CN113652429A

CN113652429A - 靶向敲低长链非编码RNAMIR205HG的shRNA和及其应用

Info

Publication number: CN113652429A
Application number: CN202110982782.3A
Authority: CN
Inventors: 郭长缨; 刘丰其; 张红颖
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2021-08-25
Filing date: 2021-08-25
Publication date: 2021-11-16
Anticipated expiration: 2041-08-25
Also published as: CN113652429B

Abstract

本发明公开靶向敲低长链非编码RNAMIR205HG的shRNA和及其应用，本发明提供靶向敲低lncRNA‑MIR205HG基因的shRNA序列能特异靶向lncRNA‑MIR205HG基因。根据lncRNA‑MIR205HG在雌激素受体阳性肿瘤组织中呈现不同水平表达，构建敲低lncRNA‑MIR205HG的MCF7细胞系，研究lncRNA‑MIR205HG在雌激素受体阳性乳腺癌细胞肿瘤形成中的作用，结果表明敲低lncRNA‑MIR205HG能明显降低MCF7细胞对雌激素的响应程度，促进雌激素受体降解，显著抑制MCF7细胞的凋亡、周期、迁移和克隆形成能力。本发明揭示了lncRNA‑MIR205HG在乳腺癌发病机制中的重要作用，也为雌激素受体阳性乳腺癌的临床诊断、治疗和预后监测提供了新的分子标记和药物靶点。

Description

靶向敲低长链非编码RNAMIR205HG的shRNA和及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及长链非编码RNA MIR205HG的五种靶向敲低序列、及其应用。

背景技术

乳腺癌是来自乳腺终末导管小叶单位的上皮性恶性肿瘤。发病率在过去50年中呈缓慢上升趋势，已跃居女性恶性肿瘤第一位。乳腺癌的组织型态十分复杂，病理学上按照分子亚型将乳腺癌分为三阴性、雌激素受体阳性(ER⁺)、Her-2⁺三大类。乳腺癌的发病机制尚未完全阐明，研究发现乳腺癌与机体雌激素分泌紊乱有关。雌激素主要是由雌二醇(Estradi ol，E2)组成，具有多种生物学功能包括维持第二特征，促进新陈代谢，预防骨质疏松，调节血管功能等[1]Qu Chao,Liu Zhong Y,Xi Rong G,et al.Estrogen signalingreview [J].Biotechnologycommunication,2014,25(03):448-450。雌激素在体内的代谢产物可能会引起脱嘌呤现象，造成DNA链的损伤和基因组紊乱，为细胞癌变提供基础。然而，仅调节雌激素水平的高低尚不能得到良好的肿瘤预后效果，多种异常调控的基因和遗传学因素的改变，亦是影响肿瘤发生发展和预后的至关重要环节。

ER阳性乳腺癌患者的临床治疗效果相对乐观，虽然治愈率在70％以上且患者5年生存率较高。临床上ER阳性乳腺癌患者采取的治疗方法主要是内分泌治疗法，通过去除或阻断雌激素的作用达到抑制癌细胞生长的作用，常见的药物如雌激素拮抗药物Tamoxifen，芳香族酶抑制剂来曲唑以及雌激素受体调节剂氟维司群等。这些药物虽然有着确切的疗效和较小的毒性，但是长时间使用后患者会对这些激素类药物产生一定程度的耐药现象使得癌症治疗进入一种瓶颈状态，临床上一旦ER⁺乳腺癌出现对Tamoxifen耐药，肿瘤细胞的异质性明显增加，分化程度显著降低，致使原本位于上皮组织中原位癌细胞内的EMT途径异常活跃，癌细胞更倾向于由上皮向间充质细胞转化，游离出来的癌细胞经血道或者淋巴道转移定居至患者的肺部和骨髓等多个脏器，使得患者多功能器官受累病变，加速了早期乳腺癌向晚期乳腺癌的病理进程，从而大大提高了患者的死亡率。除此之外，三种不同药理途径的药物都会给患者带来多种常见的副作用，况且大量使用激素类药物将导致机体激素水平异常引起内分泌系统失调进而出现潮热呕吐、静脉血栓性形成、骨质疏松关节疼痛等各种不良反应，使患者的生活质量严重下降。

近10年来，非编码RNA的研究进展迅速。非编码RNA通过RNA语言构成巨大的R NA分子和蛋白质分子相互作用网络参与许多生命过程。其中长链非编码RNA(long nonco dingRNA,lncRNA)是一类转录长度大于200nt(nucleotide)，并且不翻译成蛋白质的功能性RNA分子[2]Su,X.et al.Comprehensive analysis of long non-coding RNAs in hu manbreast cancer clinical subtypes.Oncotarget 5,9864–9876。研究表明，在黑色素瘤细胞系中高表达的lncRNA MIR205HG被敲低后，细胞系中VEGFA的蛋白水平和RNA 水平都显著下调，小鼠荷瘤实验中肿瘤体积也明显变小[3]Guo J,et al.LncRNA MIR20 5HGregulates melanomagenesis via the miR-299-3p/VEGFA axis[J].Aging,2021,1 2。LncRNA MIR205HG的表达水平异常增高在发病率和死亡率跃居第一的肺癌样本中也有表征，尤其是最常见的肺鳞癌患者中，lncRNA MIR205HG通过调控Bcl-2和Bax信号轴相关蛋白在临床上与癌症患者的恶性病变以及差劣的预后效果有着密切的关系,这也为临床上的预后诊断治疗提供了新思路[4]Chang Y,et al.MIR205HG facilitates carcinogenesis of lung squamous cell carcinoma in vitro revealed by long noncoding RNAprofil ing[J].Acta Biochimica et Biophysica Sinica,2020,52(4)。随着lncRNA的研究逐日增多，lncRNA MIR205HG在其他上皮细胞癌中的生理作用和机制也映入眼帘，如2019年有团队研究到lncRNA MIR205HG通过上调FOXP2信号通路促进宫颈癌的恶性增生和转移[5] Li Y,et al.Long non-coding RNA MIR205HG function as a ceRNA toaccelerate tumor growth and progression via sponging miR-122–5p in cervicalcancer[J].Bioch emical and Biophysical Research Communications,2019.；2017年一篇关于头颈鳞状细胞癌的研究表明lncRNA MIR205HG可致使p53蛋白突变发挥促癌活性[6]Long Non-co ding MIR205HG Depletes Hsa-miR-590-3p Leading to UnrestrainedProliferation in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma.[J].Theranostics,2018。多项临床参数指征显示出lncRNA MIR205HG的表达水平与肿瘤的发生发展有着明显的正相关关系，lncRNA MIR205HG敲低后可以促进ER⁺乳腺癌细胞中ER的降解，这与Tamoxifen、Fulvestrant 等芳香族酶抑制剂有着相似地临床治疗作用，而且目前还没直接靶向lncRNAMIR205HG 作为诊断治疗指标的临床先例。

