CN103920164A - MiR-424-5p在抑制转移性肝癌中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了MiR-424-5p在制备抑制转移性肝癌的药物中的应用，具体应用时，可以将miR-424-5p或其类似物制备成治疗肝癌转移的药物，也可以构建miR-424-5p的真核表达载体，用于基因治疗。本发明通过研究发现miR-424-5p是在转移性肝癌细胞中下调最明显的microRNA之一。进一步地研究结果表明肝癌细胞转染miR-424-5p后细胞侵袭力、转移力和克隆形成能力均减弱。因此，可以认为，miR-424-5p可以抑制肝癌细胞的转移，并降低肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗，具有引起肝癌细胞细胞周期阻滞、抑制肝癌细胞增殖、侵袭、转移和克隆形成能力等作用。因此，miR-424-5p可以用于制备抑制转移性肝癌的药物。

Description

MiR-424-5p在抑制转移性肝癌中的应用

技术领域

本发明涉及MiR-424-5p在抑制转移性肝癌中的应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。肝细胞性肝癌(hepatocelluar carcinoma，HCC)是肝癌最主要的病理类型，占原发性肝癌的80％左右，在我国占到了90％。肝细胞肝癌发病率死亡率居高不下，具高转移性。肿瘤的转移是一个多步骤、多因素的复杂过程，肝癌的高转移性是其高致死率的重要原因。而抵抗失巢凋亡，是肝癌细胞进行转移的首要条件。

大多数细胞的增殖取决于两个信号：第一，细胞需要确定它们被适当地定位在组织内,通过表面受体感知细胞外基质并使之与细胞骨架相连，这一行为激活许多信号级联反应并且影响细胞对其他刺激的反应；第二，细胞需要生长因子和细胞因子促进增殖。对这两个信号的精确调节确保所有器官正常发育。正常情况下，当细胞失去正常细胞基质间相互作用，细胞周期会发生阻滞并且引发caspase介导的细胞程序性死亡，称为失巢凋亡。失巢凋亡使得发生“错位”的细胞被消除，从而防止异位增生。当细胞发生恶性转化时，能够通过其它渠道获得迁徙和增殖特性，并发生对失巢凋亡的抵抗，从而导致转化细胞在异位的恶性增生，即形成转移癌。

失巢凋亡能够作为肝癌转移过程中的一个筛选压力。能够抵抗失巢凋亡的肝癌细胞，其侵袭力、转移力、抵抗放疗、化疗和凋亡诱导治疗的能力都大大增强。因此，肝癌细胞能够通过抵抗失巢凋亡，获得在循环系统存在的能力，并通过逃逸肿瘤治疗，获得机会到达异位，形成转移癌。因此，获得抵抗失巢凋亡能力的肝癌细胞，是一类具有强大侵袭转移力的转移性肝癌细胞。

miRNA是一类内源性的、不参与蛋白质编码的小RNA分子，其长度大约有18-25个核苷酸。miRNA前体，经酶切割为成熟miRNA。后者与相关蛋白一起组成RNA-诱导沉默复合体(RISC)，调控其靶基因的表达。miRNA调控靶基因的方式有两种：与靶基因mRNA的3’UTR结合导致其降解；与靶基因mRNA3’UTR结合抑制其翻译。在植物中比较普遍的沉默机制中，miRNA和靶基因mRNA几乎完全配对时，诱导其降解。然而大多数哺乳动物是通过不完全的配对结合，从而在转录后水平抑制基因翻译。除此之外，miRNA还可通过促进靶mRNA polyA尾的去除，mRNA快速脱腺苷酸化促进了其被3`核酸外切酶水解。人类的microRNA由2％的基因编码，却能调控人体约30％的基因。多种miRNA已被报道在肿瘤发生中参与调节相关基因的表达。非编码小RNA在调控EMT的细胞信号通路中具有重要作用。例如miR-200和miR-205抑制ZEB1和ZEB2，后者调控E-cadherin的表达，由此维持上皮细胞的表型。

