CN101792777B - 食蟹猴骨髓间充质干细胞的慢病毒转染 - Google Patents

Abstract

本发明涉及食蟹猴骨髓间充质干细胞的慢病毒转染，具体涉及一种提高被病毒感染的细胞的病毒转染效率的方法。本发明提供的方法，包括：I)培养所述被病毒感染的细胞；II)对培养得到的所述被病毒感染的细胞进行转染；其特征在于：在培养所述被病毒感染的细胞时添加抗病毒药物，在所述细胞被转染之前的一段时间内，培养基中不使用抗病毒药物。通过本发明的方法使在被病毒感染的细胞的扩增数量增加的基础上，使得细胞的病毒转染效率大大地提高。

Description

食蟹猴骨髓间充质干细胞的慢病毒转染

技术领域

本发明涉及一种提高被病毒感染的细胞的病毒转染效率的方法，更具体地说，涉及一种提高被猴泡沫病毒(Simian Foamy Virus，SFV)感染的成年食蟹猴骨髓间充质干细胞的慢病毒转染效率。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞，主要存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，是具有自我复制、多向分化潜能的成体干细胞。在一定诱导条件下具有向成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、肌腱细胞、脂肪细胞以及基质细胞等中胚层细胞分化的能力；同时，MSC还可以向外胚层的神经元细胞和内胚层的肝卵圆性细胞分化。这突破了MSC仅为中胚层干细胞的概念，揭示了MSC具有更为重要的理论研究意义和更为广阔的应用前景。骨髓MSC体外分离培养容易获取，细胞免疫原性低，易于被外源病毒转染且表达稳定，已成为组织工程、基因治疗和再生医学研究中理想的种子细胞。间充质干细胞的应用大多是通过细胞直接自体移植或细胞体外扩增并自体移植的方式。

无论是利用骨髓MSC作为移植细胞或者基因工程的载体细胞，其治疗或使用的方法以及效果和疗效都需要经过大量的实验进行验证。但以病患者为直接研究对象进行科学研究受到诸多因素的制约，尤其是伦理学方面的限制。因此，需要首先在实验动物的身上确定各种治疗方法的疗效。

在所有的实验动物中，普遍认为灵长类哺乳动物是与人类最接近的动物。食蟹猴作为一种近年来大规模饲养的猴科灵长类哺乳动物，在各种治疗方法和药物的临床前实验中，发挥越来越重要的作用。

在以食蟹猴为对象研究骨髓间充质干细胞的应用中，本发明人发现成年食蟹猴的骨髓MSC在体外传代代数非常有限，细胞很快融合，在体外食蟹猴的骨髓MSC很难扩增到需要的数量。成年食蟹猴的骨髓MSC体外培养不超过3代就出现大片的细胞融合。无法进行细胞数量的扩增以及体外的基因工程改造的实验。而在某些成年多发疾病的研究中，作为细胞移植治疗以及基因工程改造的材料，必须提供足够数量的成年骨髓MSC。

经研究发现，所述成年食蟹猴的骨髓MSC体外培养不超过3代就出现大片的细胞融合现象的原因是因为它们感染了猴泡沫病毒(Simian Foamy Virus，SFV)，在本发明人的研究中发现，向成年食蟹猴的骨髓MSC的细胞培养基中添加抗逆转录病毒的药物可以使细胞在体外培养10代以上，使细胞数量大大地扩增。

但在以成年食蟹猴的骨髓MSC为研究对象的基因工程试验中，本发明人发现在成年食蟹猴的骨髓MSC的培养基中添加抗逆转录病毒的药物又会使细胞在以逆转录病毒为载体进行病毒转染的过程中的转染效率大幅度地降低，从而无法进行相关的研究。

在对某些病毒感染疾病的转基因疗法的研究中，我们也需要对病毒转染的细胞进行病毒转染，来验证病毒转染的治疗对病毒感染的细胞的治疗效果。

发明内容

本发明的目的之一是通过对被病毒感染的细胞的病毒转染方法的改进，使其转染效率大幅度地提高。

为此，本发明提供了一种提高被病毒感染的细胞的病毒转染效率的方法，包括：I)培养所述被病毒感染的细胞；II)对培养得到的所述被病毒感染的细胞进行转染；其特征在于：在培养所述被病毒感染的细胞时添加抗病毒药物，在所述细胞被转染之前的一段时间内更换培养基，更换的培养基中不使用抗病毒药物。

