CN102220324B - 一种抑制caspase-3基因表达的siRNA - Google Patents

Abstract

一种抑制caspase-3基因表达的siRNA，其序列为：正义链：5’－GAGTCTGACTGGAAAGCCGAA－3’反义链：5’－TTCGGCTTTCCAGGAAGACTC－3’。本发明所提供的siRNA进入到神经细胞时，可以显著提高神经细胞的细胞活力、明显减少神经细胞凋亡相关基因caspase-3基因的表达、降低神经细胞的凋亡坏死率，同时也可以显著降低阿尔茨海默标志蛋白APP和Tau蛋白的表达。该siRNA可以高效、特异的抑制疾病相关基因caspase-3的表达，使有关疾病基因发生沉默，能对靶基因的表达进行有效敲除，达到治疗目的，可用于制备抑制神经细胞凋亡或治疗神经退行性疾病的药物。

Description

一种抑制caspase-3基因表达的siRNA

技术领域

本发明涉及一种siRNA，特别是一种抑制caspase-3基因表达的siRNA。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象是一种在进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制，是一种序列特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。它已在许多不同种属的生物体中被发现，并在生物体细胞之间进行传递，具有抵抗病毒入侵和维持基因组稳定的作用。RNAi技术不仅能大大推进人类后基因组计划的发展，还能高通量地筛选药物靶基因，促进基因治疗、新药开发等，为治疗癌症、遗传病等疾病开辟新的途径。RNAi的研究与应用具有极其重要的理论和实际意义，将对医学生物学的发展产生深远的影响。

虽然RNA干扰技术的研究历程较短，但其发展速度却超乎人们的想象。在过去的几年时间里，RNAi作为一种新基因疗法，被广泛的应用于病毒感染、癌症、显性遗传病等医学研究中，开辟了“基因治疗(gene-specific therapeutics)”的新理念，小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)甚至被称为“治病药物”。目前，人们已经开始利用RNAi技术从基因组水平分析哺乳动物体内基因的功能，可以更迅速地鉴定出许多与疾病相关的基因，使我们可以更好地研究生物体内基因调控的网络系统。现在RNAi技术已经能够成功治愈哺乳动物细胞、器官及活体的病变，预示着不久的将来，RNAi会成功用于人类疾病的治疗，使得siRNA的“治病药物”称号名副其实。

公知人体内的细胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡则是病理性的，有关细胞死亡过程的研究，近年来已成为生物学、医学研究的一个热点。到目前为此，人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡。目前的研究认为，细胞坏死是细胞接受刺激后的一种被动的细胞死亡方式，而细胞凋亡则是一种主动的程序性的细胞死亡方式，它是细胞的一种基本生物学现象。细胞凋亡是多基因严格控制的过程，这些基因在种属之间非常保守，如Bcl-2基因家族、caspase基因家族、癌基因等。随着分子生物学技术的发展，对多种细胞凋亡的过程有了相当的认识，但是迄今为止凋亡过程确切机制尚不完全清楚，而凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系，如神经退行性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病等。如果能应用RNA干扰技术特异性地阻抑凋亡相关基因的表达及其蛋白质水平，将可以有效沉默凋亡相关基因，帮助细胞减少凋亡，增进细胞活力。因此，对凋亡相关基因的RNA干扰研究与应用具有极其重要的理论和实际意义，能有效地筛选药物靶基因，促进基因治疗、新药开发等，为治疗神经退行性疾病等与细胞凋亡相关的疾病开辟新的途径。

