CN115944736A - 抑制或下调scarna2表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，提供了SCARNA2作为靶向标志物的应用，也提供了抑制或下调SCARNA2表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。实验结果显示，抑制SCARNA2基因表达的shRNA能促进肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞G2期细胞阻滞，促进照射对肿瘤细胞的DNA损伤，进而提高肿瘤细胞对放射治疗的敏感性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，涉及SCARNA2作为靶向标志物的应用，具体涉及抑制或下调SCARNA2表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。
背景技术
直肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，总生存率为50％。根据2022年全球癌症普查的统计数据，直肠癌是全球第三大最常见的恶性肿瘤。近50年来，世界上很多国家的直肠癌发病率和死亡率呈急剧上升趋势。根据世界卫生组织的数据，直肠癌目前是全世界癌症死因的二名，约占全部恶性肿瘤的19％。全世界每年的新增病例超过120万。目前已知直肠癌的发生有多个危险因素，如吸烟，肥胖，熬夜，久坐，肠道息肉和人体自身免疫力下降等因素，存在危险因素的个体患直肠癌的概率会增加。相应的预防直肠癌的发生就要减少危险因素暴露，如定期切除肠道息肉，减少吸烟，减肥，经常运动等。直肠癌的病因至今尚不完全明确，但是严重影响了患者的生命健康和生存质量。目前直肠癌的主要治疗手段包括手术治疗、放射治疗、化学治疗及靶向治疗。其中，放射治疗是是治疗直肠癌的重要手段，但很多患者出现辐射抵抗，治疗效果不如人意。肿瘤对辐射不敏感或对辐射产生抗拒性，是放射治疗难以根治恶性肿瘤的主要原因之一。
小Cajal体特异性RNA2(Small Cajal Body-Specific RNA 2，SCARNA2)是一种定位于核Cajal体的核仁内小非编码RNA。这种小非编码RNA大小在60-170个核苷酸之间，可以指导其它RNA的化学修饰，尤其是在核糖体和小核RNA(snRNA)中发挥作用。snoRNA分为两个不同的家族，box C/D家族，催化RNA甲基化，box H/ACA家族，催化假尿苷化。这两个家族都与一组特定的蛋白质结合形成snoRNP(小核仁核糖核蛋白)，其中RNA提供靶向特异性。boxC/D和H/ACA snoRNA的一个分支，称为SCARNA，定位于核Cajal体，在那里它们有助于剪接小体snRNA的修饰。大量研究表明，SCARNA是一种肿瘤抑制基因；且在多种人类肿瘤中表达下调或缺失，但在放疗耐受肿瘤中高表达；同时研究发现，SCARNA不仅能够抑制肿瘤发生，而且能够抑制肿瘤转移。这些研究表明，SCARNA与肿瘤的发生发展密切相关。
目前基于SCARNA2和肿瘤之间关系的研究主要集中于SCARNA2通过竞争性结合minRNA来影响细胞生长、细胞周期和侵袭或者影响肿瘤细胞的化学抗性等方面。抑制或下调SCARNA2基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用国内外至今无人报道。
发明内容
本发明依托上述研究进行，目的在于提供SCARNA2作为靶向标志物的应用，也在于提供抑制SCARNA2表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明的第一方面，提供了抑制或下调SCARNA2基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。
优选的，该抑制或下调SCARNA2基因表达的试剂是通过shRNA敲低SCARNA2基因表达的试剂；进一步优选为含有shRNA的重组表达载体或转染细胞；更优选为靶向SCARNA2基因的重组慢病毒质粒。
