CN101412987A

CN101412987A - 体外骨髓间充质干细胞扩增方法

Info

Publication number: CN101412987A
Application number: CNA2008100080301A
Authority: CN
Inventors: 陈兵; 陆德宾; 梁自文; 姜友昭; 李晓艳; 张忠辉
Original assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU; First Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2008-03-04
Filing date: 2008-03-04
Publication date: 2009-04-22

Abstract

本发明涉及细胞扩增，具体涉及一种体外骨髓间充质干细胞扩增方法。本发明所述的体外骨髓间充质干细胞扩增方法，包括以下步骤：(1)取骨髓，然后分离并收集骨髓间充质干细胞；(2)将收集的细胞重新混悬均匀，再接种、培养；(3)细胞达85％～95％融合时，对其进行消化并收集细胞，再传代培养；(4)培养3代16天后，弃去胎牛血清培养基；(5)然后用PBS冲洗，再加入含10％与骨髓来自同一主体的血清的培养基，继续培养3天；然后用胰酶消化，再用血清终止消化即可。与现有技术相比，本发明的方法具有更高的扩增效率；并且有效地解决了体外培养MSC存在的致瘤性和致敏性的问题。

Description

体外骨髓间充质干细胞扩增方法

技术领域

本发明涉及细胞扩增，具体涉及一种体外骨髓间充质干细胞扩增方法。

背景技术

我国是继印度之后的第二位糖尿病高发人群大国。糖尿病足是糖尿病最严重的并发症之一，以往治疗糖尿病足，服用药物是常用的方法，但是服用药物常常效果不佳，不能有效的减少截肢率；近年来，干细胞移植治疗糖尿病足初见疗效，但面临着组织来源不足和免疫排斥反应两大难题。干细胞研究给糖尿病足患者带来了新的希望，其中成体骨髓间充质干细胞多向分化潜能最强，最适合治疗糖尿病足这种包括神经血管在内的混合性病变，但是现有方法所扩增的细胞常常具有致瘤性和较强的免疫原性，这些因素限制了其临床应用。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述缺陷和不足，提供一种安全快速的体外骨髓间充质干细胞扩增方法。

本发明所述的体外骨髓间充质干细胞扩增方法，包括以下步骤：

(1)取骨髓，Percoll密度梯度离心分离并收集骨髓间充质干细胞；

(2)将收集的细胞用含15％胎牛血清的DMEM培养液重新混悬均匀，再接种、培养；

(3)细胞达85％～95％融合时，对其进行消化并收集细胞，用全培养基重新悬浮细胞按1:2传代培养；

(4)培养3代17天后，弃去胎牛血清培养基；

(5)然后用PBS冲洗，再加入含10％血清的培养基，继续培养5天；然后用胰酶消化，再用血清终止消化即可。

步骤(2)所述的接种、培养优选以下过程：按1×10⁵/ml密度接种于直径为35cm²的培养皿中，置于37℃，5％CO₂饱和湿度的CO₂孵箱中培养。

步骤(5)所述血清为与步骤(1)的骨髓来自同一主体的血清。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的方法具有更高的扩增效率；

(2)本发明的方法有效地解决了体外培养MSC存在的致瘤性和致敏性的问题。

附图说明

图1为实施例1扩增后所得的细胞的形状图；

图2是流式检测实施例1扩增后所得细胞的表面抗原CD34-特征图；

图3是流式检测实施例1扩增后所得细胞的表面抗原CD44+特征图；

图4是流式检测实施例1扩增后所得细胞的表面抗原CD105+特征图；

图5MSC扩增曲线图；

图6是对1例实施扩增后所得细胞进行染色体检测结果图；(其中图A是实验结果图，图B是经过LUCIA自动分析软件分析后得到的染色体排序结果图)

图7为裸鼠致瘤性检测的对照组结果图；

图8为裸鼠致瘤性检测的实验组结果图。

具体实施方式

以下提供本发明效果较好的实施例，以助于进一步理解本发明。

实施例1

(1)用装有2ml含500u/ml肝素的生理盐水的20ml无菌注射器抽取10ml骨髓.摇匀后注入50ml的无菌离心管中。再用等量含20u/ml肝素的生理盐水液稀释后，沿管壁徐徐滴流叠加入等体积的比重为1.077g/ml的Ficoll人淋巴细胞分离液上，2000r/min，离心30min，用毛细吸管首先将最上层脂质吸出弃掉，再将50％血清约20ml吸出，加入80mlDMEM制成含10％的与骨髓来自同一主体的血清的培养基共100ml，过滤，冻存于—20℃下(留最后5天培养时用)，再将毛细吸管伸至单个核细胞层中(位于细胞分离液与血浆之间的乳白色云雾状白膜层)，沿管壁轻轻吸出全部细胞(剩下的红细胞层和血浆层留用于制备与骨髓来自同一主体的血清)。然后用DMEM培养液离心洗涤2次，每次1500r/min，离心10min，弃去上清液，收集细胞。