使用RNAi治疗疾病的思路是根据病原体的致病基因序列以及生物体内与疾病发生相关的基因序列，设计和制备与这些基因序列具有同源性的小干扰RNA（siRNA），然后通过某种方式将siRNA转移到动物体内使有关疾病基因发生沉默，从而达到治疗的目的。其优势在于只抑制疾病相关蛋白的表达，而不损伤正常细胞功能，其序列特异性及基因抑制作用的强大性是其他药物难以匹敌的。siRNA可用于治疗任何由于基因发生突变或过度表达所引起的疾病，只要确定了与疾病相关的靶点，即靶基因，就可以通过siRNA特异性地使靶基因保持沉默。所以，寻找最适宜的siRNA，对于RNA干扰的广泛应用至关重要。

caspase基因家族是一类基因结构相似并参与细胞凋亡的基因。根据它们对细胞凋亡结果的不同分为两类，一类是抑制细胞凋亡的基因，另一类是促进细胞凋亡基因。caspase-3基因是其中促进细胞凋亡的基因，其过度表达能够加速与该凋亡基因相关的疾病的细胞凋亡，因此对caspase-3 RNAi的研究与应用具有极其重要的理论和实际意义。但是作用于caspase-3基因，即靶基因不同位点的siRNA的作用效果差异很大，可能与siRNA的碱基分布、两端自由能大小等有关。因此，在siRNA沉默特定基因的实验中，有效的siRNA序列是该技术的关键点。然而到目前为止，还没有最适宜的抑制caspase-3基因表达的siRNA。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中还没有最适宜的抑制caspase-3基因表达的siRNA的问题，提供一种抑制caspase-3基因表达的siRNA。

为达到上述目的，本发明是采用如下技术方案实现的：一种抑制caspase-3基因表达的siRNA序列，该序列为：

正义链：5’－GAGTCTGACTGGAAAGCCGAA－3’

反义链：5’－TTCGGCTTTCCAGGAAGACTC－3’。

本发明所提供的抑制caspase-3基因表达的siRNA由 21个核苷酸组成，序列的方向从左至右为5’ 端至3’端，自5’端的第1至第19位核苷酸为核糖核苷酸，第20至第21位核苷酸为脱氧核糖核苷酸。

本发明针对caspase-3基因序列设计合成出一个siRNA序列，经QRT-PCR及免疫组织化学法检测，可以有效抑制原代培养神经细胞的caspase-3基因表达，从而显著降低神经细胞的凋亡和坏死，并在原代培养神经细胞上验证了设计合成出的caspase-3 siRNA对神经细胞凋亡的抑制作用。本发明所提供的caspase-3 siRNA不但可以用于体外培养细胞的RNAi，也可以用于阿尔茨海默病动物模型的体内实验。

本发明所提供的siRNA可用于制备与caspase-3基因相关疾病的治疗药物，如细胞凋亡相关疾病或退行性疾病的药物。该siRNA或由此得到的药物通过某种方式进入到动物体或人体内时，可以比以往任何手段更高效、特异、方便的抑制疾病相关蛋白的表达，使有关疾病基因发生沉默，从而达到治疗的目的。其优势在于不损伤正常细胞功能，其序列特异性及基因抑制作用的强大性是其他药物难以匹敌的。本发明筛选出能高效抑制caspase-3基因表达的 siRNA，能对靶基因的表达进行有效敲除。

附图说明

图1为caspase-3 RNAi正常对照组神经细胞的光镜照片（×200）。

图2为caspase-3 RNAi染铝组神经细胞的光镜照片（×200）。

图3为caspase-3 RNAi病毒载体组神经细胞的光镜照片（×200）。

图4为caspase-3 RNAi组转染原代培养神经细胞DAPI染色的荧光照片（×200）。

图5为caspase-3 RNAi组转染原代培养神经细胞GFP标记的荧光照片（×200）。

图6为caspase-3 RNAi组转染原代培养神经细胞并经GFP荧光标记后转染成功的细胞的荧光照片（×200）。

图7为caspase-3 RNAi正常对照组神经细胞的荧光照片（×200）。

图8为caspase-3 RNAi染铝组神经细胞的荧光照片（×200）。

图9为caspase-3 RNAi病毒载体组神经细胞的荧光照片（×200）。

具体实施方式

实施例1：抑制caspase-3基因表达的siRNA的合成。

制定抑制caspase-3基因表达的一条siRNA序列，同时选用一条随机序列作为阴性对照。caspase-3 siRNA序列中的A、G、C、U表示腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸，T表示胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。

