CN111450262A - 抑制或下调gtse1基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用 - Google Patents
抑制或下调gtse1基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111450262A CN111450262A CN202010118757.6A CN202010118757A CN111450262A CN 111450262 A CN111450262 A CN 111450262A CN 202010118757 A CN202010118757 A CN 202010118757A CN 111450262 A CN111450262 A CN 111450262A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gtse1
- inhibiting
- cells
- expression
- lung cancer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 101150052459 GTSE1 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 101100338062 Homo sapiens GTSE1 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 23
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 title claims description 14
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 title claims description 14
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 title claims description 12
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims abstract description 34
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims abstract description 34
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 34
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims description 5
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000637 radiosensitizating effect Effects 0.000 claims 1
- 101001026457 Homo sapiens G2 and S phase-expressed protein 1 Proteins 0.000 abstract description 33
- 102100037488 G2 and S phase-expressed protein 1 Human genes 0.000 abstract description 32
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 12
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 abstract description 9
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 abstract description 9
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 abstract description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 8
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 abstract description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 102
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 13
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 3
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 3
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 3
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 3
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010040476 FITC-annexin A5 Proteins 0.000 description 2
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 2
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 230000010337 G2 phase Effects 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 101000859758 Homo sapiens Cartilage-associated protein Proteins 0.000 description 1
- 101000916686 Homo sapiens Cytohesin-interacting protein Proteins 0.000 description 1
- 101000726740 Homo sapiens Homeobox protein cut-like 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000761460 Homo sapiens Protein CASP Proteins 0.000 description 1