在一种优选的实施方式中，所述被病毒感染的细胞优选是被逆转录病毒感染的。

在一种优选的实施方式中，所述逆转录病毒优选是猴泡沫病毒。

在一种优选的实施方式中，所述被病毒感染的细胞优选是食蟹猴骨髓间充质干细胞。

在一种优选的实施方式中，所述食蟹猴骨髓间充质干细胞优选是成年食蟹猴骨髓间充质干细胞。

在一种优选的实施方式中，所述以病毒为载体的转染方法优选是以逆转录病毒为载体的转染方法。

在一种优选的实施方式中，所述以逆转录病毒为载体的转染方法优选是以慢病毒为载体的转染方法。

在一种优选的实施方式中，所述抗病毒药物优选为抗逆转录病毒药物。

在一种优选的实施方式中，所述抗逆转录病毒药物优选为泰诺福韦。

在一种优选的实施方式中，所述一段时间优选是2至8天。

应用本发明的方法，使感染有猴泡沫病毒的成年食蟹猴骨髓间充质干细胞不仅能够增殖达到足够的数量，还可以使病毒转染的效率大幅度地提高。另外，本发明的方法也可以用于对某些病毒感染疾病的转基因治疗的研究中。

附图说明

图1A示出了本发明实施例和对比例中使用的慢病毒载体转移质粒DUET101-GFP的基因分布的概图(其中EF 1-α和PGK是两个启动子结构，分别驱动GFP基因和潮霉素抗性基因，还包括复制起点、长末端重复序列(LTR)和氨苄青霉素抗性基因)，图1B中示出了本发明实施例和对比例中使用的包装质粒CMVΔ8.91的基因构建图，图1C中示出了本发明实施例和对比例中使用的包装质粒PMD.G的基因构建图，图1D示出了本发明实施例和对比例中使用的载体质粒DUET101的基因构建图。

图2A示出了本发明中使用的293T细胞在显微镜下所观察到的细胞的照片(放大倍数为100倍)，图2B示出了在荧光显微镜下观察到的制备的慢病毒，图2C示出了在荧光显微镜下观察到的慢病毒滴度鉴定的结果，图2D示出了通过流式细胞仪检测到的带有绿色荧光蛋白的细胞百分比，横坐标GFP代表绿色荧光，图中十字右侧显示表达绿色荧光阳性细胞，左侧表示阴性细胞；纵坐标PI表示红色荧光，十字上方为红色荧光阳性细胞，下方为红色荧光阴性细胞，PI染色死亡细胞核。

图3示出了在对比例2中，在转染本发明中的慢病毒后，在不同时间点所观察到的细胞中GFP的阳性率。

图4示出了在对比例1和2以及实施例1中在病毒转染前的不同时间点停用泰诺福韦进行病毒转染，所达到的有绿色荧光蛋白的细胞的百分比。

图5示出了在对比例1和2以及实施例1中分别在病毒转染前的第2天和第6天停用泰诺福韦进行病毒转染后，在荧光显微镜下观察到的带有绿色荧光蛋白的细胞，其中图5B和5G的放大倍数为200倍，图5C、图5D、图5E、图5H、图5I和图5J放大的倍数为100倍。

具体实施方式

本发明中使用的感染有病毒的细胞可以取自活的动物体或是刚刚处死的动物或者可以是实验室自行冻存的细胞。在本申请的实施例中所使用的细胞就是发明人自己冻存的成年食蟹猴骨髓间充质干细胞。本发明的细胞也可以是猩猩等其他灵长类哺乳动物的细胞。本发明的方法也可以用于对某些病毒感染疾病的转基因治疗的研究中。如艾滋病等其他病毒感染疾病的转基因治疗中。

感染有病毒的细胞在培养的过程中，如果不添加抗病毒的药物，生长状况较差，而且会很快融合，无法大量地增殖下去。当向这些细胞的培养基中添加抗病毒的药物会使细胞的生长状况得到改善，但是添加抗病毒药物后，以病毒为载体进行病毒转染的效率会很低。在本发明中，在进行病毒转染前的一段时间内，停止使用抗病毒药物，使病毒转染的效率提高。

