CN107177552A - 一种肝门静脉癌栓奥沙利铂耐药细胞株及其构建方法 - Google Patents

一种肝门静脉癌栓奥沙利铂耐药细胞株及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种肝门静脉癌栓奥沙利铂耐药细胞株及其构建方法。本发明采用人肝癌门静脉癌栓细胞株CSQT‑2为诱导对象，利用不同浓度的奥沙利铂连续处理7个月，寻找细胞能够存活并缓慢生长的最大耐药浓度，并以此浓度作为筛选浓度继续处理上述CSQT‑2细胞4个月，进一步获得了能在奥沙利铂处理下快速生长的人肝细胞门静脉癌栓奥沙利铂耐药细胞株CSQT‑2‑OXA。本发明在研究肝癌门静脉癌栓耐药机制、逆转肝癌门静脉癌栓细胞耐药性和指导临床病人化疗用药方面具有重要的应用前景。

Description

一种肝门静脉癌栓奥沙利铂耐药细胞株及其构建方法
所属技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种肝门静脉癌栓奥沙利铂耐药细胞株及其构建方法。
背景技术
原发性肝癌栓世界上肿瘤引起病人死亡的主要原因之一，其发病率在恶性肿瘤中排名第六，死亡率中排名第三。大多数肝癌患者发现时已处于晚期，失去手术时机。晚期肝癌患者容易在门静脉主干或主要分支内形成癌栓，堵塞门静脉，引起门静脉高压以及肝功能障碍等，严重影响患者的预后，因此，这部分病人仍需及时有效的药物治疗。
药物治疗是晚期肝癌伴门静脉癌栓患者的主要手段之一，但治疗过程中患者经常出现耐药现象，它是药物治疗失败的主要原因。因此，研究肝门静脉癌栓细胞耐药机制及其预防或逆转肝门静脉癌栓耐药的发生，对于提高患者治疗效果十分重要；建立肝门静脉癌栓耐药细胞株对于研究肝门静脉癌栓细胞耐药机制、逆转肝门静脉癌栓细胞耐药性和指导病人用药方面都具有重要的应用价值.
奥沙利铂(Oxaliplatin，OXA)是第三代铂类抗肿瘤药物，与其他铂类药物相比其具有更少的副作用，以奥沙利铂为基础的联合用药对原发性肝癌患者中展现出具有前景的抗肿瘤活性.其可以在DNA内形成连间和连内的交叉连接，从而阻止DNA复制和转录，进而引起细胞死亡。但是患者群中有相当一部分人对奥沙利铂不敏感，敏感的病人经奥沙利铂长期治疗后也常有耐药现象发生。但是，目前尚缺乏对奥沙利铂耐药的肝癌细胞株，肿瘤耐药细胞株的构建方法也亟需改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肝门静脉癌栓奥沙利铂耐药细胞株，本发明的另一目的是提供该耐药细胞株的构建方法。
本发明的主要技术方案是利用不同浓度的奥沙利铂处理人肝门静脉癌栓细胞株CSQT-2细胞，从中找到CSQT-2细胞的最高耐受浓度(细胞可以长期存活并缓慢生长)，并以此浓度作为筛选浓度继续长期刺激细胞4个月，最终获得人肝门静脉癌栓奥沙利铂耐药细胞株CSQT-2-OXA。
本发明提供了一种肝门静脉癌栓奥沙利铂耐药细胞株的构建方法如下：
①、取人肝门静脉癌栓细胞CSQT-2细胞复苏后用含10％胎牛血清的DMEM培养液，于37℃，5％CO2培养箱中培养；为找寻最适宜奥沙利铂刺激浓度，取对数生长期CSQT-2细胞接种于12孔板中，在各培养孔中分别加入0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、24μmol/L、32μmol/L奥沙利铂，适时传代或换液。
②、当奥沙利铂的浓度为24μmol/L时CSQT-2细胞可以长期存活但生长缓慢；浓度小于24μmol/L时CSQT-2细胞不但可以大量存活，还能较快生长；浓度大于24μmol/L时CSQT-2细胞全部死亡。因此，我们确实筛选浓度为24μmol/L。然后依次用不同浓度梯度的奥沙利铂处理细胞，最后达到筛选浓度：0.5μmol/L处理一周，1μmol/L处理一周，2μmol/L处理一周，4μmol/L处理一周，8μmol/L处理一周，16μmol/L处理一周，24μmol/L连续处理6个月，最后筛选到能在24μmol/L奥沙利铂刺激下快速生长的CSQT-2耐药细胞，其最大耐药浓度可达32μmol/L。
本发明还提供了一种根据上述构建方法获得的肝门静脉癌栓奥沙利铂细胞株；
本发明提供了一种肝门静脉癌栓奥沙利铂耐药细胞株，该细胞株的构建方法如下：
复苏人肝门静脉癌栓细胞株CSQT-2细胞后，用含10％胎牛血清的DMEM培养液，于37℃，5％CO2培养箱中培养；取对数生长期的人肝门静脉癌栓细胞株CSQT-2细胞接种于培养皿中；在培养皿中加入奥沙利铂至终浓度24μmol/L，适时传代或换液；每次传代或换液之后，均加入奥沙利铂至终浓度24μmol/L，连续培养4个月以上；筛选到仍能快速生长的人肝门静脉癌栓细胞株CSQT-2细胞即为耐药细胞株。
本发明所述的耐药细胞株是在24μmol/L奥沙利铂刺激6个月后，仍能快速生长的人肝门静脉癌栓细胞株CSQT-2细胞.