- 102000010638 Kinesin Human genes 0.000 description 1
- 108010063296 Kinesin Proteins 0.000 description 1
- 102100023424 Kinesin-like protein KIF2C Human genes 0.000 description 1
- 101710134369 Kinesin-like protein KIF2C Proteins 0.000 description 1
- 206010023774 Large cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 101000761459 Mesocricetus auratus Calcium-dependent serine proteinase Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100024933 Protein CASP Human genes 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000702263 Reovirus sp. Species 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 102000015098 Tumor Suppressor Protein p53 Human genes 0.000 description 1
- 108010078814 Tumor Suppressor Protein p53 Proteins 0.000 description 1
- 206010064390 Tumour invasion Diseases 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000011360 adjunctive therapy Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- 208000002458 carcinoid tumor Diseases 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000005251 gamma ray Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- -1 lipid compound Chemical class 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000009546 lung large cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000002638 palliative care Methods 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011249 preoperative chemoradiotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明涉及生物医药工程技术领域，提供了抑制或下调GTSE1基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用，尤其在制备肺癌放疗增敏药物中的用途。通过实验证实，GTSE1敲低促进了照射对肺癌细胞的DNA损伤，显著增加了三种肺癌细胞的辐射敏感性，并且随着照射剂量的增加，显著增加照后三种肺癌细胞凋亡率，其细胞存活率明显低于正常肺癌细胞组。因此，本发明为提高放射治疗的敏感性提供了新的探索，有助于提高恶性肿瘤的放射敏感性，具备一定的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及抑制或下调GTSE1基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用、包含其的载体和药物。
背景技术
肺癌是全球患病率及致死率最高的恶性肿瘤，在中国及其他发展中国家占比达30—40％。近40年来，中国肺癌发病率逐年增高，2015年我国肺癌发病例数已约达78.1万例，居我国国民恶性肿瘤发病率首位。肺癌起病隐匿，恶性程度高，患者五年生存率极低，已成为严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一。根据世界卫生组织的数据，肺癌目前是全世界癌症死因的第一名，约占全部恶性肿瘤的19％。全世界每年的新增病例超过120万。在男性肿瘤死因中已居首位，在女性中仅次于乳腺癌居第二位。目前肺癌的主要治疗手段包括手术治疗、放射治疗、化学治疗及靶向治疗。其中，放射治疗是肺癌重要的局部治疗手段。根据放疗的出发点不同，放疗可分为根治性放疗，同步放化疗，姑息性放疗，术前和术后放疗。其中，对于不能耐受或者拒绝手术的早期肺癌患者，放疗是有效的局部治疗手段；对于接受了手术的患者，放疗是重要的辅助治疗手段；对于晚期患者，放疗是重要的姑息治疗手段。但随着放疗方案的实施，肿瘤细胞本身对电离辐射的耐受性逐渐增加，治疗效果很快出现瓶颈，多数患者均会出现不同程度的辐射抵抗，最终导致放疗失败。肿瘤对辐射不敏感或对辐射产生抗拒性，是放射治疗难以根治恶性肿瘤的主要原因之一。
G2/S期应答相关蛋白1(GTSE1)是由人类gtse1基因编码的细胞周期相关蛋白，基因定位于22q13.2-q13.3，编码蛋白由741个氨基酸组成，全长76645Da。该蛋白仅在细胞周期的S和G2期特异性表达，主要分布于细胞质并结合于微管，主要功能是抑制细胞周期G2期向M期转换。在多种DNA损伤刺激因素下，该蛋白还可以穿过核膜积聚在细胞核中，调控肿瘤抑制蛋白p53诱导的细胞凋亡。此外，作为有丝分裂调节因子，GTSE1可以通过抑制微管解聚酶-有丝分裂着丝粒相关驱动蛋白(mitotic centromere-associated kinesin,MCAK)活性调节有丝分裂期间微管稳定性。
目前发现GTSE1在多种肿瘤中高表达，与肿瘤的侵袭和迁移密切相关。肿瘤细胞对多种化疗药物的耐受均与GTSE1的异常高表达有关。但肿瘤细胞对化疗耐受是否也与GTSE1的异常高表达有关并未可知，因此抑制或下调GTSE1基因在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用国内外至今无人报道。
发明内容
本发明的目的在于，对GTSE1的异常高表达与肿瘤细胞对化疗耐受之间关系进行研究，提供GTSE1基因抑制剂的新用途，并提供了一种肿瘤放疗增敏药物组合物。