实施例1和对比例1和2

发明人以慢病毒为载体转染食蟹猴间充质干细胞，在实施例1中，使用的细胞是感染有猴泡沫病毒的成年食蟹猴细胞，分别在慢病毒转染前的2、4、6和8天停用抗逆转录病毒药物泰诺福韦，即在慢病毒转染前的2、4、6和8天更换培养基，更换的培养基中不含抗逆转录病毒药物泰诺福韦；在对比例1中，使用的细胞是感染有猴泡沫病毒的成年食蟹猴细胞，在以慢病毒为载体转染的过程中不停用抗逆转录病毒药物泰诺福韦；在对比例2中，使用的细胞是没有感染猴泡沫病毒的食蟹猴细胞(这些食蟹猴细胞取自幼年1-3岁的食蟹猴，实验动物食蟹猴来自于广西南宁灵康赛诺科生物科技有限公司，该公司的动物实验设施已获得国际实验动物管理评估及认证协会(Association for Assessment and Accreditation of LaboratoryAnimal Care，AAALAC)的资质认证)，在没有感染病毒的食蟹猴细胞的培养和病毒转染的过程中均没有添加泰诺福韦，以此为阳性对照。

第一步：慢病毒的制备(即在293T细胞中进行病毒的扩增)

1)传代培养293T细胞，保持细胞在较高的密度，按1∶4～1∶5分传；

2)在转染病毒前一天，用100μg/ml的多聚-右旋-赖氨酸溶液包被100mm培养皿(使细胞贴壁更牢)，室温作用60min，使用前用无菌PBS洗两次；

3)使293T细胞在转染前可以达到70～80％汇片；

4)取400μl OPTI-MEM培养基(Invitrogen)置于5ml聚苯乙烯管中，将载体质粒DNA按照DUET101∶CMV8.91∶PMD.G(这三种质粒来自霍普金斯大学程临钊实验室，结构在网址为http://www.addgene.org/pgvec1？f＝c&identifier＝17629&cmd＝findpl&attag＝c上可查到)＝3∶4∶1比例溶于其中，三个质粒DNA总量为16μg，混匀，室温放置5min；

5)同样取Lipofectamine2000脂质体(GIBCO)32μl加入另一盛有400μl OPTI-MEM(Invitrogen)的聚苯乙烯管中，轻柔混匀，室温放置5min；