本发明所述的耐药细胞株最大耐药浓度为32μmol/L.
本发明所述的耐药细胞株命名为CSQT-2-OXA.
本发明通过形态学观察、生长曲线测定、细胞周期的测定和凋亡实验，评价肝门静脉癌栓耐药株CSQT-2-OXA的生物学特性，成功建立CSQT-2-OXA耐药株。
在本发明中，人肝门静脉癌栓细胞株CSQT-2细胞、人肝门静脉癌栓细胞株CSQT-2、人肝门静脉癌栓门静脉癌栓细胞株CSQT-2、CSQT-2细胞同义。
本发明还提供了肝门静脉癌栓耐药细胞株CSQT-2-OXA在筛选抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供了肝门静脉癌栓耐药细胞株CSQT-2-OXA在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明可用于分析肝门静脉癌栓细胞奥沙利铂耐药后的形态学及生物学表型的变化；研究肿瘤对奥沙利铂耐药的分子机制和逆转肿瘤耐药的方法及筛选其他抗肿瘤药物；发现肿瘤耐药标志物以及筛选和评估新型抗肿瘤药物等，具有较高的科研和生产应用价值
附图说明
图1是肝门静脉癌栓耐药株CSQT-2-OXA细胞的诱导建立验证图；
图2是光学显微镜下CSQT-2和CSQT-2-OXA细胞的细胞形态；
其中A是CSQT-2，B是CSQT-2-OXA；
图3是CSQT-2和CSQT-2-OXA细胞生长曲线；
图4是CSQT-2和CSQT-2-OXA细胞细胞周期；
图5是CSQT-2和CSQT-2-OXA细胞迁移实验；
图6是CSQT-2和CSQT-2-OXA细胞细胞凋亡；
图7是CSQT-2和CSQT-2-OXA细胞中P-gp mRNA含量图，*p＜0.05；
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
实施例所用的人肝门静脉癌栓细胞CSQT-2细胞来自中科院；实施例所用的奥沙利铂为市售的sigma公司的5mg规格的产品。
实施例1：肝门静脉癌栓耐药株CSQT-2-OXA细胞的诱导建立验证
①、取人肝门静脉癌栓细胞CSQT-2细胞复苏后用含10％胎牛血清的DMEM培养液，于37℃，5％CO2培养箱中培养；为找寻最适宜奥沙利铂刺激浓度，取对数生长期CSQT-2细胞接种于12孔板中，为找寻细胞能够耐受奥沙利铂的最大耐药浓度(细胞能够存活并缓慢生长的浓度)，在各培养孔中分别加入0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、24μmol/L、32μmol/L奥沙利铂，适时传代或换液。
②、上述实验结果显示：当奥沙利铂的浓度为24μmol/L时CSQT-2细胞可以长期存活但生长缓慢；浓度小于24μmol/L时CSQT-2细胞不但可以大量存活，还能较快生长；浓度大于24μmol/L时CSQT-2细胞全部死亡。因此，我们确实筛选浓度为24μmol/L.然后依次用不同浓度梯度的奥沙利铂处理细胞，最后达到筛选浓度：0.5μmol/L处理一周，1μmol/L处理一周，2μmol/L处理一周，4μmol/L处理一周，8μmol/L处理一周，16μmol/L处理一周，24μmol/L连续处理6个月，最后筛选到能在24μmol/L奥沙利铂刺激下快速生长的CSQT-2耐药细胞。