本发明的第一方面，提供了一种抑制或下调GTSE1基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。
所述的抑制或下调GTSE1基因表达的试剂为任何能够降低GTSE1基因的稳定性、能够抑制或下调GTSE1的表达或抑制GTSE1基因的转录加工活性的物质，包括但不限于：特异性干扰GTSE1基因表达、加工的小干扰分子，如shRNA分子、siRNA分子、反义核苷酸等；GTSE1的拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。优选特异性干扰GTSE1基因表达的干扰RNA分子、短发夹RNA或反义核苷酸，更优选结构简单的干扰RNA分子，该干扰RNA分子可通过购买途径获取。
本发明以肺癌细胞A549、H460和H1299为例进行研究，通过RNA干扰(RNAi)沉默GTSE1基因研究其对肺癌细胞的影响。
研究发现，GTSE1siRNA可以有效抑制肺癌细胞中高度表达的GTSE1蛋白(图1)；GTSE1敲低显著增加了三种肺癌细胞的辐射敏感性(P<0.05)，随着照射剂量的增加，转染GTSE1siRNA 72h的A549、H460、H1299细胞的细胞存活率明显低于正常肺癌细胞组(图2)；细胞凋亡结果显示GTSE1敲低可显著增加照后三种肺癌细胞凋亡率(P<0.05)(图3)。
进一步，对转染GTSE1siRNA的A549、H460和H1299细胞进行GTSE1过表达，发现重新过表达GTSE1的非小细胞肺癌细胞系辐射敏感性显著降低(P<0.05)(图4)。最后，采用彗星电泳检测DNA损伤变化，证实敲低GTSE1基因促进了照射对A549细胞的DNA损伤。
因此，本发明着重提供了抑制或下调GTSE1基因表达的试剂在制备肺癌放疗增敏药物中的应用。
本发明的第二方面，提供了GTSE1基因抑制剂重组载体及其在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。
该重组载体包括表达载体以及插入设置在该表达载体上的特异性干扰GTSE1基因表达的干扰RNA、短发夹RNA或反义核苷酸。
所述的表达载体包括病毒载体和非病毒载体。
所述的“病毒载体”，包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、柯萨奇病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、细小病毒、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、痘苗病毒与水疱性口炎病毒等。合适的病毒载体是本领域普通技术人员所熟知的。
所述的“非病毒载体”，包括脂质体或脂类复合物、阳离子多聚物、壳聚糖聚合物及纳米粒子载体等。合适的非病毒载体是本领域普通技术人员所熟知的。
本发明的第三方面，提供了肿瘤放疗增敏药物组合物，该肿瘤放疗增敏药物组合物包括活性组分以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。其中，所述活性组分为前述的抑制或下调GTSE1基因表达的试剂或GTSE1基因抑制剂重组载体。
本发明的抑制或下调GTSE1基因表达的试剂不仅仅能够提高肺癌细胞的放疗增敏性，也可以提高其他肿瘤细胞的放疗增敏性，如乳腺癌、肝癌、肠胃类癌、前列腺癌等的细胞放疗增敏性。
本发明的有益保障及效果：
本发明提供了抑制或下调GTSE1基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用，尤其在制备肺癌放疗增敏药物中的用途。通过实验证实，GTSE1敲低促进了照射对肺癌细胞的DNA损伤，显著增加了三种肺癌细胞的辐射敏感性，并且随着照射剂量的增加，显著增加照后三种肺癌细胞凋亡率，其细胞存活率明显低于正常肺癌细胞组。因此，本发明为提高放射治疗的敏感性提供了新的探索，有助于提高恶性肿瘤的放射敏感性，具备一定的临床应用前景。
附图说明
图1为实施例二中转染GTSE1siRNA、NC质粒的A549、H460、H1299细胞和正常A549、H460、H1299细胞中GTSE1蛋白的表达情况；
图2为实施例三中正常A549、H460、H1299细胞和转染GTSE1siRNA的A549、H460、H1299细胞照后生长和增殖的改变；
图3为实施例四中正常A549、H460、H1299细胞和转染GTSE1siRNA的A549、H460、H1299细胞照后的凋亡变化；
图4为实施例五中转染GTSE1siRNA后过表达GTSE1质粒的A549、H460、H1299细胞中GTSE1蛋白的表达情况；转染GTSE1siRNA的A549、H460、H1299细胞和转染GTSE1siRNA后过表达GTSE1质粒的A549、H460、H1299细胞照后生长和增殖的改变；
图5为实施例六中正常A549细胞和转染GTSE1siRNA的A549细胞照后DNA损伤变化。
具体实施方式
以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如PCR方法，那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiais，T.(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press。
除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明，具体实施方式文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
下述实施例中所需的材料和试剂如下：
细胞株和细胞培养：将人肺泡II型上皮癌细胞A549(美国细胞收藏中心)、人大细胞肺癌细胞H460、人非小细胞肺癌细胞H1299在含有10％胎牛血清的DMEM培养基于37℃、5％CO2培养箱中培养。
药物与主要试剂：药DMEM培养基、胎牛血清、胰酶购自Gibco公司；Annexin V-FITC及PI购自Invitrogen公司。结晶紫、标准蛋白质分子量、SDS-PAGE上样缓冲液、RIPA蛋白裂解液、TE电泳缓冲液、10×转膜液、30％Acry-Bis、Tris-HCl、过硫酸铵(AP)、SDS、四甲基乙二胺(TEMED)、碘化丙啶(PI)购自江苏碧云天生物技术研究所；二甲基亚砜(DMSO)、琼脂糖和Tween-20来自上海高科技生物工程有限公司；抗GTSE1、GAPDH抗体购自CST。
实施例1、GTSE1siRNA转染
将GTSE1的siRNA转染入肺癌细胞A549、H460、H1299中，以转染A549细胞为例，细胞转染过程如下：
