CN107753956B - 一种rax2基因的靶向抑制剂及其用途 - Google Patents
一种rax2基因的靶向抑制剂及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种RAX2基因的靶向抑制剂及其用途。一种RAX2基因的靶向抑制剂，该靶向抑制剂的基因序列为：5’‑GGAGGAACCGCACCACCTTCATTCAAGAGA‑3’（SEQ ID No.1）。该抑制剂可与RAX2基因特异性结合，使RAX2基因沉默，从而抑制RAX2对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，诱导胶质瘤细胞凋亡，达到治疗胶质瘤的目的。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种RAX2基因的靶向抑制剂及其用途。
背景技术
神经胶质瘤是中枢系统最常见的恶性肿瘤，占原发性脑肿瘤的50%-60%。目前治疗手段主要以手术为主，放化疗为辅助治疗。但是，由于胶质瘤具有侵袭性生长的生物学特征，并且胶质瘤级别越高，侵袭性越强，手术即使达到影像学和显微镜下全切，复发还是在所难免。目前主流的手术加术后同步放疗后统计显示其中位生存期仅为12个月，5年生存率不足13%。高级别神经胶质瘤预后更差，如多形性胶质母细胞瘤（Glioblastomamultiforme, GBMs）的疗效仍然很差，生存中位数仍然不超过15个月。为了提高治疗的有效性，解决其复发以及治疗抵抗的问题，从基因与分子水平上研究神经胶质瘤的发病机制，寻找新的生物标志和治疗靶点显得尤为的重要。
转录因子RAX2（retina and anterior neural fold homeobox 2, RAX2）定位于染色体19p13.3，由三个外显子组成，可与蛋白物质协同作用并招募参与转录机制的其他蛋白共同作用和激活转录过程。RAX2的突变与视网膜营养不良相关。软件预测BDNF-AS的Alu元件和RAX2 mRNA的3’-UTR的Alu元件存在结合位点。但是，目前关于转录因子RAX2在胶质瘤中的表达和作用仍尚未见报道。
RNA 干扰技术的原理是利用Dicer酶切割RNA分子，形成RNA沉默复合体，靶向结合目标RNA分子进而降解RNA分子的过程。本发明希望利用RNA干扰技术研制RAX2基因的抑制剂，在胶质瘤基因治疗领域发挥作用。
目前，RAX2在胶质瘤发生发展中的作用以及相关机制还未见报道，关于RAX2在胶质瘤基因治疗方面的应用目前还一片空白。因此，研制一种RAX2相关的药物成为目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明人经实验证明RAX2基因在胶质瘤在组织中高表达，抑制RAX2的表达能够抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力，并促进其凋亡。
本发明的目的在于利用RNA干扰技术，设计并提供一种RAX2基因靶向抑制剂及其用途，该抑制剂可与RAX2基因特异性结合，使RAX2基因沉默，从而抑制RAX2对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，达到治疗胶质瘤的目的。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明提供了一种RAX2基因的靶向抑制剂，该靶向抑制剂的基因序列为：
5’-GGAGGAACCGCACCACCTTCATTCAAGAGA-3’（SEQ ID No.1）
本发明进一步提供了该靶向抑制剂能够抑制RAX2基因表达的shRNA序列，所述shRNA模板序列包括正义链和反义链，所述正义链和反义链分别为：
正义链：
5’-
CACCGGAGGAACCGCACCACCTTCATTCAAGAGATGAAGGTGGTGCGGTTCCTCCTTTTTTG-3’（SEQID No.2）
反义链：
5’-
GATCCAAAAAAGGAGGAACCGCACCACCTTCATCTCTTGAATGAAGGTGGTGCGGTTCCTCC-3’（SEQID No.3）。
进一步地，本发明提供了一种转录上述的shRNA 的转录产物，序列为：
5’-GGAGGAACCGCACCACCTTCATTCAAGAGATGAAGGTGGTGCGGTTCCTCCTT-3’ （SEQ IDNo.4）。
