CN103422176B - 人羊膜间充质干细胞库的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人羊膜间充质干细胞库的构建方法。其方法是取人羊膜进行检测，用磷酸缓冲液冲洗涤后粉碎，加磷酸缓冲液稀释，用胰蛋白酶消化后，用胶原酶Ⅳ及脱氧核糖核酸酶Ⅰ消化，过滤制成单细胞悬液；再通过V_DMEM∶V_F12=1∶1DMEM／F12基础培养基中添加人血清白蛋白、转铁蛋白、胰岛素和亚硒酸钠，使人羊膜间充质干细胞在无血清条件下，置于培养箱中，换液和传代。将体外培养和扩增获得间充质干细胞置液氮冷冻，按新生儿性别和ABO/Rh分型及HLA分型保存，建立细胞信息档案，构建出人羊膜间充质干细胞库。本发明具有无其他动物源性、来源广泛、不受伦理限制的特点。可提供间充质干细胞进行细胞治疗及其他应用。

Description

人羊膜间充质干细胞库的构建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域的一种干细胞库的构建方法，具体涉及的是一种人羊膜间充质干细胞库的构建方法。

背景技术

组织器官的损伤一直以来是人类健康所面临的一大难题，完美地修复或替代因疾病、意外事故或遗传因素所造成的组织器官创伤一直是人类的梦想。利用干细胞构建各种细胞、组织、器官作为移植的来源将成为干细胞应用的主要方向。

细胞治疗实现产业化过程主要包括细胞分离、培养、鉴定、建库、大量扩增、规模化生产等步骤，构建干细胞库是实现转化医学研究即临床细胞治疗的重要环节之一，世界各国科学家均认识到建立干细胞库的重要性。英国于2002年在Peter Andrews教授的推动下率先开始了人类干细胞库的建设。2004年5月，英国成立了世界上第一家干细胞库，收集并向研究者提供各种胚胎与成体干细胞，同时该干细胞库还负责发展各项干细胞相关技术(如分离、培养、分化、冻存、复苏等)和制定相应的临床应用标准。2005年我国开始建立人类骨髓和脐带间质干细胞库。

人羊膜是胎儿出生以后的“废弃物”。其中包含的羊膜间充

质干细胞(mesenchymal stem cells，简称MSCs)不表达MHC-Ⅱ类抗原，仅表达少量的MHC-Ⅰ类抗原，免疫原性低，是一类免疫缺陷细胞，适宜异体移植，具有比骨髓MSCs更强的扩增能力和免疫原性更低等骨髓MSCs无法比拟的优点的细胞治疗的理想靶细胞。目前世界上尚无羊膜间充质干细胞库，每年大量的人羊膜被废弃，其中的干细胞资源也白白流失。因此，构建人羊膜间充质干细胞库具有重要的战略意义。

发明内容

本发明针对现有干细胞来源或者受伦理限制或数量有限的问题，而提供一种同种异体、来源广泛、不受伦理限制及无免疫原性问题的人羊膜间充质干细胞库的构建方法。

本发明技术方案如下:

人羊膜间充质干细胞库的构建方法，包括以下步骤：

（1）人羊膜的选材严格遵循供体符合医学标准并建立资料档案；

（2）人羊膜收集

取供体符合医学标准剖腹产或正常分娩的胎膜，在胎膜娩出5～10分钟内，从胎膜上钝性分离羊膜；进行ABO/Rh血型检测及HLA分型检测和微生物学检测；用磷酸盐缓冲液（PBS）或0.9%生理盐水反复漂洗后剪成膜片；用含1000U/ml庆大霉素和2.5μg/ml二性霉素B的磷酸盐缓冲液或0.9%生理盐水浸泡30～40分钟；

