CN104922153A - Nrg1-erbb4复合体在制备治疗心肌缺血的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供神经调节蛋白1(NRG1)与其酪氨酸蛋白激酶受体ERBB4的复合体(NRG1-ERBB4复合体)在制备治疗心肌缺血的药物中的应用。本发明提供了以NRG1-ERBB4复合体为靶标的治疗心肌缺血的药物。优选地，所述的药物是ERBB4基因修饰的骨髓间充质干细胞(MSC)。通过慢病毒在MSC中过表达ERBB4，从而反馈性上调其配体NRG1的表达，形成NRG1-ERBB4-NRG1的自反馈通路的药物，不仅提高了MSC对缺氧环境的耐受能力，且通过NRG1-ERBB4-NRG1的自反馈通路保持高水平NRG1的浓度，改善并增强MSC对于心肌细胞的保护作用，提高了心肌缺血药物的疗效。

Description

NRG1-ERBB4复合体在制备治疗心肌缺血的药物中的应用

技术领域

本发明属于基因和蛋白的功能与应用领域，涉及神经调节蛋白1(NRG1)与其酪氨酸蛋白激酶受体ERBB4的复合体(NRG1-ERBB4复合体)的应用，特别涉及NRG1-ERBB4复合体在制备治疗心肌缺血的药物中的应用。

背景技术

据统计，心血管疾病发病率在全球非传染性疾病中居首位，具有“发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高、并发症多”，即“四高一多”的特点，是一种严重威胁人类健康的疾病。尽管近年来对心血管疾病的预防、诊断及治疗都有很大的进展，其发病率及死亡率仍居高不下。现有的治疗方法都有其局限性：如冠状动脉血管重建术无法避免心肌损伤，20-37％的病人中并发了心肌梗死，逐渐出现心脏功能衰竭等症状；而心脏移植术供体有限，创伤大，术后易发生排斥反应等并发症。因此，寻求高效、高靶向性、低创、低毒性的治疗方法成了当务之急。

干细胞是一群原始且未分化的细胞，可自我复制，在特定条件下，具有分化成其他种类成熟细胞的能力，因此又被称为“万能细胞”。它们参与胚胎及组织的发育及成熟过程，而对于组织或器官受损后的修复或再生，这些自身特点也使得干细胞成为潜力极大的治疗手段。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)在动物模型及临床试验中都显示出极大的应用潜力和治疗效果，是研究最广、安全性最好、效果最显著的干细胞类型。尽管MSC的作用机制尚未被完全阐明，其强大的旁分泌功能在多种疾病中的疗效已经得到证实。MSC可分泌多种营养性及具有免疫调节活性的因子，抑制细胞凋亡，促进细胞的存活及增殖，降低缺血部位的炎症反应，保护受损的心肌细胞，招募内源性心肌干细胞进行组织修复，大大减少了心梗后发生心肌损伤及功能紊乱的几率。局部注射MSC的培养上清可显著缩小心梗面积，改善左室功能。研究发现，MSC分泌的bFGF、VEGF、SDF-1、Angiopoietin-1、HGF、IGF、PDGF、SFRP、TGF、MMP9等有利于损伤的修复，是MSC发挥保护作用的关键因子。然而，通过静脉系统给入或局部注射的MSC到达梗死部位后，由于局部缺血缺氧的环境无法提供细胞存活所需的营养物质，移植细胞的存活率低，很大程度上限制了干细胞的治疗作用。因此，对MSC进行充分改造，使之更能耐受病灶内的恶劣环境，成为今年研究的热点之一。

