KR20130011379A

KR20130011379A - Ａｄｅｎｉｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ 2 발현 또는 활성 억제제를 이용한 폐암 치료 방법

Info

Publication number: KR20130011379A
Application number: KR1020110072503A
Authority: KR
Inventors: 김철우; 김민경; 장지영
Original assignee: 주식회사 바이오인프라
Priority date: 2011-07-21
Filing date: 2011-07-21
Publication date: 2013-01-30

Abstract

본 발명은 adenine nucleotide translocator 2(ANT2) 발현 또는 활성 억제제를 이용하여 폐암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 Adenine nucleotide translocator 2 small interfering RNA (ANT2 siRNA) 또는 ANT2 short hairpin RNA (shRNA) 를 유효성분으로 함유하는 폐암 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA를 환자에게 투여하여 폐암을 치료하는 방법을 제공한다.
궁극적으로, 본 발명은 폐암 세포 성장 억제 효과 및 우수한 치료 효능을 가지는 폐암 치료제를 제공할 수 있을 것이며, 폐암 치료제 개발에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

Ａｄｅｎｉｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ 2 발현 또는 활성 억제제를 이용한 폐암 치료 방법{Method for treating lung cancer using expression or activity inhibitors of Adenine nucleotide translocator 2}

본 발명은 Adenine nucleotide translocator 2 (ANT2) 발현 또는 활성 억제제를 이용하여 폐암을 치료하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 ANT2 siRNA (small interfering RNA) 또는 ANT2 shRNA (short hairpin RNA)를 이용하여 폐암을 치료하는 방법 등에 관한 것이다.

폐암은 암 전이를 일으키며 사망에까지 이르게 하는 고 위험성 암 유형 중 하나이며, 여성의 경우 유방암보다 많은 숫자가 매년 폐암으로 사망하고 있다. 폐암의 종류는 작은 세포 폐암종 및 비 작은 세포 폐암으로 나뉘는데, 치료요법은 외과적 수술, 화학적 치료, 방사선 치료법이 대부분이다.

정상세포와 악성종양간의 차별될 수 있는 생물학적 과정을 동정해내 새로운 암치료제 개발을 할 수 있는데, 세포성장과 혈관 성장을 조절하는 신호전달 체계 mTOR의 활성이 일어나고 이 경로를 통한 저산소 유도인자(HIF-1: hypoxia-inducible factor-1)의 발현으로 저산소증의 암세포는 악성종양으로 발생하게 된다.

악성종양에서 신생혈관 생성과 당분해의 증가는 저산소 상태의 미세환경을 나타내며, 이는 종양의 침습성, 전이 환자의 예후와 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 혈관에서 산소, 포도당, 기타 영양소 등은 제한된 범위 내에서 확산에 의하여 공급되기 때문에 성장하는 악성 종양의 조직에서 신생혈관이 형성되지 않으면 종양세포들은 저산소증에 빠지게 되고 저산소증에 빠진 세포는 산소의 저분압 상태를 감지하여 저산소증 조절 유전자들을 발현시키려는 신호체계를 활성화 시켜 그 환경에 적응하려는 변이를 일으켜 악성종양으로 자라게 된다.

저산소증 상태에서 맥관형성의 유도와 같은 세포적응의 과정에는 HIF-1 단백이 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 세포의 산소분압이 떨어지면 HIF-1 유전자의 mRNA의 전사와 단백합성의 증가가 일어나게 되고 저산소증에 노출되었을때만 핵내에 급속히 축적되는 단백이다. 세포내에 축적된 HIF-1a 단백은 일단 세포의 재산소화가 이루워지면 세포내 ubiquitin-proteasome 경로에 의해 신속히 분해되므로, HIF-1 단백의 활성은 HIF-1a 아단위에 의해 결정된다.

이중 새로운 혈관형성을 유도하는 Vascular endothelial growth factor: VEGF는 HIF-1 에 조절되는 대표 단백질로 정상세포보다 암세포 안에서 활성화 되어있다. HIF-1a 단백은 세포의 적응을 돕는 이런 단백들의 발현과 관련된 유전자의 hypoxia response elements 부위에 결합하여 이들 유전자를 활성화 시킨다. 많은 악성종양의 조직내부에는 저산소증의 부위가 존재하는 것으로 알려져 있으며, 화학요법치료 또는 방사선 치료에도 내성을 나타내 치료에도 큰 장애가 되고 있고, 불량한 예후와도 관련이 있다고 한다.