（3）人羊膜间充质干细胞分离及单细胞悬液的制备

取人羊膜5×5cm² ,尽量剪碎，先用终浓度1.25-2.5g/L胰蛋白酶，室温消化30-60分钟，共2-4次，然后用DMEM／F12培养液中止胰蛋白酶，采用含加入终浓度为1.0-2.0 g /L胶原酶Ⅳ和0.1-0.2g/L脱氧核糖核酸酶Ⅰ的V_DMEM：V_F12=1：1的DMEM／F12培养液，37℃消化30-60分钟，得到细胞悬液；将细胞悬液过滤，制成单细胞悬液；用200目不锈钢网过滤将消化下来的细胞制成单细胞悬液，1000转／分钟，离心5-10分钟，用PH7.2磷酸缓冲液PBS洗2次；再离心，离心机的转速为1500转／分钟-2500转／分钟，时间为10-20分钟，弃去上清液，即获得间充质干细胞。以2×lO⁷ L^-1-2×lO⁸ L^-1密度接种于培养基中培养；

（4）人羊膜间充质干细胞无血清培养、纯化及扩增

将第(3)步所得细胞接种于培养基中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的C0₂，培养箱中进行培养，根据细胞生长情况，每2-3天全量换液1次，待细胞达到80％-90％融合时，用终浓度2.5g/L胰蛋白酶消化，然后按1：2的比例或l：3的比例进行传代接种培养，并记为P1代，传代培养过程中每2-3天全量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，重复上述操作进行传代培养，并记为P2代，继续上述传代培养过程。使人羊膜间充质干细胞逐渐得到扩增和纯化；

所述培养基采用V_DMEM：V_F12=1：1 DMEM／F12无血清培养基15.0-15.6g/L，其中含有体积分数5.0-10×10^-1 % 人血清白蛋白，1.0- 5.5×10^-1g/L人转铁蛋白，5.0-10×10^-1g/L 人胰岛素，5.2- 6.7×10^-4g/ L亚硒酸钠；

在上述第(4)步中，择优选择将第(3)步所得细胞以2×lO⁷ L^-1-2×lO⁸ L^-1密度接种于培养基中培养；

（5）人羊膜间充质干细胞库的构建

取P2-3代羊膜间充质干细胞，保存于无血清培养液加冷冻保护

液10%二甲基亚砜（DMSO）中，细胞浓度调整至1×10 ⁶个/ml,分装于标记冻存日期的冷冻管中，置液氮冷冻。液氮冷冻温度为-196 ℃；按其新生儿性别和ABO/Rh分型及HLA分型进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建出人羊膜间充质干细胞库；

（6）人羊膜间充质干细胞复苏

羊膜间充质干细胞复苏方法 于60 ℃恒温水浴箱中，0.5min内快速复苏，按2×10⁴/cm²接种于塑料培养瓶内，用含DMEM/F12无血清培养基中培养，按1:3传代，扩增后获得大量人羊膜间充质干细胞，备用；

将细胞扩增和纯化的过程优选如下：在第(3)步开始细胞培养后，培养48-72小时，更换培养液，弃去未贴壁的细胞，根据细胞生长情况，每2-3天全量换液一次，待细胞达到80％-90％融合时，用终浓度2.5g/L胰蛋白酶消化，然后按1：2的比例或l：3的比例进行传代接种培养，并记为P1代，传代培养过程中每2-3天全量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，重复上述操作进行传代培养，并记为P2代，继续上述传代培养过程。

本发明的优点在于：本发明人羊膜间充质干细胞(Human Amniotic mesenchymal stem cells，简称HAMSCs)，采用无血清培养基与用含有胎牛血清的培养液培养人羊膜间充质干细胞相比，具有无其他动物源性、来源广泛、不受伦理限制及异种免疫原性等优越性。储存于库内的羊膜间充质干细胞，经过短期培养可获得1×10¹⁰人羊膜间充质干细胞，可获得大量富有活性人羊膜间充质干细胞，并能长期保存而不失去活性操作简单易行，建库成本低廉，富有应用前景。

附图说明    

图1（P0-P5）为原代培养的HAMSCs倒置显微镜（×40）图。

图2 羊膜来源的MSCs的细胞生长曲线。

具体实施方式  

    下面结合附图和实施例详细描述本发明： 

实施例1

如图1所示，（P0-P5）为原代培养的HAMSCs倒置显微镜（×40）图。

如图2所示， 羊膜来源的MSCs的细胞生长曲线：取第3代的HAMSCs按2×10⁴细胞/孔接种于24孔板内，每隔24小时消化3个孔，收集细胞，并用0.4%苔盼蓝染色后计数活细胞，取5次结果的平均值，绘制生长曲线。