(1)细胞培养：将A549细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中；将其细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每2-3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。
(2)细胞转染：转染前一天，将细胞用胰酶消化、计数，以合适的密度接种6孔板，置于CO2培养箱中培养过夜，使转染当日细胞融合度为70％～90％。铺板和转染期间避免使用抗生素。
转染溶液配制：质粒：Lipofectamine3000用量比为1μg/孔：1.5μl/孔。向每孔中加入500ngDNA及5μLP3000，而后加入250μL Opti-MEM培养基混匀，室温静置5min，备用；向每孔中加入3.75μL Lipofectamine 3000以及250μL Opti-MEM培养基混匀，室温静置5min，备用。将稀释的DNA同稀释的脂质体试剂混合，在室温保温20min后，加入待转染的A549细胞中，5％CO2、37℃培养；24h后，弃去含转染试剂的培养液，加入新鲜的完全培养基，继续培养后，72小时内完成瞬时转染。
(3)转染72小时后提取蛋白，进行Western blot电泳。
实验结果如图1所示，GTSE1siRNA转染入A549、H460、H1299细胞后成功抑制了GTSE1蛋白的表达。
实施例2、GTSE1siRNA增强肺癌细胞辐照敏感性
(1)细胞培养及细胞转染方法同实施例一；
(2)细胞克隆形成方法：
取处于对数生长期的肺癌A549、H460、H1299细胞及转染GTSE1siRNA 72h的A549、H460、H1299细胞，并按不同照射剂量要求接种不同数量的细胞到六孔板中(0,2,4,8Gy剂量接种细胞数量分别为200、400、800和1600个)。
三组细胞同时接受不同剂量(0-8Gy)的γ-射线照射，照后继续培养直至培养皿中出现明显肉眼可见的细胞克隆时终止培养。弃培养基，PBS洗两次，并采用无水甲醇固定30分钟，Gimsa染液染色30分钟，流水冲洗后晾干后进行计数，计算出细胞存活率。
结果如图2所示，随着照射剂量的增加，转染GTSE1siRNA 72h的A549、H460、H1299细胞的细胞存活率明显低于正常A549、H460、H1299细胞组。
实施例3、GTSE1siRNA促进肺癌细胞凋亡
(1)细胞培养及细胞转染同实施例一；
(2)流式细胞仪检测细胞凋亡法：取处于对数生长期的A549、H460、H1299细胞和转染GTSE1siRNA 72h的A549、H460、H1299细胞，分别以1×105/mL的浓度接种至六孔板中，给予各组细胞8Gy的60Coγ射线照射，然后继续培养24h后，使用不含EDTA的胰酶消化细胞，1500转离心5分钟后PBS洗三遍，采用Annexin V-FITC及PI双染后通过流式细胞仪检测细胞凋亡。
结果如图3所示，转染GTSE1siRNA 72h的A549、H460、H1299细胞的凋亡率照后明显高于正常A549、H460、H1299细胞组。
实施例4、重新过表达GTSE1的非小细胞肺癌细胞系辐射敏感性显著降低
(1)细胞培养及细胞转染同实施例一；
(2)取处于对数生长期的转染GTSE1siRNA 72h的A549、H460、H1299细胞和转染GTSE1siRNA并过表达GTSE1质粒的A549、H460、H1299细胞，并提取蛋白进行Western blot电泳。
结果如图4A所示，GTSE1质粒转染入GTSE1敲低的A549、H460、H1299细胞后成功过表达GTSE1蛋白。
(3)细胞克隆形成方法：取处于对数生长期的转染GTSE1siRNA 72h的A549、H460、H1299细胞和转染GTSE1siRNA并过表达GTSE1质粒的A549、H460、H1299细胞，并按不同照射剂量要求接种不同数量的细胞到六孔板中(0,2,4,8Gy剂量接种细胞数量分别为200,400,800和1600个)。各组细胞同时接受不同剂量(0-8Gy)的γ-射线照射，照后继续培养直至培养皿中出现明显肉眼可见的细胞克隆时终止培养。弃培养基，PBS洗两次，并采用无水甲醇固定30分钟，Gimsa染液染色30分钟，流水冲洗后晾干后进行计数，计算出细胞存活率。
结果如图4B所示，重新过表达GTSE1的非小细胞肺癌细胞系辐射敏感性显著降低(P<0.05)。
实施例5、敲低GTSE1促进照射对A549细胞的DNA损伤
(1)细胞培养及细胞转染同实施例一；
(2)彗星电泳检测DNA损伤变化：将A549细胞以1×105个/mL密度接种于六孔板，加2mL DMEM培养基培养；将清洁的载玻片浸入熔融的1％高熔点琼脂糖中并立即擦拭来制备彗星电泳预涂片。第二天给予A549细胞8Gy的60Coγ射线照射，分别在0h、4h及8h用胰酶进行消化，1000rpm离心5min；用PBS液洗一遍，弃上液；用无Ca 2+、Mg 2+的PBS将单细胞悬浮液的浓度调节至2×104个细胞/ml，然后将0.4ml的溶液浸入1.2ml的0.65％低熔点琼脂糖中，40℃水浴。将1.2ml细胞悬浮液混合并快速移液到预涂片的表面上并铺均匀；晾干后将玻片轻轻浸于新鲜配置并预冷的细胞裂解液中，4℃避光裂解1小时。从裂解液中取出玻片，用电泳液淋洗5秒后移入水平电泳槽，倒满电泳液，25V电泳30分钟。电泳后取出玻片，用双蒸水轻轻清洗。用PI(10μg/ml)染色20分钟，然后用双蒸水轻轻冲洗。最后，通过荧光显微镜(Olympus BX60)在10x目标下观察所有凝胶。使用CASP 1.2.3b2(CASPlab，Wroclaw，Poland)进行分析。
结果如图5A～C所示，照后A549细胞的尾矩及尾相均有增加，但是敲低GTSE1组与对照组有明显差异。说明敲低GTSE1促进了照射对A549细胞的DNA损伤。
上述实施例中所采用的照射条件为：军事科学院的60Coγ射线照射，以8Gy的γ射线照射剂量率1Gy/min处理细胞。
统计学处理：上述实施例的所有实验均重复3次以上，结果采用±S表示。采用SAS统计软件对相关数据进行t检验，以P<0.05为有显著性差异。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (7)
1.抑制或下调GTSE1基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的抑制或下调GTSE1基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用，其特征在于：
其中，所述应用为抑制或下调GTSE1基因表达的试剂在促进射线照射对肿瘤细胞DNA损伤中的用途。