암세포들의 악성종양으로 발생함에 따라 저산소환경으로 노출되게 되고, 미토콘드리아 내의 ATP 생산이 중단되고, 세포가 전적으로 glycolytic 신진대사로 전환하여 암세포의 성장이 이루어진다.

아데닌 뉴클레오티드 트랜스로케이터(ADP/ATP translocator, ANT)는 미토콘드리아 내막(inner membrane, IM)에 존재하는 효소로서 외막(outer membrane, OM)의 VDAC(voltage dependent anion channel)를 통하여 세포질로부터 미토콘드리아 내부로 ADP를 전달(import)하고 전자전달계(electron transfer chain system)를 거쳐 생성되는 ATP를 세포질로 방출(export)하는 기능을 수행하는 효소로 알려져 있다 (HLA Vieira, et al., Cell Deathand Differentiation, 7, 1146-1154, 2000).

또한, 세포의 에너지 대사에 필수적인 역할을 수행하는 ANT는 3개의 유사체(isoform)인 ANT1, ANT2 및 ANT3가 알려져 있으며 이 중에서 특히 ANT2는 정상세포에서는 그 발현이 낮지만 암세포 또는 증식능이 높은 세포에서는 매우 높게 발현되는 특징을 가지고 있는데 이는 혐기성 상태(anaerobic condition)에서의 해당(glycolysis)반응과 밀접한 관련이 있으며, 또한 최근에는 새로운 암 치료의 표적으로 제시된 바 있다(Chevrollier, A, et al.,Med. Sci., 21(2), 156-161, 2005).

이에 더하여, 폐암세포는 상피세포성장인자(EGF)-상피세포성장인자 수용체(EGFR) 신호전달 시스템 또한 상피세포가 근원인 조직의 항상성을 유지하는데 필수적인 세포의 성장, 증식, 분화를 조절한다. EGFR이 HSP90 샤페론 단백과의 신호전달체계를 통해 폐암세포성장이 일어나게 되고 EGFR 유전적 변이가 일어나, 암세포의 자연사멸을 막아주게 되며 이는 암치료에 대한 내성과도 관련되어있다

따라서, 본 발명자들은 폐암세포의 EGFR 발현양상에 따른 ANT2 shRNA의 효과 및 저산소환경-폐암세포에서 HIF-1a과 ANT2(adenine nucleotide translocator 2)의 상관 관계를 밝히고, 아울러 대표적 유전자로 ANT2(adenine nucleotide translocator 2)를 선택하여 효과적이며 안전한 항암 치료제 개발에 중점을 두어 왔다.

본 발명자들은 ANT2 단백질 합성을 특이적으로 차단할 수 있는 ANT2 shRNA(short hairpin RNA)가 ANT2 mRNA 발현 수준을 특이적으로 감소시켜 폐암 세포의 저산소환경내 ATP전달을 암특이적으로 억제할 뿐만 아니라 폐암 세포의 사멸을 유도하여 폐암 세포를 효과적으로 치료할 수 있음을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다. 따라서 본 발명의 목적은 ANT2 shRNA를 이용한 폐암 치료용 조성물 및 폐암 치료 방법 등을 제공하는 것이다.

본 발명은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 를 유효성분으로 함유하는 폐암 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 폐암 세포의 저산소 환경에서의 전사조절 및 성장 억제 또는 사멸을 유도하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 는 서열번호 3으로 기재된 안티센스(anti-sense)서열이 서열번호 1로 기재된 센스(sense)서열과 결합하여 ANT2 mRNA의 분해를 유도하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 저산소환경 조절자인 HIF-1 (hypoxia inducible factor-1)을 전사 및 번역 과정에서 저해시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 저산소 환경에서 폐암세포주의 성장 억제 및 세포 사멸을 유도하는 것을 특징으로 한다. 상기 폐암세포주는 A549 및 H157를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 mTOR(mammalian target of rapamycin) 기전을 방해시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 저산소 환경에서 혈관형성 혈관내피세포증식인자(VEGF, Vascular endothelial growth factor) 유전자의 발현을 저해하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 EGFR(epidermal growth factor receptor)의 유형에 관계 없이 발현을 감소 시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 폐암세포의 EGFR 유형에 관계없이 HSP90(Heat shock protein 90)의 단백질을 저해 시키는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA를 환자에게 투여하여 폐암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 는 폐암 세포의 ANT2 유전자 발현을 감소시켜 효과적으로 폐암 세포의 성장 억제 및 세포 사멸을 유도한다는 장점을 가지고 있다. 특히 본 발명의 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA는 저산소 환경에서의 전사조절인자인 HIF-1의 발현을 조절함에 따라 폐암세포의 성장 및 혈관형성에 관여하는 mTOR 신호전달체계를 억제하는 효과를 나타낸다.