将上述细胞与CSQT-2对照细胞接种12孔板(没空1X105个细胞)，24小时后加入不同浓度的奥沙利铂(24-64μmol/L)，96小时后拍照。拍照结果如图1所示，CSQT-2对照细胞在24μmol/L及以上浓度刺激时，培养上清全部为粉红色；而CSQT-2-OXA细胞在32μmol/L浓度时仍能生长代谢，培养基颜色变黄，说明CSQT-2-OXA细胞具有较好的耐药性(各数字表示所用奥沙利铂浓度，单位μmol/L)。
实施例2：肝门静脉癌栓耐药株CSQT-2-OXA细胞的形态学观察
①、倒置相差显微镜观察活细胞形态：分别取对数生长期的CSQT-2对照细胞和CSQT-2-OXA耐药细胞，PBS清洗换液后，在倒置显微镜(X200)下观察活细胞形态。通过光镜可以观察到CSQT-2细胞的大小基本一致，边缘欠光滑(如图2a所示)；而CSQT-2-OXA细胞大小形态各异，并且伸出长伪足(如图2b所示).
实施例3：肝门静脉癌栓耐药株CSQT-2-OXA细胞的生长曲线测定
取对数生长期CSQT-2、CSQT-2-OXA细胞，用0.5％胰酶消化，2倍体积的含10％胎牛血清的DMEM培养基中止消化，1000rpm离心5分钟，用含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬并计数，按每孔5000个细胞的密度接种于96孔板并设3个复孔，每孔再各家150μL培养基，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养中培养0h，24h，48h，72h，96h；于各时间点吸弃培养基，每孔各加100μL CCK8工作液，在培养箱中培养4小时后，放入酶标仪以450nm波长检测，读出每孔的OD值并计算平均值，以时间为横坐标、OD值平均值为纵坐标，绘制成生长曲线。
连续检测两细胞的生长状态后发现：耐药细胞株CSQT-2-OXA较正常肿瘤细胞株CSQT-2的增殖速度更快，显示耐药细胞株CSQT-2-OXA具有更强的增殖能力(如图3所示)。
实施例4：CSQT-2-OXA细胞株的细胞周期分析
将CSQT-2和CSQT-2-OXA分别接种于6孔板中，加2ml 10％FBS DMEM，24h后收集细胞，吸去培养基，0.25％胰酶(无EDTA)消化，将细胞消化成单个，离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次(加3ml，吹悬，离心，弃上清算洗一次)，加入2ml预冷(-20度)70％乙醇到细胞沉淀中，于4度固定过夜。第二天，离心收集细胞，以3mL的PBS洗细胞两次，加入500uLPBS，使用碘化丙啶(PI，50μg/ml)染色，RNase A(20μg/ml)消化，室温避光孵育30分钟。上流式细胞仪分析，细胞周期软件Flowjo分析结果.
