TWI670080B - 抑制癌細胞及/或癌症幹細胞之存活、癌化及轉移之方法 - Google Patents

抑制癌細胞及/或癌症幹細胞之存活、癌化及轉移之方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種用於抑制及預防受試者身上癌症幹細胞(CSCs)之存 活、癌化及轉移的新方法，其係使用針對CSCs的第十七型膠原蛋白(Col XVII)抑制劑，或者提供一種Col XVII抑制劑用於製造一種可抑制及預防CSCs之存活、癌化及轉移的藥劑的用途。本發明亦提供一種用於抑制及預防該癌症幹細胞之存活、癌化及轉移的藥物組成物，其包含一有效量的Col XVII抑制劑。

Description

抑制癌細胞及/或癌症幹細胞之存活、癌化及轉移之方法
本發明大致關於一種抑制及預防受試者身上癌細胞及/或腫瘤起始細胞或癌症幹細胞(TICs或CSCs)之存活、癌化及轉移的方法。特別是，本發明提供一種用於TICs的第十七型膠原蛋白(Col XVII)抑制劑的用途，其係用於抑制及預防該腫瘤起始細胞或癌症幹細胞之存活、癌化及轉移。
腫瘤起始細胞或癌症幹細胞(TICs)可作為癌症起始組分的發現，提供了一種引人注目的癌症治療方法。TICs構成癌細胞的一小部分，其具有幹細胞的特質，例如自我更新(self-renewal)及多能分化性。TIC自我更新的調控異常可能是發展成癌症所需的原因，而TICs的存活則是抵抗癌症治療及造成腫瘤復發的原因。既然TICs會造成腫瘤起始及抵抗治療，新發現的TICs特徵以及抑制訊息路徑已快速地成為癌症新式療法的戰略。
高純度TICs群體已在細胞亞群中被鑑定出，其在某些特定的表面標誌上呈現陽性，例如CD133、EpCAM、CD44、CD166(O'Brien CA,Pollett A,Gallinger S,Dick JE(2007)。一種能在免疫不全小鼠中起始腫瘤生長的人類結腸癌細胞(A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice.)。Nature 445：106-110；Ricci-Vitiani L,Lombardi DG,Pilozzi E,Biffoni M,Todaro M,Peschle C,De Maria R(2007)。人類結腸癌起始細胞的鑑定及擴增(Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells.)。Nature 445：111-115)，或者可由球體條件中獲得，其為一種在無血清培養基中的懸浮培養條件(Dalerba P,Dylla SJ,Park IK,Liu R,Wang X,Cho RW,Hoey T,Gurney A,Huang EH,Simeone DM et al(2007)。人類結腸直腸癌症幹細胞的表型鑑定(Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells.。Proc Natl Acad Sci U S A 104：10158-10163)。癌細胞是在非貼附性條件(anchorage-independent condition)中增生/分化，而形成群落性球體，其可部分地概括原發性腫瘤表達譜(Lee J,Kotliarova S,Kotliarov Y,Li A,Su Q,Donin NM,Pastorino S,Purow BW,Christopher N,Zhang W et al(2006)。相較於經血清培養的細胞株，來自膠質母細胞瘤的腫瘤幹細胞而培養於bFGF及EGF中，較接近於原發性腫瘤的表型及基因型(Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.。Cancer Cell 9：391-403)。