鉴于miRNA在癌症发生发展的重要作用，我们在前期建立的肝癌失巢模型中，进行了microRNA差异表达谱的分析，miR-424-5p是在转移性肝癌细胞中下调最明显的microRNA之一。已有研究证明miR-424-5p可以调控众多生物学行为，包括细胞分化增殖，细胞周期。有相关报道证明miR-424-5p在一些癌症中表达异常。这些资料证明miR-424-5p在癌症恶性行为中的重要作用，但是对于miR-424-5p在肝癌中的作用机制还未有报道，对其靶基因的研究也仅限于少数基因。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了miR-424-5p的新用途——在制备抑制转移性肝癌的药物中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明建立了肝癌失巢模型，并获得了能够抵抗失巢凋亡和具备强侵袭转移力的转移性肝癌细胞。通过进行microRNA差异表达谱的分析，发现miR-424-5p是在转移性肝癌细胞中下调最明显的microRNA之一。进一步地，本发明构建了miR-424-5p的表达载体，转染肝癌细胞，结果表明肝癌细胞转染miR-424-5p后细胞增殖能力减弱。因此，可以认为，miR-424-5p可以抑制肝癌细胞的转移，并降低肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗，具有引起肝癌细胞细胞周期阻滞、抑制肝癌细胞增殖、克隆形成能力等作用。因此，miR-424-5p可以用于制备抑制转移性肝癌的药物。

所述miR-424-5p的序列为CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA，如SEQ ID NO.1所示；其特异性扩增引物序列如下：特异性的上游引物序列为：GGCAGCAGCAATTCATG，如SEQ ID NO.2所示；通用下游引物序列为：CAGTGCGTGTCGTGGAG，如SEQ ID NO.3所示。

所述miR-424-5p可以作为药物进行应用，也可以用于制备药物。具体应用时，可以将miR-424-5p或其类似物制备成治疗肝癌转移的药物，也可以构建miR-424-5p的真核表达载体，用于基因治疗。

附图说明

图1：Real-time PCR检测肝癌细胞系BEL7402、SMMC7721、HepG2在失巢前后miR-424-5p表达差异，以U6为内参。*为P＜0.05，**为P＜0.01。其中，图1A：BEL7402；图1B：SMMC7721；图1C：HepG2。

图2：miR-3126-5p在肝癌细胞成功过表达。其中图A-C：BEL7402(图A)、SMMC7721(图B)、HepG2(图C)分别转染miR-424-5 pmimic，24h后收集细胞总RNA，逆转录后Real-timePCR检测miR-424-5p表达。*为P＜0.05，**为P＜0.01。

图3：miR-424-5p转染后24h后，置于poly-HEMA铺被的培养板中继续培养，检测caspase3诱导的转移性肝癌细胞的凋亡状况。图A：Western blot检测肝癌细胞系HepG2，SMMC7721转染miR-424-5p前后caspase3活化情况。图B：caspase3检测试剂盒检测到miR-424-5p促进caspase3的活化。**为P＜0.01。

图4：Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测miR-424-5p诱导的转移性肝癌细胞凋亡。BEL7402，HepG2分别转染miR-424-5p24h后置poly-HEMA板中继续培养24h。收集细胞，Annexin V-FITC/PI双染，上机检测。图4A、B分别为转染了miR-NC和miR-424-5p的转移性BEL7402细胞的流式细胞术检测结果，图4C、D分别为转染了miR-NC和miR-424-5p的转移性HepG2细胞的流式细胞术检测结果，图4E为BEL7402细胞凋亡率比较的柱形图，图4F为HepG2细胞凋亡率比较的柱形图。*为P＜0.05，**为P＜0.01。

图5：肝癌细胞株BEL7402，SMMC7721，HepG2，分别转染miR-424-5p mimic以及阴性对照miR-c，其中，A：BEL7402；B：SMMC7721；C：HepG2。24h后置poly-HEMA培养板中继续培养24h。收集细胞胰酶消化计数，以1000/小室密度种到铺有Matrigel基质胶的transwell小室中，过夜(16h)。计数穿过小室基底膜的细胞数。结果以柱状图给出。*为P＜0.05，**为P＜0.01，***P＜0.001。

图6：肝癌细胞株BEL7402，SMMC7721，HepG2，分别转染miR-424-5p mimic以及阴性对照miR-c。其中，A：BEL7402；B：SMMC7721；C：HepG2。24h后置poly-HEMA培养板中继续培养24h。收集细胞胰酶消化计数，以1000/孔密度种到六孔板中，培养7-10天。计数大于50个细胞的克隆数。结果以柱状图给出。***P＜0.001。