优选的，该抑制剂为任何药物治疗学上可接受的的剂型。
优选的，该抑制剂的剂型为注射制剂。
优选的，该抑制剂为任何药物治疗学上可接受的的剂量。
一种RAX2基因抑制剂作为制备用于治疗人脑胶质瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
1、本发明靶向抑制剂特异性强，抑制RAX2基因的表达。
2、RAX2基因抑制剂靶向治疗，能显著降低传统治疗药物的耐药问题。
3、实验已证明在体外细胞学水平上应用，治疗效果确切，无不良反应发生。
附图说明
图1为应用Real-time PCR检测RAX2基因在正常脑组织和不同级别胶质瘤组织中的表达水平图。
图2.为应用Western blot实验检测RAX2基因在正常脑组织和不同级别胶质瘤组织中的表达水平的电泳图和柱状图。
图3为应用Real-timePCR检测应用RAX2基因靶向抑制剂后，U87、U251胶质瘤细胞中的RAX2表达水平显著下调的柱状图。
图4为CCK-8细胞活力法检测应用RAX2基因抑制剂后，显著抑制U87、U251胶质瘤细胞增殖的柱状图。
图5为Transwell细胞迁移实验检测应用RAX2基因抑制剂后，显著抑制U87、U251胶质瘤细胞迁移的照片和统计图。
图6为Transwell细胞侵袭实验检测应用RAX2基因抑制剂后，显著抑制U87、U251胶质瘤细胞侵袭能力的照片和统计图。
图7为应用流式细胞仪，应用RAX2基因抑制剂后，U87、U251胶质瘤细胞凋亡显著增加的照片和柱状图。
具体实施方式
本发明主要技术方案是。
1. Real-time PCR
2. Western blot
3. shRNA的设计和干扰载体的制备
2. 干扰效率的验证
3. 细胞增殖实验
4. 细胞迁移、侵袭实验
5. 流式细胞仪检测细胞凋亡实验
实施例1
一、不同级别（I\II\III\IV级）胶质瘤细胞的制备
人胶质母细胞瘤细胞系U87和U251购自上海研究院生命科学细胞资源中心，培养基使用的都是含10%血清、100U/ml盘尼西林和100µg/ml链霉素的DMEM高糖培养液或F12高糖培养液，培养环境是含有5%C02且湿润的37℃恒温培养箱。
二、实时定量PCR检测RAX2基因在正常脑组织和不同级别胶质瘤组织中的表达水平。
（1） Trizol法提取细胞中的总RNA。
（2）一步染料法qRT-PCR检测RAX2的表达：
测定CT值，以GAPDH为内参照，以2-△△Ct表示RAX2的相对表达量。
检测RAX2基因在正常星形胶质细胞和不同级别胶质瘤细胞中的表达水平，结果如图1所示，RAX2基因在胶质瘤细胞中的表达显著上调。
二、Western blot检测RAX2基因在正常脑组织和不同级别胶质瘤组织中的表达水平。
(1) 收集细胞，加入RIPA蛋白裂解液，震荡摇匀，冰上静置30min, 4°C条件下12000g 离心30min；
(2) 获得并收集上清并采用BCA法测定样品的蛋白浓度；
(3) 取40mg蛋白与5x上样缓冲液混合(1:4)，煮沸5min变性；
(4) 将变性蛋白加入8-10%不等的SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；
(5) 转膜：电压100V，电流120mA, 90min-200min；
(6) 5%脱脂牛奶封闭2h；
(7) 一抗稀释液以一定比例稀释相关抗体封膜，4°C过夜；
(8) TTBS洗5min，3次，加相应二抗，室温摇床上孵育2h；
(9) ECL发光，照相，quantity one软件定量分析。
检测RAX2基因在正常星形胶质细胞和胶质瘤细胞中的表达水平，结果如图2所示，RAX2蛋白在胶质瘤细胞中的表达显著上调，其中，在高级别胶质瘤组织中的表达上调更为显著。
三、 RAX2基因抑制剂的制备和应用
设计RAX2基因的干扰序列，选定靶向人RAX2基因并特异性抑制RAX2 基因表达的靶基因序列如下：
5’-GGAGGAACCGCACCACCTTCATTCAAGAGA-3’（SEQ ID No.1）
在NCBI 的同原序列比对分析nucleotide blast 中输入GGAGGAACCGCACCACCTTCATTCAAGAGA序列进行比对分析，结果表明该序列和人的其它mRNA基因没有高度同源性，可作特异性干扰RAX2基因的特异性序列。