與教條相反的是，表皮細胞的存活是貼附性的，先前報導已證明，當將一小群正常神經或乳腺幹細胞培養於懸浮條件時，可產生漂浮的球體群落(Dontu G,Abdallah WM,Foley JM,Jackson KW,Clarke MF,Kawamura MJ,Wicha MS(2003)。人類乳腺幹/前驅細胞的體外增殖及轉錄譜(In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.)。Genes Dev 17：1253-1270；Reynolds BA,Weiss S(1996)。群落及族群分析證明EGF-應答的乳腺哺乳動物胚胎CNS前驅細胞是一種幹細胞(Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell.)。Dev Biol 175：1-13；Weiss S,Reynolds BA,Vescovi AL,Morshead C,Craig CG,van der Kooy D(1996)。在哺乳動物前腦中有神經幹細胞嗎？(Is there a neural stem cell in the mammalian forebrain？)。Trends Neurosci 19：387-393)。雖然這些數據同時強烈暗指TICs或正常幹細胞較其他細胞而言，可具有較佳的懸浮存活能力，但，即便有也很少會有研究會特地探討這些細胞的懸浮存活能力是否有所提高，以及闡明其基本機制。
本發明係基於非預期性地發現，第十七型膠原蛋白(Col XVII)可作為S727-磷酸化STAT3(S727STAT3)的下游標的，並且能藉由形成半橋粒(hemidesmosome)結構而介導癌症幹細胞(CSCs)的懸浮存活能力。
因此，一方面，本發明提供一種抑制及預防受試者身上癌細胞及/或癌症幹細胞(CSCs)之存活、癌化及轉移的方法，其包含將一種含有針對CSCs且具有可有效抑制且預防該癌症幹細胞形成半橋粒結構、存活、癌化及轉移的劑量的第十七型膠原蛋白(Col XVII)抑制劑的藥物組成物給藥予該受試者。
另一方面，本發明提供一種針對CSCs的Col XVII抑制劑，而用於製造一種可抑制及預防癌細胞及/或CSCs形成半橋粒結構、存活、癌化及轉移的用途。
本發明中，Col XVII抑制劑為一種可阻斷PP2A-S727STAT3-Col XVII路徑的要素、一種可抑制Col XVII本身的要素、或一種可抑制S727STAT3-Col XVII-層粘蛋白5-FAK路徑的要素，因而可介導CSCs中半橋粒結構的形成、懸浮存活性及腫瘤起始。在本發明一具體實施例中，Col XVII抑制劑係選自由微 RNA(miRNA)、小干擾RNA(siRNA)、化學試劑、抗體、存在於PP2A-S727STAT3-Col XVII路徑中酵素的抑制劑、存在於S727STAT3-Col XVII-層粘蛋白5-FAK路徑中酵素的抑制劑所組成的群組中。
又一方面，本發明亦提供一種用於抑制及預防癌細胞及/或癌症幹細胞形成半橋粒結構、存活、癌化及轉移的藥物組成物，其包含一有效量的Col XVII抑制劑。
又一方面，本發明亦提供一種用於製造可預防致癌性及治療癌症的套組的CSC表面蛋白或胞外蛋白之用途，其中該CSC表面蛋白或胞外蛋白是Col XVII。
這些和其它方面將由下述結合以下附圖的較佳實施例的詳細說明而變得明顯，雖然其變體及修飾可在不脫離本發明新穎概念的精神及範疇下受到影響。
前述發明內容以及下述本發明的詳細說明將藉由與所附附圖一起閱讀來獲得更佳的理解。
圖1a-1f顯示經球體培養滋養的TICs的鑑定，其中圖1a是在非貼附性或貼附性球體培養中，由CCS及HT29形成的球體代表圖，比例尺=50μm；圖1b，每隔15天將在球體培養中的CCS癌細胞進行繼代。針對三個繼代且尺寸超過250μm的CCS球體，取五張照片進行定量。圖1c(西方墨點)及1d(流式細胞儀)是用於分析團塊癌細胞(團塊)及經球體培養滋養的TICs(SPH)。圖1e(左)，針對團塊癌細胞、經球體培養滋養的TICs、以及在基質膠中分化一個月的TICs的Cdx2進行免疫染色，比例尺=50μm，圖1e(右)，每個樣本取五張照片進行 呈現陽性細胞的定量。圖1f顯示得自CCS及HT29細胞的團塊癌細胞及球體滋養的TICs的致癌性。結果以三個獨立試驗的平均值±SD表示之。星號代表由單向ANOVA(b，e)、學生t檢定(d)及費雪精確性檢定(f)所決定的顯著差異。