优选的，抑制SCARNA2基因表达的shRNA包括正义链和反义链，正义链和反义链的核苷酸序列分别如下所示：
正义链：5’-CACCGCATCAGGCCCACACC(SEQ ID NO.1)；
反义链：5’-TGCGGGCTGCCGGTGGCGTA(SEQ ID NO.2)；
优选的，所述的肿瘤放疗增敏药物促进肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞G2期细胞阻滞，促进照射对肿瘤细胞的DNA损伤，提高肿瘤细胞对放射治疗的敏感性。
进一步的，肿瘤为结直肠癌、肝癌或肺癌，优选为结直肠癌。所述的肿瘤放疗增敏药物是用于直肠癌的放疗增敏药物。
本发明将SCARNA2shRNA及NC序列转入直肠癌细胞HCT116/HT29中，72h应用Western blot对直肠癌细胞HCT116/HT29的SCARNA2蛋白进行检测。结果发现：SCARNA2shRNA可以有效抑制HCT116/HT29细胞中高度表达的SCARNA2蛋白。
进一步，对正常HCT116/HT29细胞和转染SCARNA2shRNA及NC序列的HCT116/HT29细胞给予不同剂量(0、2、4、8Gy)的60Coγ射线照射，然后继续培养2周后采用克隆形成率检测细胞生长和增殖，结果显示：转染SCARNA2shRNA的HCT116/HT29细胞随着照射剂量的增加，细胞死亡率明显高于正常HCT116/HT29细胞和转染NC质粒的HCT116/HT29细胞。同时，本发明给予两种细胞8Gy的60Coγ射线照射，然后继续培养24h后采用AnnexinV-FITC及PI双染后通过流式细胞仪检测细胞凋亡，结果显示：转染SCARNA2shRNA的HCT116/HT29细胞的凋亡率照后明显高于正常HCT116/HT29细胞组及转染NC组。
接下来，本发明将两种细胞以1×105个/ml密度接种于六孔板，加2ml 1640培养基培养；第二天给予两种细胞8Gy的60Coγ射线照射，分别在0h、8h、12h及24h用胰酶进行消化，1000rpm离心5min；用PBS液洗一遍，弃上液；用0.3ml PBS溶液重新悬浮细胞，然后缓慢加入4℃预冷的无水酒精0.7ml，-20℃冰箱过夜；检测前进行PI单染：1000rpm离心5min，去上液；加PBS清洗一遍，加100μl 5mg/ml RNA酶溶液，37℃保温30min，然后冰浴终止酶作用；加PI染液(100μg/ml)避光染色30min；应用FCM测细胞周期：用EPICSXL流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)进行细胞周期分析，氩离子激发PI荧光，激发光波长为488nm，用620nm波长滤器检测对数红色荧光，收集数据待分析。结果显示，抑制SCARNA2基因在照射后促进HCT116/HT29细胞发生了更明显的G2期细胞阻滞。
最后，本发明将两种细胞以1×105个/ml密度接种于六孔板，加2ml 1640培养基培养；将清洁的载玻片浸入熔融的1％高熔点琼脂糖中并立即擦拭来制备彗星电泳预涂片。第二天给予两种细胞8Gy的60Coγ射线照射，分别在0h、4h及8h用胰酶进行消化，1000rpm离心5min；用PBS液洗一遍，弃上液；用无Ca2+、Mg2+的PBS将单细胞悬浮液的浓度调节至2×104个细胞/ml，然后将0.4ml的溶液浸入1.2ml的0.65％低熔点琼脂糖中，40℃水浴。将1.2ml细胞悬浮液混合并快速移液到预涂片的表面上并铺均匀；晾干后将玻片轻轻浸于新鲜配置并预冷的细胞裂解液中，4℃避光裂解1小时。从裂解液中取出玻片，用电泳液淋洗5秒后移入水平电泳槽，倒满电泳液。25V电泳30分钟。电泳后取出玻片，用双蒸水轻轻清洗。用PI(10μg/ml)染色20分钟，然后用双蒸水轻轻冲洗。最后，通过荧光显微镜(Olympus BX60)在10x目标下观察所有凝胶。使用CASP 1.2.3b2(CASPlab，Wroclaw，Poland)进行分析。结果显示，下调SCARNA2后，结肠癌细胞中DNA的损伤程度要比对照组细胞更严重，表明SCARNA2可能在由电离辐射引起的DNA损伤修复中发挥着重要的作用。