我们通过一定的生物信息学相关手段通过筛选后发现lncRNAMIR205HG可以为ER蛋白提供一种良好的保护作用，当ER⁺的MCF7乳腺癌细胞中的MIR205HG敲低表达后，该细胞对雌激素依赖以及响应的基因明显降低表达，我们通过Chasing实验发现，MIR205H G敲低表达后细胞内ER的蛋白水平明显降低，ER在细胞内的降解也明显增加，MCF7细胞内ER蛋白的降解机制与临床上氟维司群上的调节ER蛋白表达降低虽然有着异曲同工的作用，但是二者的生理机制却是完全不同，氟维司群通过自身的特异性靶点结构来使得ER 蛋白的水平在细胞内绝对或相对降低，我们发现的LncRNA则是通过影响细胞内ER蛋白及其相关大分子复合物的结构稳定性，从而促使ER蛋白在细胞内自发地进行降解在绝对水平上的低表达。癌细胞的扩散以及转移不仅是乳腺癌细胞致死率高的主要原因，更是临床上目前面临的比较棘手的治疗问题。从生理水平上讲，雌激素受体是细胞核内不可或缺的重要调控因子，ER的结合与发挥功能总是牵连着一些列下游的促癌以及抑癌基因和蛋白的表达，尤其是在以恶性表皮性癌症著称的ER⁺乳腺癌细胞中，通过进一步的研究我们也在典型的MCF7细胞系中验证了ER的强大调控作用，我们发现在MCF7细胞系中敲低了Lnc-MIR20 5HG以后，该细胞系的克隆增殖明显被抑制，此外上皮癌细胞转移的经典EMT(上皮间充质细胞转化途径)途径也得到了很好的抑制，我们发现在MCF7细胞系中敲低MIR205HG 后细胞系内的E-cadherin明显上调，N-cadherin蛋白水平则相应下降，经过对比敲低前后两种细胞系对Tamoxifen药物敏感程度的检测，我们发现在MCF7细胞系中敲低LncRNA- MIR205HG以后，MCF7细胞系对Tam的敏感度明显增加，这种抗生长、抗转移、促进雌激素受体降解、增加乳腺癌细胞对药物敏感性的新颖药理机制也为我们提供了一些治疗思路和策略。

尽管如上述文献记载了lncRNA MIR205HG的高表达对多种癌症有促进发生，发展，转移等作用，但是关于lncRNAMIR205HG调控ER⁺乳腺癌对雌激素响应的作用及机制尚未有人报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供多种在ER⁺乳腺癌组织中靶向敲低MIR205HG基因的shRNA序列及其应用。

技术方案:

五种靶向敲低长链非编码RNA MIR205HG基因的shRNA序列，该序列包括MIR205HG-shRNA-F1/MIR205HG-shRNA-R1、MIR205HG-shRNA-F2/MIR205HG-shRNA-R2、MIR205HG-shRNA-F3/MIR205HG-shRNA-R3、MIR205HG-shRNA-F4/MIR205HG-shRNA-R4、MIR205HG-shRNA-F5/MIR205HG-shRNA-R5，其中，MIR205HG-shRNA-F1为SEQ ID NO.1，MIR205HG-shRNA-R1为SEQ ID NO.2，MIR205HG-shRNA-F2为SEQ ID NO.3， MIR205HG-shRNA-R2为SEQ ID NO.4，MIR205HG-shRNA-F3为SEQ ID NO.5， MIR205HG-shRNA-R3为SEQID NO.6，MIR205HG-shRNA-F4为SEQ ID NO.7， MIR205HG-shRNA-R4为SEQ ID NO.8，MIR205HG-shRNA-F5为SEQ ID NO.9， MIR205HG-shRNA-R5为SEQ ID NO.10。

五种靶向长链非编码RNA lncRNA-MIR205HG核苷酸序列如SEQ ID NO:1-SEQ IDNO10所示。

含有权利要求1所述核苷酸序列的重组质粒plk-shRNA-MIR205HG。

含有权利要求1所述核苷酸序列的重组病毒plk-shRNA-MIR205HG。

含有权利要求1所述核苷酸序列的重组病毒载体。

所述靶向长链非编码RNA lncRNA-MIR205HG的五种shRNA在制备诊断乳腺癌的产品中的应用。

靶向长链非编码RNA lncRNA-MIR205HG的五种shRNA在制备治疗乳腺癌的产品中的应用。

本发明利用lncRNA表达谱芯片技术检测ER⁺乳腺癌对雌激素响应和不响应组织中lncRNA的表达情况，通过差异分析筛选到lncRNA-MIR205HG的表达在雌激素响应的组织中显著增高，但是LncRNA-MIR205HG的表达量增高可以增加ER蛋白的稳定性，而临床上关于ER⁺乳腺癌的治疗往往是降低或者拮抗ER蛋白的表达量导致MCF7细胞对雌激素不响应。因此，我们通过设计lncRNA-MIR205HG的shRNA引物，构建降低 lncRNA-MIR205HG表达的重组慢病毒，以获得低表达lncRNA-MIR205HG的MCF7乳腺癌细胞系，使得MCF7细胞中的ER蛋白失去细胞内的保护作用加速自身的降解，研究 lncRNA-MIR205HG对MCF7细胞ER蛋白表达以及对雌激素响应程度的影响。从而探讨靶向lncRNA-MIR205HG的shRNA在乳腺癌发病过程中的作用，及其作为新的肿瘤标记物在乳腺癌临床诊断、治疗和药物开发中的应用。

