CN114717322A

CN114717322A - 一种长链非编码rna st8sia6-as1作为垂体瘤分子标志物的应用

Info

Publication number: CN114717322A
Application number: CN202210494584.7A
Authority: CN
Inventors: 李作伟
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2022-05-07
Filing date: 2022-05-07
Publication date: 2022-07-08

Abstract

本发明提供了一种长链非编码RNA ST8SIA6‑AS1作为垂体瘤分子标志物的应用，属于肿瘤分子生物学技术领域，具体为一种长链非编码RNA ST8SIA6‑AS1作为垂体瘤分子标志物的应用，所述应用包括长链非编码RNA ST8SIA6‑AS1的检测试剂在制备垂体瘤诊断与预后检测试剂盒中的应用；或长链非编码RNA ST8SIA6‑AS1的抑制剂在制备治疗垂体瘤的药物中的应用；其中，长链非编码RNA ST8SIA6‑AS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明为垂体瘤提供一个潜在的治疗靶点。

Description

一种长链非编码RNA ST8SIA6-AS1作为垂体瘤分子标志物的应用

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，具体涉及一种长链非编码RNA ST8SIA6-AS1作为垂体瘤分子标志物的应用。

背景技术

垂体腺瘤是一种常见的颅内肿瘤，由于其细胞增殖和内分泌特性，具有不同的生物学行为。垂体腺瘤的恶性虽然罕见，但有些垂体腺瘤可浸润鞍区周围组织，破坏正常结构，浸润血管壁，侵袭海绵状窦及周围脑组织。垂体腺瘤的发生可能与细胞周期的调节、癌基因的表达和抑癌基因的缺失有关。但其发病机制尚不清楚。

上皮-间充质转化(EMT)的特征是肿瘤细胞中内皮粘附因子减少，细胞骨架收缩蛋白增加。因此，细胞形态转化为间充质细胞，上皮细胞从基底膜分离。因此，它为肿瘤细胞的迁移提供了准备。血管生成拟态(VM)是一种存在于高度恶性组织如卵巢癌、乳腺癌和肝癌中的血液供应途径。这种不寻常的供血通道是由可塑恶性细胞与细胞外基质一起变形而形成的，不受内皮细胞的参与。因此，有必要进一步研究模拟血管生成的分子机制。通过EMT，肿瘤细胞获得了较高的迁移能力。更重要的是，有报道称接受EMT的肿瘤细胞更容易形成血管生成拟态。以往对EMT的研究主要集中在蛋白质水平。随着基因测序技术的不断进步，人们发现非编码RNA在肿瘤细胞的转移中发挥着重要作用。

长链非编码RNA(LncRNAs)覆盖了人类DNA中的大部分非编码信息。LncRNA占整个基因组的90％以上，它们构成了一个广泛而复杂的分子群。越来越多的研究证明，LncRNA在细胞分化、迁移和凋亡过程中可以进行分子交换，通过改变基因表达模式来改变细胞状态。LncRNA可以通过顺式或反式调控发挥其功能。此外，LncRNA可以与蛋白质或mRNA分子相互作用，从而影响其稳定性。重要的是，LncRNA在垂体腺瘤中发挥重要作用。据报道，ST8SIA6-AS1在其他肿瘤中发挥重要作用。具体来说，ST8SIA6-AS1通过吸收miR-5195-3p调控HOXB6促进肝细胞癌。在乳腺癌中，ST8SIA6-AS1通过p38 MAPK信号通路促进增殖、迁移和侵袭。然而，ST8SIA6-AS1在垂体腺瘤中的作用尚不清楚。

许多研究表明了miRNAs在肿瘤生物学过程中的重要性，包括肿瘤的发生、进展和转移。miRNAs可能在垂体腺瘤的肿瘤发生中发挥了比之前预期的更大的作用。最近的研究发现HOXA9基因在胚胎发育、造血调节和肿瘤发育中编码一个重要的转录调控因子。必须阐明HOXA9表达的调控机制才能理解肿瘤特别是垂体腺瘤的发病机制。

在体内，miRNA可以通过结合mRNA导致基因沉默，而LncRNA可以通过竞争性地结合miRNA来调节基因表达。LncRNA可以通过应答元件与microRNA结合从使miRNA失效，从而屏蔽miRNA的转录抑制效应。这一LncRNA-miRNA-下游基因调节通路，是非编码RNA参与肿瘤调节的重要途径。

肿瘤是基因疾病，其生物学基础是基因的异常，致病因素是体细胞基因突变导致正常基因表达紊乱，从而影响细胞的生物学活性与遗传活性，形成与正常细胞在形态，代谢与功能上均有所不同的肿瘤细胞。肿瘤的发生是多基因、多步骤突变的结果，不同基因的突变与不同强度的突变，导致发生不同的疾病。

