建立的毛囊干细胞培养体系，接种少量成纤维细胞做滋养层细胞，用William’sE完全培养基在37℃、5%CO₂、100%湿度的培养箱中培养。

2.毛囊干细胞用绿色荧光蛋白标记：恢复性生长24小时后，细胞生长状态良好；加入带有绿色荧光蛋白基因的慢病毒储存液（购自Invitrogen公司），感染24小时后，换为新鲜William’sE完全培养基，48小时可以观察到绿色细胞。

3.绿色荧光蛋白标记的毛囊干细胞的纯化和扩增：首先利用毛囊干细胞贴壁紧的特点，用消化液（质量百分含量为0.1%的胰蛋白酶+0.008%的EDTA的磷酸盐缓冲液）在室温下消化，显微镜下观察，待成纤维细胞脱落后，用磷酸盐缓冲液（pH为7.3左右）将成纤维细胞洗掉，剩余仍然贴壁的都是毛囊干细胞；然后加消化液在37℃继续消化，收集毛囊干细胞；用适量磷酸盐缓冲液重悬，用流式细胞仪进行分选，只保留绿色荧光较强的细胞；将分选出的高表达绿色荧光蛋白的毛囊干细胞接种到10cm细胞培养皿中扩增，加少量成纤维细胞做共培养，培养条件为William’sE完全培养基在37℃、5%CO₂、100%湿度的培养箱中培养，2-3天更换一次培养液，将绿色荧光蛋白标记的毛囊干细胞增殖到需要的细胞量备用。

实施例3新生大鼠真皮细胞的制备

将出生后24小时之内的大鼠冰中处死后，用75%酒精浸泡消毒3-5分钟，随后在超净工作台中操作，先用无菌生理盐水洗2遍，使用消毒后的剪刀和镊子将整个背部的皮肤剪下，用生理盐水洗一遍，然后用解剖刀轻刮去皮下脂肪，随后用生理盐水洗7遍。将皮肤表皮朝上铺于培养皿内，小心加入消化液（0.25%的胰酶和Dispase酶（Gibco公司）体积比1∶1），使皮肤漂于液面，4℃消化过夜。第二天揭去表皮，将真皮部分置于四型胶原酶中37℃消化45min。用400目的筛布过滤消化后的真皮细胞悬液，收集滤过的单细胞悬液，1000rpm，10min离心收集细胞，计数，用DMEM/F12重悬后备用。

实施例4硅凝胶敷料和待移植细胞准备

1.预先购买硅凝胶敷料（美国Biodermis公司所生产的硅胶贴产品），撕去包装后，裁剪成直径3.5cm左右的圆片，浸泡于75%的酒精中待用；使用前取出，于超净台中吹干，再用DMEM/F12培养液浸泡涮洗，最后放置于10cm的培养皿中备用。

2.将培养的绿色荧光标记的成年大鼠触须毛囊干细胞用0.1%的胰酶在室温下消化，用磷酸缓冲液洗掉滋养层成纤维细胞；加0.25%的胰酶在37℃继续消化，收集毛囊干细胞，计数后用DMEM/F12重悬后备用。

3.将毛囊干细胞与真皮细胞以1∶5的比例混合，3.5×10⁶个毛囊干细胞和1.8×10⁷个真皮细胞用DMEM/F12培养基混合为一份，用于一只裸鼠的移植；混匀两种细胞，而后再与冰上溶解的基质胶混匀；将以上液体滴加到已吹干及漂洗过的硅胶贴上，形成直径1.5厘米的液滴，置于37℃培养箱中孵育2小时；取出后打开培养皿上盖，在超净工作台中以0.3m/s的低风速吹约20分钟至形成胶冻状，置于冰上待移植。

实施例5皮肤重建手术

1.手术操作台提前用紫外线消毒，手术器械用高压灭菌消毒；裸鼠腹部皮肤消毒，腹腔注射经过过滤除菌的麻醉剂；待裸鼠麻醉后，注射适量青霉素-链霉素溶液；整个背部皮肤依次用碘伏和75%酒精擦拭消毒，使用环形印章沓出外径1.5厘米的空心圆，用眼科剪沿此圆圈外剪出创口，将皮下结缔组织清除干净，露出肌肉层；小心地用镊子夹起已准备好的附有细胞的硅胶贴，细胞面朝向伤口，迅速置于裸鼠背部创伤处；使用医用胶水将硅胶贴边缘与裸鼠背皮粘合，最后用医用丝绸胶带包扎一圈半，以加固硅胶贴；整个过程要求无菌操作。