针对以上靶序列设计靶向人RAX2基因而抑制RAX2基因表达的shRNA序列如下，包括正义链和反义链，此shRNA 序列为：
正义链：
5’-
CACCGGAGGAACCGCACCACCTTCATTCAAGAGATGAAGGTGGTGCGGTTCCTCCTTTTTTG-3’（SEQID No.2）
反义链：
5’-
GATCCAAAAAAGGAGGAACCGCACCACCTTCATCTCTTGAATGAAGGTGGTGCGGTTCCTCC-3’（SEQID No.3）。转录上述的shRNA 的转录产物，序列为：
5’-GGAGGAACCGCACCACCTTCATTCAAGAGATGAAGGTGGTGCGGTTCCTCCTT-3’ （SEQ IDNo.4）。
将以上序列信息设计并合成相应质粒，作为RAX2基因抑制剂。RAX2基因抑制剂转染：sh-NC、sh-RAX2的质粒U6/GFP/Neo,使RAX2表达沉默，不含有RAX2序列或shRNA的空质粒为实验阴性对照；应用24孔培养板培养胶质瘤细胞，当细胞生长达到80%左右时进行转染；配置转染需要的质粒、Opti-MEM®Ⅰ和LTX and Plus reagent (Life Technologies)转染试剂。A管：一个孔按照1μg质粒DNA溶解于50 μl Opti-MEM®Ⅰ+1μl p3000，放置5 min，B管：孔按照1μl LTX and Plus溶解于50 μl Opti-MEM®Ⅰ中；将A、B两管混匀后静置5 min；吸出培养液，每孔加入转染混合液100 µL，再加入EBM-2培养液400 µL；48 h后用含有浓度为0.4mg/mL抗生素G418的培养基进行筛选，不断增加G418的浓度，大约4周后得到能够稳定沉默RAX2的细胞系。在后续实验中分为3组，分别是：正常组;转染RAX2沉默空质粒的空白对照组；转染RAX2沉默质粒的抑制剂组。
检测应用RAX2基因抑制剂后，相对于正常组和空白对照组，胶质瘤细胞中的RAX2表达水平显著下调的柱状图（如图3所示）。
四、分别测定正常组，空白对照组和抑制剂组CCK-8检测胶质瘤细胞活力
（1）细胞计数方法同上。U87和U251分别铺于96孔培养板中，每孔大约2000个细胞，每组细胞铺五个副孔。
（2）在37℃细胞孵箱中分别培养48小时，分别在不同的时间点取出培养板每孔加入Cell Counting Kit-8 10µl后放入37℃恒温培养箱中1小时。
（3）利用酶标仪，选取波长450nm，测定每孔的OD值。
应用CCK-8细胞活力法，检测应用RAX2基因抑制剂后，相对于正常组和空白对照组，显著抑制了U87、U251胶质瘤细胞的增殖（如图4）。
五、分别测定正常组，空白对照组和抑制剂组胶质瘤细胞Transwell迁移、侵袭能力实验
1. 细胞迁移能力的检测
（1）在24孔细胞培养板内每孔加入500µl含有10%血清的DMEM高糖培养
液，孔内放置孔径为8µm的transwell小室。
（2）细胞计数后，将不同组细胞用不含有血清的DMEM高糖培养液将其吹成细胞悬液，分别均匀地铺在上室里面，每孔小室里加入100µl细胞悬液大约含10000个细胞。放入37℃恒温培养箱中培养24小时。
（3）24 小时后取出小室，用棉棒将上室内面没有迁移过去的细胞擦净，按照甲醇∶冰乙酸 = 3∶1的比例配置固定液。
（4）将小室放入固定液中，使小室底面的细胞固定30分钟。
（5）用PBS清洗小室后晾干。配制吉姆萨染液，染液：工作液1:9。将吉姆萨染液滴与小室底面，染色1小时。
（6）用PBS清洗两次，在倒置400×显微镜下观察细胞的迁移情况，随机取每组细胞的5个视野进行细胞个数的统计，以此代表细胞的迁移能力。
通过Transwell细胞迁移实验，检测应用RAX2基因抑制剂后，相对于正常组和空白对照组，显著抑制了U87、U251胶质瘤细胞的迁移（如图5）。
2. 细胞侵袭能力的检测
（1） 在小室内面均匀铺上50µl浓度为500ng/µl的基质胶Matrigel，放入37℃
恒温箱中4小时使其凝固。
（2） 然后再铺上细胞悬液，方法同迁移实验。
通过Transwell细胞侵袭实验，检测应用RAX2基因抑制剂后，相对于正常组和空白对照组，显著抑制了U87、U251胶质瘤细胞的侵袭（如图6）。
六、正常组，空白对照组和抑制剂组细胞凋亡实验