因此，本发明要求保护抑制SCARNA2基因在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。通过抑制SCARNA2基因，可以提高放射治疗的敏感性，从而提高放射治疗疗效。
本发明的第二方面，提供了一种抑制或下调SCARNA2表达的重组表达载体，其包含抑制SCARNA2表达的shRNA，该shRNA包括正义链和反义链，所述正义链的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第三方面，提供一种肿瘤放疗增敏剂，包含活性组分以及药学上可接受的载体。所述活性组分包括抑制SCARNA2表达的shRNA，或包含该shRNA的重组表达载体或转基因细胞系，该shRNA包括正义链和反义链，正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
相比于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明首次公开了SCARNA2基因和抑制或下调SCARNA2基因表达的试剂的新应用，能够有效提高结直肠癌的放射敏感性。实验结果显示，抑制SCARNA2基因表达的shRNA能促进肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞G2期细胞阻滞，促进照射对肿瘤细胞的DNA损伤，进而提高了肿瘤细胞对放射治疗的敏感性。
附图说明
图1为实施例1中转染SCARNA2shRNA、NC序列的BEAS-2B/A549/H460/H1299/H1975/HCT116/HT29/WIDR/T87/U251/U373/U87/HuH7/7721/HepG2细胞，和正常BEAS-2B/A549/H460/H1299/H1975/HCT116/HT29/WIDR/T87/U251/U373/U87/HuH7/7721/HepG2细胞SCARNA2蛋白的表达情况；
图2为实施例2中转染SCARNA2shRNA、NC序列的HCT116/HT29细胞和正常HCT116/HT29细胞SCARNA2蛋白的表达情况。
图3为实施例3中正常HCT116/HT29细胞和转染SCARNA2shRNA序列的HCT116/HT29细胞的单克隆SCARNA2蛋白表达情况。
图4为实施例4中正常HCT116/HT29细胞和转染SCARNA2shRNA序列的HCT116/HT29细胞照后生长增殖变化。
图5为实施例5中正常HCT116/HT29细胞和转染SCARNA2shRNA及NC序列的HCT116/HT29细胞照后细胞凋亡变化。
图6为实施例6中正常HCT116/HT29细胞和转染SCARNA2shRNA及NC序列的HCT116/HT29细胞照后细胞周期变化。
图7为实施例7中正常HCT116/HT29细胞和转染SCARNA2shRNA及NC序列的HCT116/HT29细胞照后DNA损伤变化。
图8为实施例8中正常HCT116/HT29细胞和转染SCARNA2shRNA、NC及OE序列的HCT116/HT29细胞照后DNA损伤标志物的蛋白水平变化。
图9为实施例9中正常HCT116/HT29细胞和转染SCARNA2shRNA、NC及OE序列的HCT116/HT29细胞照后DNA损伤标志物抑制剂对SCARNA2转录水平的影响。
具体实施方式
下现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
本实施例所涉及的材料及来源如下：细胞株和细胞培养：将人结直肠癌癌细胞系HCT116/HT29(美国细胞收藏中心)在含有10％胎牛血清的1640培养基于37℃、5％CO2培养箱中培养。药物与主要试剂：1640培养基、胎牛血清、胰酶购自Gibco公司；Annexin V-FITC及PI购自Invitrogen公司。结晶紫、标准蛋白质分子量、SDS-PAGE上样缓冲液、RIPA蛋白裂解液、TE电泳缓冲液、10×转膜液、30％Acry-Bis、Tris-HCl、过硫酸铵(AP)、SDS、四甲基乙二胺(TEMED)、碘化丙啶(PI)购自江苏碧云天生物技术研究所；二甲基亚砜(DMSO)、琼脂糖和Tween-20来自上海高科技生物工程有限公司；抗SCARNA2、GAPDH抗体购自CST。