现有技术中尚未有长链非编码RNA ST8SIA6-AS1关联侵袭性垂体瘤的报道。现有技术中长链非编码RNA ST8SIA6-AS1的调控机制主要在于miR-338-3p/NONO通路等，与本发明的调控路径不同。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种长链非编码RNA ST8SIA6-AS1作为垂体瘤分子标志物的应用。

本发明的技术方案如下：

一种长链非编码RNA ST8SIA6-AS1作为垂体瘤分子标志物的应用，所述应用包括长链非编码RNA ST8SIA6-AS1的检测试剂在制备垂体瘤诊断与预后检测试剂盒中的应用；或长链非编码RNA ST8SIA6-AS1的抑制剂在制备治疗垂体瘤的药物中的应用；其中，长链非编码RNA ST8SIA6-AS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明优选的，所述垂体瘤包括：侵袭性垂体瘤和非侵袭性垂体瘤。

进一步优选的，所述垂体瘤为侵袭性垂体瘤。

根据本发明优选的，所述长链非编码RNA ST8SIA6-AS1的检测试剂为荧光定量PCR检测试剂。

进一步优选的，所述荧光定量PCR检测试剂包括根据核苷酸序列为SEQ ID NO.1的长链非编码RNA ST8SIA6-AS1设计的特异性引物，特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

根据本发明优选的，所述治疗垂体瘤的药物包括核酸分子、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、干扰慢病毒，均为长链非编码RNA ST8SIA6-AS1的抑制剂。

进一步优选的，所述核苷酸分子包括：小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)短发夹RNA(shRNA)、反义寡核苷酸。

一种用于垂体瘤诊断与预后检测的荧光定量PCR试剂盒，包括根据核苷酸序列为SEQ ID NO.1的长链非编码RNA ST8SIA6-AS1设计的特异性引物，特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

有益效果

1、本发明首次发现LncRNA ST8SIA6-AS1在侵袭性PA和非侵袭性PA中的表达水平不一，Lnc ST8SIA6-AS1在侵袭性PA中表达量显著高于非侵袭性PA。

2、本发明所述一种垂体瘤新的治疗靶标，采用体内实验与体外实验方法进行验证，证实了LncRNA ST8SIA6-AS1通过上调HOXA9促进EMT进而影响肿瘤侵袭的机制，对了解垂体瘤的发病机制，制定新的治疗策略具有十分重要的意义，为垂体瘤提供一个潜在的治疗靶点。

附图说明

图1是ST8SIA6-AS1在非侵袭性垂体瘤和侵袭性垂体瘤中的表达的检测图；

图中：Non-invasive为非侵袭性垂体瘤，Invasive为侵袭性垂体瘤。

图2是ST8SIA6-AS1基因下调抑制垂体瘤的增殖和侵袭的检测图；

图中：A为EDU的免疫荧光；B为细胞侵袭实验；C为细胞划痕实验；

GH3为垂体瘤细胞系，GTI-1为垂体瘤细胞系；

sh-NC为ST8SIA6-AS1敲减质粒的对照质粒，sh-ST8SIA6-AS1为ST8SIA6-AS1的敲减质粒；

Edu为目的蛋白表达量，DAPI为细胞核，Merge为目的蛋白和细胞核共定位组合。

图3是ST8SIA6-AS1基因下调抑制垂体腺瘤细胞EMT的检测图；

图中：A-G分别为A-G相关基因的PCR实验；

GH3为垂体瘤细胞系，GTI-1为垂体瘤细胞系；

sh-NC为ST8SIA6-AS1敲减质粒的对照质粒，sh-ST8SIA6-AS1为ST8SIA6-AS1的敲减质粒。

图4是小鼠模型体内实验检测图；

图中：A-D分别为A：肿瘤图片；B：肿瘤体积；

C：肿瘤重量；D接种不同种肿瘤细胞后ST8SIA6-AS1的转录水平；

图5是HOXA9被miR-5195-3p直接靶向检测图；

图中：A-B分别为A：计算机模拟下二者的结合；

B：双荧光素酶实验验证下二者的结合；

miR-NC为miR-140-5p空载体对照、miR-140-5p为miR-140-5p过表达载体；

pmiGLO-HOXA9-WT为HOXA9的野生型载体、pmiGLO-HOXA9-MT为HOXA9的突变型载体。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中未详加说明的内容均按本领域现有技术。