本发明人羊膜间充质干细胞库的构建方法，包括以下步骤：

（1）人羊膜间充质干细胞的分离及单细胞悬液的制备

在无菌条件下取正常足月剖腹产后产妇捐赠的羊膜；进行ABO/Rh血型检测及HLA分型检测和微生物学检测；检测甲型肝炎抗体、乙型肝炎病毒表面抗原、乙型肝炎病毒表面抗体、乙型肝炎病毒e抗原、乙型肝炎病毒e抗体、乙型肝炎核心抗体IgM、丙型肝炎抗体、戊型肝炎抗体、艾滋病病毒抗体、梅毒螺旋体抗体等其他相关传染性指标均呈阴性；在无菌超净台上钝性分离胎盘脐带面的羊膜5×5cm²，用PH7.2磷酸缓冲液(PBS)充分冲洗，将羊膜置于含1000U/ml庆大霉素和2.5μg/ml二性霉素B的生理盐水中，浸泡20分钟；将羊膜尽可能的剪碎，按每克组织加入终浓度2.5g/L胰蛋白酶5m1，搅拌使之与羊膜充分混和，置入37℃温箱消化30分钟后取消化液1000rpm离心5min，弃上清液；如此共3次，然后用V_DMEM：V_F12=1：l DMEM／F12培养液5ml中止胰蛋白酶，以尽可能除去上皮细胞；然后加入终浓度为1.0g/L胶原酶Ⅳ和0.1g/L脱氧核糖核酸酶Ⅰ的V_DMEM：V_Fl2=1：1的DMEM／F12培养液 5m1，        置                   于                   37℃消化30-60分钟后得细胞悬液；用200目不锈钢网过滤将消化下来的细胞制成单细胞悬液，1000r／m离心5-10分钟，用PBS洗2次，用苔盼兰染色，计数活细胞，以2×lO⁸ L^-1的密度将所得细胞接种于75ml培养瓶内；在接种时的细胞密度可采用2×10⁷-2×10⁸ L^-1；

（2）人羊膜间充质干细胞的无血清培养、纯化及扩增

将上述人羊膜间充质细胞接种在75ml培养瓶培养，内含5ml无血清培养液，包括：

基础培养基DMEM／F12（按体积1:1混合）15.0g/L

人血清白蛋白                           5.0×10^-1% 

人转铁蛋白                             1.0×10^-1g/L

人胰岛素                               5.0×10^-1g/L 

亚硒酸钠                               5.2×10^-4g/L

接种时的细胞密度采用2×10⁷L^-1；

置于37℃体积分数为5%的Co₂饱和湿度培养箱中培养。培养48-72小时后，更换培养液，弃去未贴壁的细胞，根据细胞生长情况，每2-4天全量换液一次；待细胞达到80％-90％融合时，用2.5g／L胰蛋白酶消化，然后按1：2或1：3的比例的比例进行传代接种培养，并记为P1代。传代培养过程中每2天全量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，再重复上述操作进行传代，此传代培养记为P2代，然后继续上述传代培养过程；传3代后，细胞生长进入对数生长期，倍增时间为2天。HAMSCs为细长型成纤维状，融合后呈漩涡状。随着传代的进行，HAMSCs的胞体逐渐增大，出现部分宽大扁平的细胞，失去增殖和分化能力，而大部分细胞仍然维持细长的梭形，保持增生和分化能力；体外培养8代以后，细胞的增殖速度明显减慢，细胞出现老化现象；

（3）人羊膜间充质干细胞库的构建

取P2-3代羊膜间充质干细胞，保存于无血清培养液加冷冻保护

液10%二甲基亚砜（DMSO）中，细胞浓度调整至1×10 ⁶个/ml,分装于标记冻存日期的冷冻管中，置液氮冷冻。液氮冷冻温度为-196 ℃；按其新生儿性别和ABO/Rh分型及HLA分型进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，将其具体信息包括供者姓名，供者父母姓名、地址、联系方式，干细胞的配型信息等输入电脑数据库，建立完善的数据档案备查询，即构建出人羊膜间充质干细胞库。