本发明构思

多项临床参数指征显示出lncRNA MIR205HG的表达水平与肿瘤的发生发展有着明显的正相关关系，lncRNA MIR205HG敲低后可以促进ER+乳腺癌细胞中ER的降解，这与Tamoxifen、Fulvestrant等芳香族酶抑制剂有着相似地临床治疗作用，而且目前还没直接靶向lncRNA MIR205HG作为诊断治疗指标的临床先例。我们通过一定的生物信息学相关手段通过筛选后发现lncRNAMIR205HG可以为ER蛋白提供一种良好的保护作用，当ER+ 的MCF7乳腺癌细胞中的MIR205HG敲低表达后，该细胞对雌激素依赖以及响应的基因明显降低表达，我们通过Chasing实验发现，MIR205HG敲低表达后细胞内ER的蛋白水平明显降低，ER在细胞内的降解也明显增加，MCF7细胞内ER蛋白的降解机制与临床上氟维司群上的调节ER蛋白表达降低虽然有着异曲同工的作用，但是二者的生理机制却是完全不同，氟维司群通过自身的特异性靶点结构来使得ER蛋白的水平在细胞内绝对或相对降低，我们发现的LncRNA则是通过影响细胞内ER蛋白及其相关大分子复合物的结构稳定性，从而促使ER蛋白在细胞内自发地进行降解在绝对水平上的低表达。从生理水平上讲，雌激素受体是细胞核内不可或缺的重要调控因子，ER的结合与发挥功能总是牵连着一些列下游的促癌以及抑癌基因和蛋白的表达，尤其是在以恶性表皮性癌症著称的ER+乳腺癌细胞中，癌细胞的扩散以及转移不仅是乳腺癌细胞致死率高的主要原因，更是临床上目前面临的比较棘手的治疗问题，通过进一步的研究我们也在典型的MCF7细胞系中验证了ER的强大调控作用，我们发现在MCF7细胞系中敲低了Lnc-MIR205HG以后，该细胞系的克隆增殖明显被抑制，此外上皮癌细胞转移的经典EMT(上皮间充质细胞转化途径)途径也得到了一定的抑制，我们发现在MCF7细胞细中敲低MIR205HG后细胞系内的E-cadherin 明显上调，N-cadherin蛋白水平则相应下降，这种抗生长、抗转移、促进雌激素受体降解的新颖药理机制也为我们提供了一些治疗思路和策略。因此，本发明通过敲低MCF7细胞系中的lncRNAMIR205HG基因，以期为乳腺癌的治疗、预后提供新的生物标志物和靶点。

有益效果：

本发明提供的lncRNA-MIR205HG在对雌激素响应的ER⁺乳腺癌组织中呈现高水平表达，在乳腺癌细胞对激素药物治疗产生耐药形成过程中发挥重要作用。认为低表达ER⁺乳腺癌细胞中的lncRNA-MIR205HG，能够明显促进MCF7细胞的ER蛋白降解，抑制MCF7 细胞对雌激素的响应程度，表明lncRNA-MIR205HG在乳腺癌发病和治疗过程中发挥重要作用，可作为诊断乳腺癌是否易出现耐药的新的分子标记和药物靶点。

附图说明

图1为得到的lncRNA-MIR205HG在不同组织中表达分析结果示意图，示意图显示lncRNA-MIR205HG在乳腺中的分布有偏好性和特异性表达；

图2为Real-time PCR检测MCF7-KD-MIR205HG细胞中lncRNA-MIR205HG敲低后的表达验证，其中(A)为根据lncRNA-MIR205HG序列设计的两条shRNA在MCF7 细胞中靶向敲低的表达验证；(B)为由相应siRNA序列转换过来的shRNA在MCF7细胞中靶向敲低的表达验证；

图3为Real-time PCR检测雌激素刺激后，不同的雌激素响应基因在 MCF7-KD-MIR205HG细胞系中的表达示意图；其中(A)为雌激素依赖因子TFF1在MCF7 和MCF7-KD-MIR205HG两种细胞中分别对雌激素的响应程度验证；(B)为雌激素调控基因GREB在MCF7和MCF7-KD-MIR205HG两种细胞中分别对雌激素的响应程度验证；(C) 为孕酮受体基因PGR在MCF7和MCF7-KD-MIR205HG两种细胞中分别对雌激素的响应程度验证；(D)为雌激素响应的肿瘤标志记忆CA12在MCF7和MCF7-KD-MIR205HG两种细胞中分别对雌激素的响应程度验证；

图4为敲低表达lncRNA-MIR205HG的MCF7细胞系的凋亡实验结果示意图，凋亡实验中MCF7细胞上机图；图(A)为空白对照组MCF7细胞在经过流式细胞仪时展示出来的结果示意图；图(B)为MCF7-KD-MIR205HG组乳腺癌细胞在经过流式细胞仪时的荧光检测示意图，与图(A)相比图(B)第二、三象限中的细胞数目明显增多，提示 lncRNA-MIR205HG敲低后MCF7有加速凋亡的趋势；