图7：HepG2细胞分别转染miR-424-5p mimic及inhibitor，收集细胞总RNA，real-timePCR检测ICAT的表达。**为P＜0.01，***为P＜0.001。

图8：向BEL7402、SMMC7721、HepG2中分别转染miR-424-5p mimic以及阴性对照(miR-c)24h后收集细胞蛋白，western blot检测ICAT表达(图8A)。以β-actin为内参基因，用柱形图表示相对阴性对照组ICAT的表达量，图8B：BEL7402,8C:SMMC7721,8D：HepG2。*为P＜0.05，**为P＜0.01。

图9：构建pmiR-GL0-ICAT-3’UTR的野生型和突变型报告基因载体。图9A：示意图中标出miR-424-5p与ICAT3’UTR的结合位点以及突变位点。图9B：MiR-424-5p与野生型及突变体共转染，24h后洗涤并裂解细胞20min，测定荧光素酶的活性。内参照质粒pRL-TK携带的海肾荧光素酶激发底物所释放荧光的数值为Ml,pGL3-p50-3'UTR携带的萤火虫荧光素酶激发底物所释放荧光为M2。计算每一样品的数值M2/M1,即为该组细胞所得的焚光素酶的相对活性。***为P＜0.001。

图10：向HepG2细胞中转染ICAT小干扰，western blot检测ICAT蛋白表达，以β-actin为内参基因。

图11：向肝癌细胞株HepG2中转入ICAT小干扰，收集总RNA，real-time PCR检测EMT相关基因的mRNA水平。图A：β-catenin,图B：N-cadherin,图C：Snail，图D:Vimentin.以β-actin为内参基因。*为P＜0.05。

图12：向细胞中转染ICAT表达载体,剂量依次为0μg，1μg，2μg，4μg。细胞蛋白用IP buffer裂解后与β-catenin一抗4℃结合一个小时后，加琼脂糖珠子4℃结合过夜，第二天离心珠子收集蛋白，western blot检测洗脱下的蛋白。

图13：将肝癌细胞株HepG2分为四组，分别①转染miR-424-5p，②转染ICAT表达载体，③先转染miR-424-5p,24h后转染ICAT表达载体以及④空白对照。收集蛋白，western blot检测蛋白表达(图A)。柱形图表示相对表达，β-actin为内参基因(图B)。*为P＜0.05，**为P＜0.01，***为P＜0.001。

图14：肝癌细胞株BEL7402，SMMC7721，HepG2，分别转染miR-424-5p mimic阴性对照miR-NC，抑制子inhibitor，si-ICAT。收集细胞胰酶消化计数，以1000/小室密度种到铺有Matrigel基质胶的transwell小室中，过夜(16h)(图A)。计数穿过小室基底膜的细胞数。结果以柱状图给出(图B)。*为P＜0.05，**为P＜0.01。

图15：miR-424-5p在临床肝癌组织中的表达状况。A.Trizol提取肝癌患者癌组织和癌旁组织的总RNA，逆转录后Real-time PCR检测miR-424-5p的表达。B.根据临床样本资料，将肝癌病人分为转移(M)和原位(H)两组。C.HC为健康对照，T为癌组织，NT为癌旁组织。统计分析方法采用Mann-Whitney U检验，由prism软件完成。*为P＜0.05，**为P＜0.01，***为P＜0.001。

图16：ICAT与miR-424-5p相关性分析，以上四个图分别为在癌组织(图A)、癌旁组织(图B)、转移性肝癌组织(图C)、原位癌组织(图D)中的表达分析。采用spearman分析方法，R为相关系数，负数为负相关，P小于0.05有统计意义。

图17：miR-424-5p在临床转移性肝癌、肝癌患者及健康对照的血清中的表达状况。A.血清中miR-424-5p在原位癌患者外周血清(H)，转移性肝癌患者外周血清(M)，健康对照外周血血清(N)。*为P＜0.05，***为P＜0.001。B.miR-424-5p在肝癌患者组织和外周血清中表达相关性分析，spearman R为相关系数，为正相关，P＝0.0433有统计意义。

