KR20140143880A - miRNA의 발현 증가를 이용한 성체줄기세포의 노화 억제 조성물 - Google Patents

miRNA의 발현 증가를 이용한 성체줄기세포의 노화 억제 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 성체줄기세포의 노화 억제 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 miRNA의 함량을 증가시킴으로써, 성체줄기세포의 AIMP3 (ARS-interacting multi-functional protein 3)의 발현을 억제시키고, p16 또는 p21의 발현을 감소시켜 성체줄기세포의 노화를 억제하는 방법 및 성체줄기세포의 증식 방법에 관한 것이다.

Description

miRNA의 발현 증가를 이용한 성체줄기세포의 노화 억제 조성물{Composition for Inhibiting Senescence of Adult Stem Cells By Increasing of miRNA Expression}
본 발명은 성체줄기세포의 노화 억제 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 miRNA의 함량을 증가시킴으로써, 성체줄기세포의 AIMP3(ARS-interacting multi-functional protein 3)의 발현을 억제시키고, p16 또는 p21의 발현을 감소시켜 성체줄기세포의 노화를 억제하는 조성물 및 성체줄기세포의 증식용 조성물에 관한 것이다.
노화는 시간이 흐름에 따라 생물의 신체기능이 퇴화하는 현상이다. 일반적으로 세포의 노화는 Rb(retinoblastoma) 단백질에 의존적인 노화기전과 염색체를 보호하는 역할을 담당하는 텔로미어(telomere)의 손실로 일어나는 노화, 항산화 스트레스에 의한 노화, DNA 손상에 의한 노화 등이 있다. 세포의 노화는 세포가 분열할 수 있는 능력을 잃어버리는 것으로 나타난다. 중간엽 줄기세포 역시 생물체가 노화하는 동안 자가 재생능력(self-renewal)과 뼈 형성 능력을 잃어버리게 된다. 따라서, 이러한 성체줄기세포의 노화 기전을 밝혀내는 것이 세포 및 생물체 수준에서의 노화와 연계된 중요한 결과가 될 수 있다.
한편, miRNA(microRNA)는 21 내지 25 뉴클레오티드(nt)의 단일가닥 RNA 분자로서 mRNA의 3'-UTR에 결합하여 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 새로운 물질이다. miRNA의 생성은 Drosha(RNaseⅢ type 효소)에 의해 stem-loop 구조의 pre-miRNA로 만들어지고, 세포질로 이동하여 Dicer에 의해 절단되어 miRNA로 만들어진다. 이렇게 만들어진 miRNA는 표적단백질의 발현을 조절함으로써 발생, 세포증식 및 사멸, 지방대사, 종양형성 등에 관여한다. 이러한 기능을 갖는 miRNA가 최근에는 히스톤 디아세틸라아제(histone decaetylases. HDACs) 또는 DNA 메틸트랜스퍼라아제(DNA methyl transferases, DNMTs) 외의 또 다른 후생적 조절자(epigenetic regulators)로 주목받고 있다.
성체 줄기세포를 사용하여 실제 의학에서 필요로 하는 장기 재생을 할 수 있을 뿐 아니라 이식된 후 각 장기의 특성에 맞게 분화할 수 있는 특성을 지니고 있다. 특히, 대표적 성체줄기세포인 중간엽 줄기세포는 체외에서 쉽게 증식할 수 있으며, 여러 가지 세포형태(지방세포, 연골세포, 근육세포, 뼈세포)로 분화가 될 수 있다. 따라서 중간엽 줄기세포는 유전자 치료와 세포치료에 있어서 유용한 타겟(target)으로 이용될 수 있으며, 이러한 점에서 중간엽 줄기세포에서 miRNA의 노화조절에 대한 이해는 이를 이용한 세포치료를 위해 중요하다.
최근, AIMP3(ARS-interacting multi-functional proteins-3)와 관련하여 AIMP3의 과발현이 세포노화를 유도한다는 것을, 세포분화의 감소, 노화 마커의 증가, 핵막 단백질인 라민 A의 감소에 의한 핵의 변형을 통하여 알려진 바 있다(대한민국 등록특허 제10-1123866호). 다만, 지금까지 성체줄기세포의 증식과 노화에 miRNA가 어떠한 영향을 미치는지에 대해서는 밝혀진 바가 없다.
본 발명의 목적은 성체줄기세포에서의 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p의 함량을 증가시킴으로써, 성체줄기세포의 노화를 억제시키고, 줄기세포를 증식시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1양태는, miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는, 성체줄기세포의 노화 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 제2양태는, miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA 핵산 분자 및 성체줄기세포를 포함하는 노화를 억제시키는 세포치료제를 제공한다.
본 발명의 제3양태는, 성체줄기세포 내 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA의 함량을 증가시키는 단계를 포함하는, 노화가 억제된 성체줄기세포 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 제4양태는, 성체줄기세포 내 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA의 함량을 증가시키는 단계를 포함하는, 성체줄기세포의 노화 억제 방법을 제공한다.
본 발명의 제5양태는, 성체줄기세포 내 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA의 함량을 증가시키는 단계를 포함하여, 성체줄기세포에서 AIMP3(ARS-interacting multi-functional protein-3)의 발현을 억제시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 제6양태는, 성체줄기세포 내 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA의 함량을 증가시키는 단계를 포함하여, 성체줄기세포에서 p16 또는 p21의 발현을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 제7양태는, 성체줄기세포 내 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA의 함량을 증가시키는 단계를 포함하여, 성체줄기세포의 세포 주기 중 G기를 감소시키고, S기를 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 제8양태는, 성체줄기세포 내 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA의 함량을 증가시키는 단계를 포함하여, 성체줄기세포에서 노화-관련 β-갈락토시다아제(SA-β-gal)의 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 제9양태는, miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는, 성체줄기세포의 증식용 조성물을 제공한다.
본 발명의 제10양태는, 성체줄기세포 내 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA의 함량을 증가시키는 단계를 포함하는, 성체줄기세포의 증식 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명에서 용어,“miRNA(microRNA)”는 21 내지 25 뉴클레오티드(nt)의 단일 가닥 RNA 분자로써, 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 조절물질이다. miRNA는 표적 mRNA에 상보적으로 결합하여 전사 후 유전자 억압자(post-transcriptional gene suppressor)로써 작용하며, 번역 억제와 mRNA 불안정화를 유도하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 miRNA-543 및 miRNA-590-3p의 염기서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
Gene 서열번호 Sequence
miRNA-543 서열번호 1 5’- AAACAUUCGCGGUGCACUUCUU - 3’
miRNA-590-3p 서열번호 2 5’- UAAUUUUAUGUAUAAGCUAGU - 3’
miRNA-543은 TWIST1, BMI1, ZEB1/2, 및 miR-200 패밀리 miRNAs를 포함한 신호전달체계를 억제(repression)하는 것으로 보고되었으나, 직접적인 타겟은 아직까지 밝혀지지 않았다. 또한 miRNA-590-3p는 알츠하이머 환자에게서 hnRNP-A1만이 유일한 타겟으로 알려져 있다. 하지만 miRNA-543 및 miRNA-590-3p가 세포에서 구체적으로 어떠한 기능을 하고 있는지는 아직까지 알려져 있지 않고 있으며, miRNA-543 및 miRNA-590-3p가 성체줄기세포의 노화 억제 및 줄기세포 증식에 이용될 수 있다는 것은 본 발명자들에 의해 최초로 규명되었다.
본 발명에서 이용할 수 있는 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p 핵산 분자는 인간을 포함한 동물, 예를 들어 원숭이(monkeys), 돼지(pigs), 말(horses), 소(cows), 양(sheep), 개(dogs), 고양이(cats), 생쥐(mice), 토끼(rabbits) 등으로부터 유래할 수 있으며, 바람직하게는 인간 유래일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 사용되는 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, miRNA-543 또는 miRNA-590-3p 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, miRNA-543 또는 miRNA-590-3p 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다.
또한, 본 발명의 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. 성숙형 miRNA 분자는 주로 단일 가닥으로 존재하지만, 전구체 miRNA(pre-miRNA) 분자는 주로 이중가닥 부분을 형성할 수 있는 부분적으로 자가-상보적인(예를 들어 스템- 및 루프-구조)구조이다.
본 발명의 상기 핵산 분자는 공지의 서열정보 데이터베이스, 예를 들어 NCBI의 GenBank 등을 통하여 정보를 얻을 수 있으며, 이를 이용하여 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 핵산 분자는 miRNA 및 핵 단백질의 복합체, miRNA 및 지질의 복합체 등의 다양한 형질전환 기술을 이용하여 세포 내로 도입시킬 수 있는데, 이를 위해 상기 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p 핵산 분자는 세포 내로의 효율적인 도입을 가능하게 하는 전달체 내에 포함된 형태일 수 있다.