实验表明，对MSC进行基因改造可改善细胞的生物学特性，包括存活率，迁移性，抗凋亡能力等。比如，在MSC中过表达Bcl-2(B-cell lymphoma 2)蛋白，可增强移植细胞的体内存活，有助于心梗后左室功能的恢复[Figeac,F.,etal.,Nanotubular crosstalk with distressed cardiomyocytes stimulates theparacrine repair function of mesenchymal stem cells.Stem Cells,2014.32(1):p.216-30.]。同样，在MSC中过表达促生长因子1(insulin-like growthfactor 1，IGF1)可诱导干细胞的迁移，促进新生血管形成，从而改善心脏缺血状态[Haider,H.,et al.,IGF-1-overexpressing mesenchymal stem cellsaccelerate bone marrow stem cell mobilization via paracrine activationof SDF-1alpha/CXCR4signaling to promote myocardial repair.Circ Res,2008.103(11):p.1300-8.]。然而，以往的研究在目标基因的筛选上，只注重该基因对细胞本身或体内未分化的干细胞的作用，从未关注其对成熟心肌细胞的影响，而后者亦为参与心脏修复和组织再生的重要环节，因此，筛选并鉴定出同时对移植细胞本身和成体心肌细胞具有保护作用的关键基因或信号通路具有更贴近实际需要的应用潜力。

最近Bersell等人的研究发现，神经调节蛋白1(neuregulin1，NRG1)可刺激成熟的心肌单核细胞重新进入分裂周期[Bersell,K.,et al.,Neuregulin1/ErbB4signaling induces cardiomyocyte proliferation andrepair of heart injury.Cell,2009.138(2):p.257-70.]。靶向性地导入NRG1或其酪氨酸蛋白激酶受体ERBB2或ERBB4对心梗有保护作用。NRG1属于表皮生长因子家族，通过与酪氨酸激酶受体ERBB结合，介导细胞接触及信号传递，在心脏的发育及成熟过程中至关重要。重组人NRG1已被用于慢性心力衰竭的临床试验(ClinicalTrials.gov identifiers NCT01131637,NCT01258387)，在纠正心衰、改善心肌重构上初见成效。ERBB2是一个共受体，不具有配体结合域，但可与ERBB4形成ERBB2/ERBB4异二聚体，后者可与配体NRG1结合并发挥作用。而ERBB4除了可以与ERBB2形成异二聚体外，自身亦可形成同二聚体，与其配体NRG1结合。NRG1-ERBB通路激活后，可启动下游的PI3K/Akt信号转导，从而促进细胞的增殖，分裂和存活。尽管这些研究结果都提示NRG1有望成为治疗心梗的有效手段，但亦有其不足之处：其一，NRG1在体内的半衰期极短(约30分钟)，为制定给药时间及间歇造成困难；其二，在成体心脏中只有大约10％的心肌细胞为单核细胞，其中只有0.3％的单核心肌细胞对NRG1刺激产生反应，重新进入分裂周期[Bersell,K.,et al.,Neuregulin1/ErbB4signaling inducescardiomyocyte proliferation and repair of heart injury.Cell,2009.138(2):p.257-70.]；其三，NRG1的刺激呈受体依赖性，靶细胞是否表达ERBB受体决定其是否对NRG1作出反应。因此，如何使NRG1持续且稳定地释放到病灶局部，是目前急需解决的重要课题。

发明内容

本发明的第一个目的是提供神经调节蛋白1(NRG1)与其酪氨酸蛋白激酶受体ERBB4的复合体(NRG1-ERBB4复合体)在制备治疗心肌缺血的药物中的应用。

根据本发明所述的在制备治疗心肌缺血的药物中的应用，所述NRG1-ERBB4复合体作为基因修饰MSC的靶标。

本发明的第二个目的是提供以NRG1-ERBB4复合体为靶标的治疗心肌缺血的药物。

本发明所述的药物是能在病灶局部过表达ERBB4，从而反馈性地上调其配体NRG1的表达，形成NRG1-ERBB4-NRG1的自反馈通路的药物。

优选地，所述的药物是ERBB4基因修饰的骨髓间充质干细胞(MSC)。该MSC具有增强的对缺氧环境的耐受力，又能在病灶局部过表达ERBB4，通过NRG1-ERBB4-NRG1的自反馈通路保持病灶局部高水平NRG1的浓度，改善并增强MSC对于心肌缺血的治疗效果。