3.根据权利要求1或2所述的抑制或下调GTSE1基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用，其特征在于：
其中，所述肿瘤为肺癌。
4.根据权利要求1或2所述的抑制或下调GTSE1基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用，其特征在于：
其中，所述抑制或下调GTSE1基因表达的试剂为特异性干扰GTSE1基因表达的干扰RNA、短发夹RNA或反义核苷酸。
5.抑制或下调GTSE1基因表达的试剂在制备肺癌放疗增敏药物中的应用。
6.一种GTSE1基因抑制剂重组载体，其特征在于，所述重组载体包括表达载体以及插入设置在该表达载体上的特异性干扰GTSE1基因表达的干扰RNA、短发夹RNA或反义核苷酸。
7.一种肿瘤放疗增敏药物组合物，其特征在于，该肿瘤放疗增敏药物组合物包括活性组分以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂，
其中，所述活性组分为权利要求1～4任一项所述的抑制或下调GTSE1基因表达的试剂或权利要求6所述的GTSE1基因抑制剂重组载体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010118757.6A CN111450262A (zh) | 2020-02-26 | 2020-02-26 | 抑制或下调gtse1基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010118757.6A CN111450262A (zh) | 2020-02-26 | 2020-02-26 | 抑制或下调gtse1基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111450262A true CN111450262A (zh) | 2020-07-28 |
Family
ID=71670983
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010118757.6A Pending CN111450262A (zh) | 2020-02-26 | 2020-02-26 | 抑制或下调gtse1基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111450262A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112143811A (zh) * | 2020-10-12 | 2020-12-29 | 中国科学院近代物理研究所 | Mdm2蛋白作为生物标志物在预测非小细胞肺癌患者重离子放疗的疗效中的应用 |
| CN112999238A (zh) * | 2021-03-30 | 2021-06-22 | 苏州大学 | Linc00167在制备抑制肿瘤血管生成药物中的应用 |
| CN114699394A (zh) * | 2022-05-24 | 2022-07-05 | 中山大学附属第一医院 | 用于肝癌放疗增敏的药物组合物及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1882702A (zh) * | 2003-09-22 | 2006-12-20 | 罗斯塔英法美蒂克斯有限责任公司 | 用rna干扰进行的协同致死筛选 |
| US20090023149A1 (en) * | 2005-12-01 | 2009-01-22 | Steen Knudsen | Methods, kits and devices for identifying biomarkers of treatment response and use thereof to predict treatment efficacy |
| JP2019149987A (ja) * | 2018-03-05 | 2019-09-12 | 学校法人 埼玉医科大学 | 頭頸部扁平上皮癌に対する放射線療法の有効性を予測する方法 |
-
2020
- 2020-02-26 CN CN202010118757.6A patent/CN111450262A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1882702A (zh) * | 2003-09-22 | 2006-12-20 | 罗斯塔英法美蒂克斯有限责任公司 | 用rna干扰进行的协同致死筛选 |
| US20090023149A1 (en) * | 2005-12-01 | 2009-01-22 | Steen Knudsen | Methods, kits and devices for identifying biomarkers of treatment response and use thereof to predict treatment efficacy |
| JP2019149987A (ja) * | 2018-03-05 | 2019-09-12 | 学校法人 埼玉医科大学 | 頭頸部扁平上皮癌に対する放射線療法の有効性を予測する方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| M. MONTE等: "Cloning, chromosome mapping and functional characterization of a human homologue of murine Gtse-1 (B99) gene", 《GENE》 * |
| MARTIN MONTE等: "The Cell Cycle-regulated Protein Human GTSE-1 Controls DNA Damage-induced Apoptosis by Affecting p53 Function", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 * |
| SU JIN CHOI等: "Alteration of DNA Methylation in Gastric Cancer with Chemotherapy", 《J. MICROBIOL. BIOTECHNOL.》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112143811A (zh) * | 2020-10-12 | 2020-12-29 | 中国科学院近代物理研究所 | Mdm2蛋白作为生物标志物在预测非小细胞肺癌患者重离子放疗的疗效中的应用 |