본 발명에서 용어, “성체줄기세포”는 발생과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계 혹은 성체단계에서 나타나는 줄기세포를 의미하며, 이는 그 분화능이 일반적으로 특정 조직을 구성하는 세포로만 한정된다. 성체줄기세포는 유방, 골수, 제대혈, 혈액, 간, 피부, 위장관, 태반, 및 자궁 등으로 구성된 군에서 유래할 수 있다. 본 발명의 성체줄기세포는 신경세포로 분화할 수 있는 신경줄기세포, 혈액세포로 분화할 수 있는 조혈모세포, 뼈, 연골, 지방, 근육 등으로 분화할 수 있는 중간엽 줄기세포, 간세포로 분화할 수 있는 간줄기세포일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는 본 발명의 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포를 의미하며, 여기서 “중간엽 줄기세포”란 연골, 뼈, 지방, 골수간질, 근육, 신경, 피부 등을 만드는데 원조가 되는 세포로서, 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지만 제대, 제대혈, 말초혈액, 기타 조직 등으로부터도 수득할 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명의 목적상, 바람직하게는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 세포 유래인 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 더욱 바람직하게는 본 발명의 중간엽 줄기세포는 제대혈 중간엽 줄기세포를 의미할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 대표적으로 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 및 마우스 골수 유래 중간엽 줄기세포에서 miRNA-543 및 miRNA-590-3p를 증가시켰을 경우에 노화를 억제하는 것을 확인하였다(실시예 8-2). 이와 같은 결과는 다른 성체줄기세포에서의 상기 miRNA의 함량 증가 역시 동일한 결과를 나타낸다는 것을 뒷받침하는 것이다.
본 발명의 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA 핵산분자는 성체줄기세포의 노화를 억제하는 용도로 사용될 수 있다. 여기서 “노화”란 세포의 형질 및 기능 퇴화와 그것에 이어지는 세포사 혹은 증식 정지가 일어날 때까지의 과정을 의미한다. 노화현상의 원인에 대해서는 세포의 대사산물에 의한 대사저해, 세포표면 변화, 교질원 등의 세포골격분자간 가교결합 증가, 자유라디칼에 의한 세포 내 열화분자 축적, 유전정보 전사·번역 과오축적, 치사유전자에 의해 유전적으로 세포수명이 프로그램화 되어 있는 것, 세포 내 DNA 상해와 수복능 저하 등이 알려져 있다. 본 발명에서의 노화는 세포 노화(cellular senescence) 뿐만 아니라, 조직 또는 생물체의 노화의 의미도 포괄한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 실시간 q-PCR을 사용하여 초기 및 후기 계대의 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(hUCB-MSCs)에서의 miRNA의 발현 수준을 스크리닝한 결과, miRNA-543 및 miRNA-590-3p이 복제성 노화세포에서 유의적으로 감소하였음을 확인하였고, 나아가 다른 노화-유도 조건에서 하에서 miRNA-543 및 miRNA-590-3p의 발현 정도를 조사한 결과, 이들 miRNA의 세포적 수준은 AIMP3 단백질 수준이 증가하는 조건에서만 감소하였음을 확인함으로써(실시예 6-2), miRNA-543 및 miRNA-590-3p가 세포 노화를 조절하는 것을 확인할 수 있었다.
구체적으로, 본 발명은 성체줄기세포 내 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA의 함량을 증가시킴으로써, 성체줄기세포의 노화가 억제되었음을 확인하였고(실시예 8-2), 이에 성체줄기세포 내에서 상기 miRNA의 함량을 조절함으로써, 야생형(wild-type) 성체줄기세포보다 노화가 억제된 성체줄기세포를 제조하거나, 야생형 성체줄기세포의 노화를 억제시킬 수 있다. 여기서 야생형 성체줄기세포는 성체줄기세포 내 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA의 함량을 임의로 증가시키지 않은, 대조군 의미로서의 성체줄기세포를 의미한다. 본 발명의 방법에 따라 성체줄기세포 내 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA의 함량을 증가시키는 단계에 의해 노화가 억제된 성체줄기세포를 제조함으로써, 이를 세포치료제 등의 용도로 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 miRNA의 함량 증가는, 상기 miRNA를 성체줄기세포 내에 도입하는 방법, 상기 miRNA를 암호화하는 유전자의 세포내 카피수 증가, 상기 miRNA를 암호화하는 염색체 상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법, 상기 miRNA를 암호화하는 염색체 상의 유전자의 발현 조절 서열을 이보다 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법, 상기 miRNA의 활성이 증가하도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 miRNA를 암호화하는 유전자를 대체하는 방법 및 상기 miRNA의 활성이 강화되도록 상기 miRNA를 암호화하는 염색체상의 유전자에 변이를 도입시키는 방법 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 형질감염(transfection) 방법에 의하여 miRNA의 함량을 증가시킬 수 있으며, 여기서 형질감염이란, 배양동물세포에 miRNA를 직접 도입하여 세포의 유전형질을 변이시키는 방법을 의미하며, 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 miRNA-543 및 miRNA-590-3p의 제대혈 유래 중간엽 줄기세포로의 형질감염을 통하여 상기 miRNA의 함량을 증가시키는 방법을 사용하였으며, 구체적으로 DharmaFECT 1 Transfection reagent(Dharmacon, 미국)를 사용하여 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 배지 내에서 48시간 동안 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p와 함께 배양함으로써 miRNA의 함량을 증가시켰다 (실시예 7-1).
본 발명에 따라, 성체줄기세포 내 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA의 함량을 증가시킴으로써, 성체줄기세포에서 AIMP3(ARS-interacting multi-functional protein-3)의 발현을 억제시킬 수 있다.
AIMP3/p18은 단백질 합성효소 복합체(aminoacyl-tRNA synthetase complex)의 보조인자 중 하나이다. AIMP3(aminoacyl-tRNA synthetase-interacting multifunctional protein-3)은 MSC(multisynthetase complex) 내의 MRS(Methionyl-tRNA synthetase)의 안정성을 유지시켜 주며, ATM(Ataxia-telangiectasia mutated)과의 상호작용을 통해 종양 억제자(tumor suppressor) 역할을 한다. 또한 최근에는 라민 A(lamin A)의 조절인자로서, 노화에 연관되어 있음이 알려졌다.
본 발명의 일 실시예에서는, 성체줄기세포 노화에서의 AIMP3의 역할을 알아보기 위하여 AIMP3를 과발현 및 억제시킨 결과, AIMP3의 과발현은 노화의 표현형을 나타냄을 확인하였으며(실시예 4-1), 또한 노화된 마우스의 골수 유래 중간엽 줄기세포(mBM-MSCs)의 AIMP3 수준은 어린 마우스의 AIMP3의 수준보다 높음을 확인하였다(실시예 4-2).
또한, 성체줄기세포 내 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA의 함량을 증가시킴으로써, 성체줄기세포에서 p16 또는 p21의 발현을 감소시킬 수 있다.
p16과 p21은 암 억제제로 알려져 있으며, 특히 세포주기를 조절하는데 중요한 기능을 한다고 알려져 있다. p16에 변이가 증가하게 되면 암이 다양하게 발달하게 되는데, 특히 흑색종에서 p16의 변이가 두드러지게 나타난다. p16과 p21은 노화된 조직에서 발현이 증가하게 되는데, 이는 p16과 p21의 발현이 증가하면서 세포의 증식 능력이 억제되기 때문이다. 따라서 줄기세포에서 p16과 p21의 발현이 증가하게 되면 줄기세포의 특징인 다능성이 감소하게되고 세포가 노화되게 된다.
또한, 성체줄기세포 내 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA의 함량을 증가시킴으로써 성체줄기세포의 세포 주기 중 G기를 감소시키고, S기를 증가시킬 수 있다.
본 발명에서 용어, “세포 주기”란 증식기에 있는 세포가 대사기와 핵분열기를 되풀이하는 것을 말하며, 한번의 분열로부터 다음의 핵분열까지를 1주기라 하여, 핵분열기(M기)-DNA합성전기(G1기)-DNA합성기(S기)-DNA합성후기(G2기)로 나누어진다. G1·S·G2기를 포함하여 일반적으로 간기 또는 휴지기라고 하며 특히 S기에는 DNA가 2배로 증가한다. 한편, 세포주기 중 G1기에 있는 세포가 증식회로에서 벗어나서 휴지 상태에 들어간 시기를 G0기라고 한다.
노화 세포는 세포 주기의 G0 또는 G1기에서 차단되고, 세포 주기가 정지되어 더이상 분화되지 않는다. 이들은 S기로 재진입이 불가능하며, 생리학적인 유사분열 제제에 의한 자극에도 더 이상 반응하지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서, 세포 주기의 분포를 살펴봄으로써 세포의 노화여부를 예측할 수 있다.