图5敲低表达lncRNA-MIR205HG的MCF7细胞系的周期检测结果细胞周期分布峰图；经过周期检测发现lncRNA-MIR205HG敲低的组即右边峰图中，lncRNA-MIR205HG 敲低后MCF7细胞的生长周期被明显地阻滞在了G2期；

图6为敲低表达lncRNA-MIR205HG的MCF7细胞系的划痕实验结果示意图；划痕实验中表明接种MCF7和MCF7-KD-MIR205HG两种不同的细胞在24h、48h和96h后划痕创伤愈合的结果有着明显地差异，尤其在24h以后，MCF7-KD-MIR205HG组的愈合程度显著地滞后于MCF7组；

图7为敲低表达lncRNA-MIR205HG的MCF7细胞系的克隆形成实验结果示意图，表示荧光显微镜观察慢病毒pPlk-non target或lncRNA-MIR205HG感染细胞7天后的克隆形成情况；其中(A)、(B)、(C)三幅图为接种MCF7组的三个重复孔；(D)、(E)、(F) 三幅图为接种MCF7-KD-MIR205HG细胞系的三个重复孔，经过7天的培养及结晶紫染色后发现，(A)、(B)、(C)三组的细胞增殖克隆速度要明显高于(D)、(E)、(F)三组的生长克隆速度；

图8通过CCK8实验检测了LncRNA-MIR205HG敲低后MCF7对Tamoxifen的耐受情况，Control组(MCF7)和Sh-MIR组(MCF7-KD-MIR205HG)两种细胞经过相同浓度梯度的Tamoxifen处理后，呈现出不同的细胞活力即LncRNA-MIR205HG敲低后MCF7对Tamoxifen 的药敏程度明显增加，表明靶向敲低LncRNA-MIR205HG与Tamoxifen联用后有着更好的治疗效果。

图9为检测在给雌激素刺激后，MCF7细胞系和敲低表达lncRNA-MIR205HG的 MCF7细胞系ER蛋白的表达水平，以及在MCF7细胞系中敲低后做为重要调控因子的ER 对MCF7细胞的EMT途径有什么影响。(A)为Real-time PCR检测ER的转录水平表达结果统计图；(B)为Western blot检测E2刺激前后三种MCF7细胞中ER蛋白的表达水平。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明做进一步说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规方法，或按照制造厂商所建议的条件与实验步骤。

实施例1：构建降低表达lncRNA-MIR205HG的MCF7细胞系

1.材料

1.1质粒与细胞

本发明所用的慢病毒包装系统为PLKO.1载体质粒、pMDG包装质粒、psPAX2包装质粒、PRTR 包装质粒；ER⁺乳腺癌细胞系MCF7和人胚肾上皮细胞(293T)购买自中科院上海细胞库，均培养于含有10％灭活胎牛血清(美国Thermo公司)、庆大霉素(100U/mL)、链霉素(100 μg/mL)和青霉素(100U/mL)的DMEM培养基中，培养条件为37℃、5％CO₂。

1.2试剂

限制性内切酶EcoRⅠ和AgeⅠ、T4 DNA连接酶、感受态DH5α均购自美国FermentasMBI 公司；质粒小提试剂盒(Plasmid Mini Kit I)购自美国OMEGA公司；质粒转染Lipofectamine^TM2000购自美国Invitrogen公司；Taq DNA聚合酶购自美国Promega公司；聚凝胺(polybrene，PB)、青霉素、链霉素为美国Sigma产品；

2.方法

2.1重组质粒pPLK-shLncRNA-MIR205HG的构建

2.1.1引物设计

根据Lnc-RNA的转录本序列，通过NCBI的引物设计工具(Primer BLAST)设计合成下面 10条shRNA序列：

1)MIR205HG-1shRNA-F:CCGGCATGGAGCTGACAACCATGACTCGAGTCATGGTTGTCAGCTCCATGTTTTTG

2)MIR205HG-1shRNA-R:AATTCAAAAACATGGAGCTGACAACCATGACTCGAGTCATGGTTGTCAGCTCCATG

3)MIR205HG-2shRNA-F:CCGGCTGAACTGGGTGCTTTATATCTCGAGATATAAAGCACCCAGTTCAGTTTTTG

4)MIR205HG-2shRNA-R:AATTCAAAAACTGAACTGGGTGCTTTATATCTCGAGATATAAAGCACCCAGTTCAG

5)MIR205HG-3shRNA-F:CCGGCAGAGACAGCCAGAGAGAAATTCTCGAGAATTTCTCTCTGGCTGTCTCTGTTTTTG

6)MIR205HG-3shRNA-R:AATTCAAAAACAGAGACAGCCAGAGAGAAATTCTCGAGAATTTCTCTCTGGCTGTCTCT

7)MIR205HG-4shRNA-F:CCGGCGCAGCAGCAGCAAGAGUAATTCTCGAGAATTACTCTTGCTGCTGCTGCGTTTTTG

8)MIR205HG-4shRNA-R:AATTCAAAAACGCAGCAGCAGCAAGAGTAATTCTCGAGAATTACTCTTGCTGCTGCTGC

9)MIR205HG-5shRNA-F:CCGGCGGUGAUGGGCAGAUUGGAATTCTCGAGAATTCCAATCTGCCCATCACCGTTTTTG

10)MIR205HG-5shRNA-R:AATTCAAAAACGGTGATGGGCAGATTGGAATTCTCGAGAATTCCAATCTGCCCATCACC

2.1.2shRNA引物退火反应

按诺唯赞公司的退火试剂盒推荐的引物最适浓度(100μM)，将LncRNA-MIR205HG的特异性shRNA引物以去离子水溶解，并建立以下反应体系：oligo1(100μM)1μl，oligo2(100μM)1μl，T4 DNA Lignase buffer(10×)1μl，T4 PNK 0.5μl，灭菌ddH₂O 6.5μl。置于 95℃热水中，自然降温退火。