이에 더하여 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA는 폐암의 EGFR 발현 양상에 관계없이 폐암세포의 사멸을 유도하였으며 이는 폐암세포의 효과적인 치료제로서의 가능성이 기대된다. 궁극적으로, 본 발명은 폐암세포 성장 억제 효과 및 우수한 치료 효능을 가지는 폐암 치료제를 제공할 수 있을 것이며, 폐암 치료제 개발에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1A 및 1B는 저산소환경(hypoxia)에 정상세포와 폐암세포를 노출시켰을 때 시간별로 유전자들의 발현 정도를 mRNA level로 확인한 RT-PCR 결과이다.
도 1C는 ANT2 유전자 내에 저산소반응요소(HRE-TCGTC) sequence가 존재하는 것을 확인한 결과이다.
도 2A는 저산소 환경내 폐암세포(A549)에 ANT2 shRNA를 도입하였을 때 HIF-1의 발현이 mRNA level에서 저해된다는 것을 확인한 RT-PCR결과이다.
도 2B는 저산소 환경내 폐암세포(A549)에 ANT2 shRNA를 도입하였을 때 HIF-1의 발현이 ANT2 shRNA의 양에 따라 감소하는 결과를 확인한 전사활성도(luciferase repoter gene activity assay)측정 결과이다.
도 3A는 저산소 환경내 정상 세포(wi-38)와 폐암세포들에 ANT2 shRNA를 도입하였을 때 폐암 세포주에서만 세포증식이 저해되는 것을 확인한 CCK-8 assay결과이다.
도 3B는 저산소 환경내 폐암세포에 ANT2 shRNA를 도입하였을 때 미토콘드리아막 손상 (DilC staining)에 의한 세포사멸(Annexin V/PI staining)이 일어나는 것을 확인한 Annexin V staning결과이다.
도4는 저산소 환경내 ANT2 shRNA를 폐암세포에 도입하였을 때, 세포성장 및 혈관생성에 관련하는 mTOR 기전을 저해하고, HIF-1 단백의 번역 후 변형(post translation modification)에 의해 조절되는 것을 확인한 RT-PCR 결과이다.
도 5A는 저산소 환경내 ANT2 shRNA를 폐암세포에 도입하였을 때 혈관(angiogenesis)형성 유전자 VEGF의 저해가 일어난다는 것을 mRNA level로 확인한 RT-PCR결과이다.
도 5B는 저산소 환경내 ANT2 shRNA를 폐암세포에 도입하였을 때 endothelial cell(SVEC) 성장이 감소된다는 것을 확인한 결과이다.
도 6은 저산소 환경내 ANT2 shRNA를 폐암세포에 도입하였을 때, VEGF와 HIF-1의 결합력을 떨어뜨리는 것을 확인한 CHIP assay결과이다.
도 7A는 폐암세포에 ANT2 shRNA를 도입하였을 때 EGFR의 발현이 감소하는 것을 확인한 FACS analysis 결과이다.
도 7B는 폐암세포에 ANT2 shRNA를 도입하였을 때 EGFR의 발현이 감소하는 것을 확인한 western blotting 결과이다.
도 8은 폐암세포에 ANT2 shRNA를 도입하였을 때 EGFR과 HSP90 단백의 결합을 저해시키고, 이는 HSP90의 안정도가 떨어져 단백분해로 인해서임을 확인한 western blotting 결과이다.

본 발명은 ANT2 발현 또는 활성 억제제를 이용하여 폐암을 치료하는 방법 등을 제공한다. 본 발명자들은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 가 폐암 세포의 증식 속도를 저하시키는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 따라서 본 발명은 Adenine nucleotide translocator 2 small interfering RNA (ANT2 siRNA) 또는 ANT2 short hairpin RNA (shRNA) 를 유효성분으로 함유하는 폐암 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 폐암 세포의 성장 억제 또는 사멸을 유도하는 것을 특징으로 한다.