또한, 성체줄기세포 내 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA의 함량을 증가시킴으로써, 성체줄기세포에서 노화-관련 β-갈락토시다아제(SA-β-gal)의 활성을 감소시킬 수 있다.
노화-관련 β-갈락토시다아제(SA-β-gal)의 활성은 세포 노화의 대표적인 마커로서 사용되고 있으며, 이는 노화된 세포에서 라이소좀의 β-galactosidase의 발현이 증가하여 나타나는 현상을 이용한 것이다. 따라서, 노화된 세포일수록 SA-β-gal의 활성은 유의적으로 증가함을 보인다.
본 발명의 일 실시예로서, miRNA를 과발현시킴으로써 AIMP3 단백질과 노화마커 p16INK4A, p21CIP1 / WAF1를 감소시켰음을 확인하였고(도 11a 및 11b), SA-β-gal 활성도 감소하였으며(도 11c 내지 11e), 세포주기 변화를 관찰한 결과, miRNA 형질감염에 의해 G1 세포주기 정지 또한 감소하였으며, S기의 비중이 증가하였음을 확인하였다(실시예 8-2).
본 발명의 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA 핵산 분자는 조성물의 형태로 존재할 수 있으며, 상기 miRNA를 포함하고 있는 한, 그 형태 및 구성에 제한되지 않는다. 따라서 본 발명의 조성물에는 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p 핵산 분자 자체 뿐만 아니라, 세포 내에서 상기 miRNA의 함량을 증가시키는 물질, 예를 들어 화합물, 천연물, 신규 단백질 등을 추가로 포함할 수 있으며, 또는 조성물의 세포 내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다.
바람직하게는 상기 miRNA는 벡터에 삽입된 형태일 수 있다. 여기서 “벡터(vector)”란, 재조합 DNA 실험에서 유전자를 숙주에 도입하여 증식시킬 목적으로 사용되는 소형의 자율 증식능이 있는 DNA를 말한다. 보통 플라스미드, 바이러스 또는 박테리오파지가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p 핵산 분자를 포함하는 벡터는 선별마커를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 여기서, "선별마커(selection marker)"란 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p 핵산 분자가 도입되어 형질전환된 세포의 선별을 용이하게 하기 위한 것이다. 본 발명의 벡터에서 사용할 수 있는 선별마커로는 벡터의 도입 여부를 용이하게 검출 또는 측정할 수 있는 유전자라면, 특별히 한정되지 않으나, 대표적으로 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들, 예를 들어 FP(녹색 형광 단백질), 퓨로마이신(puromycin), 네오마이신(Neomycin: Neo), 하이그로마이신(hygromycin: Hyg), 히스티디놀 디하이드로게나제(histidinol dehydrogenase gene: hisD) 및 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(guanine phosphosribosyltransferase: Gpt) 등이 있으며, 바람직하게는 GFP(녹색 형광 단백질) 및 퓨로마이신 마커를 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p 핵산 분자를 포함하는 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다. 여기서 약학적으로 허용가능한 담체란, 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p 핵산 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 체료 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
본 발명의 조성물은 치료학적 또는 예방학적 유효량으로 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 단일 또는 다중 투여일 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한 본 발명은 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA 핵산 분자 및 성체줄기세포를 포함하는 노화 억제용도의 세포치료제로 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, “세포치료제”는 사람을 포함한 동물로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류되며 본 발명은 특히 줄기세포치료제에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명의 세포치료제는 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA 핵산 분자가 세포 내에 도입된 형태를 가질 수 있으며, 상기 miRNA를 다량으로 함유한 세포를 이식함으로써, 세포 또는 생물체의 노화를 억제시킬 수 있다. 그러므로, miRNA-543 또는 miRNA-590-3p 핵산 분자가 도입된 세포는 노화 억제를 위한 세포치료제로 이용될 수 있다. miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA 핵산 분자를 세포 내로 도입시키는 방법은 형질감염(transfection) 또는 형질도입(transduction)에 의할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 노화 억제용 세포치료제는 당업계에 일반적인 제형, 예컨대, 주사제의 형태로 제조될 수 있으며, 외과수술적으로 직접 이식하거나, 투여된 후 이동할 수 있다. 본 발명의 세포치료제의 투여량은 환자의 질환의 경중, 투여경로, 환자의 나이 및 성, 및 질병의 정도에 따라 변할 수 있으나, 바람직하게는 평균 성인의 경우, 1 × 107 내지 1 ×1011 개 세포를 투여한다.
세포치료제의 투여는 임의의 동물에 적용가능하며, 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개, 쥐, 랫트 및 고양이 등의 가축을 포함한다. 본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 세포치료제를 도입하는 것을 의미하며, 분화된 세포의 이식을 포함한다. 본 발명의 세포치료제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA 핵산 분자는 성체줄기세포의 증식용도로 사용될 수 있으며, 구체적으로 상기 miRNA 핵산 분자의 성체줄기세포의 증식활성에 의하여, 성체줄기세포 내 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA의 함량을 증가시킴으로써, 성체줄기세포를 증식시킬 수 있다.
본 발명에서 용어, “증식”이란 세포증식을 의미하며, 이는 세포수의 증가를 의미한다. 따라서 세포증식은 DNA 복제, 세포분열(cell division) 및 각종 세포성분의 증가를 동반하며, 세포증식 속도는 생체 내에서 조절된다.
본 발명의 실시예에서는 대표적으로 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 및 마우스 골수 유래 중간엽 줄기세포에서 miRNA-543 및 miRNA-590-3p를 증가시켰을 경우에 줄기세포의 증식률이 증가함을 Ki67 면역세포화학분석법을 통하여 확인하였다(실시예 8-2). 이와 같은 결과는 다른 성체줄기세포에서의 상기 miRNA의 함량 증가 역시 동일한 결과를 나타낸다는 것을 뒷받침하는 것이다. 따라서, 성체줄기세포 내 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA의 함량을 증가시켜 분화능과 세포 재생능력을 유지한 성체줄기세포를 다량으로 수득하여, 세포치료제 혹은 연구용으로의 사용가능성을 높일 수 있다.
본 발명에 따른 성체줄기세포의 노화를 억제하는 조성물은 성체줄기세포 배양시 계대배양을 시행할수록 세포의 노화가 빠른 속도로 진행되어 세포 분열이 급격히 감소하는 문제점을 해결할 수 있다. 이로써 분화능과 세포 재생능력을 그대로 유지한 성체줄기세포를 오래 유지할 수 있어, 세포치료제 혹은 연구용으로 사용할 수 있는 세포를 더욱 많이 확보할 수 있으며, 노화 및 이와 관련된 질환의 치료를 위한 새로운 방법을 제공하여 줄 수 있다.
도 1은 복제성-, 접촉 방해- 및 미토마이신 C-유도에 의한 노화 세포에서 AIMP3의 단백질 발현 수준(level)이 증가한 것을 나타낸 것이다.
도 1a는 세포 유속기(flow cytometry)에 의해 분석된 세포주기의 분포를 나타낸 도이다.
도 1b는 노화 상태를 확인하기 위하여 상기 그룹에 SA-β-gal 및 면역세포화학법을 수행하여 현미경을 통해 본 사진이다.
도 1c는 웨스턴 블랏 분석(western blot analysis)에 의해 관찰된 AIMP3, p16INK4A 및 p21CIP1 / WAF1의 발현 수준을 나타낸 도이다.
도 2는 AIMP3는 산화적 스트레스 유발성 노화세포에서는 증가하지 않음을 나타낸 도이다. 산화적 스트레스 유발을 위하여 400μM의 과산화수소(H2O2)를 3일간 hUCB-MSCs에 처리하였다.
도 2a는 상기 과산화수소 처리 후 세포 주기의 변화를 분석한 도이다.
도 2b는 상기 과산화수소 처리 후 SA-β-gal 활성의 변화를 나타낸 사진이다.
도 2c는 상기 과산화수소 처리 후, 시간에 따른(0, 24시간 이후, 72시간 이후) AIMP3, p16INK4A 및 p21CIP1 / WAF1의 발현 수준을 웨스턴 블랏 분석에 의하 나타낸 도이다.
도 2d는 상기 과산화수소를 처리한 세포에서의 miRNA-543 및 miRNA-590-3p의 발현 수준을 나타낸 도이다.
도 3은 AIMP3의 과발현이 세포주기 정지 및 노화의 표현형을 유발함을 나타내는 도이다.
도 3a는 AIMP3의 과발현을 유도하기 위하여, hUCB-MSCs에 0.5㎍/㎖ AIMP3 발현벡터를 48시간 동안 형질감염(transfection)시키고, 또는 AIMP3 발현의 억제를 위하여, hUCB-MSCs에 25nm siRNA-AIMP3를 48시간 동안 형질감염(transfection)시켰다. 이후 웨스턴 블랏 분석에 의하여 AIMP3, p16INK4A 및 p21CIP1 / WAF1의 단백질 수준을 나타낸 도이다.