2.1.3重组质粒pPLK-shRNA-MIR205HG的构建

用限制性内切酶EcoRⅠ和AgeⅠ分别双酶切纯化的PLKO.1载体后，用T4 DNA连接酶将其与通过2.1.2所述方法获得靶向LncRNA-MIR205HG的双链shRNA进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，筛选阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定后送至南京金斯瑞生物科技公司进行测序鉴定，将测序结果正确携带靶向LncRNA-MIR205HG的双链shRNA的重组质粒命名为 plk-KD-lncRNA-MIR205HG。

2.2重组病毒的包装

取对数生长期的293T细胞，按1.5×10⁶个/板细胞数接种在直径10cm细胞培养板内，加入 10ml不含抗生素的DMEM培养基，于37℃、5％CO₂培养箱内培养。次日当细胞汇合度达 70％-80％时，利用脂质体Lipofectamine^TM2000将携带shRNA的质粒plk-KD-lncRNA-MIR205HG、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMDG、包膜质粒PRTR按照5:3:1:1的比例共转染293T细胞，同时以pPLK-copGFP、psPAX2、pMDG、包膜质粒PRTR共转染293T细胞作为空载体对照。于转染10h更换新鲜的含抗生素的培养基。转染48h后利用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表达情况。转染48h和72h后分别收集细胞培养上清，将两次收集的上清混合后加入PB至终浓度为8μg/ml，然后经过0.45μm滤器过滤后分装，于-70℃保存备用。将所获得的慢病毒分别命名为Pplk(慢病毒空载体)和sh-MIR205HG(表达shRNA的重组慢病毒)

2.3shRNA在MCF7细胞中的表达及lncRNA-MIR205HG敲低效果的验证将MCF7细胞以0.5×10⁶/孔接种于6孔板中，用完全培养基培养。当细胞汇合度达70％-80/％时去除培养基，更换为不含双抗的DMEM完全培养基。将2.2所述方法得到的慢病毒经4 ℃，7000rpm离心30分钟后，收集病毒pPLK和sh-MIR205HG分别接种于6孔板中，用以感染MCF7细胞，8h后吸弃上清，加入新鲜的完全培养基。于48h后经荧光显微镜观察GFP 的表达情况；感染72h后，以汇合度达75％的MCF7细胞(约10⁶-10⁷)为对象，进行传代冻存。

实例2：MCF7-KD-MIR205HG细胞系和正常MCF7细胞系中的lncRNA-MIR205HG的验证

1.材料

1.1细胞

实验所用到的MCF7细胞培养方法同实施例1。

1.2试剂

含EDTA胰酶消化液，购上海碧云天生物技术研究所；

Reagent购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒(DDR037A)南京诺唯赞生物科技有限公司。荧光实时(Real-time)定量 PCR(polymerase chain reaction)所用的SYRB Premix Ex Taq^TM(TliRNaseH Plus)试剂盒为南京诺唯赞生物有限公司生产。Real-time PCR特异性引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

2.方法

2.1提取总RNA

以构建好的MCF7细胞系为对象，用60cm的碟子培养，待细胞长至70％-80％密度时，用胰酶消化收集细胞，加入400μl

Reagent后置于室温(15-30℃)使核蛋白复合物完全分离。5min后加入0.2ml氯仿，盖好管盖，旋窝振荡器15s，室温放置2-3min。于4℃条件下以12000g离心15min，将上层无色水相转移至另一个1.5mlEppendorf管。加入0.5ml异丙醇，室温放置10min。于4℃条件下以12000g离心10min，弃去上清。用1ml75％乙醇洗涤RNA沉淀。旋涡混合器混匀。于2-8℃条件下以7500g离心5min，弃去上清。空气干燥 5-10min后用无RNA酶的ddH₂O溶解RNA，微量加样器反复吹吸并置于55-60℃温育10min 促进RNA溶解。于260nm测定RNA浓度，提取的RNA可置于-70℃保存。

2.2引物设计

根据Lnc-RNA的转录本序列，通过NCBI的引物设计工具(Primer BLAST)设计LncRNA-MIR205HG的qPCR引物，即上游引物：ATCTCTCAAGTACCCATCTTGGA；下游引物：GGCCTCATGGTTGTCAGCTC。

2.3反转录反应

以提取的总RNA(1μg)为模板，加入以下反应体系，具体为：5×gDNA EraserBuffer 2μl， RNA样品1μg，以无RNA酶的ddH2O将反应体系补足为10μl，将混匀液置于42℃2min，再加入5X Prime Script Buffer 2 4μl，Prime Script RT Enzyme Mix I 1μl，RTPrimer Mix 1μl 将反应体系补足为20μl，置于37℃15min，85℃5S，即获得cDNA。该cDNA可用于lncRNA Real-time PCR检测。

2.4Real-time PCR反应

按照诺唯赞公司的SYBR Premix Ex Taq^TM(Tli RNaseH Plus)试剂盒推荐的引物最适浓度(10 μM)将LncRNA-MIR205HG的Real-time特异性引物以去离子水溶解，并建立以下反应体系： SYBR green 5μl，PCR Forward Primer(10μM)0.25μl，PCR Reverse Primer(10μM)0.25 μl，cDNA 6μl。以95℃30s预变性，按照95℃10s变性、60℃20s退火、70℃10s延伸过程循环40次，获得Ct值。获得的Ct值记录的CT值表示在基因扩增产生的荧光强度达到默认阈值时的循环数，基因相对表达量按照2^{-(Ct样本-Ct内参)}进行计算。

3.结果

3.1利用LncRNA-MIR205HG的差异表达对ER+乳腺癌细胞系MCF7进行敲低验证为了验证shRNA靶向LncRNA-MIR205HG的敲低效果，本发明对构建好的MCF7-KD-MIE205HG 细胞系进行Real-time PCR检测，证实LncRNA-MIR205HG在构建好的MCF7-KD-MIE205HG细胞系中的表达明显低于对照组的MCF7，提示MCF7-KD-MIE205HG细胞系构建成功。