2.手术1周后，裸鼠背上的硅胶贴基本自然脱落，伤口逐渐愈合；定期观察裸鼠伤口愈合及长毛情况。

实施例6形态学观察

1.手术4周后，麻醉裸鼠后，在荧光体视镜下观察裸鼠背部；并可以取背部疤痕部位皮肤，立即转移到-80℃保存；用冰冻切片包埋剂（OCT）包埋皮肤组织，冰冻切片，切片厚度40微米。

2.用4%的中性多聚甲醛溶液于室温固定10分钟，磷酸缓冲液洗3遍，用防淬灭剂DABCO封片，-20℃保存；用荧光显微镜观察时，绿色的组织即为绿色荧光蛋白标记的毛囊干细胞分化形成的组织，可以发现毛囊干细胞已经成功分化为结构正常的表皮、毛囊和皮脂腺。

其中，图2中A图是手术后4周裸鼠背部明显长出的新毛；B图是A图所示裸鼠背部的俯拍图，可见绿色虚线框所示的创伤愈合区域中已长出不同于裸鼠自身畸形毛发的新毛；C图为A图的局部放大图。图3中A图是手术后4周在荧光体视镜下拍到的裸鼠背部创伤愈合区域的局部放大图，可见图2B中长毛区域相较于外周的非创伤皮肤呈现明显绿色，说明这一区域正是由毛囊干细胞参与重建的皮肤组织；B图为A图中白色虚线框的局部放大图，可见毛干基部有绿色亮斑，说明此毛囊是由移植的绿色荧光蛋白标记的毛囊干细胞重建而来。图4是手术后4周裸鼠背部创口及附近皮肤冰冻切片后，在荧光显微镜下观察到的由绿色荧光蛋白标记的毛囊干细胞分化形成的表皮、毛囊、和皮脂腺结构。

Claims (26)

1.一种制备用于皮肤重建的皮肤类似物的方法，所述方法以毛囊干细胞为种子细胞，以硅凝胶敷料作为细胞移植载体，包括以下步骤：

1)培养扩增毛囊干细胞；

2)培养真皮细胞；

3)将步骤1)培养扩增的毛囊干细胞与步骤2)培养的真皮细胞混合；

4)将步骤3)的混合细胞滴加于硅凝胶敷料上孵育；

5)得到用于皮肤重建的皮肤类似物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤1)中的毛囊干细胞来源于哺乳动物毛囊隆突部。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤1)中的毛囊干细胞来源于大鼠触须。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤1)中的培养扩增毛囊干细胞为将毛囊干细胞和成纤维细胞按2:1-1:2的比例接种到培养皿中培养。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述步骤1)中的培养扩增毛囊干细胞为将毛囊干细胞和成纤维细胞按1:1的比例接种到培养皿中培养。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述毛囊干细胞是利用器官培养的方法，采用William’sE完全培养基对毛囊进行培养并分离纯化而制备的。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤2)中的真皮细胞来源于新生大鼠。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述步骤2)中的真皮细胞来源于24小时内出生的新生大鼠。

9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤3)还包括在混合前，将毛囊干细胞和真皮细胞分别使用DMEM/F12重悬以得到重悬液的步骤。

10.根据权利要求9所述的方法，其中步骤3)还包括混匀后，加入基质胶的步骤。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述基质胶在冰上溶解。

12.根据权利要求10所述的方法，其中将所述基质胶与细胞混合液按体积比1:2-1:4混合。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述基质胶与细胞混合液的体积之比为1:3。

14.根据权利要求9所述的方法，其中所述步骤3)中毛囊干细胞和真皮细胞的混合比例为1:1-1:10。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述毛囊干细胞和真皮细胞的混合比例为1:4-1:6。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述毛囊干细胞和真皮细胞的混合比例为1:5。

17.根据权利要求9-16中任一项所述的方法，其中将所述步骤3)中的重悬液吹成胶冻状。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述步骤3)中，在超净工作台中以0.2-0.5m/s的风速将所述重悬液吹15-25分钟至形成胶冻状即可。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述风速为0.3m/s。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述硅凝胶敷料为医用自粘性硅凝胶敷料。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述医用自粘性硅凝胶敷料为医用自粘性硅凝胶膜或医用自粘性硅凝胶贴。

22.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括用绿色荧光蛋白标记毛囊干细胞的步骤。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述绿色荧光蛋白标记毛囊干细胞是通过慢病毒感染法。

24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法重建的皮肤类产品。

25.根据权利要求24所述的皮肤类产品在制备用于治疗皮肤损伤的产品中的用途。

26.根据权利要求25所述的用途，其中所述皮肤损伤包括烧伤或烫伤。