（1）用预冷的PBS清洗细胞两次。用不含EDTA的胰酶消化，将细胞轻轻吹打成细胞悬液后转移至1.5ml离心管中，1000rpm离心3分钟收集细胞。
（2）用PBS继续清洗，1000rpm离心3分钟，离心后倒掉上清。重复两次。
（3）将工作液10×binding buffer稀释十倍。每管加入100µl Binding Buffer，悬浮细胞。
（4）每管相继加入5µl Annexin V-PI和5µl FITC混匀，室温避光15分钟。
（5）上机前向每管加入400µl1×binding buffer，吹打均匀后，上流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。
应用流式细胞仪检测应用RAX2基因抑制剂后胶质瘤细胞的凋亡情况，证实应用RAX2基因抑制剂后，相对于正常组和空白对照组，胶质瘤细胞的凋亡显著增加（如图7）。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医科大学附属盛京医院
<120> 一种RAX2基因的靶向抑制剂及其用途
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggaggaaccg caccaccttc attcaagaga 30
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caccggagga accgcaccac cttcattcaa gagatgaagg tggtgcggtt cctccttttt 60
tg 62
<210> 3
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gatccaaaaa aggaggaacc gcaccacctt catctcttga atgaaggtgg tgcggttcct 60
cc 62
<210> 4
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggaggaaccg caccaccttc attcaagaga tgaaggtggt gcggttcctc ctt 53
Claims (5)
1.RAX2基因的靶向抑制剂作为制备用于治疗人脑胶质瘤药物中的应用；
所述RAX2基因的靶向抑制剂为能够抑制RAX2基因表达的shRNA序列，所述shRNA模板序列包括正义链和反义链，所述正义链和反义链分别为： 正义链： 5’- CACCGGAGGAACCGCACCACCTTCATTCAAGAGATGAAGGTGGTGCGGTTCCTCCTTTTTTG-3’（SEQ ID No.2）； 反义链： 5’- GATCCAAAAAAGGAGGAACCGCACCACCTTCATCTCTTGAATGAAGGTGGTGCGGTTCCTCC-3’（SEQ IDNo.3）。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，转录所述shRNA序列的转录产物，序列为：5’-GGAGGAACCGCACCACCTTCATTCAAGAGATGAAGGTGGTGCGGTTCCTCCTT-3’（SEQ ID No.4）。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，该靶向抑制剂为任何药物治疗学上可接受的剂型。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，该靶向抑制剂的剂型为注射制剂。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，该靶向抑制剂为任何药物治疗学上可接受的剂量。
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| Evolution of the Rax family of developmental transcription factors in vertebrates;Daniela P.Orquera et al.;《Mechanisms of Development》;20161110;第144卷;第163-170页 * |
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