实施例1：
(1)细胞培养：将BEAS-2B/A549/H460/H1299/H1975/HCT116/HT29/WIDR/T87/U251/U373/U87/HuH7/7721/HepG2细胞培养于含10％胎牛血清的1640培养基中；将其细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每2-3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。
(2)细胞转染：转染前一天，将细胞用胰酶消化、计数，以合适的密度接种6孔板，置于CO2培养箱中培养过夜，使转染当日细胞融合度为70％～90％。铺板和转染期间避免使用抗生素。
转染溶液配制：按照质粒：Lipofectamine3000用量比为1μg/孔：1.5μl/孔。500ng/孔DNA及5μl/孔P3000加入250μl Opti-MEM培养基混匀，室温静置5min，备用；3.75μl/孔Lipofectamine3000加入250μl/孔Opti-MEM培养基混匀，室温静置5min，备用；将稀释的shRNA的逆转录DNA同稀释的脂质体试剂混合，在室温保温20min后，加入待转染的HCT116/HT29细胞中，5％CO2，37℃培养。24小时后，弃去含转染试剂的培养液，加入新鲜的完全培养基，继续培养后，72小时内完成瞬时转染。
(3)转染72小时后提取蛋白，进行Western blot电泳。结果如图1所示，SCARNA2shRNA转染入HCT116/HT29细胞后成功抑制了SCARNA2蛋白的表达。
实施例2：
(1)细胞培养及细胞转染同实施例1；
(2)转染72小时后提取蛋白，进行Western blot电泳。结果如图2所示，SCARNA2shRNA转染入HCT116/HT29细胞后成功抑制了SCARNA2蛋白的表达。
实施例3：
(1)细胞培养及细胞转染同实施例1；
(2)单克隆细胞系的建立：选用敲除效果最明显的sgl质粒和敲低效果最明显的sh1质粒构建稳转细胞系。进一步构建了单克隆细胞系。在HCT116的sg1敲除稳转细胞系中培养8株SCARNA2的单克隆细胞株，通过RT-PCR验证它们的干扰效率。
所得结果如图3所示，选取效果最好的5#单克隆细胞株(p<0.001)进行接下来的一系列实验，并将其命名为sg-SCARNA2，sg-crtl为感染空白质粒的敲除组对照稳转细胞。而对于HT29细胞，经过多次筛选，没有成功得到单克隆细胞株，但是HT29的sh1敲低稳转细胞系的敲低效果较好(p<0.001)，所以用它来进行后续的实验研究，将其命名为sh-SCARNA2，sh-crtl为感染空白质粒的敲低组对照稳转细胞。
实施例4：
(1)细胞培养及细胞转染同实施例1；
(2)细胞克隆形成方法：取对数生长期HCT116/HT29细胞及转染SCARNA2shRNA、NC质粒72h的HCT116/HT29细胞，并按不同照射剂量要求接种不同数量的细胞到六孔板中(0,2,4,8Gy剂量接种细胞数量分别为200,400,800和1600个)。两种细胞同时接受不同剂量(0-8Gy)的γ-射线照射，照后继续直至培养皿中出现明显肉眼可见的细胞克隆时终止培养。弃培养基，PBS洗两次，并采用无水甲醇固定30分钟，Gimsa染液染色30分钟，流水冲洗后晾干后进行计数，计算出细胞存活率。所得结果如图4所示，随着照射剂量的增加，转染SCARNA2shRNA的HCT116/HT29细胞的细胞死亡率明显高于正常HCT116/HT29及转染NC序列的HCT116/HT29组。
实施例5：
(1)细胞培养及细胞转染同实施例1；
(2)流式细胞仪检测细胞凋亡法：取对数生长期HCT116/HT29细胞和转染SCARNA2shRNA72h及NC质粒的HCT116/HT29细胞(1×105/ml)接种至六孔板中，给予两种细胞8Gy的60Coγ射线照射，然后继续培养24h后，使用不含EDTA的胰酶消化细胞，1500rpm离心5分钟后PBS洗三遍，采用Annexin V-FITC及PI双染后通过流式细胞仪检测细胞凋亡。所得结果如图5所示，转染SCARNA2shRNA的HCT116/HT29细胞的凋亡率照后明显高于正常HCT116/HT29细胞组及转染NC质粒的HCT116/HT29组。