도 3b는 AIMP3의 과발현 또는 억제 이후, 세포주기의 변화를 나타낸 도이다.
도 3c는 AIMP3의 과발현 이후, SA-β-gal 및 Ki67 면역세포화학법을 수행하여 현미경을 통해 본 사진이다.
도 3d는 전체 세포에 대한 Ki67-양성세포의 비율을 그래프로 나타낸 도이다.
도 3e는 전체 세포에 대한 SA-β-gal 양성세포의 비율을 그래프로 나타낸 도이다.
도 3f는 AIMP3의 과발현 이후, MTT 어세이에 의하여 증식률를 측정하여 나타낸 도이다.
도 4는 접촉 방해된 세포에서 AIMP3 억제에 의한 p16INK4A이 감소함을 나타낸 도이다. hUCB-MSCs를 4일간 접촉 방해시켰고, 이후 50nm siRNA-AIMP3로 형질감염시켰다. 계대배양없이 2일 후에 2번째 형질감염을 시켰고, 웨스턴 블랏 분석에 의하여 AIMP3, p16INK4A 및 p21CIP1 / WAF1의 발현 수준을 확인하였다.
도 5는 AIMP3가 생체 내(in vivo)에서 노화 마커를 조절함을 나타내는 도이다.
도 5a는 4주령의 어린 마우스(Y)와 19주령의 늙은 마우스(O)로부터 1차적으로 배양된 골수 유래 중간엽 줄기세포(mBM-MSCs)의 웨스턴 블랏 분석에 의한 AIMP3, p16INK4A 및 p21CIP1 / WAF1의 단백질 수준을 나타낸 도이다.
도 5b는 야생형(WT) 마우스와 Aimp3 형질전환(TG) 마우스를 관찰한 사진이다.
도 5c는 14월령의 야생형(WT) 및 Aimp3 형질전환(TG) 마우스의 간에서의 p16INK4A에 대한 SA-β-gal 및 면역세포화학법을 수행하여 현미경을 통해 본 사진이다.
도 5d는 10월령의 야생형(WT) 및 Aimp3 형질전환(TG) 마우스와 12월령의 야생형(WT) 및 Aimp3 헤테로 넉아웃(HKO) 마우스로부터 1차적으로 배양한 mBM-MSCs의 웨스턴 블랏 분석에 의한 AIMP3, p16INK4A 및 p21CIP1 / WAF1의 단백질 수준을 나타낸 도이다.
도 6은 AIMP3는 AIMP3-형질전환(TG) 마우스 및 AIMP3-헤테로 넉아웃(HKO) 마우스에서 CDK 억제자를 조절함을 나타낸 도이다. 10월령의 야생형 마우스와 Aimp3 TG 마우스 및 12월령의 야생형 마우스와 Aimp3 HKO 마우스의 심장, 간, 장(intestine) 조직을 웨스턴 블랏 분석을 한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 AIMP3 조절자의 후보물질을 스크리닝하는 단계를 나타낸 도이다.
도 7a는 hUCB-MSCs에 후생적 조절자(epigenetic regulator)로서, 4mM 발프로익산(valproic acid, VPA), 2mM 소듐 부티레이트(SB) 및 2μM 5-아자-20-데옥시시티딘(5-aza-20-deoxycitidine, 5-aza)을 각각 0, 1, 3, 6일간 처리한 후의 AIMP3 및 β-actin의 발현 수준을 나타낸 도이다.
도 7b는 복제성- 및 미토마이신 C-유도의 노화세포에서 AIMP3의 RNA 발현 수준을 실시간 PCR에 의해 나타낸 도이다.
도 7c는 AIMP3 프로모터 지역의 개략도이다.
도 7d는 복제성- 및 미토마이신 C-유도의 노화 세포의 AIMP3 프로모터 지역에서의 아세틸 히스톤 H4(acetyl histone H4, AceH4), 히스톤 H3 라이신4 트리메틸레이션(histone H3 lysine4 trimethylation, H3K4me3) 및 히스톤 H3 라이신27 트리메틸레이션(histone H3 lysine27 trimethylation, H3K27me3)에 대한 크로마틴 면역침강 어세이를 나타낸 도이다.
도 8은 miRNA-543 및 miRNA-590-3p는 AIMP3를 직접 타겟으로 함을 나타낸 도이다.
도 8a는 AIMP3를 표적으로 하는 것으로 예상되는 miRNA의 수를 벤다이어그램으로 나타낸 도이다.
도 8b는 실시간 정량적 PCR(q-PCR)로 5가지의 후보 miRNA의 발현 수준을 관찰한 결과, miRNA-543 및 miRNA-590-3p의 발현이 복제성 노화에서 유의하게 감소하였음을 나타내는 도이다.
도 8c는 미토마이신 C- 및 접촉 방해 유도의 노화 세포에서의 실시간 PCR에 의한 miRNA-543 및 miRNA-590-3p의 세포 수준을 나타낸 도이다.
도 8d는 AIMP3 3′UTR 지역에서 예상되는 miRNA-543 및 miRNA-590-3p의 결합 위치를 나타낸 도이다.
도 8e는 AIMP3 3′UTR-루시퍼레이스 벡터와 대조군 miRNA(miR-CTL) 또는 miRNA(miRNA-543 및 miRNA-590-3p)의 성숙형을 293T 세포에 형질감염시키고, 48시간 경과 후 루시퍼레이스 어세이를 수행한 결과를 나타낸 도이다. 투여량 의존방식에서 루시퍼레이스 활성이 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p의 성숙형의 형질감염에 의하여 유의적으로 감소하였다.
도 8f는 miR-CTL, miRNA-543 또는 miRNA-590-3p를 형질감염시킨 11계대의 hUCB-MSCs와 anti-miR-CTL, anti-miRNA-543 또는 anti-miRNA-590-3p를 형질감염시킨 7계대의 hUCB-MSCs에서의 AIMP3 및 α-tubulin의 발현 수준을 나타낸 도이다.
도 9는 miRNA-543, miRNA-590-3p 및 AIMP3 mRNA의 3′UTR 서열과 포유류 간의 보존서열을 나타낸 도이다.
도 9a는 miRNA의 seed region에 대한 AIMP3 mRNA 3′UTR의 대응관계를 나타낸 도이다. 왼편에 기재된 숫자는 매칭 장소를 의미한다.
도 9b는 다양한 포유류에서의 miRNA 서열을 나타낸다. 붉은색 글자는 AIMP3 mRNA에의 결합위치를 의미한다.
도 10은 접촉 방해된 세포에서의 AIMP3에 대한 miRNA의 영향 및 AIMP3의 mRNA 수준을 나타낸 도이다.
도 10a는 접촉 방해된 hUCB-MSCs에서 miRNA의 형질감염 이후의 AIMP3의 발현 수준을 나타낸 도이다.
도 10b는 성숙형 및 안티센스 miRNA-형질감염된 hUCB-MSCs에서의 AIMP3의 mRNA 수준을 나타낸 도이다.
도 11은 miRNA-543 및 miRNA-590-3p의 과발현이 hUCB-MSCs의 노화를 조절함을 나타낸 도로서, 50nm 성숙형 miR-control, miRNA-543 또는 miRNA-590-3p를 48시간 동안 11계대의 hUCB-MSCs에 형질감염시켰다.
도 11a는 형질감염에 의해 증가된 각 miRNA의 발현 수준을 나타낸 도이다.
도 11b는 miRNA의 형질감염 이후, 웨스턴 블랏 분석에 의해 AIMP3, p16INK4A 및 p21CIP1 / WAF1의 수준이 감소하였음을 나타낸 도이다.
도 11c는 SA-β-gal 및 Ki67 면역세포화학법을 수행하여 현미경을 통해 본 사진이다.
도 11d는 상기 사진의 5개 영역을 무작위로 선택하여 Ki67-양성세포의 비율을 그래프로 나타낸 도이다.
도 11e는 상기 사진의 5개 영역을 무작위로 선택하여 SA-β-gal 양성세포의 비율을 그래프로 나타낸 도이다.
도 11f는 유속세포기(flow cytometry)에 의하여 분석된 세포주기의 분포를 나타낸 도이다.
도 12는 miRNA-543 및 miRNA-590-3p의 발현 억제가 hUCB-MSCs의 노화를 조절함을 나타낸 도로서, 50nm 안티센스 miR-control, miRNA-543 또는 miRNA-590-3p를 48시간 동안 7계대의 hUCB-MSCs에 형질감염시켰다.