(2)再将收集的细胞用含15％优质胎牛血清的DMEM培养液重新混悬均匀后，计数细胞数，调整细胞密度。然后按1×10⁵/ml接种于直径为35cm²的培养皿中，置于37℃，5％CO₂饱和湿度的CO₂孵箱中培养。1d后首次换液，弃去未贴壁细胞，以后每2天更换培养液1次，

(3)当细胞达85％～95％融合时用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA混合液37℃消化25min。当细胞突起缩回，细胞之间间隙增大，细胞接近圆形时用胎牛血清终止消化。用吸管反复吹打平皿底壁，使已经消化的细胞脱离平皿底壁。收取细胞悬液，1000r/min，离心5min，弃上清后用全培养基重新悬浮细胞按1:2传代培养。

(4)培养3代17天后，弃胎牛血清培养基。

(5)然后用PBS冲洗二次后，加入含10％与骨髓来自同一主体的血清的培养基，继续培养5天，再用胰酶消化培养瓶中贴壁第4代MSC后，用与骨髓来自同一主体的血清及时终止消化即可。

实施例2

(1)观察实施例1扩增后所得细胞的数量和形状：图1为实施例1扩增后所得的细胞的形状图。从图1可以看出，细胞排列呈旋涡状或平行排列，细胞形态呈长梭形。说明本方法培养的细胞形态符合人骨髓间充质干细胞的形态特征。

(2)流式检测实施例1扩增后所得细胞的表面抗原CD105+、CD44+、CD34-的特征。图2是流式检测实施例1扩增后所得细胞的表面抗原CD105+特征图；图3是流式检测实施例1扩增后所得细胞的表面抗原CD44+特征图；图4是流式检测实施例1扩增后所得细胞的表面抗原CD34-特征图。说明本方法培养的细胞表面抗原的表达符合人骨髓间充质干细胞的特征。

图5为MSC扩增曲线图，从图5可以看出，本发明的方法可以用约22天的时间从10ml人的骨髓液中培养出2.0×10⁸以上的间充质干细胞，扩增效率比较高。

(3)对5例实施扩增后所得细胞进行染色体检测：图6是其中1例扩增后所得细胞进行染色体检测结果图。其中图A是实验结果图，图B是经过LUCIA自动分析软件分析后得到的染色体排序结果图，结果提示染色体正常；无变异或缺失。从图6可以看出，扩增后所得的细胞并没发现染色体变异、缺失，同时仍保持其二倍体的稳定性。

(4)致瘤性检测：将实施例1扩增后所得细胞注入裸鼠体内，4个月后经病理科活检证实并无肿瘤细胞生成，见图7～8，图7为致瘤性检测的对照组结果图，图8为致瘤性检测的对照组结果图由图7和图8对比可见。

图6、7、8说明扩增后MSC染色体稳定，裸鼠致瘤性试验(—)，此时的MSC没有向肿瘤细胞分化，形成肿瘤的倾向。注入5位患者自体也证实的这一结果(最早的患者已经随访1年)。

(5)致敏性检测：将实施例1扩增后所得的细胞用生理盐水通过离心洗涤3次的细胞悬液，注入2～3个月的成年豚鼠皮下，48h后再注入一次，观察3天后，注射局部虽然出现中性粒细胞和巨噬细胞聚集，但豚鼠并无明显过敏反应。说明我们培养的细胞没有明显的致敏性，注入5位患者自体也证实的这一结果。

将最后生理盐水稀释的细胞悬液送检验科进行细菌、霉菌、真菌、支原体、衣原体、病毒检测并无以上病原生成。排除了体外培养过程中MSC受到污染的情况，保证了MSC细胞悬液的无菌状态。

Claims

1、一种体外骨髓间充质干细胞扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：

(4)培养3代17天后，弃去胎牛血清培养基；

2、根据权利要求1所述的一种体外骨髓间充质干细胞扩增方法，其特征在于，步骤(2)所述的接种、培养包括以下过程：按1×10⁵/ml密度接种于直径为35cm²的培养皿中，置于37℃，5％CO₂饱和湿度的CO₂孵箱中培养。

3、根据权利要求1所述的一种体外骨髓间充质干细胞扩增方法，其特征在于，步骤(5)所述血清为与步骤(1)的骨髓来自同一主体的血清。