实施例6：
(1)细胞培养及细胞转染同实施例1；
(2)流式细胞仪检测细胞周期：取对数生长期HCT116/HT29细胞和转染SCARNA2shRNA及NC序列72h的HCT116/HT29细胞(1×105/mL)接种至六孔板中，第二天给予两种细胞8Gy的60Coγ射线照射，分别在0h、8h、12h及24h用胰酶进行消化，1000rpm离心5min；用PBS液洗一遍，弃上液；用0.3ml PBS溶液重新悬浮细胞，然后缓慢加入4℃预冷的无水酒精0.7ml，-20℃冰箱过夜；检测前进行PI单染：1000rpm离心5min，去上液；加PBS清洗一遍，加100μl 5mg/ml RNA酶溶液，37℃保温30min，然后冰浴终止酶作用；加PI染液(100μg/ml)避光染色30min；应用FCM测细胞周期：用EPICSXL流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)进行细胞周期分析，氩离子激发PI荧光，激发光波长为488nm，用620nm波长滤器检测对数红色荧光，收集数据待分析。
所得结果如图6所示，两种细胞G0/G1期细胞比例总的趋势是随照后时间的增加，细胞比例呈下降趋势，12小时达到最低，24小时有所恢复。其中，敲低SCARNA2组的细胞比例下降明显高于对照组与转染NC质粒组(p＜0.05)，而对照组与转染NC质粒组无明显差异(p＜0.05)；两种细胞G2/M期细胞比例总的趋势是随照后时间的增加，细胞比例呈上升趋势，12小时达到最高，24小时有所回复。其中，敲低SCARNA2组的细胞比例上升明显高于对照组与转染NC质粒组(p＜0.05)，而对照组与转染NC序列组无明显差异(p＜0.05)。这些结果说明，抑制SCARNA2基因在照射后促进HCT116/HT29细胞发生了更明显的G2期细胞阻滞。
实施例7：
(1)细胞培养及细胞转染同实施例1；
(2)彗星电泳检测DNA损伤变化：将两种细胞以1×105个/ml密度接种于六孔板，加2ml 1640培养基培养；将清洁的载玻片浸入熔融的1％高熔点琼脂糖中并立即擦拭来制备彗星电泳预涂片。第二天给予两种细胞8Gy的60Coγ射线照射，分别在0h、4h及8h用胰酶进行消化，1000rpm离心5min；用PBS液洗一遍，弃上液；用无Ca2+、Mg2+的PBS将单细胞悬浮液的浓度调节至2×104个细胞/ml，然后将0.4ml的溶液浸入1.2ml的0.65％低熔点琼脂糖中，40℃水浴。将1.2ml细胞悬浮液混合并快速移液到预涂片的表面上并铺均匀；晾干后将玻片轻轻浸于新鲜配置并预冷的细胞裂解液中，4℃避光裂解1小时。从裂解液中取出玻片，用电泳液淋洗5秒后移入水平电泳槽，倒满电泳液。25V电泳30分钟。电泳后取出玻片，用双蒸水轻轻清洗。用PI(10μg/ml)染色20分钟，然后用双蒸水轻轻冲洗。最后，通过荧光显微镜(OlympusBX60)在10x目标下观察所有凝胶。使用CASP 1.2.3b2(CASPlab，Wroclaw，Poland进行分析。
所得结果如图7所示，定量分析结果显示，在SCARNA2敲除的HCT116细胞中，8Gy照射后8h的彗星尾部DNA百分比(Tail DNA％)比对照组高40％(31.46±1.27vs18.81±0.90，p<001)；彗星尾距(Tail moment)比对照组高51.8％(52.84±2.27vs 25.48±0.29，p<0.001)。同样，在HT29细胞中敲低SCARNA2也观察到了类似的趋势，照射后8h的彗星尾部DNA百分明显高于对照组(31.18±2.15vs 15.10±0.98，p<0.001)；形成的彗星距也显著高于对照组(44.79±1.59vs 13.63±1.09，p<0.001)。该结果说明下调SCARNA2后，结肠癌细胞中DNA的损伤程度要比对照组细胞更严重，表明SCARNA2可能在由电离辐射引起的DNA损伤修复中发挥着重要的作用。