本发明首次筛选并鉴定出同时对移植细胞本身和成体心肌细胞具有保护作用的关键基因或信号通路，揭示了NRG1和ERBB4两者结合能够成为基因修饰MSC的靶标而用于制备治疗心肌缺血的药物。在本发明中，利用慢病毒系统在MSC中过表达ERBB4(MSC-ERBB4)，反馈性的上调了其配体NRG1的表达，不仅提高了移植细胞在体内的存活率，且MSC-ERBB4通过上调NRG1的表达，保护心肌细胞。药物的筛选、制备及剂量优化一直是临床心肌缺血治疗的难题之一，在治疗心肌缺血的药物研发过程中应特别关注一些对成熟心肌细胞具有保护作用的关键性蛋白的影响。本发明首次证实了NRG1-ERBB4-NRG1自反馈通路的存在，既可增强间充质干细胞本身对缺氧的耐受力，增高的NRG1又可促进成熟心肌细胞的增殖。因此，NRG1-ERBB4复合体可以作为靶标，对于临床心肌缺血药物的筛选、制备及剂量优化具有重要意义。

附图说明

图1A为第三代慢病毒包装质粒图谱，由addgene公司提供。

图1B为穿梭质粒pGFP及pER4-GFP的图谱，由广州复能基因有限公司提供。

图2A为慢病毒感染小鼠MSC后的效率鉴定图，显示MSC可被慢病毒成功感染，MSCe及MSC-ERBB4成功携带GFP。

图2B为RT-PCR检测MSC在慢病毒感染后，ERBB4的表达图，显示MSC-ERBB4成功携带ERBB4表达。

图3A为Annexin V-PI染色法检测凋亡细胞的结果图，显示流式细胞术检测缺氧24小时后，MSCe和MSC-ERBB4的凋亡情况。

图3B为凋亡细胞率的统计结果。

图4A为Western Blotting检测细胞中NRG1的表达情况。

图4B为Elisa检测细胞上清中NRG1的表达水平。

图5A为免疫荧光染色α–actinin鉴定心肌细胞。

图5B为加入细胞培养上清后免疫荧光染色检测Ki67阳性的心肌细胞，证明MSCe及MSC-ERBB4的培养上清对心肌细胞增殖的影响。

图5C为Ki67阳性着染细胞的统计结果。

具体实施方式

本发明采用以下的技术路线：构建含有ERBB4基因的慢病毒表达质粒，加入包装质粒后共同转染包装细胞，收集病毒上清并感染MSC，使MSC成功过表达ERBB4，从而反馈性地上调其配体NRG1的表达。

主要包括以下步骤：

(1)利用慢病毒包装系统在MSC中过表达ERBB4(MSC-ERBB4)；

(2)比较MSC-ERBB4与野生型MSC在缺氧环境下的抗凋亡能力；

(3)检测NRG1在MSC-ERBB4与野生型MSC中的表达差异；

(4)验证NRG1在两种细胞中的差异表达是否对成熟心肌细胞有影响。

研究表明，基因修饰的方法可使MSC自身的功能得到改良，更好地发挥治疗效果。而以往的研究中，在靶基因的选择上，只关注其对MSC本身或未分化的干细胞的作用，忽略其对成熟心肌细胞的影响。本发明通过在MSC中过表达ERBB4，反馈性上调了其配体NRG1的表达，不仅大大提高了MSC对缺氧的耐受性，而且上调的NRG1可保护心肌细胞，达到了一举两得的双重效果，为临床优化MSC疗法开拓了新的思路。

实施例一：慢病毒制备，MSC感染以及ERBB4表达效率的鉴定

本实验所需的第三代慢病毒包装质粒购于Addgene公司(https://www.addgene.org/)，质粒图谱见图1A。穿梭质粒pGFP及pER4-GFP购于广州复能基因有限公司，质粒图谱见图1B。这些质粒的信息见表1。慢病毒包装细胞293FT购于Invitrogen公司(目录号R700-07)；MSC从C57/BL6小鼠骨髓提取。C57/BL6小鼠购于香港大学实验动物中心。