表1：临床肝癌病人中miR-424-5p的表达与病人临床检测指标之间的相关性。

表2：临床肝癌病人血清miR-424-5p的表达与病人临床指标之间的相关性。

具体实施方式

本发明发现miR-424-5p在抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中显著下调。将对数期的肝癌细胞BEL7402，SMMC7721，HepG2分别经贴壁和脱离基质附着培养24h，得到贴壁生长和脱离附着的失巢状态的肝癌细胞。通过real-time PCR检测两种状态下肝癌细胞中miR-424-5p的表达。检测结果证实了芯片结果，即miR-424-5p在脱离附着的肝癌细胞中的表达显著性下调(图1)。

本发明为获得高效表达，分别合成了miR-424-5p mimics和miR-424-5p inhibitor。其中，miR-424-5p mimic,inhibitor以及阴性对照序列如下：

MiR-424-5p mimics：CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA，如SEQ ID NO.4所示；

CAAAACAUGAAUUGCUGCUGUU，如SEQ ID NO.5所示；

MiR-424-5p inhibitor：UUCAAAACAUGAAUUGCUGCUG，如SEQ ID NO.6所示；

microRNA negative control：UUCUCCGAACGUGUCACGU，如SEQ ID NO.7所示；

ACGUGACACGUUCGGAGAA，如SEQ ID NO.8所示；

MicroRNA inhibitorN.C：CAGUACUUUUGUGUAGUACAA，如SEQ ID NO.9所示。

选择三个肝癌细胞株BEL7402，SMMC-7721和HepG2细胞，贴壁培养24h后分别转染miR-424-5p mimics和表达载体，转染4-6h后换液,继续培养24h，收集总RNA，microRNA检测试剂盒检测miR-424-5p的表达。转染miR-424-5p mimic组，miR-424-5p表达效率较高，在肝癌细胞中平均上调30倍以上(图2)，因此采用该miR-424-5p mimic进行后续的过表达实验。

选择肝癌细胞株HepG2，BEL7402，转染miR-424-5p mimics。转染24h后消化细胞，置poly-HEMA培养板中继续培养24h。收集失巢后的转移性肝癌细胞，用移液器轻轻吹开细胞团成单个细胞，1000rpm4℃离心5min，预冷PBS冲洗3遍，进行AnnexinV-FITC染色，上机后检测凋亡细胞，结果如图4所示，转染miR-424-5p的细胞凋亡率显著增加。

前期研究表明，抵抗失巢凋亡的肝癌细胞获得了更高的侵袭能力，本发明进一步研究这种高侵袭力的获得是否与miR-424-5p下调有关。为此选择SMMC7721，BEL7402，HepG2细胞株，并转染miR-424-5p mimics，转染24h后置poly-HEMA培养板中24h，胰酶消化离心后计数加入铺有matrigel胶的transwell小室，16h后结晶紫染色，观察穿过小室膜的细胞数。结果表明转染miR-424-5p后穿过小室的细胞减少，细胞侵袭力下降(图5)。

克隆形成能力是体外检测肿瘤细胞增殖能力和致瘤性的常规方法。选择肝癌细胞株BEL7402，SMMC-7721，HepG2，分别转染miR-424-5p mimics，转染后24h置poly-HEMA培养板中培养24h，消化计数后以1000个细胞/孔种在六孔板中。7-10天计数单个细胞形成的大于50个细胞的克隆数。结果表明转染miR-424-5p的肝癌细胞克隆形成能力下降(图6)。

用miR-424-5p对肝癌细胞进行转染，结果显示miR-424-5p能够下调ICAT在肝癌细胞中的表达(图8)。报告基因分析显示，ICAT是miR-424-5p的直接靶基因(图9)。进一步的细胞实验显示，miR-424-5p能够促进E-cadherin和β-catenin复合物的形成，促进细胞粘附，抑制间质细胞蛋白的表达；而ICAT的作用则相反，表现为促进细胞的侵袭转移，提示miR-424-5p通过靶向ICAT对肝癌细胞发挥效应(图11-14)。