6)再将步骤4)和5)得到的两种液体混合，室温放置20min；

7)将质粒DNA与Lipofectamine2000脂质体的混合液加入含有8ml新鲜培养基的293T细胞培养皿中，混匀，37℃，5％CO₂培养箱中培养；

8)转染后12h，弃去转染液，加入8ml ITS培养液收集病毒上清；

9)继续培养24hr、48hr后收集病毒上清后收集病毒上清，500rpm离心去除细胞碎片，用0.45μm滤器过滤到无菌离心管中，在浓缩前在4℃下进行保存。

第二步：慢病毒的浓缩

1)取4ml无菌DPBS加到Ultra-Plus 20滤膜(Millipore)上，2500rpm离心5分钟，湿润滤膜。弃去管底DPBS溶液。

2)将经过0.45μm滤器过滤的病毒上清加入滤膜插件(滤膜套管内)中，4℃，4000g离心20min。

3)吸取滤膜插件上的上清，分装于1.5ml EP管中，滴度鉴定后储存于-80℃冰箱中，备用。

第三步：慢病毒滴度的鉴定

1)用100μg/ml的多聚-右旋-赖氨酸溶液包被六孔板，以每孔2×105个细胞的密度将293T细胞接种于六孔板。

2)将病毒上清加入293T细胞培养液中，以8μg/ml的浓度加入聚凝胺。

3)荧光显微镜下计算绿色荧光蛋白阳性细胞数，以下面公式计算病毒上清滴度。病毒滴度＝绿色荧光蛋白阳性细胞百分比×293细胞总数/加入病毒上清的体积。

第四步：细胞的培养

实施例1和对比例1中使用的成年食蟹猴骨髓间充质干细胞是本发明人冻存的细胞，取自成年食蟹猴(这些食蟹猴来自于广西南宁灵康赛诺科生物科技有限公司，该公司的动物实验设施已获得国际实验动物管理评估及认证协会(Association for Assessment andAccreditation of Laboratory Animal Care，AAALAC)的资质认证)，这些细胞在冻存之前的培养过程中一直使用含有泰诺福韦的培养基，如果使用复苏的成年食蟹猴骨髓间充质干细胞，在复苏后停止使用泰诺福韦，即使用不含泰诺福韦的培养基，分别在复苏后的第2、4、6和8天进行病毒转染(指进行四个在不同时间点进行病毒转染的平行实验，相当于分别在转染前的第2、4、6和8天停用泰诺福韦)或者是成年食蟹猴骨髓间充质干细胞也可以不经冻存，在食蟹猴体外培养合适阶段就进行转染，如果不冻存，则分别在转染前的2、4、6和8天停用泰诺福韦，即分别在转染前的2、4、6和8天使用更换后的不含泰诺福韦的培养基。在对比例2中所使用的细胞是未感染猴泡沫病毒的食蟹猴骨髓间充质干细胞，这些细胞取自幼年1-3岁的食蟹猴，这些食蟹猴的来源来自于广西南宁灵康赛诺科生物科技有限公司，该公司的动物实验设施已获得国际实验动物管理评估及认证协会(Association for Assessment and Accreditationof Laboratory Animal Care，AAALAC)的资质认证。可以是冻存的，也可以是未经过冻存的，在整个培养和转染的过程中均不使用泰诺福韦。

第五步：慢病毒转染细胞

1)等到细胞长满70％，更换新鲜培养基，根据绿色荧光蛋白(GFP)病毒滴度和细胞数量，按照MOI值等于10加入病毒上清(MOI＝病毒数/细胞数，即相当于10个病毒一个细胞)加入病毒上清，以10μg/ml的浓度加入聚凝胺。孵育20小时后弃去转染液，加入新鲜培养基；

2)培养1周后，荧光显微镜下观察，同时在不同时间点计算转染效率。

结果：在对比例2的阳性对照中，病毒转染的效率较高，在转染进行20小时时达到平台期，最高可以达到85％，具体结果可以参见图3；在对比例1中，在整个细胞培养和转染的过程中一直都使用泰诺福韦，病毒转染的效率很低，只有10％；在实施例1中，在停用泰诺福韦两天后进行病毒转染的效率最高可达到15％，在停用泰诺福韦6天后进行病毒转染的效率最高可达到50％，在实施例1中停用泰诺福韦后的不同时间点进行病毒转染可以达到的效率以及对比例1和2中病毒转染可以达到的效率可以参见图4，在图5中示出了在荧光显微镜下观察到的进行了病毒转染实验的照片。随着停用泰诺福韦时间的延长，细胞中SFV的拷贝数也相应提高，平均超过8天，成年食蟹猴MSC细胞会出现融合的现象，影响细胞的进一步传代培养。

由上述实验结果可以看出，通过本发明的方法可以相对目前采用的方法更为高效地进行成年食蟹猴MSC细胞的病毒转染，以便于进行各种病毒转染的研究。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种提高被猴泡沫病毒感染的食蟹猴骨髓间充质干细胞的以慢病毒为载体的病毒转染效率的方法，包括：

I)培养所述被猴泡沫病毒感染的食蟹猴骨髓间充质干细胞；

II)对培养得到的所述被猴泡沫病毒感染的食蟹猴骨髓间充质干细胞进行以慢病毒为载体的病毒转染；

其特征在于：在培养所述被猴泡沫病毒感染的食蟹猴骨髓间充质干细胞时添加抗逆转录病毒药物，接着在所述食蟹猴骨髓间充质干细胞被以慢病毒为载体的病毒转染之前的一段时间内更换培养基，该更换的培养基中不使用抗逆转录病毒药物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述食蟹猴骨髓间充质干细胞是成年食蟹猴骨髓间充质干细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗逆转录病毒药物为泰诺福韦。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述一段时间是2至8天。

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