表1：慢病毒包装质粒信息

本实验所需试剂见表2。

表2：用于慢病毒制备，MSC感染以及ERBB4表达效率鉴定的试剂

本实验中293FT及小鼠骨髓MSC培养基成分见表3。

表3：293FT细胞及小鼠骨髓MSC培养基配方

实验过程：

1.慢病毒制备

细胞转染前24小时，消化293FT细胞并计数，以5×10⁶接种于10cm培养皿中，使其转染时细胞融合率达80％-90％。按照Lipofectamine2000说明书的步骤，将慢病毒病毒表达质粒pER4-GFP及pGFP分别加入包装质粒后转染293FT细胞，质粒用量分别为(10μg pGFP+6.52μg pMDL+2.52μg pRSV-REV+3.52μg pMD2.G)及(36μg pER4-GFP+12μg pMDL+6μg pRSV-REV+18μg pMD2.G)。转染48小时后，收获包装细胞293FT产生的病毒上清，置于4度冰箱暂存。加入新鲜293FT培养基，再培养24小时，第二次收集病毒上清，与第一次收集的病毒上清混合，经0.45μm滤膜过滤并按照Peg-it说明书将病毒浓缩。分装浓缩后的病毒液，置于-80度冰箱保存。

2.慢病毒感染MSC及感染效率的检测

2.1小鼠骨髓MSC提取

小鼠MSC细胞通过骨髓冲洗法获取。通过贴壁培养法去杂细胞，大约传代4次后，镜下可见MSC为较规则的长梭形，排列有方向性，呈现漩涡状、辐射状生长趋势。

2.2慢病毒感染MSC及感染效率检测

消化MSC细胞并计数，以1×10⁶每孔的密度接种于6孔板中，将病毒上清及Polybrene(终浓度为8μg/mL)加入6孔板中。感染48小时后在荧光倒置显微镜下观察MSC中绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况。

在488nm波长激发光下，可见绝大多数细胞发出绿色荧光，证实靶细胞MSC可被成功感染。表达对照载体pGFP的MSC记为MSCe，表达载体pER4-GFP的MSC记为MSC-ERBB4。未进行慢病毒感染的MSC作为对照组，无GFP表达(图2A)。2.3慢病毒感染后ERBB4基因的表达鉴定

分别收集1×10⁶的MSC，MSCe及MSC-ERBB4，按照QIAGEN公司的RNeasy MiniKit(目录号74104)提取细胞总RNA，根据Takara公司的PrimeScript FirstStrand cDNA Synthesis Kit(目录号6110A)逆转录试剂盒说明书，将总RNA逆转录为cDNA，用TaKaRaTaq^TM(目录号R001A)并以60℃为退火温度进行PCR。PCR所用引物序列如下：

根据小鼠ERBB4基因(GENBANK登录号：NM_010154)设计以下引物：

F引物：5’-TTCCAACCCGAGAAATCCCC-3’(SEQ ID NO:1)

R引物：5’-TGTCTTCCAAATCCTCTTCATCCA-3’(SEQ ID NO:2)

根据小鼠β-actin基因(Genbank登录号：NM_007393.3)设计以下引物：

F引物：5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’(SEQ ID NO:3)

R引物:5'-TGCTGGAAGGTGGACAGTGAG-3’(SEQ ID NO:4)

结果显示，相比阴性对照组MSC以及空载体MSCe对照组，重组载体pER4-GFP病毒感染后的MSC-ERBB4细胞中ERBB4表达水平显著提高(图2B)，证明重组载体pER4-GFP病毒感染MSC效果良好，可使其稳定过表达ERBB4。