实施例3：LncRNA-MIR205HG在MCF7细胞雌激素响应过程中的应用

1.材料

1.1细胞

实验用到的对照组MCF7细胞系、MCF7-KD-MIE205HG细胞系如同实施例2。

1.2试剂

Real-Time PCR试剂同实施例2；雌激素购买自Sigma公司；不含酚红的DMEM培养基购买自Gibco公司；CF血清购买自Gibco公司；无EDTA胰蛋白酶购买自凯基公司；细胞凋亡、周期检测试剂盒购买自凯基公司；CCK8检测试剂盒购买自碧云天公司。

2.方法

2.1Real-Time PCR实验

2.1.1细胞无雌激素处理及刺激以构建好的MCF7细胞系为对象，用60cm的碟子培养，待细胞密度为30％-40％时跟换为含 5％CF血清的无酚红DMEM培养基处理，每12h换液，细胞长至汇合度为70％-80％时加入含有浓度为100nM雌激素的5％CF血清的无酚红DMEM培养基，雌激素处理24h后收集细胞提取总RNA如实施例2所示。

2.1.2引物设计

根据雌激素响应基因CND1、KCNK5、SGK3和SMAD7的转录本序列，通过NCBI的引物设计工具(Primer BLAST)设计这四种基因的qPCR引物，即CND1上游引物：GCTGCGAAGTGGAAACCATC；下游引物：CCTCCTTCTGCACACATTTGAA；KCNK5上游引物：ACTGGCCCAATGC AATGATTT；下游引物：CTGATCCACGTCAGGCAGAG；SGK3上游引物：TCCCAGCTCTGACGAACA CA；下游引物：AGCAACATCTCGGCAGTAAAA；SMAD7上游引物：TTCCTCCGCTGAAACAGGG；下游引物：CCTCCCAGTATGCCACCAC。

2.3反转录反应及Real-time PCR反应

如实施例2所示。

2.2流式检测细胞凋亡实验以构建好的种MCF7细胞系为对象，培养方法同实施例1。待细胞长至70％-80％时用不含EDTA 的胰酶消化后300g，4℃离心5min收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞两次，每次均在300 g，4℃下离心5min，收集1-5×10⁵个细胞并用100μL 1×结合缓冲液重悬细胞。每管加入4-5 μL的FITC-Annexin V和5μL的PI工作液。室温避光冰上孵育10-15min，每管加入400μ L的PBS或1×结合缓冲液，尽快通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.3流式检测细胞周期实验以构建好的两种MCF7细胞系为对象，培养方法同实施例1。待细胞长至70％-80％用含EDTA 的胰酶消化制备细胞悬液，800g左右离心5min，沉淀细胞。小心吸除上清，残留约50微升左右的上清液，以避免吸走细胞。加入1ml冰浴预冷的PBS，重悬细胞，800g×5min。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，残留约20ul左右的PBS，以避免吸走细胞。缓慢加入 750ul冰浴预冷无水乙醇，轻轻吹打混匀，4℃固定2小时。1000g离心3-5min，沉淀细胞。加入约1ml冰浴预冷的PBS，洗涤细胞一次。用200ul预冷的PBS重悬细胞，加入Rnase A 溶液20ul，37℃水浴30min，每管细胞样品中加入400ul碘化丙啶染色液，缓慢并充分混匀后4℃避光孵育30min。尽快通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.4划痕实验

6孔板中加入2mlDMEM培养基，以3×10⁶个/孔细胞数将对照组MCF7细胞、 MCF7-KD-MIE205HG细胞接种于6孔板中，37℃5％CO₂培养，次日当细胞长至70％汇合度时，去除原培养基，用200ul枪头在6孔板底部平行划线，每组3个重复孔。分别在24h、 48h和96h在荧光显微镜下观察划痕愈合程度。

2.5软琼脂克隆形成实验

配制2×DMEM培养液(含有2×抗生素和20％的胎牛血清)和1.2％、0.6％两种浓度的低熔点琼脂糖溶液，维持低熔点琼脂糖溶液的温度在40℃，使其不凝固。将1.2％的琼脂糖溶液和2×DMEM培养液按照1:1比例进行混合，取1ml混合液平铺于12孔板中，室温冷却待其凝固即制成为底层琼脂。将照组MCF7细胞和MCF7-KD-MIE205HG细胞消化后制成细胞悬液、计数并调整细胞浓度为2000个/ml。取100ul细胞悬液(200个细胞)、1ml0.6％琼脂糖溶液和1ml2×DMEM，于无菌离心管中充分混匀后注入已铺有0.6％底层琼脂的6孔板中，每组设3个复孔，置37℃、5％CO₂培养箱中孵育。7天后取出培养板，荧光显微镜下观察计数形成的细胞克隆数量和大小。

2.6CCK8检测细胞对Tam的药敏试验以构建好的两种MCF7细胞系为对象，培养方法同实施例1。待细胞长至70％-80％用含EDTA 的胰酶消化制备细胞悬液，800g左右离心5min，沉淀细胞。加入1ml的新鲜DMEM完全培养基重悬细胞，用细胞计数板技术后按3000个/孔接种于96孔板中，分别做空白、Control、 1.5μΜ、3.0μΜ、6μΜTam组别，待细胞贴壁加药处理24h后每孔加10μlCCK8试剂， 37℃培养3h，用酶标仪450nm波长测OD值按照计算公式：