实施例2

本发明人羊膜间充质干细胞库的构建方法，包括以下步骤：

（1）人羊膜间充质干细胞的分离及单细胞悬液的制备

在无菌条件下取正常足月剖腹产后产妇捐赠的羊膜；进行ABO/Rh血型检测及HLA分型检测和微生物学检测；检测甲型肝炎抗体、乙型肝炎病毒表面抗原、乙型肝炎病毒表面抗体、乙型肝炎病毒e抗原、乙型肝炎病毒e抗体、乙型肝炎核心抗体IgM、丙型肝炎抗体、戊型肝炎抗体、艾滋病病毒抗体、梅毒螺旋体抗体等其他相关传染性指标均呈阴性；在无菌超净台上钝性分离胎盘脐带面的羊膜5×5cm²，用PH7.2磷酸缓冲液(PBS)充分冲洗，将羊膜置于含1000U/ml庆大霉素和2.5μg/ml二性霉素B的生理盐水中，浸泡20分钟；将羊膜尽可能的剪碎，按每克组织加入终浓度2.5g/L胰蛋白酶5m1，搅拌使之与羊膜充分混和，置入37℃温箱消化30分钟后取消化液1000rpm离心5min，弃上清液；如此共3次，然后用V_DMEM：V_F12=1：l DMEM／F12培养液5ml中止胰蛋白酶，以尽可能除去上皮细胞；然后加入终浓度为1.0g/L胶原酶Ⅳ和0.1g/L脱氧核糖核酸酶Ⅰ的V_DMEM：V_Fl2=1：1的DMEM／F12培养液 5m1，        置                   于                   37℃消化30-60分钟后得细胞悬液；用200目不锈钢网过滤将消化下来的细胞制成单细胞悬液，1000r／m离心5-10分钟，用PBS洗2次，用苔盼兰染色，计数活细胞，以2×lO⁸ L^-1的密度将所得细胞接种于75ml培养瓶内；在接种时的细胞密度可采用2×10⁷-2×10⁸ L^-1；

（2）人羊膜间充质干细胞的无血清培养、纯化及扩增

将上述人羊膜间充质细胞接种在75ml培养瓶培养，内含5ml无血清培养液，包括：

基础培养基DMEM／F12（按体积1:1混合）15.0g/L

人血清白蛋白                           5.0×10^-1% 

人转铁蛋白                             1.0×10^-1g/L

人胰岛素                               5.0×10^-1g/L 

亚硒酸钠                               5.2×10^-4g/L

接种时的细胞密度采用2×10⁷L^-1；

置于37℃体积分数为5%的C0₂饱和湿度培养箱中培养。培养48-72小时后，更换培养液，弃去未贴壁的细胞，根据细胞生长情况，每2-4天全量换液一次；待细胞达到80％-90％融合时，用2.5g／L胰蛋白酶消化，然后按1：2或1：3的比例的比例进行传代接种培养，并记为P1代。传代培养过程中每2天全量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，再重复上述操作进行传代，此传代培养记为P2代，然后继续上述传代培养过程；传3代后，细胞生长进入对数生长期，倍增时间为2天。HAMSCs为细长型成纤维状，融合后呈漩涡状。随着传代的进行，HAMSCs的胞体逐渐增大，出现部分宽大扁平的细胞，失去增殖和分化能力，而大部分细胞仍然维持细长的梭形，保持增生和分化能力；体外培养8代以后，细胞的增殖速度明显减慢，细胞出现老化现象；

（3）人羊膜间充质干细胞库的构建

取P2-3代羊膜间充质干细胞，保存于无血清培养液加冷冻保护

液10%二甲基亚砜（DMSO）中，细胞浓度调整至1×10 ⁶个/ml,分装于标记冻存日期的冷冻管中，置液氮冷冻。液氮冷冻温度为-196 ℃；按其新生儿性别和ABO/Rh分型及HLA分型进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，将其具体信息包括供者姓名，供者父母姓名、地址、联系方式，干细胞的配型信息等输入电脑数据库，建立完善的数据档案备查询，即构建出人羊膜间充质干细胞库；