实施例二、检测MSC-ERBB4与MSCe在缺氧环境下的抗凋亡能力

本实验目的为检测在MSC中激活NRG1-ERBB4通路后是否影响细胞在缺氧环境下的抗凋亡能力。

细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。Annexin V是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白，易于与磷脂类如PS结合。利用Annexin V对PS的高亲和性，Annexin V可作为探针检测暴露在细胞膜表面的PS，从而分辨出处于凋亡状态的细胞。然而，PS转移到细胞膜外不是凋亡细胞独有的，也可发生在坏死细胞中。细胞凋亡和坏死的差别在于细胞膜的完整性-凋亡细胞的细胞膜是完整的，而坏死细胞的细胞膜已经受损。因此，凋亡细胞对细胞活性鉴定染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的坏死细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的凋亡细胞则不会有红色荧光信号。因此，在双变量流式细胞仪的散点图上，Annexin V-PI-双阴性的细胞为活细胞，Annexin V+及PI+双阳性为坏死细胞，Annexin V-PI+的为坏死细胞，Annexin V+PI-的为凋亡细胞。

将MSCe与MSC-ERBB4按照1×10⁶每孔的密度分别接种于6孔板，在无血清培养基中加入不同浓度的NRG1(0ng/mL，10ng/mL,20ng/mL,50ng/mL)，然后将细胞置于低氧环境下(1％O₂)培养。24小时后，消化细胞，按照Annexin V-PIapoptosis detection kit(eBioscience,目录号88-8007-74)说明书对细胞进行染色后，流式细胞术上机分析。在常氧条件下(21％O₂)培养的细胞作为实验对照组。

本实验采用缺氧及无血清条件培养细胞，目的使在体外模拟体内的心肌缺血微环境。

结果见图3。常氧培养的MSCe(图3，Ai)及MSC-ERBB4(图3，Avi)均未出现凋亡。缺氧培养24小时后，MSCe(图3，Aii，20.0％)及MSC-ERBB4(图3，Avii，18.4％)呈现相当程度的凋亡。在培养基中添加NRG1后，MSCe的凋亡率没有明显改变(图3，Aiii，Aiv，Av)，但MSC-ERBB4对NRG1刺激有明显的反应，其凋亡率随NRG1浓度的增高而降低(图3，Aviii，Aix，Ax及B)，说明激活MSC中NRG1-ERBB4信号通路可增强其对缺氧无血清环境的耐受力。

实验例三、检测NRG1在MSC-ERBB4与MSCe中的表达差异

收集MSC、MSCe及MSC-ERBB4的蛋白以及培养上清。

所述蛋白提取使用RIPA(Sigma,目录号R0278)试剂，按照说明书进行。

所述细胞培养上清的收集步骤：将MSC，MSCe及MSC-ERBB4分别接种于10cm培养皿，调整细胞密度为70％-80％，PBS洗细胞两遍，加入8mL无酚红DMEM(GIBCO,目录号21063-029)。将细胞分别置于常氧及低氧下培养24小时后收集细胞上清，依次通过离心及0.22μm滤膜过滤去除残留细胞，用浓缩注(Millipore,目录号UFC801024)对上清进行浓缩。浓缩倍数为10。

所得细胞蛋白经Bradford(BIO-RAD,目录号5000202)方法进行定量后，用于常规western blotting实验。检测靶蛋白为NRG1(Santa Cruz，目录号SC-348)，内参照为β-actin(Santa Cruz，目录号SC-47778)。

所得细胞上清浓缩液用于ELISA实验，旨在检测上清中分泌性NRG1的表达水平。ELISA实验使用试剂盒(USCN,目录号E91866Mu)，按照说明书进行。

结果显示，MSC及MSCe中有NRG1的表达，但在MSC-ERBB4中，NRG1的表达水平显著上调(图4，A)。经ERBB4过表达后，NRG1不仅在细胞中的表达上调，在细胞分泌的上清中，也可检测到NRG1的增高，且在缺氧条件下更为明显(图4，B)。