암세포들의 악성종양으로 발생함에 따라 저산소환경으로 노출되게 되고, 미토콘드리아 내의 ATP생산이 중단되고, 세포가 전적으로 glycolytic 신진대사로 전환하여 암세포의 성장이 이루어진다. 폐암종양 조직내부에는 저산소증의 부위가 존재하는 것으로 알려져 있으며, 화학요법치료 또는 방사선 치료에도 내성을 나타내 치료에도 큰장애가 되고 있고 예후에도 불량한 경우가 많이 있다고 알려져 있다. 저산소증 상태에서 맥관형성의 유도와 같은 세포적응의 과정에는 HIF-1 단백이 중요한 역할을 한다고 알려져 있고, HIF-1 발현이 악성 종양에서 더욱 높게 나타나 폐암발생에 있어서 악성으로의 전이에 중요한 역할을 한다고 볼 수 있다.

따라서 본 발명자들은 ANT2 shRNA 도입이 HIF-1의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해 저산소환경에 정상세포와 폐암세포를 노출시켰을 때, 폐암 세포주 A549 및 H157에 ANT2 shRNA를 도입하여 HIF-1의 발현이 감소하는 것을 확인하였다 (도 1 및 도 4 참조). 또한, 저산소환경에 정상세포와 폐암세포를 노출시켰을 때, 전사 및 번역 과정에 ANT2 shRNA가 HIF-1을 조절하고 (도 2 및 도 4 참조), 폐암 세포주에서만 세포 증식이 저해되는 것을 확인하였으며 (도 3A 참조), 미토콘드리아 막을 붕괴하는 암세포사멸을 유도하는 것을 확인하였다 (도 3B 참조). 이를 통해 저산소 환경에서 HIF-1에 의해 조절되는 혈관 형성 유도 단백 VEGF의 저해를 확인하였고 endothelial cell의 성장을 감소시키는 결과를 확인하였다 (도 5 참조).

이에 더하여, 저산소 환경내 ANT2 shRNA를 폐암세포에 도입하였을 때, VEGF와 HIF-1의 결합력이 떨어지는 것을 확인하였고 (도 6 참조), EGFR의 발현이 감소하는 것을 확인하였다 (도 7 참조). 이에 더하여, 폐암세포에 ANT2 shRNA를 도입하였을 때 HSP90의 안정도가 떨어져 단백 분해가 일어나기 때문에, EGFR과 HSP90 단백의 결합을 저해시킨다는 것을 확인하였다 (도 8 참조).

결론적으로 ANT2 유전자 발현 억제는 저산소 환경에서 이루어지는 암세포 성장 기전에 폐암의 악성으로의 세포증식을 효과적으로 억제시킬 뿐만 아니라 세포사멸을 유도한다는 결과를 얻었다 (도 3 참조). 이를 통하여 ANT2 유전자의 발현 억제는 폐암 치료에 효과적으로 활용될 수 있을 것이라 판단된다.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함 할 수 있다.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 및 에탄올 등을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있으며, 제제화할 경우에는 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 부형제 등을 사용할 수 있다.

본 발명은 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA를 환자에게 투여하여 폐암을 치료하는 방법을 제공한다.

상기 투여 방법에는 제한이 없다. 예를 들면, 경구 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 경피 주사, 비강 내 투여, 경기관지 투여 또는 근육 내 투여 등이 포함된다. 또한 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하게 조절될 수 있음은 당업자에게 명백하다. 일일 투여량은 0.001 내지 100mg/kg이며, 투여량과 횟수는 경우에 따라 조절 될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

ANT2 shRNA 의 발현벡터 제작

미국 국립생명공학정보센터(Nationanl Center for Biotechnology Information, NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)로부터 입수한 ANT2 mRNA 염기서열은 Genebank Accession No. NM_001152이다. 이 염기서열을 siRNA 예측 프로그램(http://www.ambion.com/technical, resources/siRNA target finder)에 대입하여 적합한 ANT2 siRNA 후보 염기서열을 확보하였고, 여러 후보 염기서열 가운데 ANT2 mRNA의 두 번째 엑손에 해당하는 염기서열인 5' GCAGAUCACUGCAGAUAAG 3'에 결합하는 siRNA를 제작하여 ANT2 siRNA에 의한 ANT2 mRNA의 감소 (silencing)효과를 세포 수준에서 (in vitro) 확인하였다 [이 때 ANT2 siRNA 제작은 Bioneer(한국)에 의뢰하였다].