合成的siRNA序列如下：

正义链：5’－GAGTCTGACTGGAAAGCCGAA－3’

反义链：5’－TTCGGCTTTCCAGGAAGACTC－3’。

实施例2：神经细胞原代培养。

选用新生1～3d的SD小乳鼠，将其置于75%冰酒精中浸泡2min，无菌条件下取脑，除去脑膜及白质，收集大脑皮质并制成匀浆，将其置于加入5mL 37℃预热的0.25%(w/v)胰蛋白酶的离心管中，轻轻吹打，使成为单细胞悬液。静置，将上层细胞悬液移入含2mL全细胞培养液的离心管中终止消化，220nm滤网过滤，1000r/min离心10min，弃上清，加入无血清细胞培养液，吹打均匀，1000r/min离心5min，弃上清，加入全细胞培养液，吹打均匀，用细胞计数板调整细胞浓度为1×10⁵个/mL，接种于事先铺有多聚赖氨酸的培养瓶或培养皿上，于37℃、5%CO₂培养，培养后24h，加入0.5mg/mL阿糖胞苷（终浓度10μM）培养液以抑制胶质细胞增殖，每3天换液1次。

实施例3：神经细胞感染。

将浓度1×10⁵个/mL的神经细胞悬液接种于96孔板中，每孔加培养基100μL。在细胞培养第4天左右，选取生长良好的同批次神经细胞，分为正常活细胞组、1mM染铝组、1mM染铝+caspase-3 RNAi病毒组，观察细胞的生长状况和形态学改变。具体情况如下：正常活细胞组只加入培养液90μL； 1mM染铝组加入含有铝的培养液90μL至染铝终浓度为1mM；1mM染铝+caspase-3 RNAi病毒组加入含有铝的培养液90μL至染铝终浓度为1mM，同时加入病毒载体及caspase-3 siRNA干扰试剂。把细胞培养板放回培养箱孵育，8～12h以后观察各组细胞的生长状态，24h后更换新鲜培养基培养，感染3天后分别在光镜下和荧光显微镜下观察神经细胞的生存状态及荧光转染效率。

光学显微镜观察神经细胞可见，正常活细胞组神经细胞细胞核大而清晰，核仁明显，轴突长且比较均一，有较多从胞体开始向末梢逐渐变细的树突，且长短不一有分支，细胞与突触间、胞体与胞体间连接丰富（图1）。1mM染铝组（图2）细胞数量明显减少，细胞体积缩小，轴突变短，且树突的数量减少，细胞与突触间、胞体与胞体间连接明显减少，部分神经元的大多数树突消失融解，细胞轴突也严重受损，胞体变圆、收缩。1mM染铝+caspase-3 RNAi病毒组（图3）细胞从形态和数量上接近于正常活细胞组。

图4～6显示了caspase-3 siRNA转染组DAPI荧光染色的神经细胞（图4）、GFP 荧光标记的神经细胞（图5），GFP荧光标记转染成功的神经细胞（图6）。计数GFP荧光标记的转染细胞数量与DAPI荧光染色的所有转染细胞，并计算转染效率，转染效率计算公式为：转染效率=GFP荧光标记的细胞数量/相同视野下DAPI染色的细胞数量×100%。结果表明，转染细胞数多于细胞总数的90%。说明caspase-3 siRNA序列的转染效率大于90%。

实施例4：神经细胞的细胞活力检测。

将浓度为1×10⁵个/mL的神经细胞悬液接种于96孔板中，4天后按照前述分组情况处理，在各组细胞中每孔加入5μL CCK-8试剂，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养1.5h后，在λ＝450nm条件下用酶标仪测定其吸光度值A。细胞活力检测结果显示：同正常活细胞组比较，仅有1mM染铝组细胞活力有显著性差异（P＜0.01），细胞活力明显下降；同1mM染铝组相比较，1mM染铝+caspase-3 RNAi病毒组有显著性差异（P＜0.01），细胞活力远远高于1mM染铝组，且与正常活细胞组相近，见表1。