通过检测人肝癌组织和正常肝组织中microRNA的表达水平，发现与正常肝组织相比，miR-424-5p在癌组织中表达下调，见图15，相关性分析也显示miR-424-5p的表达水平与肝癌的进展和转移呈显著性负相关(表1)。

本发明依据病人的转移状况将其分为转移组和非转移组，在两组病人中对miR-424-5p的表达进行了检测，并对其与临床指标的相关性进行了分析。结果显示，miR-424-5p在转移患者中的表达相对下调(图15)，与肝癌临床指标的相关性分析显示在疾病进展期、以及预后较差的患者中，miR-424-5p的表达显著性下调(表1)，提示其表达失调参与了肝癌的转移和疾病进程。miR-424-5p与ICAT在肝癌中的表达水平呈负相关，临床标本中的检测进一步说明ICAT是miR-424-5p的直接靶基因(图16)。

在临床诊断中，血清检测作为无创诊断具有很大的优势，microRNA等小分子在外周血血清中的表达往往与肿瘤发展密切相关。根据以上结果提示miR-424-5p在肝癌中发挥抑癌作用。为了进一步判断miR-424-5p在肝癌中的诊断以及治疗意义，在这一部分中引入对肝癌病人血清中miR-424-5p表达的检测。

收集的病人血清62例，详细病人信息及miR-424-5p与临床指标的相关性见表2。由表2可见，肝癌病人血清miR-424-5p的表达与其临床分期及病理分级呈负相关，与癌细胞的转移呈负相关。

利用real-time PCR分别检测正常人，原位癌患者以及转移癌患者血清中miR-424-5p的表达，应用2^-△△Ct公式计算得到miR-424-5p的相对表达量。应用graphpad prism软件分析，对不同分组miR-424-5p的表达进行U检验，结果如图17A。结果显示miR-424-5p在正常人外周血清中表达水平最高，在转移癌患者外周血清中表达水平最低。对比分析miR-424-5p在血清和组织中的表达，虽然例数较少但可以看出两者呈正相关的趋势(图17B)。

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

所涉及的试剂、方法等，若无特别说明，均为本领域常规试剂、方法。

实施例1细胞株及培养条件

BEL7402、HepG2和SMMC7721细胞系均为人肝癌细胞系，购自中国科学院上海细胞生物研究所，引进后在本实验室长期培养。以RPMI1640+10％FBS，37℃、5％CO₂，95％空气，饱和湿度条件下进行培养。

实施例2肝癌患者手术标本和血清标本的收集

收集2012年4月至2013年11月间，在山东省立医院肝胆外科行肝癌根治性手术的50例患者切除标本及癌旁组织作为肝癌组织标本和癌旁对着。所有患者术前未接受过放化疗等抗肿瘤治疗。标本取材后立即放入4％甲醛溶液中进行组织固定。所有组织标本的病理学特征均经病理检查确认。50例患者的一般临床特征(见表1)。收集2012年4月至2013年11月间，在山东省立医院诊断为肝癌的患者血清标本62例，详细病人信息及miR-424-5p与临床指标的相关性见表2。

实施例3失巢细胞模型的建立

(1)用20mL95％的乙醇溶解2.4gPoly-HEMA粉末，65℃振荡混匀8h以上，制备成Poly-HEMA储存液，于4℃密封保存。用时用95％的乙醇稀释成工作液，在无菌条件下将工作液沿孔壁轻轻加入培养板孔的底部至覆盖整个孔底，紫外线照射过夜，4℃保存，用前在紫外灯下照射0.5h，并用无菌PBS洗涤3遍。

(2)BEL7402和SMMC7721细胞系以RPMll640加10％胎牛血清为培养液，在37℃、5％C02条件下培养至对数生长期，O.25％的胰蛋白酶消化成单细胞悬液，调整好浓度后，加入Poly-HEMA培养板中继续培养24h，得到失巢细胞模型。