圖2a-2i顯示經球體培養滋養的TICs的較佳懸浮存活能力。圖2a(左)，針對CCS進行TUNEL染色的代表圖，以及圖2a(右)，TUNEL陽性細胞的定量值。圖2b顯示，將團塊癌細胞(團塊)及球體培養-滋養的TICs(SPH)培養在球體條件中24小時，接著進行TUNEL檢測。圖2c顯示，將由HCW原發性肝轉移結腸直腸癌細胞中分離出的ALDH-及ALDH+細胞培養於球體條件下24小時，接著進行TUNEL檢測。流式細胞儀分析圖顯示在HCW原發性肝轉移癌細胞中及新鮮結腸直腸癌樣本中ALDH+細胞的表現(虛線：含5μM DEAB對照組；實線：ALDH表現量)，以及HCW細胞中流式細胞儀細胞分選的方法，其中P6是ALDH-分選區域，而P5是ALDH+分選區域。圖2d顯示，將團塊癌細胞(團塊)及經球體培養-滋養的TICs(SPH)培養於球體條件下10小時，接著分別進行西方墨點分析。圖2e顯示，將團塊癌細胞(團塊)及經球體培養-滋養的TICs(SPH)培養於培養皿中24小時，培養皿上塗佈含有生長培養基及0.5%甲基纖維素(MC)，且不含或含有5%基質膠(MG)的Poly-HEMA(6mg/ml)。圖2e(左)，CCS的TUNEL染色代表圖片，比例尺=50μm，以及圖2e(右)，TUNEL陽性細胞的定量。圖2f(頂部)，CCS在軟瓊脂上的貼附性生長測試代表圖片，以及2f(底部)，每孔中群落的定量。圖2g顯示，將由CCS的經培養-滋養的TICs中分離的CD133-及CD133+細胞培養於球體條件下24小時，接著進行TUNEL檢測。結果以三個獨立試驗的平均值±SD表示之。星號代表由單向ANOVA所決定的顯著差異。圖2h顯示，以PKH標定CCS癌細胞，接著將其培養在球體條 件下15天。使球體進行TUNEL染色及β-微管蛋白及被剪切的半胱天冬酶(C3)的免疫染色。圖2i顯示，在不含或含有5%基質膠(MG)的情況下，將CCS團塊癌細胞(團塊)及經球體培養-滋養的TICs(SPH)置於體內懸浮條件中24小時。圖2i(左)，TUNEL染色的代表照片，而圖2i(右)，TUNEL陽性細胞的定量。每個樣本取五張照片進行TUNEL檢測的定量。結果以三個獨立試驗的平均值±SD表示之。星號代表由學生t檢定或單向ANOVA所決定的顯著差異。比例尺=20μm。
圖3a-3i顯示STAT3在S727位點上的活化，介導經球體滋養的TICs的懸浮存活能力。圖3a-3c顯示，將團塊癌細胞(Bulk)及經球體培養-滋養的TICs(SPH)培養於球體條件中10小時，接著以西方墨點法分析總蛋白質(參見圖3a)或分級分離的蛋白質(N代表細胞核，而C則代表細胞質)(參見圖3b)，並進行免疫染色，接著以共聚焦顯微鏡(CCS)觀察(參見圖3c)。圖3d顯示，以PKH標定CCS癌細胞，接著培養於球體條件中15天。進行球體的免疫染色，接著以共聚焦顯微鏡觀察。圖3e顯示，將過度表現有對照組shRNAs(CTR)或不同STAT3 shRNAs，si(1)及si(2)，的球體培養CCS懸浮並培養於球體條件中24小時，接著進行TUNEL檢測。圖3e(頂部)，STAT3敲除效率的西方墨點分析，以及圖3e(底部)，TUNEL陽性細胞的定量。圖3f及3h顯示過度表現對照組質體(CTR)或S727A點突變的STAT3(SA)的球體培養細胞。圖3g及3i顯示過度表現對照組質體(CTR)或者，不含或含Y705F突變(YFSE)的S727A點突變的STAT3(SE)的團塊癌細胞。圖3f及3g顯示細胞培養於球體條件下24小時，接著進行TUNEL檢測。圖3f及3g(上部)，西方墨點分析，以及圖3f及3g(底部)，TUNEL陽性細胞的定量。圖3h及3i顯示，將得自CCS的細胞在體內懸浮條件下培養24小時，接著進行TUNEL檢測。結果以三個獨立試驗的平均值±SD表示之。星號代表由學生t檢定及單向ANOVA所決定的顯著差異。比例尺=20μm。