长链非编码RNA ST8SIA6-AS1以下简称“ST8SIA6-AS1”。

侵袭性垂体腺瘤是指向周围组织侵袭生长的垂体腺瘤，介于良性肿瘤和恶性肿瘤之间。

垂体腺瘤简称为垂体瘤，属于内分泌系统的一种肿瘤。

实验例1

采用qRT-PCR检测ST8SIA6-AS1和HOXA9在非侵袭性垂体腺瘤和侵袭性垂体腺瘤中的表达水平，具体步骤如下：

1.1引物设计：从基因文库NCBI中查到长链非编码RNA ST8SIA6-AS1的序列如SEQID NO.1所示、HOXA9的基因ID是3205，转录本是NM_152739.4，用Primer软件设计引物如下：

ST8SIA6-AS1的引物如下：

上游引物：5'-TTCAGTGGCATGGTTCAGTC-3'SEQ ID NO.2；

下游引物：5'-CTCAGAGGCGACAGGGGTTTC-3'SEQ ID NO.3；

HOXA9的引物如下：

上游引物：5'-ATGCTTGTGGTTCTCCTCCA-3'SEQ ID NO.4；

下游引物：5'-AGTTGGCTGCTGGGTTATTG-3'SEQ ID NO.5。

1.2临床样本收集：收集2018年1月至2020年10月在山东省中医院诊断的30例非侵袭性垂体腺瘤和30例侵袭性垂体腺瘤进行分析。所有患者均接受鼻内窥镜手术切除垂体腺瘤。垂体腺瘤组织于术后30min内保存于液氮中。垂体腺瘤的诊断可通过临床表现、激素类型、磁共振成像(MRI)结果以及所有垂体激素的组织病理学分析和免疫组化染色来确定。本发明经山东中医药大学伦理委员会审核批准。

1.3qRT-PCR检测：根据产品说明，使用Trizol试剂提取总RNA。使用Nano-Drop1000测定RNA的纯度和浓度。采用cDNA合成试剂盒从总RNA(5μg)中合成cDNA。采用BioRadCFX-96体系，SYBR Greenq PCR Super Mix-UDG试剂盒，按照说明书进行qRT-PCR检测。

PCR扩增体系见表1：

表1

PCR扩增条件为50℃2min，95℃2min，95℃15s，60℃30s，40个循环。

1.4实验结果：相较于非侵袭性垂体腺瘤，侵袭性垂体腺瘤中RNA ST8SIA6-AS1(见图1)和HOXA9表达量显著升高。

实验例2

检测ST8SIA6-AS1对GH3和GTI-1垂体腺瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响，具体步骤如下：

2.1细胞培养：GH3和GTI-1细胞均在含体积分数10％胎牛血清的完全培养基中培养。在37℃、5％CO₂的培养箱中培养。融合80％的细胞后，用0.25％胰蛋白酶消化细胞。以1:3的比例进行传代培养。

2.2细胞转染：将细胞数量调整为2×10⁸/mL，计数后接种到相应的培养板中。将GH3和GTI-1细胞以每孔1×10⁵细胞的密度接种到6孔板中。培养一段时间后，用无血清培养基(Ham's F-12K培养基)代替培养基。继续培养24小时。在50μL的无血清培养基中加入10μL的pcDNA3.1-ST8SIA6-AS1或sh-ST8SIA6-AS1和对照pcDNA3.1-NC或sh-NC。轻轻混合，在室温下静置5分钟。将脂质体2μL与上述混合溶液5μL混合，静置20分钟。轻轻摇匀，37℃孵育6小时。将无血清培养基更换为完全培养基(Ham's F-12K+15％HS+2.5％FBS+1％P/S)，继续培养24小时。Lipofectamine 2000为转染试剂。检测转染效率后，收集细胞用于后续实验。

2.3 CCK8实验：96孔板每孔培养7000个细胞。分组为对照组和sh-ST8SIA6-AS1组。按CCK-8细胞活性检测试剂盒说明书测定细胞增殖率。用酶标仪测定波长490nm处的OD值。细胞增殖率＝(过表达组OD值-空白组OD值)/空白组OD值×100％。

实验结果表明ST8SIA6-AS1与细胞侵袭能力显著相关。

2.4 Transwell小室试验：细胞以每孔1×10⁵细胞的密度接种到6孔板中。在37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。消化离心后，用2×10⁴细胞/mL无血清培养基(Ham's F-12K培养基)稀释细胞，制备细胞悬液。细胞悬液以200μL/孔加入Transwell室。同时在Transwell中添加体积分数10％TBS和500μL培养基(Ham's F-12K+15％HS+2.5％FBS+1％P/S)。在37℃、5％CO₂的培养箱中培养。24小时后取出，并从Transwell上腔吸取多余的液体。上腔加入结晶紫染料。5分钟后，用自来水冲洗染料。再次，轻轻旋转上腔内的棉签，将水抽干。将载玻片放在显微镜载玻片上。把Transwell洞倒放在上面，拍张照片。在100×视野下，计数。上述实验重复3次，取平均值。

