CN111184865B - Stat1在耐紫杉醇上皮性卵巢癌治疗中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体地说，是STAT1在耐紫杉醇上皮性卵巢癌治疗中的用途。本发明构建了单克隆耐紫杉醇上皮性卵巢癌细胞株并通过转染siRNA构建了STAT1功能缺失模型，发现在STAT1表达降低后，细胞中肿瘤干细胞相关标志物的表达水平上升，提示STAT1与干性之间有负调控关系；通过转染STAT1过表达质粒构建了STAT1功能获得模型，发现在STAT1表达上升后，细胞中肿瘤干细胞相关标志物表达水平下降，且细胞的成球能力降低，说明过表达STAT1可以抑制耐药细胞的干性。且细胞的集落形成能力和增殖生长能力也下降，说明过表达STAT1可以抑制耐紫杉醇的上皮性卵巢癌细胞的生长和增殖。

Description

STAT1在耐紫杉醇上皮性卵巢癌治疗中的用途

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体地说，是STAT1在耐紫杉醇上皮性卵巢癌治疗中的用途。

背景技术

卵巢癌的发病率位列女性生殖系统恶性肿瘤的第三位，同时也是致死率最高的妇科肿瘤。卵巢癌中最常见的病理类型是上皮性卵巢癌，目前标准一线治疗为肿瘤减灭术后辅以铂类联合紫杉醇化疗方案。

患者在治疗初期可以获得较为明显的效果，初次治疗的缓解率高，但大多数患者在完全缓解两年左右复发，复发率高达80％。复发性上皮卵巢癌几乎对所有化疗药物耐药，这极大地限制了化疗临床疗效和应用范围，也是卵巢癌治疗失败的主要原因。有研究显示，上皮性卵巢癌的复发和耐药形成和肿瘤干细胞的存在相关。因此，对于耐药的上皮性卵巢癌，针对肿瘤干细胞的治疗或可成为一种有效的方法，但是其具体的临床应用尚无报道。

本发明目的在于寻找与肿瘤干细胞及耐药相关的新型上皮性卵巢癌标志物，从而提高该疾病的治疗效果与患者预后。

STAT1是信号转导与转录激活子(Signal Transducer and Activator ofTranscription，STAT)家族的成员之一，是细胞因子/生长因子信号转导中重要的胞质转录因子，主要受干扰素的激活，细胞因子可促进STAT1酪氨酸及丝氨酸位点的磷酸化，入核后形成同/异二聚体激活下游基因的表达。STAT1有两个亚型，包括全长STAT1α(含磷酸化位点Tyr 701和Ser 727)(有C-末端反式激活区)和剪辑变体STAT1β(不含磷酸化位点Ser 727)。STAT1可参与调节免疫系统、细胞分化、肿瘤、细胞生长以及细胞凋亡等生理过程，在多种肿瘤中发挥抑制作用，也有报道STAT1在肿瘤中发挥促进作用。

但是关于本发明STAT1在作为耐紫杉醇上皮性卵巢癌治疗中的用途目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种STAT1的新用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

STA1的促进剂在制备治疗耐紫杉醇的上皮性卵巢癌的药物中的应用。

STA1的促进剂在制备抑制耐紫杉醇的上皮性卵巢癌细胞的增值、迁移、侵袭和/或成球能力的试剂中的应用。

STA1的促进剂在制备降低耐紫杉醇的上皮性卵巢癌的标志物表达的试剂中的应用。

优选地，所述的标志物为CD44、CD133、NANOG、OCT4。

优选地，所述的促进剂选自以STAT1α或STAT1β蛋白或它们的转录本为靶序列、且能够促进其蛋白表达或基因转录的小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；或能表达或形成所述小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

优选地，所述的小干扰RNA序列是：正义链：GCGUAAUCUUCAGGAUAAUtt(SEQ ID NO:1)；反义链：AUUAUCCUGAAGAUUACGCtt(SEQ ID NO:2)。