分析结果显示：CSQT-2-OXA耐药细胞较CSQT-2对照的细胞周期分布发生明显改变，其主要改变为耐药细胞株CSQT-2-OXA G1期细胞增多，G2期细胞减少(结果如图4所示，数据如表1所示)。
实施例5：CSQT-2-OXA细胞迁移能力检测
将处于对数生长期的CSQT-2和CSQT-2-OXA细胞消化成单个，离心收集细胞，弃上清，用无血清的DMEM重悬细胞并计数，调整细胞浓度为1X105个/ml，取200μL细胞悬液加入上室，下室加入400μL含1％FBS DMEM。12小时后，用棉签擦拭上室，将上室细胞擦净，4％多聚甲醛固定小室底部细胞20分钟，2ml PBS洗3分钟，1ml 0.1％结晶紫染色15分钟，1ml PBS洗2次，通风处晾干，于倒置相差显微镜下拍照，并计数(结果如图5所示)。
实施例6：CSQT-2-OXA细胞细胞凋亡检测
将CSQT-2和CSQT-2-OXA分别接种于6孔板中，加入24μmol/L奥沙利铂处理72h，离心收集细胞，弃上清，用冰冷的PBS洗3次，用1XBinding Buffer调整细胞浓度为1X106个细胞/ml，吸取100μL(1X105)于1.5mlEP管中，加入5μL FITC和5μL PI，轻轻振荡，25℃室温避光孵育15min，加入400μL 1xBinding Buffer，1小时之内上机检测。(结果如图6所示)
分析结果显示：用浓度为50μmol的奥沙利铂处理CSQT-2-OXA耐药细胞和CSQT-2对照细胞显示，对照组细胞(19.55％)凋亡的比例较耐药细胞株(10.49％)明显的增多。
实施例7：CSQT-2-OXA细胞P-gp基因表达分析
P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是一种能量依赖性药物排出泵，通过ATP供应能量，它可将抗肿瘤药物由细胞内泵出细胞外，使其细胞毒作用减弱或消失出现耐药性，从而导致化疗失败.肿瘤细胞中P-gp高表达是肿瘤细胞产生耐药的重要机制之一。
细胞总RNA的提取：
①将CSQT-2和CSQT-2-OXA细胞分别种于6孔板中，培养至密度70-80％；
②吸去培养基，加入TRIZOL 1ml，室温孵育30min；
③加入200μL氯仿剧烈振荡30s，室温静置5min；
④4℃，12000rpm，离心15min；
⑤吸取上层含有RNA的水相层于新的无RNA酶的Ep管中，加入500μL异丙醇沉淀RNA，剧烈振荡30s，室温静置10min；
⑥4℃，12000rpm，离心15min；
⑦弃上清，加入500μL 75％的乙醇洗涤RNA沉淀，4℃，12000rpm，离心5min；
⑧去除乙醇，在超净台中，室温晾干RNA，待出现透明沉淀时用50μL RNAase-FREE的水溶解RNA，获得总RNA；
⑨测RNA的浓度，-80℃保存；
⑩逆转录合成cDNA第一链：
1)反应液的配制
在冰上配制如下反应
2)将反应液轻轻地搅拌均匀后，按以下温度进行反应。
3)所获得的cDNA放在-20℃保存备用。
荧光定量PCR步骤
①反应体系如下(25μl)：
引物序列(此引物序列由上海铂尚生物技术有限公司合成)
P-gp-forward：TGATTTTGGCCATCAGTCCTG
P-gp-forward：CCTCTTCAGCTACTGCTCCAGC
②反应条件：95℃预变性10min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，40个循环，72℃终末延伸10min。用Bio-Rad Real-Time PCR system软件分析结果。
如图7所示，CSQT-2-OXA细胞P-gp基因的mRNA含量较CSQT-2对照细胞表达多，即CSQT-2-OXA细胞中P-gp基因表达上调，有更强的耐药性。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (6)

1.一种肝门静脉癌栓奥沙利铂耐药细胞株，其特征在于，该细胞株的构建方法如下：
复苏人肝癌细胞株CSQT-2细胞后，用含10％胎牛血清的DMEM培养液，于37℃，5％CO2培养箱中培养；取对数生长期的人肝癌细胞株CSQT-2细胞接种于培养皿中；在培养皿中加入奥沙利铂至终浓度24μmol/L，适时传代或换液；每次传代或换液之后，均加入奥沙利铂至终浓度24μmol/L，连续培养4个月以上；筛选到仍能快速生长的人肝癌细胞株CSQT-2细胞即为耐药细胞株。
2.根据权利要求1所述的一种肝门静脉癌栓奥沙利铂耐药细胞株，其特征在于，所述的耐药细胞株是在24μmol/L奥沙利铂刺激4个月后，仍能快速生长的人肝癌细胞株CSQT-2细胞。
3.根据权利要求2所述的一种肝门静脉癌栓奥沙利铂耐药细胞株，其特征在于，所述的耐药细胞株的最大耐药浓度为32μmol/L。
4.一种如权利要求1至3任一所述的肝门静脉癌栓奥沙利铂耐药细胞株在筛选抗肿瘤药物中的应用。
5.一种如权利要求1至3任一所述的肝门静脉癌栓奥沙利铂耐药细胞株在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.一种如权利要求1至3任一所述的肝门静脉癌栓奥沙利铂耐药细胞株在在研究化疗耐药机制中的应用。
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