对照组为未干扰ST8SIA6-AS1的肿瘤细胞，实验组为干扰ST8SIA6-AS1的肿瘤细胞

2.5实验结果：相较于对照组，sh-ST8SIA6-AS1组细胞增殖活性下降、迁移和侵袭细胞数目降低，侵袭迁移活性减弱，见图2。

实验例3

用qRT-PCR检测对细胞的EMT能力的影响，具体步骤如下：

3.1 PCR：实验方法同上。

对照组为未敲低ST8SIA6-AS1的肿瘤细胞组，实验组为ST8SIA6-AS1敲低组。

3.2实验结果：见图3，在GH3和GTI-1细胞中，sh-ST8SIA6-AS1组E-cadherin表达量上升，Vimentin,N-cadherin,SNAIL1,SLUG,β-catenin and TWSIT1表达量下降。

实验结果表明：ST8SIA6-AS1与细胞侵袭相关基因表达呈明显正相关。

实验例4

在体内小鼠模型中监测ST8SIA6-AS1干扰对肿瘤体积和重量的变化的影响具体步骤如下：

4.1裸鼠皮下成瘤实验：取对数生长的垂体腺瘤细胞，用0.25％胰蛋白酶消化。在无血清培养基中洗涤，收集细胞并计数。将活细胞浓度调整至5×10⁷/mL。每只裸鼠背部右前肢柔软皮肤处接种，剂量为0.2mL/只。每只裸鼠皮下接种1点。观察四个星期。用二氧化碳释放装置处死裸鼠。由于皮下移植物瘤基本为卵圆形，用游标卡尺测量肿瘤结节的长径(mm)和短径(mm)。肿瘤体积计算公式如下:体积(mm3)＝长度(mm)×宽度(mm)2/2。每天定时用游标卡尺测量长径和短径。绘制肿瘤裸鼠皮下移植瘤体积曲线。

对照组为接种正常肿瘤细胞的裸鼠，实验组为接种ST8SIA6-AS1干扰肿瘤细胞的裸鼠。

4.2实验结果：见图4，相较于对照组，sh-ST8SIA6-AS1组小鼠肿瘤重量下降，体积减小。

实验结果表明：ST8SIA6-AS1与肿瘤细胞体内成瘤能力呈明显正相关。

实验例5

5.1双荧光素酶实验：通过PCR克隆得到含有miR-5195-3p靶序列的HOXA9或ST8SIA6-AS 3'UTR端。将其插入pGL3质粒荧光素酶报告基因下游限制位点。质粒命名为WT-HOXA9或ST8SIA6-AS-3'UTR。将合成的HOXA9或ST8SIA6-AS 3’-UTR突变序列插入pGL3质粒荧光素酶报告基因下游的NheI和XhoI酶切位点。指定为MUT-HOXA9或ST8SIA6-AS-3'UTR作为阴性对照。分别将WT/Mut-HOXA9或ST8SIA6-AS3'UTR与miR-5195-mimic/miR-NC转染到细胞中。转染48h后加入100μL PBL。室温振荡15分钟后，将20μL的产物加入等体积的LAR II溶液中检测荧光强度。完成后，加入20μL停止液。再次检测荧光强度，计算相对荧光强度。

对照组：miR-5195-3p+pmiGLO-HOXA9-WT；

实验组：miR-5195-3p+pmiGLO-HOXA9-MT。

5.2实验结果：见图5，在垂体腺瘤中，miR-5195-3p直接靶向HOXA9。MiR-5195-3p是ST8SIA6-AS1的靶基因。ST8SIA6-AS1基因下调可抑制垂体腺瘤的增殖、侵袭、血管生成和EMT。HOXA9的表达介导了ST8SIA6-AS1的生物学效应。ST8SIA6-AS1通过miR-5195-3p调控HOXA9的表达，促进垂体腺瘤的EMT。

SEQUENCE LISTING

<110> 李作伟

<120> 一种长链非编码RNA ST8SIA6-AS1作为垂体瘤分子标志物的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1811