3.结果

3.1LncRNA-MIR205HG在MCF7细胞雌激素响应能力的影响

为了验证LncRNA-MIR205HG是否能够影响MCF7对雌激素的响应能力，本发明实验通过Re al-Time PCR实验检测雌激素刺激后不同响应基因在MCF7-NON Target和MCF7-KD-MIR205H G两种细胞系内的表达情况，发现敲低LncRNA-MIR205HG后MCF7-KD-MIR205HG细胞系内雌激素基因表达明显降低(图3)，提示LncRNA-MIR205HG具有抑制MCF7细胞雌激素响应的能力。

3.2LncRNA-MIR205HG对细胞凋亡和周期的影响

为了验证LncRNA-MIR205HG是否能够影响MCF7细胞的增殖能力，本发明实验通过流式细胞术检测了MCF7-KD-MIE205HG细胞系的凋亡和周期情况，发现敲低LncRNA-MIR205HG后， MCF7细胞出现明显的细胞凋亡所占比例明显多于对照组细胞(图4)，细胞周期相比于对照组也有明显地阻滞作用(图5)，提示LncRNA-MIR205HG具有抑制MCF7细胞凋亡，促进M CF7分裂的作用。

3.3LncRNA-MIR205HG对MCF7细胞迁移和增殖能力的影响

为了验证LncRNA-MIR205HG是否能够影响MCF7细胞的增殖能力，本发明实验通过划痕实验检测了LncRNA-MIR205HG敲低后MCF7不同时间段的细胞增殖情况，发现敲低LncRNA-MIR205HG第二天起，MCF7细胞的增殖速度明显慢于对照组细胞(图6)，提示LncRNA-MIR205HG具有促进MCF7细胞增殖的作用。

通过软琼脂克隆形成实验观察LncRNA-MIR205HG对MCF7细胞恶性程度的影响，当MCF7-KD-MIE205HG细胞培养7d后，可观察到对照组形成的克隆数目显著多于 MCF7-NONTarget组，并且单个克隆的体积也较大(图7)，表明敲低LncRNA-MIR205HG后明显抑制了MCF7细胞的恶性生长。

3.4LncRNA-MIR205HG对MCF7细胞药敏程度的影响

为了验证LncRNA-MIR205HG是否能够影响MCF7细胞的对临床常用促激素受体拮抗药物 Tamoxifen的敏感程度，本实验通过CCK8实验检测了LncRNA-MIR205HG敲低后MCF7对Tamoxifen的耐受情况，发现敲低LncRNA-MIR205HG后，MCF7细胞对药物的敏感度明显增加，导致加药处理24h后MCF7的死亡速度迅速增加(图8)，LncRNA-MIR205HG后比单独用Tamoxifen组的细胞存活显著降低，表明靶向敲低LncRNA-MIR205HG与Tamoxifen联用后有着更好的治疗效果。

实施例4：LncRNA-MIR205HG降低MCF7细胞对雌激素响应的机制探索

1.材料

1.1细胞和总cDNA模板

实验用到的细胞系如实施例3所示，实验用到的cDNA模板制备如实施例2中2.2.3所示。

1.2试剂

Real-Time PCR试剂同实施例2；诺唯赞公司购买蛋白Marker；雅酶凝胶试剂盒；RIPA强效蛋白裂解液购自Corning公司；PMSF；BCA蛋白定量试剂盒购自Life公司；ECL发光试剂盒购自碧云天公司；羊抗鼠二抗上海碧云天生物技术研究所；ER、GAPDH、N-Cadherin、E-Cadherin、Vimentin抗体购自优宁维生物技术有限公司。

2.方法

2.1Real-Time PCR实验

2.1.1引物设计

根据雌激素受体基因ER的转录本序列，通过NCBI的引物设计工具(Primer BLAST)设计ER 基因的qPCR引物，即上游引物：AGTTCCTAAGCAGACAGATGTTG；下游引物：CCCATTCCCTCCTTCGATCTTTA。

2.1.2反转录反应及Real-time PCR反应

反应模板使用实施例2中2.2.3中所示的模板，反应条件如实施例2所示。

2.2蛋白质提取

以构建好的两种MCF7细胞系为对象，培养方法同实施例1。待细胞长至70％-80％用预冷的 PBS清洗细胞，吸弃PBS，每10⁶细胞加250ulRIPA，冰上3min-5min后用细胞刮勺刮下细胞，用1.5mlEP管收集，冰上30min，期间用注射器反复吹打，12000rpm离心5min，收集上清即为总蛋白液，按照说明书方法测定蛋白含量。加入5×蛋白loading buffer，混匀后在金属浴上100℃煮沸10min，保存在-20℃备用。

2.3Western blot实验

将洁净的玻璃板对齐后放入夹子中组装好，根据待测蛋白分子量大小配制合适的凝胶浓度，本实验采用的浓度为10％的分离胶，将胶加进玻璃板后，加正丁醇封层，待分离胶凝固。一块胶大约需要2.5mL浓缩胶，浓缩胶一般选用4％浓度，室温20min后，待分离胶凝固，将上层正丁醇倒出并轻轻地冲洗干净，将浓缩胶缓缓倒入，沿玻璃板贴紧插入尺梳，避免气泡，室温静置并等待浓缩胶凝固。待浓缩胶凝固，将胶板取出安装到垂直电泳槽，在两块板中间加满电泳缓冲液，然后将尺梳拔出。根据浓度，按照40μg蛋白量计算各组蛋白的上样体积进行加样，在合适泳道加入4μL蛋白Marker。加入电泳缓冲液没过电泳槽电极，进行恒压电泳。先使用60V恒压在浓缩胶中电泳30min，接着调整电压至90V，直到蛋白marker 跑出清晰的条带，溴酚蓝跑至接近泳道底端，约60min。在4℃预冷半干转缓冲液(Turbo 缓冲液)，电泳结束后将合适大小的PVDF膜浸泡在无水甲醇中进行活化，接着将滤纸片浸泡在Turbo缓冲液中，按照滤纸-PDVF膜-蛋白胶-滤纸的顺序由下而上依次铺好，每一层都要保证中间没有气泡，蛋白胶轻轻移动防止破裂或产生形变，将半干转转膜仪装好，恒压 25V进行转膜。转膜时间根据蛋白大小不同而调整。将PDVF膜取出并剪去多余的膜，并在膜的一侧做上标记。封闭液使用1×TBST溶液配制5％脱脂奶粉，将膜放到抗体孵育盒中，加入封闭液室温摇床振摇1小时。一抗用一抗稀释液按适宜比例稀释。倒去封闭液，用1×TBST 溶液洗膜三次，每次10min。加入稀释过的一抗进行孵育，4℃摇床孵育过夜或室温2h。将一抗溶液倒掉，先用1×TBST溶液清洗膜三次，每次10min。二抗用1×TBST按比例稀释，室温摇床振摇2小时。二抗孵育结束后吸出，并用1×TBST溶液洗三次，每次10min，在膜上均匀滴加新鲜配置的ECL曝光液，用凝胶成像仪对PVDF膜进行成像，拍照分析。