本发明优点在于：

1、本发明通过构建单克隆耐紫杉醇上皮性卵巢癌细胞株并通过转染siRNA构建了STAT1功能缺失模型，发现在STAT1表达降低后，细胞中肿瘤干细胞相关标志物的表达水平上升，提示STAT1与干性之间有负调控关系；通过转染STAT1过表达质粒构建了STAT1功能获得模型，发现在STAT1表达上升后，细胞中肿瘤干细胞相关标志物表达水平下降，且细胞的成球能力降低，说明过表达STAT1可以抑制耐药细胞的干性。且细胞的集落形成能力和增殖生长能力也下降，说明过表达STAT1可以抑制耐紫杉醇的上皮性卵巢癌细胞的生长和增殖，为紫杉醇耐药患者的靶向治疗提供了新的治疗方案。

2、切入点贴近临床：本发明的目的明确，旨在在解决临床上上皮性卵巢癌治疗的实际问题，从目前治疗手段的不足之处出发，发明了一种全新的潜在治疗手段，有朝一日投入临床实践，可有针对性的改善现状，从而使广大患者受益。

3、指导理念新颖：本发明结合了国内外最新最先进的基础研究成果，提出了富有创造性的假说，并在充分实验的基础上，证明了假说的实际可操作性，减轻了该类患者的压力，可很好的应用于临床，具有很好的应用前景。

附图说明

附图1是在构建成功的单克隆耐紫杉醇上皮性卵巢癌细胞株中，通过转染siRNA构建了STAT1功能缺失模型，发现在STAT1表达降低后，细胞中肿瘤干细胞相关标志物(CD44、CD133、NANOG、OCT4)的表达水平有所上升，提示STAT1与干性之间具有负调控关系。

附图2是通过转染STAT1过表达质粒构建了STAT1功能获得模型，发现在STAT1表达上升后，细胞中前述肿瘤干细胞相关标志物的表达水平有所下降，并发现细胞的成球能力降低，提示其干性降低，说明过表达STAT1可以抑制耐药细胞的干性。另外这些细胞的集落形成能力和增殖生长能力也出现下降，说明过表达STAT1可以抑制耐紫杉醇的上皮性卵巢癌细胞的生长和增殖。

附图3是STAT1过表达质粒载体结构。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1构建单克隆耐紫杉醇上皮性卵巢癌细胞株

构建方法：

准备人上皮性卵巢癌细胞株OVCAR-3(美国，美国模式培养物集存库)、紫杉醇(中国，四川太极制药有限公司)。OVCAR-3细胞株对紫杉醇敏感，耐紫杉醇上皮性卵巢癌细胞株构建自OVCAR-3细胞株，方法如下：

(1)将OVCAR-3细胞以30％的密度接种T25培养瓶中，使用含10％胎牛血清(美国，Gibco公司)的RPMI-1640(美国，Sigma公司)完全培养基进行培养。24小时后弃去培养基，用磷酸盐缓冲液冲洗后，换入含有0.01μM紫杉醇的完全培养基，继续培养24小时。随后弃去培养基，用磷酸盐缓冲液冲洗后，换入无紫杉醇的完全培养基培养3～5天后，再换为含有0.01μM紫杉醇的完全培养基培养24小时。重复上述步骤直到细胞密度达到90％。

(2)将上述细胞传代至新的细胞培养瓶，按照(1)中操作，依次使用0.01，0.1，0.5和5μM的紫杉醇浓度，不断进行干预，直到最终细胞生长状态及形状稳定，从而得到耐紫杉醇上皮性卵巢癌细胞株。