이 결과를 토대로 shRNA를 제작하기 위하여 다음과 같은 염기서열의 올리고머 두 가닥을 합성하고[이 때 ANT2 siRNA 제작은 Bioneer(한국)에 의뢰하였다],

상기 두 가닥의 올리고머를 결합 (annealing) 시킨 후, pSilencer 3.1-H1 puro 플라스미드 벡터(Ambion사)의 MCS(multi-cloning site)내 BamH I과 Hind III 부위에 클로닝하여 제작하였다. 이 때 상기 센스서열에 이어 siRNA 발현유도의 효율을 증가시키도록 TT를 첨가하였다. 또한, ANT2 shRNA의 효과를 확인하기 위해 진행한 모든 실험에는 ANT2 발현을 차단하지 못하면서, 세포 내 특정 mRNA의 발현에는 영향을 끼치지 않는 스크램블(scrambled) shRNA를 음성 대조군으로 사용하였으며, 이는 동일한 조건을 제공해주는 역할을 하는 것으로 Ambion사에서 구입하여 사용하였다.

상기 벡터로부터 발현이 되는 shRNA의 염기서열은 서열번호 1 내지 3으로 서열목록에 별도로 기재하였다.

실시예 1. 저산소환경 -폐암 세포의 HIF -1 과 ANT2 의 연관성 고찰

본 발명자들은 저산소 환경에서 폐암 세포주인 A549 및 H157에 ANT2 shRNA를 도입하여, 이로 인한 관련 유전자들의 발현 변화를 RT-PCR법을 통해 확인 하였다.

이 때 ANT2 shRNA를 폐암 세포주인 A549 및 H157에 도입하기 위해 사용된 방법은 비바이러스성 전달체인 Lipofectamine^TM2000(Invitrogen 제품)이라는 물질을 사용한 방법이며, Lipofectamine^TM2000의 positive charge를 띄는 hydrophilic한 부분과 shRNA의 negative charge가 서로 interaction에 의해 복합체 (complex)를 만들고 Lipofectamine^TM2000이 세포막과 융합되는 원리를 이용하여 shRNA가 세포 안으로 들어가게 된다.

구체적으로, 폐암 세포주인 A549 및 H157 과 정상세포 wi-38 세포는 culture dish에 60~70% 밀도로 (confluency) 하루 전에 준비 한 뒤, ANT2 shRNA 0.5ug~1ug 과 Lipofectamine^TM2000 6ul를 잘 섞어 15분간 보관 후 (incubation) 준비된 폐암 세포주에 골고루 뿌려 주었다. 이 때, ANT2 shRNA 가 Lipofectamine^TM2000과의 복합체 (complex)를 형성하여 세포로의 도입을 최대화 하기 위해서, 사용되는 세포 배양액은 10% FBS (Fetal Bovine Serum)와 antibiotics가 포함된 complete DMEM media 가 아닌 opti-MEM를 사용하여 6시간 배양하였고 이후, complete DMEM media로 배양액을 교체하고 ANT2 shRNA가 발현되기까지 정상 산소 환경 21%-O₂ 환경과, 저산소 환경 1%-O₂환경에서 0h~24h까지 시간 별로 배양하였다.

배양 후의 세포들에서 Total RNA를 획득하여 reverse transcriptase로 cDNA를 합성하고 이를 토대로 HIF-1, ANT1~3 그리고 beta-actin의 primer를 이용한 RT-PCR을 수행 후 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1A에 나타난 바와 같이, 각각 유전자의 발현 정도를 확인하여 저산소내 ANT2와 HIF-1이 암세포 특이적인 발현양상의 연관성을 알 수 있었다. 또한, 저산소환경과 함께 pHIF-1을 세포외 주입하여 과발현시켰을 때에도 HIF-1과 함께 ANT2 의 발현이 연관성 있게 증가하였고, 이는 PCR cycle 수 의 차이를 통해 그 증폭정도를 비교할 수 있었다 (도 1B 참조).

이에 더하여, www.epd.org 사이트에서 ANT2의 promoter sequence를 database에 넣고 hypoxia response sequence가 존재하는지를 검색하였고, ANT2 유전자 promoter서열 안에 HRE(hypoxia response element)서열-TCGTC가 존재하는 것으로 ANT2가 저산소 환경내에서 반응하는 유전자임을 확인하였다 (도 1C 참조).