도 12a는 안티센스 miRNA 형질감염에 의해 감소된 각 miRNA의 발현 수준을 나타낸 도이다.
도 12b는 안티센스 miRNA의 형질감염 이후, 웨스턴 블랏 분석에 의해 AIMP3, p16INK4A 및 p21CIP1 / WAF1의 수준이 증가하였음을 나타낸 도이다.
도 12c는 SA-β-gal 및 Ki67 면역세포화학법을 수행하여 현미경을 통해 본 사진이다.
도 12d는 상기 사진의 5개 영역을 무작위로 선택하여 Ki67-양성세포의 비율을 그래프로 나타낸 도이다.
도 12e는 상기 사진의 5개 영역을 무작위로 선택하여 SA-β-gal 양성세포의 비율을 그래프로 나타낸 도이다.
도 12f는 유속세포기(flow cytometry)에 의하여 분석된 세포주기의 분포를 나타낸 도이다.
도 13은 AIMP3가 어떻게 세포 노화를 조절하는지에 대하여 설명한 개략도이다. AIMP3는 miRNA-543 및 miRNA-590-3p에 의해 억제되고, 어린 세포에서 낮은 발현수준을 유지함을 나타낸다. 노화유도 스트레스에 노출되면, miRNA-543 및 miRNA-590-3p의 발현수준은 감소하고, AIMP3 mRNA의 전사활성은 증가하게 된다. AIMP3의 발현 증가는 p16INK4A 및 p21CIP1 / WAF1를 포함한 CDK 억제자의 증가를 유도하고, 이에 세포주기는 정지되며 세포는 노화됨을 보여준다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양
제대혈 유래 중간엽 줄기세포(hUCB-MSCs)의 분리를 위하여, 제대혈 시료는 모친과의 공식적 합의 하에 분만 직후 탯줄 정맥으로부터 수득하였다. 공식적 합의서는 보라매 병원의 임상시험 심사위원회(IRB)와 서울대학교 임상시험 심사위원회(IRB No.0603/001-002-07C1)에 의하여 승인받았다. 제대혈 시료를 HetaSep 용액(StemCell Technologies, 밴쿠버, 캐나다)와 5:1의 부피비로 혼합하였고, 적혈구를 소거하기 위해 실온에서 배양하였다. 상청액을 조심스럽게 수집하고, Ficoll 밀도구배 원심분리기를 2,500rpm으로 20분간 작동시킴으로써 단핵구(mononuclear cells)를 수득하였다. 수득한 세포를 PBS로 두 번 세척하였고, EGM-2 SingleQuot와 10% 소태아혈청(Invitrogen,미국)을 함유한 D-media(Fomula No.78-5470EF, Invitrogen,미국)으로 이루어진 성장 배지에 2×105 내지 2×106 세포수/㎠의 밀도로 플레이트하였다. 3일이 지난 후, 비부착성 세포를 제거하였다.
한편, 골수 유래 중간엽 줄기세포(mBM-MSCs)를 분리하기 위하여, 마우스의 대퇴골과 경골 주위의 연조직(soft tissue)를 떼어냈다. 골간의 끝을 잘라낸 후, 골수액을 1cc 주사기에 부착된 25 게이지 주사바늘로 채취하여 15㎖ 마우스 배양배지(20% FBS, 1% PS가 포함된 DMEM 저 글루코스, Invitrogen, 미국)로 세척하고, 그 후 40mm 나일론 세포 스트레이너(strainer)로 여과하였다. 배지 내의 세포는 1500rpm에서 5분간 원심분리시켰고, 펠렛(pellet)을 1㎖ 적혈구 용해 버퍼(Sigma, 미국)에 1분간 재현탁하였다. 세포를 10배 부피의 PBS로 다시 원심분리하였다. 그 후 6-well 플레이트에 25×106 세포수/well의 농도로 시딩(seeding)하였고, 5% CO2 하 37℃의 온도에서 배양하였다. 48시간 후, 비부착성 세포를 제거하기 위하여 세포를 PBS로 세 번 세척하였고, 배지를 갈아주었다.
실시예 2: 다양한 노화조건에서의 인간 제대혈 유래의 중간엽 줄기세포에서의 AIMP3 의 발현정도 평가
일반적인 노화과정에서 AIMP3가 중요한 역할을 하는지 여부를 조사하기 위하여, 다양한 조건에 의해 유도된 노화한 인간 제대혈 유래의 중간엽 줄기세포(복제성 노화세포, 접촉방해-유도 노화세포, 미토마이신 C-유도 노화세포 및 산화적 스트레스-유도 노화세포)에서의 AIMP3의 발현정도를 평가하였다.
실시예 2-1: 다양한 노화조건 형성 - 미토마이신 C 처리, 과산화수소 처리 및 휴면 유도
70% confluency에서 배양배지에 미토마이신 C 모액(0.05%(w/v), Sigma, 미국)을 직접 첨가하여 0.001%(w/v)(1:50)의 최종농도를 맞추었다. 3시간 배양 후, 세포를 PBS로 두 번 세척하였고, 새로운 배양배지로 갈아주었다. 마찬가지로 30%(w/v)의 과산화수소 용액(Sigma-Aldrich, 미국)을 배양배지에 희석하여, 최종농도 400μM를 맞추었다. 세포를 휴면상태로 유도하기 위하여, 세포를 PBS로 세 번 세척하였고, 성장인자(EGF, FGF, vEGF 및 IGF)와 소태아혈청 없이 배지에서 배양하였다.
실시예 2-2: 세포주기 변화 측정
세포주기 정지로부터 노화의 영향을 구별해 내기 위하여, 휴지상태의 세포와 노화세포의 표현형 및 유전자 발현을 비교하였다(도 1 및 도 2). 세포주기 정지는 노화의 표현형 중의 하나이므로, 먼저 상기 각 조건에서의 세포주기의 변화를 관찰하였다.
세포주기 변화를 측정하기 위하여 propodium iodide 염색을 사용한 유속 세포주기 분석방법을 사용하였다. 구체적으로, 트립신에 의해 최소 2×106 개의 세포를 수득하였고, 1500rpm에서 5분간 원심분리하였으며, PBS로 세척하였다. 세포를 다시 원심분리하였고, 그 후 -20℃에서 1시간동안 1㎖의 70%(v/v) 에탄올로 고정시켰다. 상기 세포를 1500rpm에서 10분간 10배 부피의 PBS와 함께 원심분리하였다. 상청액을 조심스럽게 제거하고, 상기 세포를 400㎕ PBS로 재현탁(resuspension)시켰고, 염색을 위하여 0.05mg/㎖ propodium iodide와 6.5㎍/㎖ RNase A(Invitrogen, 미국)를 첨가하였다. 37℃에서 최소 30분 경과 후, FACS Calibur system(Becton Dickson, Franklin Lakes, 뉴저지, 미국)를 사용하여 세포 주기 분포를 분석하였다. 모든 실험은 최소 3번 수행하였다.
그 결과, 복제성- 및 접촉방해-유도 노화세포와 휴지상태의 세포는 G0/G1 세포주기 정지를 보였다. 미토마이신 C를 처리한 세포에서, 미토마이신 C는 이중나선 DNA와 교차결합(cross-link)하기 때문에 G2/M기가 거의 사라지고 다음 기(G2)로 넘어가는 것을 차단한 반면, S기는 비정상적으로 증가하였다. 반면에, 과산화수소를 처리한 세포는 G2기 정지를 보였다(도 1a 및 도 2a).
실시예 2-3: 노화-관련 β- 갈락토시데이즈 ( SA -β- gal ) 활성 측정
세포 내에서의 SA-β-gal 활성을 분석하기 위하여, X-gal 모액(디메틸폼아마이드 내의 4% X-gal, Amresco, USA)을 예열된 X-gal 희석 완충액(1:40, PBS 내에 5mM 페리시안화 칼륨, 5mM 페로시안화 칼륨, 2mM 염화마그네슘, pH 6.0)으로 희석하였다. 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 PBS로 두 번 세척하였고, 실온에서 5분간 0.5% 글루타르알데히드로 고정시켰으며, 그 후 1mM MgCl2가 함유된 PBS로 3번 세척하였다. 상기 플레이트를 X-gal 혼합용액으로 37℃에서 배양하였다. 24시간 경과 후, 세포를 PBS로 두 번 세척하였고, 현미경(IX70, Olympus, 일본)으로 이미지를 얻었다. 최소 5개의 100X 시야(visual field)를 얻었고, 시야 내의 세포 수를 세었다.
노화마커로서 노화-관련 β-갈락토시데이즈(SA-β-gal) 활성을 측정한 결과, SA-β-gal의 활성이 노화세포와 휴지상태 세포 모두에서 증가하였다(도 1b 및 도 2b).