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

attcaggcct ccgccagctt ctaggccctg gggatggtct ttcacctccc tctttctgat 60

ctctttttca tgctcctcct tgctccaaag aaaagccgga tggcaaaaga gcccagaacc 120

tattggaact gacaaaatca agtcacggcg cctacaaaga tgaggggcag attctggctg 180

ccttttaatt tcgtccttca cctgatatct gtgccagaga atgataaaaa tcataataaa 240

ggaaataatg gaagaggaga cttatgttac tggggacatc taacataatt attttcctga 300

ttcagtggca tggttcagtc ttccaggagt tctgctacag agaagagagt aacccccatc 360

catcatggcc aaagcaccca gtcaggctcc gctctggatc cagcccgaca aatgcaaccc 420

ttgaataggg tttgtgcaag caaactggat gacgaccgaa gaaaccctgt cgcttctgag 480

aagacaccca atccaagaat gaaagcatca ggttcaatac ctaggaactc ctgtagaggg 540

tgttgtggaa tcttctttaa aagaacaaaa caaggcaaaa caaagtttaa tagggtagag 600

cagccaggtg tggtgggtca tgcctgtaat ctcagcaatt tgggaggcca aggcaggatc 660

tcagcaattt gggaggcgaa ggcaggcaga tcacttgagc ctaggagttc aagaccagct 720

tgggcaacat agcaagaccc tgcctatacc aaaaaaaaaa agtgaaccta ggagtatgag 780

gctgcagtaa gctgtggttg taccagtgca ctttgggagg ccaaggtagg cgggtcttct 840

gagatcgaga gtttgagacc agcctgacca acatggagaa accccgtctc tactaaaagt 900

acaaaattag ccggcatggt ggtgcatgcc tgtaatccca gctactcggg aggctgaggc 960

gggagaattg cttgaactca ggaggcagag gttgtggtga gccaagatcg cgccattgca 1020

ctccagcctg gacaacaaga gcgaaactcc atcacaaaca aacaaacaat aaacaaaaac 1080

catagagtga tttctggcca acagagcaag aaagaagtga accaatgaaa accggtccaa 1140

gtctgggagt caatatggaa aagctgccta attaatgtgg aagccccagg gaaatgatat 1200

accatgaaaa cctaacacta caaaaactag ttgtcagaca catgtgagca gtgaacagaa 1260

tcctaatatg ctggtttaac attcaaaact ggagagtgtt tgtgtatctt ctaaagactg 1320

tttggggttt atttgtggag ttcagctgag tgtcatcaga acaaagatta gtgcaaaaaa 1380

tctttcagaa atcatgccca aacatttgca tgcaccttaa ataagaaatg aaatagcaag 1440

aagagtatgt cacaataaag tataaatagc aagtgatatg tctcatcgta ctgagacagt 1500

tttataaatg aggcaaaggc cttgtcaaaa aataatgatg attttcaaaa ttctgaaacg 1560

caaaggagga aaactacttc attcagttaa caggaagcac acaagaatct ccccatcaac 1620

caagattttt tttttctata acccacgctt tgtaagacaa taatagcaaa aactataaac 1680

tagaatttgt tgaaagaaca acttctagaa tttgcccttt atgtgctgtt ttaccattgt 1740

catgtctgtc tctggtatga cttcctcatc tattagtagc ctcctaataa atttgaacaa 1800

atgaatgaat g 1811

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttcagtggca tggttcagtc 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctcagaggcg acaggggttt c 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgcttgtgg ttctcctcca 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agttggctgc tgggttattg 20

Claims

1.一种长链非编码RNA ST8SIA6-AS1作为垂体瘤分子标志物的应用，所述应用包括长链非编码RNA ST8SIA6-AS1的检测试剂在制备垂体瘤诊断与预后检测试剂盒中的应用；或长链非编码RNA ST8SIA6-AS1的抑制剂在制备治疗垂体瘤的药物中的应用；其中，长链非编码RNA ST8SIA6-AS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述垂体瘤包括：侵袭性垂体瘤和非侵袭性垂体瘤。

3.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述垂体瘤为侵袭性垂体瘤。

4.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述长链非编码RNA ST8SIA6-AS1的检测试剂为荧光定量PCR检测试剂。

5.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述荧光定量PCR检测试剂包括根据核苷酸序列为SEQ ID NO.1的长链非编码RNA ST8SIA6-AS1设计的特异性引物，特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

6.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述治疗垂体瘤的药物包括核酸分子、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、干扰慢病毒，均为长链非编码RNA ST8SIA6-AS1的抑制剂。

7.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述核苷酸分子包括：小干扰RNA、双链RNA短发夹RNA、反义寡核苷酸。

8.一种用于垂体瘤诊断与预后检测的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括根据核苷酸序列为SEQ ID NO.1的长链非编码RNAST8SIA6-AS1设计的特异性引物，特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。