实施例5：siRNA的抑制效率检测。

1）总RNA的提取

用Trizol法抽提细胞中的mRNA，具体步骤为：直接在培养板中加入Trizol试剂裂解细胞（每10cm²面积加入1mL Trizol试剂），用取样器吹打几次，将液体转移至1.5mL EP管中放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离，以上所有操作均在冰上完成。于4℃，12000rpm 离心15min，取上清，加入0.12mL氯仿，充分振摇15s至乳白色。室温静置3min，4℃，12000rpm离心15min。取上清，在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温静置20～30min。4℃，12000rpm离心10min。去上清，加入1mL75%乙醇（DEPC处理过的水配制）洗涤沉淀，4℃，7500rpm离心5min，倒出液体，再加入1mL无水乙醇洗涤，倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液体用枪尖吸出，注意不要吸弃沉淀。室温放置晾干，根据实验需要加入 RNAase-free无菌水20μL，反复吹打、混匀，溶解RNA。以1:1000稀释，于260nm及280nm处测定其吸光度值，计算mRNA的纯度及含量。计算公式为：mRNA纯度=A₂₆₀/(A₂₈₀－本底)，mRNA含量(μg/mL)=A₂₆₀×40×100。如mRNA纯度在1.8～2.0之间，则进一步进行反转录。

2）反转录

按反转录试剂盒说明书操作，具体如下：总RNA 5μL加入OligodT 2μL，ddH₂O水5μL，dNTP 2μL离心混匀，70℃5min，迅速冰上冷却2min，加入5×缓冲液4μL，RNasin 0.5μL，DTT 1μL，M-MLV 1μL组成20μL反应体系，离心混匀，反转录参数：25℃10min，42℃50min，95℃5min。

3）引物序列以及实时荧光定量PCR反应条件

caspase-3检测条件：94℃5min，94℃50s，61℃50s，72℃1min，40个循环，然后94℃1min，55℃30s，95℃30s收集荧光信号。反应结束后确认real-time quantitative PCR的扩增曲线，基因的表达强度CT值、内参基因（GADPH）标化后，按2^-△△CT方法计算。引物序列见表2，实时荧光定量PCR反应体系见表3。

实时荧光定量PCR检测siRNA转染抑制caspase-3基因表达抑制率的具体结果见表4。结果显示：同正常活细胞组相比较，1mM染铝组细胞caspase-3基因表达有显著升高（P＜0.01）；同1mM染铝组比较，各siRNA组均有显著性下降（P＜0.01）。caspase-3基因表达量测定结果表明，siRNA的抑制率为66.47%。根据siRNA对caspase-3基因的抑制率可知，参考转染后的神经细胞活力检测结果，该 siRNA 为caspase-3基因干扰的有效siRNA序列。

实施例6：用siRNA感染神经细胞后细胞的凋亡现象观察。

将浓度为1×10⁵个/mL的神经细胞悬液接种于96孔板中，4天后分为三组：正常活细胞组、1mM染铝组、1mM染铝+caspase-3 RNAi病毒组。D-Hanks液清洗贴壁神经细胞2次，加入荧光显色剂吖啶橙(AO)-溴化乙锭(EB)，放置30s，515～565nm处用蓝光激发在荧光显微镜下观察细胞的凋亡形态学。在荧光显微镜下，正常活细胞组神经细胞呈绿色的均匀荧光（图7），1mM染铝组（图8）神经细胞的细胞核较小、固缩呈较浓的黄绿色，或呈半月形，甚至为黄绿色碎块，有些神经细胞的胞核染成鲜红色或桔红色（凋亡细胞），并且胞浆也呈染成淡红色，部分细胞结构不清或溶解。1mM染铝+caspase-3 RNAi病毒组（图9）绝大部分细胞表现为均匀绿染的活细胞，有个别细胞呈黄绿色或红色。各组计数200个细胞，计算凋亡率。正常活细胞组细胞凋亡率很低，1mM染铝组细胞凋亡率明显高于正常活细胞组（P＜0.01）；同正常活细胞组相比较，1mM染铝+caspase-3 RNAi病毒组细胞凋亡率没有统计学意义（P>0.05）。正常活细胞组和1mM染铝+caspase-3 RNAi病毒组细胞凋亡率显著低于1mM染铝组（P＜0.01），具体数据见表5。