实施例8：
(1)细胞培养及细胞转染同实施例1；
(2)Western Blot电泳检测DDR相关蛋白变化量：
提前一天将两种细胞进行铺板接种至六孔板、60mm×15mm和100mm×20mm规格的培养皿，在单层贴壁细胞的密度达到80％-90％时提取蛋白，提取蛋白的时间点分别是细胞受到照射处理之后的0、0.5、4、8、12和24小时；用Bradford法测定蛋白，根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。将离心后的蛋白上清液转移到新的微量离心管中，将5×上样缓冲液按照蛋白体积量的1/4加入管中，涡旋震荡混匀；将离心管中的蛋白用金属浴加热10分钟使蛋白变性，然后放在冰上5分钟，最后置于-20℃保存备用。
配制SDS-PAGE凝胶。根据实验中DDR通路蛋白的分子量，我们使用的是PG112:10％的mini胶和PG113:12.5％的mini胶。将凝固后的胶板从配胶架上拿下，固定在电泳槽内，检查其水密性后，加入新鲜配制的SDS-PAGE电泳缓冲液，随后垂直拔出梳齿板。将蛋白样品提前从-20℃取出融化，涡旋震荡均匀后将其加入到上层胶的胶孔里，设定电泳程序:恒压，80V，30分钟；120V，90分钟。eBlotTML1快速湿转：将0.2μm的PVDF膜浸泡在甲醇中激活，然后在反应盒中加入10ml平衡液，将激活的膜放入B47平衡液中1分钟(蛋白分子量大于200KDa的可以不使用平衡液)。在托盘里注入适量的蒸馏水，放入电泳后的凝胶，使其完全浸润；打开转膜夹，平铺在实验台上，在正极面的塑料框内，依次铺平干净的干海绵、平衡后的PVDF膜、电泳凝胶，并用转印滚子除去膜和胶之间的气泡，在凝胶上平铺另一张干海绵，合上转膜夹，插入转膜仪的一个通道中，按下主屏幕下方的STARTB按键，仪器开始转膜。从通道B取出转膜夹，将凝胶和海绵拿掉，快速把PVDF膜放到5％的脱脂牛奶中，在水平摇床上室温封闭1小时，封闭结束后，将膜用TBS-T溶液清洗三次，每次10分钟。
孵育一抗∶根据抗体说明书，在15ml离心管中，将不同的抗体用一抗稀释液按合适的比例稀释到Western Blot实验所需的浓度，参照蛋白Marker的分子量，在PVDF膜上剪下相应的目的蛋白条段，将其放置在配好的一抗稀释液离心管中，拧紧盖子，放入4℃生化培养箱摇床上，过夜孵育；
清洗一抗∶第二天将PVDF条带从离心管中取出，放到抗体清洗盒中，用TBS-T溶液洗涤三次，每次10分钟。
孵育二抗∶根据抗体的种属(抗鼠/抗兔)，用二抗稀释液将其稀释到合适的浓度(本实验中，二抗的稀释比例为1:5000)，根据实验中所用一抗的种属，将PVDF膜放入到对应的抗体孵育盒中，室温孵育1小时；
清洗二抗∶待二抗孵育结束后，将PVDF条带用TBS-T溶液洗涤三次，每次10分钟。曝光：根据条带数量，取等体积的ECL发光液A液、B液混匀，均匀滴加在PVDF膜的正面，放在GelView 600plus自动成像仪中进行曝光显影，根据条带强弱，合理调整曝光时间以达到理想结果。
所得结果如图8所示，结果发现，在HCT116细胞的sg-ctrl组中，照射可以明显激活DDR蛋白激酶ATR、ATM和DNA-PKcs；而且其下游通路的一些效应分子如Chk1、Chk2、KAP1和RPA2等也被激活。但是，当敲除HCT116细胞中的SCARNA2后，p-ATR(S1989)，p-Chk1(Ser345)和p-RPA2(S33)的表达水平受到了显著的抑制，RAD51的表达也有所下降，而ATM、DNA-PKcs及其下游的p-Chk2、p-KAP1不受影响。此外，还检测了SCARNA2敲除细胞中γH2AX的表达水平，发现sg-SCARNA2组γH2AX的表达量显著升高，这就提示敲除SCARNA2加重了肿瘤细胞的DNA损伤程度。当过表达SCARNA2后，ATR、ATM和DNA-PKCS及其下游通路蛋白的磷酸化水平与NC组相比，没有显著性差异。同样，在照后的HT29细胞中也观察到了类似趋势，sh-SCARNA2组细胞中p-ATR、p-Chk1和p-RPA2的表达水平要显著低于sh-ctrl组，在SCARNA2-OE组细胞中则观察到相反的趋势。