| CN112143811B (zh) * | 2020-10-12 | 2024-03-08 | 中国科学院近代物理研究所 | Mdm2蛋白作为生物标志物在预测非小细胞肺癌患者重离子放疗的疗效中的应用 |
| CN112999238A (zh) * | 2021-03-30 | 2021-06-22 | 苏州大学 | Linc00167在制备抑制肿瘤血管生成药物中的应用 |
| CN112999238B (zh) * | 2021-03-30 | 2022-03-29 | 苏州大学 | Linc00167在制备抑制肿瘤血管生成药物中的应用 |
| CN114699394A (zh) * | 2022-05-24 | 2022-07-05 | 中山大学附属第一医院 | 用于肝癌放疗增敏的药物组合物及其应用 |
| CN114699394B (zh) * | 2022-05-24 | 2022-09-13 | 中山大学附属第一医院 | 用于肝癌放疗增敏的药物组合物及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111450262A (zh) | 抑制或下调gtse1基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用 | |
| Zhang et al. | MiR-30a regulates the proliferation, migration, and invasion of human osteosarcoma by targeting Runx2 | |
| Wu et al. | Suppression of long noncoding RNA MALAT1 inhibits the development of uveal melanoma via microRNA-608-mediated inhibition of HOXC4 | |
| CN113491772B (zh) | P4hb抑制剂在治疗或预防肿瘤恶病质中的用途 | |
| Xu et al. | Receptor for activated C kinase 1 promotes cervical cancer lymph node metastasis via the glycolysis‑dependent AKT/mTOR signaling | |
| Guigni et al. | Effects of conditioned media from murine lung cancer cells and human tumor cells on cultured myotubes | |
| Huang et al. | The study on expression of CIAPIN1 interfering hepatocellular carcinoma cell proliferation and its mechanisms. | |
| CN108464987B (zh) | 抑制或下调akap12基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用 | |
| Guo et al. | Deletion of miR-15a inhibited glioma development via targeting Smad7 and inhibiting EMT pathway | |
| CN112402627A (zh) | 一种PIWI蛋白相互作用RNA piR-hsa-211106的用途 | |
| CN115944736A (zh) | 抑制或下调scarna2表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用 | |
| Xue et al. | Roles of circ-CSPP1 on the proliferation and metastasis of glioma cancer. | |
| CN102028957A (zh) | Btg2基因制备放疗增敏药物的应用 | |
| Zhang et al. | CircHIPK2 promotes proliferation of nasopharyngeal carcinoma by down-regulating HIPK2 | |
| CN112410429B (zh) | Fxyd3作为胃癌诊断标志物和治疗靶标的应用 | |
| Cao et al. | Asparaginyl endopeptidase (AEP) regulates myocardial apoptosis in response to radiation exposure via alterations in NRF2 activation | |
| CN114703190A (zh) | 一种靶向抑制KIAA1429基因表达的ShRNA在慢性髓细胞白血病中的应用 | |
| CN108949974B (zh) | E3泛素连接酶asb3在制备肝癌治疗药物中的应用 | |
| Wei et al. | MicroRNA-30a-3p inhibits malignant progression of hepatocellular carcinoma through regulating IGF1. | |
| Zhang et al. | miR‐657 Targets SRCIN1 via the Slug Pathway to Promote NSCLC Tumor Growth and EMT Induction | |
| Fu et al. | Induction function of siRNA-mediated survivin gene silencing on nasopharyngeal carcinoma cell apoptosis | |
| CN111184865B (zh) | Stat1在耐紫杉醇上皮性卵巢癌治疗中的用途 | |
| Wang et al. | HuR induces inflammatory responses in HUVECs and murine sepsis via binding to HMGB1 | |
| US20230250425A1 (en) | USE OF PIWI-INTERACTING RNA piR-hsa-211106 | |
| CN115814092B (zh) | 与急性t淋巴细胞白血病治疗相关的靶点cd28及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200728 |