(3)在此基础上，使用流式分选技术，从该耐紫杉醇上皮性卵巢癌细胞株中分选并培养出具有稳定耐药表型的单克隆株，即为单克隆耐紫杉醇上皮性卵巢癌细胞株。

实施例2构建STAT1功能缺失模型

1实验方法

1.1细胞培养

所用未做特殊强调的细胞使用RPMI-1640培养基并添加10％胎牛血清，在培养板或培养瓶中进行培养。

1.2转染siRNA

合成好的siRNA(由上海吉玛公司合成)以干粉形式运输。用一定体积的无菌DEPC水(附送)溶解干粉，配置成20μM的溶液。siRNA序列见表1：

表1

准备生长状态良好的待处理细胞，当细胞达到合适密度时进行转染。首先在每孔中换入2ml的Opti-MEM培养基(美国，Gibco公司)，再根据实验需要配置合适体积的转染复合物，并依次在每孔中滴加转染复合物。对于六孔板每孔，配置方法见表2：

表2

培养箱中静置培养6小时后弃去旧培养基，加入无转染复合物的新培养基再培养48小时后用于进行后续实验。

1.3Western blot

准备预先用SDS抽提完成的细胞蛋白样，在8％的SDS-PAGE凝胶上进行电泳，后使用PVDF膜转膜，使用相应的蛋白抗体(兔抗人STAT1的IgG抗体(美国，CST公司))4℃孵育过夜。次日使用HRP标记的相应二抗(羊抗兔IgG抗体(美国，proteintech公司))常温孵育1h并曝光显影。

实施例3构建STAT1功能获得模型

1实验方法

1.1细胞培养

所用未做特殊强调的细胞使用RPMI-1640培养基并添加10％胎牛血清，在培养板或培养瓶中进行培养。

1.2质粒转染

所用STAT1过表达质粒载体结构如图3所示，由苏州金唯智生物科技有限公司合成，并制备含有该质粒载体的DH5α大肠杆菌。

进行转染实验时，首先复苏含有STAT1过表达质粒的DH5α大肠杆菌，并使用质粒无内毒素质粒小提中量试剂盒(中国，北京天根公司)进行质粒抽提。获得质粒后，配置成500ng/μl备用。

准备生长状态良好的待处理细胞，当细胞达到合适密度时进行转染。首先在每孔中换入2ml的Opti-MEM培养基(美国，Gibco公司)，再根据实验需要配置合适体积的转染复合物，并依次在每孔中滴加转染复合物。对于六孔板每孔，配置方法见表3：

表3

培养箱中静置培养6小时后弃去旧培养基，加入无转染复合物的新培养基再培养48小时后用于进行后续实验。

1.3Western blot

准备预先用SDS抽提完成的细胞蛋白样，在8％的SDS-PAGE凝胶上进行电泳，后使用PVDF膜转膜，使用相应的蛋白抗体(兔抗人STAT1的IgG抗体(美国，CST公司))4℃孵育过夜。次日使用HRP标记的相应二抗(羊抗兔IgG抗体(美国，Proteintech公司))常温孵育1小时并曝光显影。

实施例4分析实验

1实验方法

1.1干细胞成球分析实验

先配置DMEM/F12无血清培养基，并向其中添加20ng/ml表皮生长因子(EGF)、20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、0.4μg/ml B27添加剂(美国，Thermo Fisher公司)、4μg/ml肝素(美国，Sigma公司)。在超低黏附6孔板中每孔添加200ml该培养基。使用该培养基将贴壁细胞消化并使用处理成细胞悬液，计数后，在前述6孔板中每孔加入1000个细胞。置于细胞培养箱中培养11天，并每隔四天补充200μl培养基。

1.2细胞集落形成实验

细胞消化处理成悬液，计数后，按照800个/孔的密度铺于6孔板内，置于培养箱且每个两天更换培养基。第11天时取出6孔板，吸去培养基并用PBS缓冲液冲洗数遍，后用4％的多聚甲醛固定30分钟。吸去多聚甲醛并用PBS冲洗数遍后，用结晶紫染料染色15分钟。吸去结晶紫染料，PBS冲洗数遍直到洗净游离染料，后观察并拍照。