圖4a-4m顯示由S727-磷酸化STAT3造成的Col XVII上調，介導滋養的TICs的懸浮存活能力。圖4a(頂部)，球體培養0、5及15天的西方墨點 分析，以及圖4a(底部)，製備CCS細胞用於探討基因表現圖普及後續數據分析的示意圖。圖4b顯示，經由基因本體論(GO)及路徑分析得知，在得自CCS的TICs中上調的基因係分佈在癌症及細胞死亡的類別。圖4c顯示，收取在球體培養之前(第0天)及球體培養之後第5或15天的CCS癌細胞以進行mRNA分離，接著進行定量RT-PCR分析。圖4d-4e顯示HT29團塊癌細胞(團塊)及經球體培養-滋養的TICs(SPH)的定量RT-PCR結果，其係將團塊癌細胞(團塊)及經球體培養-滋養的TICs(SPH)培養於球體條件中10小時，接著進行西方墨點(圖4d)及免疫染色(圖4e)，再以共聚焦顯微鏡觀察(CCS)。圖4f顯示使過度表現對照組質體(CTR)或S727A點突變的STAT3(SA)的細胞進行mRNA及蛋白質含量測定。圖4g顯示使過度表現對照組質體(CTR)或S727E點突變的STAT3(SE)的細胞進行mRNA及蛋白質含量測定。圖4h-4i顯示表現球體培養或S727E點突變的STAT3團塊癌細胞會過度表現對照組質體shRNAs(CTR)或不同的Col17a1 shRNA，si(1)及si(2)。將細胞培養在球體條件中24小時，接著進行TUNEL檢測，包括。圖4h-4i(頂部)顯示Col17a1敲除效率的西方墨點結果，以及圖4h-4i(底部)顯示TUNEL陽性細胞的定量數值。圖4j顯示在Col17a1啟動子區域側邊區域的基因組結構(上半部)以及pEZX-PG04-Col17a1報導基因建構的示意圖。轉錄起始位置(TSS)。圖4k(左)，表現S727E點突變的STAT3的團塊癌細胞的ChIP分析結果。將染色質在不含抗體、含有抗-FLAG抗體或含同種型IgG抗體下培養。以PCR增殖在Col17a1啟動子中的第八結合位點的片段(C8)。圖4k(右)，以定量RT-PCR進行DNA結合性的定量。輸入，總輸入裂解物的4%。圖41顯示，使用表現S727A點突變的STAT3且經球體培養-滋養的TICs(SPH)分析S727的磷酸化在活化Col17a1啟動子中所扮演的角色。圖4m顯示在Col17a1啟 動子中第八個結合位點的突變分析。使用含有野生型(WT)及箱8突變的報導基因建構進行分析這個位點在介導由STAT3所產生活化的重要性。結果以三個獨立試驗的平均值±SD表示之。星號代表由學生t檢定及單向ANOVA所決定的顯著差異。比例尺=20μm。
圖5a-5k顯示經Col XVII-介導的懸浮存活能力取決於層粘蛋白5及FAK活化。圖5a及5b顯示將團塊癌細胞(團塊)及經球體培養-滋養的TICs(SPH)培養於球體條件中10小時，接著進行西方墨點分析(圖5a)，以及免疫螢光分析(圖5b)，接著以共聚焦顯微鏡進行觀察。圖5c顯示使過度表現對照組質體(CTR)或S727A點突變的STAT3(SA)球體培養細胞進行蛋白質含量分析。圖5d顯示使過度表現對照組質體(CTR)或S727E點突變的STAT3(SE)的團塊癌細胞進行其蛋白質含量測定。圖5e-5f顯示使過度表現對照組質體shRNAs(CTR)或不同的Col17a1 shRNAs，si(1)及si(2)的球體培養細胞，進行其mRNA及蛋白質含量測定(圖5e)，以及免疫染色分析(CCS)(圖5f)，接著以共聚焦顯微鏡觀察。圖5g(頂部)，在存在或不含10μM MG132情況下，以50μg/ml環己醯亞胺處理6、12、24及36小時後，針對表現對照組質體shRNAs(CTR)或Col17a1 shRNAs，si(1)及si(2)的經球體培養-滋養的TICs進行西方墨點分析。圖5g(底部)，層粘蛋白5蛋白質相對條帶強度的圖示。在細胞萃取物中層粘蛋白5蛋白質的初始強度百分比經標準化於β-微管蛋白量後隨時間作圖。圖5h顯示，將團塊癌細胞(團塊)及經球體培養-滋養的TICs(SPH)培養於球體條件中小時，接著進行西方墨點分析。圖5i顯示表現對照組質體shRNAs(CTR)或Col17a1 shRNAs，si(1)及si(2)的經球體培養-滋養的TICs的西方墨點分析。圖5j顯示，針對過度表現對照組質體(CTR)、S727A點突變的STAT3(SA)的TICs(SPH)進行蛋白質含量測定。 圖5k顯示針對過度表現對照組質體(CTR)、S727E點突變的STAT3(SE)的團塊細胞進行蛋白質含量測定。比例尺=20μm。