实施例4细胞的转染

(1)转染前一天，胰酶消化预转染的细胞，调整细胞浓度为2x10⁵个/孔接种于6孔培养板中，置于37℃，5％CO₂培养箱培养。

(2)16-20h后，细胞密度达到80％，将板内完全培养基换成opti-MEM培养液。

(3)取5μl的miR-424-5p mimics或miR-control稀释于250μl opti-MEM培养基中。

(4)取10μl Lipofectamine2000脂质体稀释于250μl opti-MEM培养基中。

(5)将稀释好的脂质体与miR混合，室温孵育25min。

(6)将miR脂质体混合液按每孔500ml/孔加到6孔板中，轻轻摇动混匀。

(7)37℃，5％CO2培养箱中培养6h后，更换为完全培养基继续培养。

实施例5microRNA的表达的分析

1.细胞/组织总RNA的提取

按TRIzol(Invitrogen)试剂说明进行，步骤如下：

(1)组织研磨后或细胞收集后用PBS洗2次，按1×10⁷细胞加入1ml细胞总RNA抽提试剂Trizol，充分匀浆；

(2)加入0.2ml氯仿混匀，室温静置3分钟后，4℃、12,000g离心15分钟；吸取上层水相置于新管中，加入0.5ml异丙醇，室温静置10分钟后，4℃、12,000g离心20分钟；

(3)弃上清，沉淀以75％乙醇洗涤，4℃、7,500g离心5分钟后，空气干燥；溶解于40μl DEPC处理的水溶液，进行浓度和纯度测定后保存于－80℃用于反转录。

2.血清microRNA的提取

(1)吸取400μl冻存的病人血清，加入750μl裂解液MRL，吹打几次。

(2)将匀浆样品剧烈震荡混匀，在室温下孵育5min，小心吸取上清转入一个新的RNasefree的离心管中。

(3)每750μl裂解液加200μl氯仿，改进样品管盖，剧烈震荡15s并将其在室温下孵育3min。

(4)于4℃12000rpm离心10min，样品会分成3层，去上层水相，移到新的RNase freeEP管中。

(5)加入0.6倍体积的70％乙醇，颠倒混匀，得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中。

(6)10000rpm离心45s，收集下滤液，加入2/3体积的无水乙醇，颠倒混匀，将混合液倒入吸附柱RB，10000rpm离心30s，弃掉废液。

(7)加入700μl漂洗液RW，12000rpm离心60s，弃掉废液。

(8)加入500μlRW，12000rpm离心60s，弃掉废液。

(9)将吸附柱RB放回空收集管，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。

(10)取出RB，放入到一个新的RNase free EP管中，在吸附膜中间加30μl RNase freewater，室温放置2min，12000rpm离心1,min。收集得到纯净microRNA保存于-80℃。

血清microRNA的逆转录和real-timePCR检测同组织microRNA操作。

3.microRNA逆转录

(1)取2μg细胞或组织总RNA，在室温解冻，解冻后迅速置于冰上。按照表3配制混合液。

表3microRNA逆转录体系

(2)85℃，5min后放于冰上，得到的microRNA cDNA可用于后续实验，或置于-20℃保存。

4.Real-timePCR检测microRNA表达

以上述逆转录反应得到的cDNA为模板，每个待测基因每个模板设置三个复孔，在冰上操作，反应体系配制如表4。

表4Real-time PCR反应体系

按照两步法PCR设定反应步骤。

反应结束，根据熔解曲线和Ct值，按照按照2^-ΔΔCT计算得到目的基因在这一模板中的相对表达值后进行分析。

U6及Hsa-miR-424-5p的引物的序列如表5所示(U6基因的上游引物序列如SEQ ID NO.10所示，下游引物序列如SEQ ID NO.11所示)。

表5引物序列

实施例6Western blot检测caspase3的活化

HepG2以及SMMC7721细胞株贴壁培养24小时后转染miR-424-5p及对照序列，24h后置poly-HEMA板中培养24h后收集蛋白，western blot检测caspase3原型及其剪切体的表达。另外，利用caspase-3活性检测试剂盒对转染前后失巢细胞内caspase-3的活化进行检测。结果显示，转染miR-424-5p的失巢的肝癌细胞中，Caspase3活性增强，说明miR-424-5p促进了失巢引起的细胞凋亡(见图3)。

实施例7Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测转移性肝癌细胞凋亡

选择肝癌细胞株HepG2和BEL7402细胞，转染miR-424-5p mimics,24h后消化细胞，置poly-HEMA培养板中继续培养24h。收集失巢后的肝癌细胞，用移液器轻轻吹开细胞团成单个细胞，1000rpm4℃离心5min，预冷PBS冲洗3遍，进行AnnexinV-FITC染色，并应用流式细胞术检测凋亡细胞，结果显示转染miR-424-5p的转移性细胞失巢后凋亡增加(见图4)。