실시예 2. 저산소환경 -폐암 세포의 HIF -1 발현에 미치는 ANT2 shRNA 도입의 효과

본 발명자들은 저산소환경내 폐암세포에 ANT2 shRNA의 도입 시 HIF-1의 발현에 미치는 영향을 확인하였다.

구체적으로, 저산소환경내 폐암세포에 ANT2 shRNA의 도입 시 HIF-1의 발현정도를 mRNA level을 RT-PCR방법으로 확인하고, 프로모터의 발광효소 전사활성 분석(luciferase activity assay), 즉 저산소환경에서, HIF-1 단백에 의해 프로모터-HRE(hypoxia response elements) 가 작동하게 되고 이를 통해 리포터유전자-발광효소인 luciferase의 전사가 시작되면 그의 발광정도로 프로모터에 의한 활성도를 측정하였다.

도 2A에 나타난 바와 같이 저산소환경내 ANT2 shRNA 도입시 HIF-1의 저해로 인해 발광 효소의 전사 활성도가 감소되는 것을 확인하였고, ANT2 shRNA는 HIF-1단백의 전사활성을 저해함을 확인하였다 (도 2B 참조).

실시예 3. 저산소환경 -폐암 세포의 세포사멸에 미치는 ANT2 shRNA 도입의 효과

본 발명자들은 저산소환경내 ANT2 shRNA의 도입 시 폐암세포의 사멸에 미치는 영향을 확인하였다.

구체적으로, 저산소 환경내 폐정상 세포주 wi-38과 폐암세포 A549 및 H157에 ANT2 shRNA를 도입하여 세포증식을 알아보기 위한 CCK8 assay를 수행하였다. CCK-8 assay는 살아있는 세포의 dehydrogenase activity를 측정하는 원리를 이용한 방법으로, 96well plate에 negative control- scramble과 ANT2 shRNA DNA를 도입한 5X10⁴ 세포를 전날 깔아준 후 저산소 환경에서 0h~48h까지 배양을 하면서 실시하였다. 그 결과, 도 3A에 나타난 바와 같이 ANT2 shRNA 를 도입한 폐암 세포주들에서만 24h부터 세포증식이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다.

또한 미토콘드리아막 손상에 의한 세포사멸임을 확인하기 위해 DiLC1/Annexin V, PI/Annexin V staining을 실시하였다.

DiLC1/Annexin V, PI/Annexin V staining은 세포가 죽을 때 세포막에 존재하고 있는 phosphatidic serin(PS)이 외부로 뒤집어져 돌출되는 것을 이용해 annexin-V가 결합되는데, 이 때 세포막에 구멍이 생기고 핵이 외부에 노출되어 PI가 결합하게 되는 양상으로 세포사멸 상태를 early~late까지 관찰할 수 있는 방법이다. 이에 더하여, 미토콘드리아에 근거한 세포사멸임을 알아보기 위해 미토콘드리아에 데미지를 입어 구멍이 나는 형상을 이용하여 미토콘드리아를 DiLC1으로 염색하고 염색이 빠지는 정도를 측정하여 세포사멸을 구체적으로 알수 있게 시행하였다, 이 결과, 도 3B에 나타난 바와 같이, ANT2 shRNA를 폐암세포에 도입 시 미토콘드리아에 근거한 세포사멸이 진행되어 세포증식이 저해되는 것을 확인하였다.

실시예 4. 저산소환경 -폐암 세포의 ANT2 shRNA 도입에 의한 mTOR 기전 저해

본 발명자들은 저산소 환경내에 ANT2 shRNA를 폐암세포에 도입시, 세포성장 및 혈관생성에 관련하는 mTOR 기전을 저해하고, HIF-1 단백의 번역 후 변형에 의해 조절되는 것을 확인하였다.

구체적으로, ANT2 shRNA를 저산소 환경내 폐암 세포에 도입한 후 일정 시간 (24h)배양하고, 전체 단백질을 추출한 뒤 AMPK의 활성을 phospo-AMPK로 확인하였다. AMPK란 세포 내 에너지 고갈 시 농도가 증가하는 AMP라는 물질을 인식해 그 활성이 증가하는 인산화 효소(단백질)로, 세포 내 에너지 밸런스 대사조절에 중추적 역할을 한다.