실시예 3: 노화 관련 유전자의 단백질 발현 변화 확인
실시예 3-1: 웨스턴 블랏 분석
단백질 용해 완충액(Pro-PREP, Intron Biotechnologies, 한국)으로 세포를 용해시켰고, 단백질 용해 완충액에서 1.5분간 균질기(TissueLyserⅡ, QIAGEN, 독일)로 마우스 조직을 분쇄하였다. Lowry 방법에 따라 준비된 단백질을 정량화하였고, 15% SDS-PAGE를 사용하여 분리하였으며, 그 후 250mA에서 4시간동안 나이트로셀룰로스 막으로 이동시켰다. 각 단백질을 검출하기 위하여 사용된 1차 항체는 다음과 같다; AIMP3 (1:1000, polyclonal, Abcam, UK), p16INK4A(1:1000,polyclonal,Abcam,UK), p21CIP1 / WAF1(1:1000,polyclonal,SantaCruz,CA), p53(1:500,polyclonal,Abcam,UK), lamin A(1:1000,monoclonal[133A2],Abcam,UK), α-Tubulin (1:5000, polyclonal, Abcam, UK) 및 β-Actin (1:2000, polyclonal, Abcam, UK). 모든 항체는 설명서에 따라 사용하였으며, 강화된 화학발광 검출키트(Amersham Pharmacia Biotech, UK)와 FluorChem HD2(Alpha Innotech, San Leandron, 캐나다)를 사용하여 단백질 밴드를 검출하였다.
실시예 3-2: 상기 각 노화조건에서의 노화관련 유전자의 단백질 발현 변화
대표적인 노화 마커인 CDK 억제자, p16INK4A, p21CIP1 / WAF1를 확인하고, 상기 각 조건에서의 AIMP3의 변화를 관찰하였다.
그 결과, 복제성 노화세포, 접촉-방해 및 미토마이신 C-유도 노화세포에서는 p16INK4A, p21CIP1 / WAF1 둘 다 발현이 증가한 반면, 과산화수소-처리세포에서는 p21CIP1/WAF1만이 증가하였다.
반면에, 휴지상태 세포에서는 이러한 노화 마커의 발현이 증가하지 않았다. p16INK4A, p21CIP1 / WAF1 모두 발현이 증가한 노화세포에서 AIMP3의 발현이 증가하였다.
이는 AIMP3는 복제성 노화 및 다른 p16INK4A-증가 노화 과정(예를 들면 미토마이신 C 처리 및 접촉 유도)에 관여하는 것을 시사한다(도 1c 및 도 2c).
실시예 4: AIMP3 발현 조절에 따른 노화 표현형 관찰
실시예 4-1: 생체 외에서의 AIMP3 발현 조절에 따른 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 노화 표현형 관찰
AIMP3의 과발현은 293, PC3 및 HCT116 세포주에서 라민 A의 분해를 가속화하여 노화 표현형을 유도하는 것으로 알려져 있다. 성체줄기세포 노화에서의 AIMP3의 역할을 알아보기 위하여, 초기계대(7계대) 또는 후기계대(11계대) 세포에서 각각 AIMP3를 과발현시키거나 억제시켰다.
그 결과, AIMP3의 과발현은 p16INK4A, p21CIP1 / WAF1의 발현을 증가시켰고, 초기 계대세포에서 G1 및 G2 세포주기 정지를 유도하였다. 반면, AIMP3의 억제는 p16INK4A, p21CIP1 / WAF1의 발현을 감소하였고, 이어서 후기 계대세포에서 G1 및 G2 기의 감소와 S기의 증가를 유도하였다. 뿐만 아니라, AIMP3의 과발현은 SA-β-gal 활성을 증가시켰고, 이에 따라 세포증식을 감소시킴으로써, AIMP3의 과발현은 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 세포노화를 유도하기에 충분함을 시사하였다(도 2c 내지 2f).
노화 마커가 접촉방해 조건에서 AIMP3에 의해 조절되는지 여부를 확인하기 위하여, 상기 조건에서 AIMP3의 발현을 억제하였고, 그 결과 AIMP3의 억제 후 p16INK4A의 감소를 관찰하였다(도 4).
실시예 4-2: 생체 내에서의 AIMP3 발현 조절에 따른 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 노화 표현형 관찰
AIMP3가 생체 내에서(in vivo) 중간엽 줄기세포의 노화과정에 관여하는지 여부를 알아보기 위하여, 4주령 및 19주령의 C57BL/6 마우스의 골수 유래 중간엽 줄기세포(mBM-MSCs)를 분리 배양하였다.
그 결과, 노화된 마우스의 mBM-MSCs의 AIMP3 수준은 어린 마우스의 AIMP3의 수준보다 높았다(도 5a).
또한, AIMP3 형질전환(TG) 마우스는 조로(premature aging) 표현형을 보였고, 노화 마커가 주요 기관에서 야생형 마우스보다 증가하였다.
생체 외(in vitro) 뿐만 아니라, 생체 내에서도 중간엽 줄기세포의 노화 마커가 AIMP3에 의해 조절되는지를 알아보기 위하여, Aimp3 형질전환(TG) 마우스와 헤테로-넉아웃(HKO) 마우스로부터 mBM-MSCs를 분리하였다.
Aimp3-transgenic 및 Aimp3-hetero 넉아웃 마우스는 김성훈(서울대학교 약학대학, 의약단백질 네트워크연구단)이 제공하였다. C57B/6 야생형 마우스는 대조군으로 사용하였다.
그 결과, Aimp3 TG 마우스로부터 유래한 골수 유래-중간엽 줄기세포에서는 노화 마커인 p16INK4A, p21CIP1 / WAF1의 발현이 상향조절되었고, 반면 HKO 마우스에서는 하향조절되었음을 관찰하였다(도 5b 및 도 5c).
실시예 5: 세포 노화에 있어서 AIMP3 발현 조절의 기작 확인
후생적 조절자(epigenetic regulators), 히스톤 데아세틸라아제(HDAC), DNA 메틸트랜스퍼라아제(DNMT) 및 miRNAs는 분화능 유지 및 인간의 중간엽 줄기세포의 세포 노화의 조절에 있어 중요한 요소에 해당한다. HDAC와 DNMT 활성이 감소함에 따라 노화 세포에서 그것들의 타겟 유전자가 증가함을 고려하여, HDAC 억제자인 발프로익산(VPA)와 소듐 부티레이트(sodium butyrate, SB) 및 DNMT 억제자인 5-아자시티딘(5-azacytidine, 5-azaC)을 hUCB-MSCs에 처리하였고, AIMP3 발현의 변화를 관찰하였다.
처리된 세포는 노화 표현형을 나타내었으나, AIMP3 단백질 수준의 증가는 없었다(도 S4A). 또한, AIMP3의 단백질 수준이 증가한 노화-유도 조건에서 AIMP3의 mRNA 수준을 평가하였다.
그 결과, AIMP3의 mRNA 수준은 이러한 조건에서 유의적으로 변하지는 않았다(도 7b). 또한, ChIP 분석에 의해 노화 세포의 AIMP3의 프로모터 지역에서의 히스톤 H3 및 H4의 후생적(epigenetic) 상태에 있어서도 유의적인 변화를 관찰하지는 못하였다(도 7c 및 7d). 전사적 활성형인 아세틸 H4 및 히스톤 H3K4Me3의 양은 AIMP3-증가 노화상태에서 변하지 않았다(도 7d).
상기 결과에 의해 세포 노화동안의 AIMP3의 조절은 전사단계에서 일어나는 것이 아니라, 전사 후 단계에서 일어나는 것임을 시사한다.
실시예 6: AIMP3 를 조절하는 miRNA 의 확인
실시예 6-1: 후보 miRNA 의 선별
세포 노화과정 중의 AIMP3를 직접적으로 조절하는 새로운 5가지의 miRNA(miRNA-590-3p, miRNA-543, miR-495, miR-204 및 miR-211)를 선택하였다.
실시예 6-2: 실시간 정량적 PCR
설명서에 따라, TRIzol 시약 TM(Invitrogen, 미국)으로 세포로부터 총 세포 RNA를 추출하였다. 정제된 RNA와 올리고-dT 프라이머를 Accupower RT premix(Bioneer, 한국)에 첨가함으로써 cDNA를 합성하였다. miRNA에 대한 cDNA를 NCode VILO miRNA cDNA Synthesis Kit(Invitrogen, 미국)를 설명서대로 사용하여 합성하였다. 실시간 정량적 PCR은 SYBR Green(Applied Biosystems, USA)을 사용하였고, RPL13A를 내부 컨트롤로 사용하였다. 본 발명에 사용된 프라이머 세트의 서열은 표 2에 나타내었다.