（4）人羊膜间充质干细胞复苏

羊膜间充质干细胞复苏方法，于60 ℃恒温水浴箱中，0.5min内快速复苏，按2×10⁴/cm²接种于塑料培养瓶内，用含DMEM/F12无血清培养基中培养，按1:3传代，扩增后获得大量人羊膜间充质干细胞，备用。

Claims (1)

1.一种人羊膜间充质干细胞库的构建方法，其特征是包括下述步骤：

（1）人羊膜的选材严格遵循供体符合医学标准并建立资料档案；（2）人羊膜收集及检测

取供体符合医学标准剖腹产或正常分娩的胎膜，在胎膜娩出5～10分钟内，从胎膜上钝性分离羊膜；进行ABO/Rh血型检测及HLA分型检测和微生物学检测，用磷酸盐缓冲液或0.9%生理盐水反复漂洗后剪碎；用含1000U/ml庆大霉素和2.5μg/ml二性霉素B的磷酸盐缓冲液或0.9%生理盐水浸泡30～40分钟；

（3）人羊膜间充质干细胞分离及单细胞悬液的制备

取人羊膜先用终浓度 2.5g/L胰蛋白酶，室温消化30-60分钟，共2-4次，然后用V_DMEM：V_F12=1：1 DMEM／F12培养液中止胰蛋白酶，采用含加入终浓度为1.0-2.0 g /L胶原酶Ⅳ和0.1-0.2g/L脱氧核糖核酸酶Ⅰ的DMEM／F12培养液，37℃消化30-60分钟，得到细胞悬液；用200目不锈钢网过滤将消化下来的细胞制成单细胞悬液，1000r／m离心5-10分钟，用PH7.2磷酸缓冲液PBS洗2次；再离心，离心机的转速为1500转／分钟-2500转／分钟，时间为10-20分钟，弃去上清液，即获得间充质干细胞；

（4）人羊膜间充质干细胞的无血清培养、纯化及扩增

将第(3)步所得细胞以2×lO⁷ L^-1-2×lO⁸ L^-1密度接种于培养基中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的C0₂培养箱中进行培养，根据细胞生长情况，每2-3天全量换液一次，待细胞达到80％-90％融合时，用终浓度2.5g/L胰蛋白酶消化，然后按1：2的比例或l：3的比例进行传代接种培养，并记为P1代，传代培养过程中每2-3天全量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，重复上述操作进行传代培养，并记为P2代，继续上述传代培养过程使人羊膜间充质干细胞逐渐得到扩增和纯化；

所述培养基采用V_DMEM：V_F12=1：1  DMEM／F12无血清培养基15.0-15.6g/L，其中含有体积分数5.0-10.0×10^-1% 人血清白蛋白，1.0- 5.5×10^-1g/L人转铁蛋白，5.0-10.0×10^-1g/L人胰岛素，5.2- 6.7×10^-4g/ L亚硒酸钠；

在上述第(4)步中，选择将第(3)步所得细胞以2×lO⁷ L^-1-2×lO⁸ L^-1密度接种于培养基中培养；

（5）人羊膜间充质干细胞库的构建

取P3代人羊膜间充质干细胞保存于无血清培养液加10%二甲基亚砜，细胞浓度调整至1×10 ⁶个/ml，分装于冷冻管中，标记冻存日期，置液氮冷冻，液氮冷冻温度为-196 ℃；按其新生儿性别和ABO/Rh分型及HLA分型进行保存，建立可供检索的细胞信息档案，即构建出人羊膜间充质干细胞库；

（6）人羊膜间充质干细胞复苏

人羊膜间充质干细胞复苏方法 于60 ℃恒温水浴箱中，0.5min内快速复苏，按2×10⁴/cm²接种于塑料培养瓶内，用含DMEM/F12无血清培养基中培养，按1:3传代，扩增后获得大量人羊膜间充质干细胞，备用。