3.结果

为了探索LncRNA-MIR205HG降低MCF7细胞对雌激素响应的机制，本发明实验通过Real-time PCR实验和Western blot实验分别从转录水平和蛋白表达水平来验证LncRNA-MIR205HG敲低后MCF7细胞中ER的表达情况，发现敲低LncRNA-MIR205HG后，MCF7细胞中ER的表达明显低于对照组细胞，提示LncRNA-MIR205HG是通过调控ER的表达水平来调控MCF7细胞对雌激素的响应程度。

在我们提供的5对shRNA序列中，通过qPCR检测验证表明3#序列敲低后与对照组差异最大(p<0.0001)，敲除效果最佳。实验结果表明LncRNA-MIR205HG敲低后能够明显降低MCF7 细胞对雌激素的响应程度、促进细胞凋亡、阻滞周期分裂、抑制乳腺癌细胞MCF7的增殖迁移能力及恶性程度，说明乳腺癌中低水平表达的LncRNA-MIR205HG参与调控肿瘤发生的多个过程，而且很好的参与雌激素响应的过程，为ER⁺乳腺癌的诊断和治疗提供了新的分子标记和药物靶标。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 靶向敲低长链非编码RNAMIR205HG 的shRNA和及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 56

<212> DNA

<213> MIR205HG-1shRNA-F(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

ccggcatgga gctgacaacc atgactcgag tcatggttgt cagctccatg tttttg 56

<210> 2

<211> 56

<212> DNA

<213> MIR205HG-1shRNA-R(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

aattcaaaaa catggagctg acaaccatga ctcgagtcat ggttgtcagc tccatg 56

<210> 3

<211> 56

<212> DNA

<213> MIR205HG-2shRNA-F(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

ccggctgaac tgggtgcttt atatctcgag atataaagca cccagttcag tttttg 56

<210> 4

<211> 56

<212> DNA

<213> MIR205HG-2shRNA-R(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

aattcaaaaa ctgaactggg tgctttatat ctcgagatat aaagcaccca gttcag 56

<210> 5

<211> 60

<212> DNA

<213> MIR205HG-3shRNA-F(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

ccggcagaga cagccagaga gaaattctcg agaatttctc tctggctgtc tctgtttttg 60

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> MIR205HG-3shRNA-R(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 6

aattcaaaaa cagagacagc cagagagaaa ttctcgagaa tttctctctg gctgtctct 59

<210> 7

<211> 60

<212> DNA/RNA

<213> MIR205HG-4shRNA-F(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 7

ccggcgcagc agcagcaaga guaattctcg agaattactc ttgctgctgc tgcgtttttg 60

<210> 8

<211> 59

<212> DNA/RNA

<213> MIR205HG-4shRNA-R(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 8

aattcaaaaa cgcagcagca gcaagagtaa ttctcgagaa ttactcttgc tgctgctgc 59

<210> 9

<211> 60

<212> DNA/RNA

<213> MIR205HG-5shRNA-F(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 9

ccggcgguga ugggcagauu ggaattctcg agaattccaa tctgcccatc accgtttttg 60

<210> 10

<211> 59

<212> DNA/RNA

<213> MIR205HG-5shRNA-R(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 10

aattcaaaaa cggtgatggg cagattggaa ttctcgagaa ttccaatctg cccatcacc 59

Claims

1.靶向敲低MIR205HG基因的shRNA序列，该序列包括MIR205HG-shRNA-F1/ MIR205HG-shRNA-R1、MIR205HG-shRNA-F2/ MIR205HG-shRNA-R2、MIR205HG-shRNA-F3/ MIR205HG-shRNA-R3、MIR205HG-shRNA-F4/ MIR205HG-shRNA-R4、MIR205HG-shRNA-F5/ MIR205HG-shRNA-R5，其中，MIR205HG-shRNA-F1为SEQ ID NO.1，MIR205HG-shRNA-R1为SEQ ID NO.2，MIR205HG-shRNA-F2为SEQ ID NO.3，MIR205HG-shRNA-R2为SEQ ID NO.4，MIR205HG-shRNA-F3为SEQ ID NO.5，MIR205HG-shRNA-R3为SEQ ID NO.6，MIR205HG-shRNA-F4为SEQ IDNO.7，MIR205HG-shRNA-R4为SEQ ID NO.8，MIR205HG-shRNA-F5为SEQ ID NO.9，MIR205HG-shRNA-R5为SEQ ID NO.10。

2.含有权利要求1所述靶向敲低MIR205HG基因的shRNA序列的重组质粒plk-shRNA-MIR205HG。

3.含有权利要求2所述重组质粒的重组病毒plk-shRNA-MIR205HG。

4.含有权利要求3所述重组病毒的重组病毒载体。

5.权利要求1所述shRNA序列在制备诊断乳腺癌的药物中的应用。