实施例7：用siRNA感染神经细胞后APP、Tau蛋白表达（蛋白印迹Western blot法）。

1）配制12%的分离胶和5%的积层胶，根据浓度确定上样体积。每孔上样25μg，以80V 电压恒压跑胶，当蛋白跑过积层胶时加压为120V，恒压直至蛋白跑至胶的底部；2）将跑好的胶取下，400mA电流作用38min转移蛋白至0.45μm PVDF膜上；3）用丽春红染色观察移至PVDF膜上的蛋白条带。0.02mol/L PBST洗膜，5min×2次；4）用封闭液37℃封闭120分钟；5）加入抗体稀释液稀释的一抗（浓度均为1:10000），4℃过夜，0.02mol/L PBST洗膜，15min×4次；6）加入抗体稀释液稀释的生物素化二抗（浓度均为1:1000），37℃2h，0.02mol/L PBST洗膜，15min×4次；7）加入0.02mol/L PBST稀释的辣根酶标记链亲和素（1:1000），37℃ 2h，0.02mol/L PBST洗膜，15min×4次；8）用ECL进行化学发光，在使用前等量混合A液和B液，混合后尽快使用；9）用镊子取出膜，打在滤纸上沥干洗液但勿使膜完全干燥，将膜完全浸入并与发光工作液（0.125mL发光工作液/cm²）充分接触，根据室温孵育15min，准备立即压片曝光；10）用镊子夹起膜，搭在滤纸上沥干工作液，但勿洗去发光液；11）在X光胶片盒内铺一张面积大于膜的保鲜膜，将杂交膜贴在保鲜膜上，将保鲜膜折起来完全包裹杂交膜，去除气泡和褶皱，用胶带将其固定在暗盒内；12）在黑暗中放入X光胶片，分别曝光不同的时间如数秒到数分钟，然后显影冲洗；13）扫描仪扫描，采用捷达801系列凝胶电泳图像分析系统对Western-blot结果进行分析，然后计算待测蛋白与β-actin光密度（IOD）的比值，比较各组间IOD样本/IOD β-actin的大小。具体结果见表6。

结果显示：同正常活细胞组相比较，1mM染铝组细胞APP、Tau蛋白的表达有显著升高（P＜0.01）；同1mM染铝组相比较，各siRNA组均有显著性下降（P＜0.01）。APP、Tau表达量测定结果表明，siRNA可以显著抑制阿尔茨海默相关标志蛋白APP、Tau蛋白的表达，参考转染后的神经细胞活力检测结果，该siRNA为抑制阿尔茨海默相关标志蛋白的有效 siRNA序列。

SEQUENCE LISTING

 

<110> 山西医科大学

 

<120> 一种抑制caspase-3基因表达的siRNA

 

<160> 2

 

<170> Patentin version 3.2

 

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

 

<220>

<223> 以caspase-3基因为靶标的siRNA序列的正义链

 

<400> 1

gagtctgact ggaaagccga a                               21

 

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

 

<220>

<223> 以caspase-3基因为靶标的siRNA序列的反义链

 

<400> 2

ttcggctttc cagtcagact c                                 21

Claims (2)

1.一种抑制caspase-3基因表达的siRNA，其序列为：

正义链：5’－GAGTCTGACTGGAAAGCCGAA－3’

反义链：5’－TTCGGCTTTCCAGGAAGACTC－3’。

2.权利要求1的siRNA在制备抑制神经细胞凋亡药物中的应用。

Images