이 결과 도 4에 나타난 바와 같이, 종양세포 분열 조절 단백질의 작용경로로 알려진 mTOR 기전은 저해가 되어 HIF-1단백 발현도 감소됨을 western blotting으로 확인하고, 감소되는 HIF-1 단백이 자연적인 proteasome에 의한 분해로 감소 되었는지 여부를 알아보기 위해 western blotting 을 실시하였다. proteasome inhibitor가 MG132를 전처리 한 후 ANT2 shRNA를 도입하였을 때 HIF-1 단백이 감소되는 것으로 보아, ANT2 shRNA에 의해 HIF-1 단백의 번역 후 변형조절(post translation modification) 단계에서 발현을 저해하는 것을 확인하였다.

실시예 5. 저산소환경 -폐암 세포에 ANT2 shRNA 도입이 혈관형성 유전자에 미치는 영향

본 발명자들은 저산소환경내 폐암세포에 ANT2 shRNA 도입이 혈관형성 유전자에 미치는 영향을 확인하였다.

구체적으로, 저산소환경내 폐암세포에 ANT2 shRNA 도입 시 산소 공급을 복원하기 위한 혈관 내피 성장인자 (VEGF) 유전자의 mRNA level이 저해되는 것을 RT-PCR을 이용하여 확인하였다. 또한, ANT2 shRNA와 scramble 도입한 폐암세포를 24시간 동안 실시예 1과 같은 opti-MEM에서 배양한 후, 분비되는 단백들이 포함된 그 배양액을 가지고 endothelial cell (SVEC)에 재배양함으로써 분비되는 단백중 VEGF를 포함한 growth factor 단백들에 의해 SVEC세포가 성장하는 지를 확인하였다.

그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, 저산소환경내 폐암세포에 ANT2 shRNA를 도입한 배양액에 의해 negative scramble보다 분비되는 VEGF의 양이 감소되어 SVEC의 성장이 저해되는 것을 확인하였다.

실시예 6. 저산소환경 - 폐암세포내 ANT2 shRNA 도입시 혈관형성 유전자인 VEGF 와 HIF-1의 단백 결합력에 미치는 영향

본 발명자들은 ANT2 shRNA를 저산소환경내 폐암세포에 도입하였을 때, 혈관형성 유전자 VEGF와 HIF-1의 단백 결합력에 미치는 영향을 확인하기 위해 CHIP assay(chromatin immunoprecipitation)을 실시하였다. 이는 세포내 단백질과 chromatin간의 상호관계를 알아보기 위한 in vivo 방법으로, 이를 이용하여 HIF-1이 VEGF유전자 부위에 결합하는 것을 확인하였다.

구체적으로, ANT2 shRNA와 scramble을 도입한 폐암세포들을 2시간 동안 저산소 환경에서 배양한 후, 세포들을 모아 단백질을 DNA에 고정시키고 sonictaion으로 절단하여 chromatin 들을 모아 항체로 DNA-protein-antibody complex를 이루어 침전(immunoprecipitation-IP) 시킨뒤, 여기서 정제한 DNA에 대해 PCR을 수행하였다. 이때 IP에 사용한 항체는 HIF-1 antibody (BD, 610958, source-mouse)이며, VEGF 프로모터-PCR 은, VEGF promoter sequence (VEGF promoter_531 to _374 region) 의 아래 specific primer 를 사용하여 실험하였다.

그 결과 도 6에 나타난 바와 같이, 저산소환경내 폐암세포에 ANT2 shRNA 도입시 HIF-1과 VEGF의 결합력이 scramble과 비교해 감소되는 것을 확인하였다.

실시예 7. 폐암세포에 ANT2 shRNA 를 도입시 EGFR 에 미치는영향

본 발명자들은 폐암세포에 ANT2 shRNA를 도입이 EGFR에 미치는 영향을 확인하였다.

구체적으로, 폐암세포주인 A549 표면에 높게 발현하는 EGFR이 ANT2 shRNA의 도입으로 인해 감소됨을 유세포 분석기 (FACS : flow cytometry and cell sorting)를 통해 확인 하였다. 유세포 분석기를 이용한 실험은 세포 표면에 발현하는 EGFR 1005 (santa cruz, SC-03, source rabbit)와 결합하는 항체를 붙이고 이 항체에 결합하는 항체인 2차 항체 anti-rabbit-IgG-PE(sancta cruz, SC-3739, source goat)를 붙여 유세포 분석기가 인지하는 원리를 이용하는 방법으로, 2차 항체의 경우 형광 물질이 결합되어 있어 유세포 분석기가 이를 인지하게 되어 EGFR이 발현 되어 있는 세포와 발현되어 있지 않는 세포를 구분하게 된다.