实施例9：
(1)细胞培养及细胞转染同实施例1；
(2)选取了DR通路上游激酶DNA蛋白激酶(DNAdependent protein kinase，DNA-PK)的抑制剂(DNAPKi：Nu741，工作浓度10μM)、ATM激酶抑制剂(ATMi：Ku-55933，工作浓度10μM)和ATR激酶抑制剂(ATRi：VE-821，工作浓度10μM)提前处理细胞2h，然后采用不同的DNA损伤刺激：IR(8Gy)或1μMCPT处理1h或100μg/mlETO处理4h后，PBS清洗细胞三次，再加入分别含有抑制剂的新鲜培养基培养细胞。选取处理4h和8h的时间点提取细胞的RNA，通过RNA反转录和RT-PCR检测IR和DNA损伤剂处理细胞，DDR通路抑制剂对SCARNA2表达水平的影响。
所得结果如图9所示，当HCT116细胞与ATMi、ATRi和DNAPki共同孵育后，与单纯照射组相比，在4h时，ATMi使SCARNA2转录水平降低(1.88±0.05vs 1.60±0.03，p<0.01)，ATRi和DNAPKi对SCARNA2转录水平不产生抑制作用。在8h时ATMi、ATRi和DNAPKi均使SCARNA2转录水平降低，其中ATMi的抑制作用最明显(3.39±0.10vs2.22±0.61，p<0.001)。对于HT29细胞)，SCARNA2转录水平与在HCT116细胞中具有相同的表达趋势，与照射组相比，在4h和8h，ATMi分别使SCARNA2转录水平显著下降了50％左右。表明由IR诱导的SCARNA2的转录可能受ATM和ATR蛋白激酶的调控。
其中，照射条件：辐射中心(海军军医大学，中国上海)的60Coγ射线照射。以8Gy的γ射线照射剂量率1Gy/min处理细胞。
统计学处理：上述实施例的所有实验均重复3次以上，结果采用
表示。采用SAS统计软件对相关数据进行t检验，以P<0.05为有显著性差异。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (9)
1.抑制或下调SCARNA2表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，抑制或下调SCARNA2基因表达的试剂是通过shRNA敲低SCARNA2基因表达的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述通过shRNA敲低SCARNA2基因表达的试剂包括含有shRNA的重组表达载体或转染细胞。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制或下调SCARNA2基因表达的试剂是靶向SCARNA2基因的重组慢病毒质粒。
5.根据权利要求2所述的应用，所述shRNA包括正义链和反义链，正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤放疗增敏药物为促进肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞G2期细胞阻滞、促进照射对肿瘤细胞的DNA损伤或提高肿瘤细胞对放射治疗敏感性的药物。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为结直肠癌、肝癌或肺癌。
8.一种抑制或下调SCARNA2表达的重组表达载体，其特征在于：该重组表达载体中包含抑制SCARNA2表达的shRNA，该shRNA包括正义链和反义链，所述正义链的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
9.一种肿瘤放疗增敏药物组合物，其特征在于，包含活性组分以及药学上可接受的载体，所述活性组分包括抑制SCARNA2表达的shRNA，或包含该shRNA的重组表达载体或转基因细胞系，该shRNA包括正义链和反义链，正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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