以上结果表明在MSC中过表达ERBB4可反馈性上调其配体NRG1的表达，这在国内外未见报道，是本项发明的核心创新性所在。

实验例四、验证NRG1在两种细胞中的差异表达是否对成熟心肌细胞有影响

已经证实，来源于MSC-ERBB4的培养上清较之来源于MSCe的培养上清，NRG1的浓度高出1到2倍，本实验为验证浓缩培养上清中增高的NRG1是否对成熟心肌细胞有影响。

成熟心肌细胞从新生小鼠中提取。具体步骤为：取出小鼠心脏，置于预冷的HBSS中，剪成0.5-1mm³的小片后，转到50mL离心管中，加入10-15mL的0.05％胰酶，放到37度的水浴中，缓慢涡旋消化15分钟后，静置让组织块沉积。去上清，加入10mL胰酶，37度水浴中消化15分钟。静置让组织块沉积后，收集上清到放有10mL Claycomb培养基的离心管中。在余下的组织块中加入10mL胰酶消化第二次。重复消化，收上清步骤直至组织块呈现成团的胶质状。通过离心收集上清中的细胞，接种于10cm培养皿中，置于37度细胞培养箱中。经2-3小时后，收集未贴壁的肌细胞，离心，计数，按照1.5×10⁵细胞每cm²的密度接种于Gelatin/Fibronectin预包被的培养板中。一天后镜下观察可见心肌细胞的收缩及跳动。

所述实验试剂及心肌细胞培养基配方见表4。

表4：实验试剂及心肌细胞培养基配方

所述Gelatin/Fibronectin预包被培养板准备方法如下：称量0.1g Gelatin，放到500mL玻璃瓶中。加入500mL双蒸水，高压灭菌。Gelatin的工作的浓度为0.02％。在199mL的0.02％Gelatin工作液中加入1mL的Fibronectin(1mg/mL)，温和混匀，分装储于-20度。按照1mL每25cm²包被细胞培养板，置于37度培养箱至少1小时后，吸走多余的液体，注意不要刮到被gelatin包被的底部，培养板即可用于心肌细胞培养。

将心肌细胞接种于4孔板中，通过常规免疫荧光细胞染色检测成熟心肌标记物α-actinin的表达来鉴定心肌细胞。镜下可见大量α-actinin阳性着染的细胞(图5A)，说明心肌细胞提取及培养成功。

将心肌细胞接种于4孔板，PBS冲洗两遍后，分别加入经缺氧24小时培养的MSCe及MSC-ERBB4的浓缩上清。在另一组实验中，在MSC-ERBB4上清中加入NRG1抗体中和增高的NRG1，目的是检测MSC-ERBB4上清中增高的NRG1对心肌细胞的作用。将肌细胞置于缺氧培养箱继续培养24小时后，通过免疫荧光细胞染色检测细胞增殖标记物Ki67的表达。

所述Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关，可作为标记物检测细胞的增殖活性。

结果显示，MSC-ERBB4培养上清比MSCe的培养上清更能刺激心肌细胞的增殖，表现为镜下Ki67阳性细胞数量增多，但在用NRG1抗体中和MSC-ERBB4上清中的NRG1后，Ki67阳性细胞数量减少至于MSCe组别相当的水平，证实MSC-ERBB4上清中NRG1对心肌细胞有促进增殖的作用(图5B及图5C)。

Claims (5)

1.神经调节蛋白1(NRG1)与其酪氨酸蛋白激酶受体ERBB4的复合体(即NRG1-ERBB4复合体)在制备治疗心肌缺血的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述NRG1-ERBB复合体作为基因修饰MSC的靶标。

3.以神经调节蛋白1(NRG1)与其酪氨酸蛋白激酶受体ERBB4的复合体(即NRG1-ERBB4复合体)为靶标的治疗心肌缺血的药物。

4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于：所述的药物是能在病灶局部过表达ERBB4，从而反馈性地上调其配体NRG1的表达，形成NRG1-ERBB4-NRG1的自反馈通路的药物。

5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于：所述的药物是ERBB4基因修饰的骨髓间充质干细胞。