实施例8转移性肝癌细胞的侵袭能力检测

前期研究表明，抵抗失巢凋亡的肝癌细胞获得了更高的侵袭能力，我们进一步研究这种高侵袭力的获得是否与miR-424-5p下调有关。为此在SMMC7721，BEL7402，HepG2细胞株中，进行miR-424-5p mimics的转染。转染24h后置poly-HEMA培养板中继续培养24h，胰酶消化离心后，进行细胞计数并按照1000/小室将细胞加入铺有matrigel胶的transwell小室，16h后进行结晶紫染色，分析穿过小室膜的细胞并拍照计数(见图5)。结果表明转染miR-424-5p后，穿过小室的肝癌细胞减少，细胞侵袭力下降。

实施例9转移性肝癌细胞的克隆形成能力检测

在肝癌细胞株BEL7402、SMMC-7721和HepG2中，进行miR-424-5p mimics的转染。转染24h后置于poly-HEMA培养板中继续培养24h，消化计数后以1000个细胞/孔接种在六孔板中。7-10天计数细胞数大于50的细胞克隆数(见图6)。结果表明转染miR-424-5p的失巢的肝癌细胞克隆形成能力下降。

实施例10miR-424-5p的靶基因预测与验证

生物信息学预测miR-424-5p的可能靶基因，分析与肝细胞癌恶性行为相关的靶基因，选择ICAT、Bcl2l2、DICER等基因为miR-424-5p的潜在靶点。在肝癌细胞中进行miR-424-5p的转染，并检测靶基因的表达水平，由此对筛选出的潜在靶基因进行调控效应验证；并应用报告基因检测miR-424-5p与ICAT等潜在靶基因3’UTR预测靶序列的结合。

分别用miR-424-5p mimic和miR-424-5p inhibitor对肝癌细胞进行转染，结果显示miR-424-5p能够下调ICAT在肝癌细胞中的表达,而其inhibitor能够上调ICAT的表达(图7)。

为了进一步验证miR-424-5p对ICAT的负向调控效应，我们在三个肝癌细胞系BEL7402，SMMC7721以及HepG2中转染了miR-424-5p mimic，24h后收集细胞蛋白，Western blot检测ICAT蛋白表达，β-actin为内参基因(见图8)，ICAT在miR-424-5p转染后表达下调，说明ICAT的表达受miR-424-5p的抑制。

为了探究miR-424-5p对ICAT的负向调控作用是否是通过靶向结合ICAT mRNA3’-UTR发挥作用，我们构建了pmiR-GL0-ICAT-3’UTR的野生型和突变型报告基因载体，我们将miR-424-5p和报告载体共转染到HEK293细胞后，发现miR-424-5p可以有效抑制pmiR-GL0野生型报告质粒的活性。而miR-424-5p的结合位点突变的载体，miR-424-5p对报告基因的抑制活性消失(图9)，说明miR-424-5p直接结合在ICAT mRNA3’UTR，从而下调ICAT蛋白表达。

进一步的细胞实验显示，miR-424-5p能够促进E-cadherin和β-catenin复合物的形成，促进细胞粘附，抑制间质细胞蛋白的表达；而ICAT的作用则相反，表现为促进细胞的侵袭转移，提示miR-424-5p通过靶向ICAT对肝癌细胞发挥效应。

实施例11验证miR-424-5p是否通过直接靶向ICAT逆转转移性肝癌细胞的恶性行为

通过以上实验结果，我们已经证实了miR-424-5p对其预测靶基因ICAT的负向调控效应，我们进一步证实miR-424-5p对失巢后肝癌细胞的EMT和肿瘤转移的也具有抑制效应。

1.靶向ICAT的小干扰的合成

根据前面结果，ICAT在抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中表达上调，为进一步验证ICAT在肝癌细胞抵抗失巢凋亡中的作用，我们合成了ICAT小干扰RNA，下调其在肝癌细胞中的表达。小干扰序列如表6所示(如SEQ ID NO.12～14所示)：