그 결과 도 7에 나타난 바와 같이, 일반적으로 폐암세포 A549에서는 EGFR을 높게 발현하게 되는데(sc shRNA), 폐암세포에 ANT2 shRNA를 도입하는 경우 EGFR의 발현이 감소되는 것을 확인하였다.

실시예 8. 폐암세포에 ANT2 shRNA 를 도입 시 EGFR - HSP90 에 미치는 영향

본 발명자들은 폐암세포에 ANT2 shRNA를 도입이 EGFR과 HSP90 결합에 미치는 영향을 확인하였다.

구체적으로, 인간 폐암세포 A549(EGFR wild type)과 H1975(EGFR mutant type)에 ANT2 shRNA를 도입시켜 ANT2 발현을 감소시키고 세포로부터 단백질을 추출하여 EGFR와 HSP90의 상호작용 (interaction)의 변화를 확인하였다. 먼저 EGFR와 결합하는 항체 hEGFR 1005 (santa cruz, SC-03, source rabbit)를 이용하여 면역 침강 (immuno-precipitation)을 시키고, HSP90에 결합하는 항체 hHSP90(santa cruz, SC-69703, source mouse)로 단백질 발현정도(western-blot)를 확인하였다 (도 8 참조).

그 결과 도 8에 나타난 바와 같이, ANT2 shRNA로 인해 ANT2 발현이 감소 된 경우 EGFR와 HSP90의 상호작용이 감소되었으며, 세포 내에서 단백질이 분해되기 전에 나타나는 현상인 유비퀴티네이션 (ubiquitination)이 증가되어 있음을 확인하였다. 즉, ANT2 shRNA에 의해 EGFR와 HSP90과의 상호 작용이 감소하고 이로 인해 EGFR의 유비퀴티네이션이 증가되어 HER2/neu의 분해가 증가되므로 결과적으로 EGFR발현이 감소함을 확인 하였다.

이 때 양성대조군으로 (positive control) 17-AAG라는 HSP90 억제약물 [HSP inhibitor/17-AAG (17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin): A.G. Scientific Inc. (San Diego, CA)]를 사용하였으며, 실험에 사용된 단백질 양이 동일했다는 것을 보여주기 위해서 세포골격을 구성하는 단백질로서 세포 외부나 내부의 변화에 영향을 받지 않는 beta-actin 단백질 양이 동일함을 보여주었다 [anti-beta-actin antibody : Cell signaling Tech. (Beverly, MA)].

<110> BioInfra, INC. <120> Method for treating lung cancer using expression or activity inhibitors of Adenine nucleotide translocator 2 <130> PB11-09304 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense sequence of ANT2 shRNA <400> 1 gcagaucacu gcagauaagu u 21 <210> 2 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Loop sequence of ANT2 shRNA <400> 2 uucaagaga 9 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-sense sequence of ANT2 shRNA <400> 3 aacuuaucug cagugaucug c 21

Claims

Adenine nucleotide translocator 2 small interfering RNA (ANT2 siRNA) 또는 ANT2 short hairpin RNA (shRNA) 를 유효성분으로 함유하는 폐암 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 ANT2 siRNA 또는 ANT2 shRNA 는 서열번호 3으로 기재된 안티센스 (anti-sense) 서열이 서열번호 1로 기재된 센스 (sense) 서열과 결합하여 ANT2 mRNA의 분해를 유도하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 저산소환경 조절자인 HIF-1을 전사 및 번역 과정에서 저해시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 저산소 환경에서 폐암세포주의 성장 억제 및 세포사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 저산소 환경에서 mTOR(mammalian target of rapamycin) 기전을 방해하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 저산소 환경에서 혈관내피세포증식인자(VEGF, Vascular endothelial growth factor) 유전자의 발현을 저해시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 폐암세포의 상피세포 성장인자 수용체 (EGFR, Epidermal growth factor receptor) 유형에 관계없이 발현을 감소 시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 폐암세포의 EGFR 유형에 관계없이 HSP90(Heat shock protein 90)의 단백질을 저해시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
Adenine nucleotide translocator 2 small interfering RNA (ANT2 siRNA) 또는 ANT2 short hairpin RNA (shRNA) 를 환자에게 투여하여 폐암을 치료하는 방법.