1.3细胞增殖实验

使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒。取96孔板，每孔加入200μl培养基，并将细胞按照3000个/孔的密度铺于板中，培养24小时后进行过表达质粒转染。所用载体同见图3。使用质粒无内毒素质粒小提中量试剂盒(中国，北京天根公司)从含有STAT1过表达质粒的DH5α大肠杆菌中进行质粒抽提。获得质粒后，配置成500ng/μl备用。准备生长状态良好的待处理细胞，当细胞达到合适密度时进行转染。首先在每孔中换入2ml的Opti-MEM培养基(美国，Gibco公司)，再根据实验需要配置合适体积的转染复合物，并依次在每孔中滴加转染复合物。对于六孔板每孔，配置方法见表3。

培养箱中静置培养6小时后弃去旧培养基，加入无转染复合物的新培养基。换液后继续培养24小时、48小时、72小时、96小时，并在各时间点按照说明书指示，使用CCK-8试剂盒测量细胞生长情况，得到读数，统计分析结果。

2结果

2.1我们在构建成功的单克隆耐紫杉醇上皮性卵巢癌细胞株中，通过转染siRNA构建了STAT1功能缺失模型，发现在STAT1表达降低后，细胞中肿瘤干细胞相关标志物(CD44、CD133、NANOG、OCT4)的表达水平有所上升(图1)，提示STAT1与干性之间具有负调控关系。

2.2通过转染STAT1过表达质粒构建了STAT1功能获得模型，发现在STAT1表达上升后，细胞中前述肿瘤干细胞相关标志物的表达水平有所下降，并发现细胞的成球能力降低，提示其干性降低(图2)，说明过表达STAT1可以抑制耐药细胞的干性。

2.3另外这些细胞的集落形成能力和增殖生长能力也出现下降(图2)，说明过表达STAT1可以抑制耐紫杉醇的上皮性卵巢癌细胞的生长和增殖。

3结论

从以上结果可以看出，STAT1可以抑制耐紫杉醇的上皮性卵巢癌中肿瘤干细胞特性相关的标志物表达，并可通过抑制肿瘤细胞的干性，降低其生长增殖能力，从而减少复发。针对STAT1设计靶向治疗，可改善患者预后。另一方面，STAT1的表达水平也可作为临床上判断上皮性卵巢癌预后的重要指标。

本发明切入点贴近临床：目的明确，旨在在解决临床上耐紫杉醇上皮性卵巢癌治疗的实际问题，从目前治疗手段的不足之处出发，发明了一种全新的潜在治疗手段，有朝一日投入临床实践，可有针对性的改善现状，从而使广大患者受益。指导理念新颖：结合了国内外最新最先进的基础研究成果，提出了富有创造性的假说，并在充分实验的基础上，证明了了假说的实际可操作性，为紫杉醇耐药患者的靶向治疗提供了新的治疗方案，可很好的应用于临床上，具有很好的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学附属金山医院

<120> STAT1在耐紫杉醇上皮性卵巢癌治疗中的用途

<130> /

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcguaaucuu caggauaaut t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

auuauccuga agauuacgct t 21

Claims (3)

1.STAT1 的促进剂在制备治疗耐紫杉醇的上皮性卵巢癌的药物中的应用，所述的促进剂为小干扰RNA ，序列是：正义链：GCGUAAUCUUCAGGAUAAUtt ，如 SEQ ID NO:1 所示；反义链：AUUAUCCUGAAGAUUACGCtt，如 SEQ ID NO:2 所示。

2.STAT1 的促进剂在制备抑制耐紫杉醇的上皮性卵巢癌细胞的增殖、迁移、侵袭和/或成球能力的试剂中的应用，所述的促进剂为小干扰 RNA，序列是：正义链：GCGUAAUCUUCAGGAUAAUtt，如SEQ IDNO:1 所示；反义链：AUUAUCCUGAAGAUUACGCtt，如SEQ IDNO:2 所示。

3.STAT1 的促进剂在制备抑制耐紫杉醇的上皮性卵巢癌细胞干性的药物中的应用，所述的促进剂为小干扰RNA，序列是：正义链：GCGUAAUCUUCAGGAUAAUtt，如SEQ ID NO:1 所示；反义链：AUUAUCCUGAAGAUUACGCtt，如 SEQ ID NO:2 所示。

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