表6.ICAT小干扰序列

在肝癌细胞株HepG2中转染分别转染三条小干扰RNA，同时转入荧光标记阴性对照，通过荧光显微镜观察荧光，监测转染效率。转染24h后收集蛋白，western blot检测ICAT的表达(见图10)。结果显示三条小干扰中Si-1和Si-3干扰效率较高，达到百分之七十，遂在下一步实验中将①和③混合转染肝癌细胞，下调ICAT的水平。

2.ICAT小干扰逆转了转移性肝癌细胞的上皮向间质转化(EMT)

向肝癌细胞株HepG2中转入ICAT小干扰，并检测EMT相关蛋白的表达，发现β-cateninmRNA水平上调，而间质化标志蛋白N-cadherin，Snail，Vimentin表达水平下调(见图11)，说明ICAT促进了肝癌细胞中EMT的发生。

3.ICAT下调E-cadherin/β-catenin复合物的形成

在HepG2细胞中按照0.5μg、1μg、2μg分别转染ICAT表达质粒，检测不同剂量的ICAT对E-cadherin/β-catenin形成复合物的影响，结果发现随着ICAT蛋白水平的提高，β-catenin可结合的E-cadherin减少，这与miR-424-5p促进E-cadherin和β-catanin复合物形成的结果相反，提示miR-424-5p通过ICAT促进E-cadherin/β-catenin复合物形成(图12)。

4.miR-424-5p通过ICAT逆转EMT

将肝癌细胞株HepG2分为四组，分别是：①转染miR-424-5p组，②转染ICAT表达载体组，③先转染miR-424-5p,24h后转染ICAT表达载体组，④空白对照组。实验结果表明,转染miR-424-5p后，E-cadherin表达下调，N-cadherin表达上调，ICAT表达下调。而转染ICAT表达载体后，以上分子的表达变化出现了逆转，说明miR-424-5p的确通过ICAT发挥抑制EMT的作用。同时，肝癌细胞内高水平的ICAT影响EMT相关基因的表达，而miR-424-5p的同时过表达能够逆转这一效应(图13)。

5.下调ICAT的表达能够抑制肝癌细胞的侵袭转移

为了进一步验证ICAT促进EMT的效应，根据5.1.1部分的结果，利用合成的ICAT的小干扰Si-ICAT(1和3)，对肝癌细胞转染进行transwell实验，发现转染靶向ICAT小干扰的肝癌细胞表现出侵袭能力下调(见图14)，这与miR-424-5p的对肝癌细胞的作用效应一致,提示miR-424-5p的作用效应通过对其靶基因ICAT的抑制作用实现。

6.miR-424-5p对失巢凋亡抵抗相关恶性行为的作用效应

向肝癌细胞中转入miR-424-5p mimics，通过免疫共沉淀以及westernblot检测细胞粘附关键分子E-cadherin/βcatenin复合物的表达以及EMT相关恶性行为。通过对肝癌细胞进行ICAT真核表达载体及小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)的转染，从正反向明确miR-424-5p对肝癌细胞的作用效应是否通过ICAT介导(图14)。

实施例12临床肝癌组织中验证miR-424-5p与ICAT的相关性

与非癌肝组织相比，miR-424-5p在肝癌组织中表达显著下调，并且与病理分级和临床分期呈负相关(表1)；并且miR-424-5p在转移患者中的表达水平显著低于原位癌患者，提示miR-424-5p在肝癌组织中的表达失调参与了肝癌进展(图15)。miR-424-5p与ICAT在肝癌中的表达水平呈负相关，临床标本中的检测进一步说明ICAT是miR-424-5p的直接靶基因(图16)。

表1.临床肝癌病人中miR-424-5p的表达与病人临床检测指标之间的相关性

Claims (2)

1.MiR-424-5p在制备抑制转移性肝癌的药物中的应用，所述MiR-424-5p的序列如SEQ IDNO.1所示。

2.用于检测MiR-424-5p的特异性扩增引物，其特征在于：特异性的上游引物序列为：GGCAGCAGCAATTCATG，如SEQ ID NO.2所示；通用下游引物序列为：CAGTGCGTGTCGTGGAG，如SEQ ID NO.3所示。