Gene Primer sequrences 서열번호
RPL13A
 F 5’-CAT CGT GGC TAA ACA GGT ACT G-3’ 서열번호 3
R 5’-GCA CGA CCT TGA GGG CAG CC-3’ 서열번호 4
AIMP3-1
 F 5’-TCC AGG CAT CAG GCA ACA TCT GT-3’ 서열번호 5
R 5’-TCC CTT TTG GCT TCC TTG GCA CA-3’ 서열번호 6
AIMP3-2
 F 5’- CAG GGT CAC TCA AGT AGA TGG GCA-3’ 서열번호 7
R 5’-GTT AGT TCC CTA CCT CTG TGT GCC 5-3’ 서열번호 8
p16INK4A
F 5’-GAA GGT CCC TCA GAC ATC CC-3' 서열번호 9
R 5’-CCC TGT AGG ACC TTC GGT GA-3' 서열번호 10
p21CIP1 / WAF1 F 5’-ATT AGC AGC GGA ACA AGG AG-3’ 서열번호 11
R 5’-CTG TGA AAG ACA CAG AAC AG-3’ 서열번호 12
p53
 F 5’-GCA GCC AGA CTG CCT TCC GG-3’ 서열번호 13
R 5’-TTG GGA CGG CAA GGG GGA CA-3’ 서열번호 14
AIMP3 promoter
 F 5’-AAG TCC CAC TCC TGC AAA CT-3’ 서열번호 15
R 5’-CAC TTC TCC ACC TGT CTC ACA-3’ 서열번호 16
p16INK4A promoter
 F 5’-ACC CCG ATT CAA TTT GGC AG-3' 서열번호 17
R 5'- AAA AAG AAA TCC GCC CCC G-3' 서열번호 18
hsa-miRNA-204 5’-TCC CTT TGT CAT CCT ATG CCT-3’ 서열번호 19
hsa-miRNA-211 5’-CCT TTG TCA TCC TTC GCC T-3’ 서열번호 20
hsa-miRNA-495 5’-AAA CAA ACA TGG TGC ACT T-3’ 서열번호 21
hsa-miRNA-543 5’-ATT CGC GGT GCA CTT CTT-3’ 서열번호 22
hsa-miRNA-590-3p 5’-CGG GGG TAA TTT TAT GTA TAA GCT AGT-3’ 서열번호 23
7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems, 미국)을 사용하여 모든 앰플리컨(amplicons)을 분석하였다.
실시예 6-3: 노화세포에서의 miRNA 의 발현 수준 확인
실시간 q-PCR을 사용하여 초기 및 후기 계대의 hUCB-MSCs에서의 상기 실시예 6-1에서의 5가지 후보 miRNA의 발현 수준을 스크리닝하였다(도 8b). 그 결과, miRNA-543 및 miRNA-590-3p만이 복제성 노화세포에서 유의적으로 감소하였다. 이 두 miRNA는 AIMP3 3′UTR에 2개 또는 3개의 결합 위치(binding site)를 가지고 있으며(도 9a), 이들의 시드 서열(seed sequence)는 다양한 포유류에서 보존되었다(도 9b).
다음으로, 다른 노화-유도 조건에서 하에서 miRNA-543 및 miRNA-590-3p의 발현 정도를 조사하였다. 그 결과, 이들 miRNA의 세포적 수준은 AIMP3 단백질 수준이 증가하는 조건에서만 감소하였다(도 8c 및 도 2d).
이는 miRNA-543 및 miRNA-590-3p는 노화 과정에서 AIMP3의 상류조절자(upstream regulator)의 강력한 후보 물질임을 시사한다.
실시예 7: 형질감염 및 3′ UTR - 루시퍼레이스 어세이를 통한 miRNA -543 및 miRNA-590-3p의 AIMP3 3′ UTR 에의 직접 결합여부 확인
실시예 7-1: 형질감염( transfection )
PC3 DNA 대조군과 PC3-AIMP3/p18 발현벡터는 김성훈(서울대학교 약학대학, 의약단백질 네트워크연구단)이 제공하였다. FuGENE 6 형질감염 시약(Roche, 독일)을 설명서에 따라 PC3 DNA 대조군과 PC3-AIMP3/p18 발현벡터의 형질감염에 사용하였다. 제대혈 유래 중간엽 줄기세포가 50~60% confluency에 이르렀을 때, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 PBS로 두 번 세척하였고, 새로운 배양배지에서 24 내지 48시간 동안 0.5㎍/㎖의 벡터와 함께 배양하였다. siRNAs, miRNAs 또는 anti-miRNAs(Bioneer, 한국) 형질감염을 위하여 DharmaFECT 1 Transfection reagent(Dharmacon, 미국)를 설명서에 따라 사용하였다. siRNA 서열은 다음과 같았다; 5′-CCAAGUCUAACAGGAUUGACUACUA-3′(서열번호 24). 제대혈 유래 중간엽 줄기세포가 50~60% confluency에 이르렀을 때, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 PBS로 두 번 세척하였고, 항생제없이 배지 내에서 48시간 동안 siRNAs, miRNAs 또는 anti-miRNAs와 함께 배양하였다. 형질감염 효과를 증가시키기 위해, 또는 장기적 효과를 알아보기 위하여, 상기 형질감염된 세포를 계대배양(subculture)하였고, 다시 동일 방법으로 형질감염시켰다.
실시예 7-2: 3′ UTR - 루시퍼레이스 어세이( assay )
miRNA 타겟 확인(target validatioin)을 위하여, 인간 AIMP3/p18의 전체 3′UTR 서열을 PCR로 증폭하였고, TA-벡터(Promega, Madison, WI, 미국, #A1360)로 클로닝하였다. 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다; 5′-CTCGAGCTGTCCATGCCATACAGAAGATC-3′(Forward)(서열번호 25) 및 5′-TTCCCTTTTGGCTTCCTTGGC-3′(Reverse)(서열번호 26). 제한효소 XhoⅠ 및 SalⅠ을 사용하여 3′UTR을 pmirGLO Dual-Luciferase 벡터(Promega, 미국)에 서브클로닝하였다. 50% confluence에서 293FT 세포 또는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 형질감염하기 24시간 이전에 24-well 플레이트에 시딩(seeding)하였다. 대조 구성(control constructs)와 AIMP3/p18 3′UTR 보고 구성(report constructs)을 DharmaFECT를 설명서대로 사용하여 50nM의 miRNAs(Bioneer,한국)와 함께 상기 실시예 7-1에서와 같이 공동-형질감염시켰다. 형질감염한지 24시간 경과 후, Dual-GloLuciferase Assay System(Promega, 미국) 광도계를 사용하여, 반딧불과 레닐라(Renilla) 루시퍼레이스 활성을 측정하였다. 반딧불의 발광은 레닐라 발광으로 정상화되었다.
실시예 7-3: miRNA -543 및 miRNA -590-3p의 AIMP3 3′ UTR 에의 결합 확인
이들 miRNA가 AIMP3 3′UTR에 직접적으로 결합함을 밝혀내기 위하여, miRNA 결합 위치를 포함한 AIMP3 3′UTR 루시퍼라아제 벡터를 생산하였고(도 4D 및 도 S5A), 50% confluency에서 293FT 세포에 상기 벡터를 형질감염(transfection)시켰다.
투여량 의존방식에서 루시퍼라아제 활성은 miRNA 형질감염에 의해 유의적으로 감소하였다(도 8e). 즉, miRNA의 과발현 또는 억제는 AIMP3의 단백질 수준을 감소시키거나 또는 증가시켰다(도 8f). 나아가 접촉 방해된 세포에서 감소된 AIMP3는 miRNA-543 및 miRNA-590-3p의 형질감염에 의해 감소하였다(도 10b). 그러나 AIMP3의 mRNA 수준은 이들 miRNA에 의해 조절되지 않았다(도 10c).
이는 노화세포에서 AIMP3 및 mRNA의 발현 패턴과 일치함을 시사한다. 종합하면, 이들 miRNA는 AIMP3 mRNA의 3′UTR에 직접 결합하고, 인간 중간엽 줄기세포의 세포 노화동안 AIMP3의 상류조절자가 될 수 있음을 의미한다.
실시예 8: miRNA -543 및 miRNA -590-3p의 발현 조절에 따른 AIMP3 및 세포 노화의 조절
실시예 8-1: 세포증식의 확인- 면역세포화학법
AIMP3/p18, p16INK4A, p21CIP1 / WAF1 및 Ki67의 면역세포화학분석을 수행하였다. 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시켰고, 실온에서 10분간 0.5% Triton X-100(Sigma-Aldrich, 미국)에 투과시켰다. 그 후 세포를 5% 정상 염소 혈청(Zymed Laboratories Inc., 미국)에서 배양하였고, AIMP3/p18 (1:200, polyclonal, Abcam, UK), p16INK4A(1:200, polyclonal, Abcam, UK), p21CIP1/WAF1(1:200,polyclonal, SantaCruz,CA) 및 Ki67 (1:200, polyclonal, Abcam, UK)에 대한 항체로 하룻밤 동안 염색하였다. 다음으로, 세포를 Alexa 488-표지된 2차항체(1:1000; Molecular Probes, 미국)로 1시간동안 배양시켰다. 핵은 DAPI(Invitrogen, 미국)로 염색하였고, 다중초점 현미경(Eclipse TE200, Nikon, 일본)으로 이미지를 얻었다.