圖6a-6e顯示經球體培養-滋養的TICs具有半橋粒樣斑塊，且可在懸浮條件下存活。圖6a顯示將由懸滴培養(團塊)而形成的HT29團塊癌細胞聚集，以及由HT29球體培養(SPH)形成的球體進行免疫螢光分析，並以共聚焦顯微鏡進行驗證。圖6b顯示由球體培養而形成的球體中，野生型半橋粒的TEM影像，比例尺=0.2μm。圖6c顯示圖6a中的細胞，在球體條件中培養24小時，接著進行存活/死亡分析。圖6d顯示，將經亂序對照組(scrambled)(Scr)，或者針對Col17a1(siCol17a1)或層粘蛋白5(si層粘蛋白5)的shRNA轉染的HT29細胞，在球體培養下所形成的球體，進行免疫螢光染色，接著以共聚焦顯微鏡進行驗證，而經球體培養24小時後，進行存活/死亡分析。圖6e顯示，將以胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶處理30分鐘的球體培養所形成的球體進行球體培養24小時，接著進行存活/死亡分析。比例尺=20μm。
圖7a-7m顯示PP2A調控STAT3在S727為點的活化，並介導TICs的懸浮存活能力。圖7a顯示，將團塊癌細胞(團塊)及經球體培養-滋養的TICs(SPH)培養於球體條件下10小時，接著進行西方墨點分析。圖7b顯示，以免疫染色分析經球體培養的PKH-標定CCS細胞。圖7c顯示經0、0.1、0.5、及1nM OA處理1小時，或0、5、10、及15nM CA處理30分鐘的CCS團塊癌細的西方墨點分析。圖7d顯示以50nM神經醯胺C6處理CCS球體培養-滋養的TICs 24小時的西方墨點分析。圖7e顯示CCS團塊癌細胞的PP2A或STAT3複合體經免疫沉澱後的西方墨點分析。圖7f顯示，將表現對照組質體(CTR)或野生型(WT)PP2A的經球體培養-滋養的TICs培養於球體條件下24小時的結果。圖7f(頂部)， 西方墨點分析；圖7f(底部)，TUNEL陽性細胞的定量數據。圖7g顯示，將表現對照組質體(CTR)或顯性失活(dominant negative)(DN)PP2A的團塊癌細胞培養於球體條件下24小時的結果，圖7g(頂部)，西方墨點分析；圖7g(底部)，TUNEL陽性細胞的定量數據。圖7h顯示將圖7f中的細胞置於體內懸浮條件中24小時，接著進行TUNEL檢測。圖7i顯示將圖7g的細胞置於體內懸浮條件中24小時，接著進行TUNEL檢測。圖7j顯示得自非貼覆性培養的經滋養TICs及ALDH+癌細胞在PP2A/S727STAT3/Col XVII路徑的提高。圖7j(左側)顯示將得自非貼性培養的團塊癌細胞(團塊)及經球體培養-滋養的TICs(SPH)培養於球體條件下10小時，接著進行西方墨點分析，而圖7j(右側)顯示分離自HCW原發性肝臟轉移癌細胞及新鮮的結腸直腸癌樣本的ALDH-及ALDH+細胞的西方墨點分析結果。圖7k顯示將團塊癌細胞(團塊)及經球體培養-滋養的TICs(SPH)培養於球體條件中24小時，接著進行西方墨點分析。圖7l顯示TUNEL陽性細胞的定量數值。圖7m顯示將團塊癌細胞(團塊)及經球體培養-滋養的TICs(SPH)培養於球體條件中10小時，接著進行西方墨點分析。結果以三個獨立試驗的平均值±SD表示。星號代表由學生t檢定所決定的顯著差異。比例尺=20μm。