실시예 8-2: miRNA -543 및 miRNA -590-3p의 발현 조절에 따른 노화의 표현형 확인
miRNA의 직접적인 조절이 AIMP3 조절을 통해 세포 노화를 유도할 수 있는지를 알아보고자 하였다. miRNA-543 및 miRNA-590-3p의 성숙형(mature form)을 hUCB-MSCs에 상기 실시예 7-1과 같이 형질감염시켰고, AIMP3의 단백질 수준과 노화 마커를 조사하였다(도 11).
이들 miRNA의 과발현은 AIMP3 단백질과 노화마커 p16INK4A, p21CIP1 / WAF1를 감소시켰다(도 11a 및 11b). 세포증식의 증가는 상기 실시예 8-1에서와 같이 Ki67 면역세포화학법에 의해 밝혀졌고, 상기 실시예 2-3에 의해 측정한 SA-β-gal 활성은 miRNA-543 및 miRNA-590-3p의 형질감염에 의해 감소하였다(도 11c 내지 11e). 또한, 상기 실시예 2-2와 같이 세포주기 변화를 관찰한 결과, miRNA 형질감염에 의해 G1 세포주기 정지 또한 감소하였으며, S기의 비중이 증가하였고, 이는 AIMP3 발현의 억제와 유사한 표현형을 보였다(도 11f).
다음으로, miRNA-543 및 miRNA-590-3p를 억제시켰고, 유전자 발현과 표현형 변화를 관찰하였다(도 12).
그 결과, 이들 miRNA의 억제는 AIMP3 발현을 증가시켰고, 노화 마커를 유도하였다(도 12a 및 12b). miRNA의 억제는 또한 실시예 8-1에서와 같이 세포 증식을 감소시켰고, 상기 실시예 2-3와 같이 측정한 SA-β-gal 활성을 유도하여, AIMP3의 과발현과 유사한 표현형을 나타내었다(도 12c 내지 12e). 같은 맥락으로, 상기 실시예 2-2와 같이 세포주기 변화를 관찰한 결과, 두 miRNA의 억제는 G1 세포주기 정지를 유발하였고, S기의 비중을 감소시켰다(도 12f). 종합하면, miRNA-543 및 miRNA-590-3p는 AIMP3 발현을 직접 조절함으로써 세포 노화 표현형을 조절한다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Composition for Inhibiting Senescence of Adult Stem Cells By Increasing of miRNA Expression <130> PA130498/KR <160> 26 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-543 <400> 1 aaacauucgc ggugcacuuc uu 22 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-590-3p <400> 2 uaauuuuaug uauaagcuag u 21 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPL13A forward primer <400> 3 catcgtggct aaacaggtac tg 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPL13A reverse primer <400> 4 gcacgacctt gagggcagcc 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP3-1 forward primer <400> 5 tccaggcatc aggcaacatc tgt 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP3-1 reverse primer <400> 6 tcccttttgg cttccttggc aca 23 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP3-2 forward primer <400> 7 cagggtcact caagtagatg ggca 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP3-2 reverse primer <400> 8 gttagttccc tacctctgtg tgcc 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p16(INKA4A) forward primer <400> 9 gaaggtccct cagacatccc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p16(INKA4A) reverse primer <400> 10 ccctgtagga ccttcggtga 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p21(CIP1/WAF1) forward primer <400> 11 ccctgtagga ccttcggtga 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p21(CIP1/WAF1) reverse primer <400> 12 ctgtgaaaga cacagaacag 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 forward primer <400> 13 gcagccagac tgccttccgg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 reverse primer <400> 14 ttgggacggc aagggggaca 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP3 promoter forward primer <400> 15 aagtcccact cctgcaaact 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP3 promoter reverse primer <400> 16 cacttctcca cctgtctcac a 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p16(INKA4A) promoter forward primer <400> 17 accccgattc aatttggcag 20 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p16(INKA4A) promoter reverse primer <400> 18 aaaaagaaat ccgcccccg 19 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miRNA-204 primer <400> 19 tccctttgtc atcctatgcc t 21 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miRNA-211 primer <400> 20 cctttgtcat ccttcgcct 19 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miRNA-495 primer <400> 21 aaacaaacat ggtgcactt 19 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miRNA-543 primer <400> 22 attcgcggtg cacttctt 18 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miRNA-590-3p primer <400> 23 cgggggtaat tttatgtata agctagt 27 <210> 24 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 24 ccaagucuaa caggauugac uacua 25 <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP3/p18 forward primer <400> 25 ctcgagctgt ccatgccata cagaagatc 29 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP3/p18 reverse primer <400> 26 ttcccttttg gcttccttgg c 21

Claims (19)

  1. miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는, 성체줄기세포의 노화 억제용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 miRNA 핵산 분자는 벡터에 삽입된 형태인 것인 조성물.
  3. miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA 핵산 분자 및 성체줄기세포를 포함하는 노화를 억제시키는 세포치료제.
  4. 제3항에 있어서, 상기 miRNA 핵산 분자는 세포 내에 도입된 형태인 것인 세포치료제.
  5. 제3항에 있어서, 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 신경줄기세포, 조혈모세포 및 간줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 것인, 세포치료제.
  6. 성체줄기세포 내 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA의 함량을 증가시키는 단계를 포함하는, 노화가 억제된 성체줄기세포 제조 방법.
  7. 성체줄기세포 내 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA의 함량을 증가시키는 단계를 포함하는, 성체줄기세포의 노화 억제 방법.
  8. 성체줄기세포 내 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA의 함량을 증가시키는 단계를 포함하여, 성체줄기세포에서 AIMP3(ARS-interacting multi-functional protein-3)의 발현을 억제시키는 방법.
  9. 성체줄기세포 내 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA의 함량을 증가시키는 단계를 포함하여, 성체줄기세포에서 p16 또는 p21의 발현을 감소시키는 방법.
  10. 성체줄기세포 내 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA의 함량을 증가시키는 단계를 포함하여, 성체줄기세포의 세포 주기 중 G기를 감소시키고, S기를 증가시키는 방법.
  11. 성체줄기세포 내 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA의 함량을 증가시키는 단계를 포함하여, 성체줄기세포에서 노화-관련 β-갈락토시다아제(SA-β-gal)의 활성을 감소시키는 방법.
  12. miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는, 성체줄기세포의 증식용 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 miRNA 핵산 분자는 벡터에 삽입된 형태인 것인 조성물.
  14. 성체줄기세포 내 miRNA-543 또는 miRNA-590-3p인 miRNA의 함량을 증가시키는 단계를 포함하는, 성체줄기세포의 증식 방법.
  15. 제6항 내지 제10항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, miRNA의 함량을 증가시키는 방법은, 상기 miRNA를 성체줄기세포 내에 도입하는 방법, 상기 miRNA를 암호화하는 유전자의 세포내 카피수 증가, 상기 miRNA를 암호화하는 염색체 상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법, 상기 miRNA를 암호화하는 염색체 상의 유전자의 발현 조절 서열을 이보다 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법, 상기 miRNA의 활성이 증가하도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 miRNA를 암호화하는 유전자를 대체하는 방법 및 상기 miRNA의 활성이 강화되도록 상기 miRNA를 암호화하는 염색체상의 유전자에 변이를 도입시키는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법인 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제2항 및 제12항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 신경줄기세포, 조혈모세포 및 간줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 것인, 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 세포 유래인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  18. 제6항 내지 제11항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 신경줄기세포, 조혈모세포 및 간줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 것인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 세포 유래인 것을 특징으로 하는, 방법.

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20180124380A (ko) * 2017-05-11 2018-11-21 순천향대학교 산학협력단 마이크로rna를 유효성분으로 포함하는 성체줄기세포 노화 억제용 조성물 및 이를 이용한 배양 방법
WO2019139351A1 (en) * 2018-01-09 2019-07-18 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Pharmaceutical composition for preventing or treating muscular disease or cachexia comprising, as active ingredient, mirna located in dlk1 -dio3 cluster or variant thereof

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WO2019139351A1 (en) * 2018-01-09 2019-07-18 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Pharmaceutical composition for preventing or treating muscular disease or cachexia comprising, as active ingredient, mirna located in dlk1 -dio3 cluster or variant thereof

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