圖8a-8f顯示懸浮存活能力決定致癌性，並對應於臨床腫瘤階段及存活。圖8a顯示表現DN PP2A及在含有或不含針對Col17a1的shRNA下的S727E點突變的STAT3的團塊癌細胞，或者過度表現WT PP2A、S727A點突變的STAT3、及針對Col17a1的shRNA的TICs的致癌性。圖8b及8c顯示由HCW原發性肝轉移癌細胞以及新鮮的癌細胞所分離出的HT29及ALDH+細胞的經培養滋養TICs(SPH)，將其培養在球體條件中24小時，期間以STAT3抑制劑(S3I-201,50μM)或1：25稀釋的0.25mg/ml抗-Col XVII抗體進行處理，接著進行TUNEL檢測(Ab-1，Abcam；Ab-2，Pierce)。圖8d顯示，在注射TICs後，以靜 脈注射方式，直接以STAT3抑制劑(S3I-201,50μM)、1：25稀釋的0.25mg/ml抗-Col XVII抗體、或STAT3抑制劑(S3I-201,5mg/kg)處理滋養的TICs(HT29)。圖8e顯示原發性結腸直腸腫瘤中pS727STAT3及Col XVII的表現，係以免疫組織化學染色法進行組織陣列玻片的染色而偵測。圖8e(頂部)，顯示大腸腫瘤組織陽性染色的代表性照片(不同階段)，圖8e(底部)，接著決定蛋白質表現及腫瘤階段間的定量及關連。結果以DAB陽性細胞的百分比表示，每個單一繪圖代以表一位病患。中位數以單一黑線表示。圖8f顯示具有或不具有pS727STAT3及Col XVII表現量上調的150位結腸直腸癌病患的存活曲線(使用Kaplan-Meier方法計算)。pS727STAT3表現量40%或Col XVII50%被視為是陽性。星號代表由費雪精確性檢定、單向ANOVA及時序檢驗法所決定的顯著差異。
圖9a-9e顯示由與人類肺癌相關的惡性胸腔積液中的TICs表現的Col XVII及層粘蛋白5表現量，以及在惡性胸腔積液中，經由來自A549細胞的經滋養TICs所誘導的Col XVII/層粘蛋白5路徑的需求。圖9a顯示來自人類惡性胸腔積液的細胞天然地形成球體，其可維持在球體培養中幾週，而來自充血性心臟衰竭病患的良性胸腔積液的細胞，即使將其培養在球體條件中，其並不會形成球體。圖9b及9c顯示的免疫螢光結果，顯示在人類惡性胸腔積液中的腫瘤細胞會形成球體型態，並表現CD44，此為一種肺癌幹細胞的細胞表面標誌，Col XVII及層粘蛋白5。圖9d顯示的免疫螢光分析結果顯示由A549細胞而來的經滋養TIC所表現的Col XVII及層粘蛋白5的表現量。圖9e顯示來自A549細胞的滋養的TICs形成惡性胸腔積液的能力取決於Col XVII-層粘蛋白5路徑。在犧牲前進行微斷層掃描(Micro-CT)以證明胸腔和肺外腫瘤的生長。圖9e(左)，接受指定量的團塊或來自A549細胞的滋養TICs注射的小鼠，其胸膜腔的粗略影像，以及圖9e(右)，以來自不同條件的指定量細胞注射後形成惡性胸腔積液的比率。比例尺=20μm。
圖10A-10F顯示在球體培養中的A549及CL1-1細胞被證明具有癌幹細胞樣細胞(CSC)及上皮至間質轉型(EMT)標誌，以及體外侵襲及遷移能力 的特徵。圖10A顯示，相較於培養於非球體培養基中而言，當將A549及CL1-1細胞培養於非貼附性培養皿及球體培養基中12天時，其表現出球體形成能力的增加。以培養在貼附性培養皿及含10% FBS的DMEM中的A549細胞作為對照組，其並不會形成球體。圖10B顯示在A549及CL1-1細胞中，Oct-4、Nanog、及Sox2的西方墨點分析結果。圖10C顯示EMT標誌，包括鋅指轉錄因子、E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白、纖維連粘蛋白及波形蛋白的西方墨點分析結果。圖10D顯示遷移試驗結果。圖10E顯示侵襲試驗結果。圖10F顯示刮除癒合試驗在0及24小時的結果。結果以三個獨立試驗的平均值±標準差表示。星號代表由學生t檢定或單向ANOVA所決定的顯著差異。比例尺代表50μm。
圖11A-11G顯示微陣列分析結果，其顯示肺癌幹細胞樣細胞(CSC)中，Col XVII及層粘蛋白-5的基因上調，以及敲除Col XVII使培養於球體培養中的A549及CL1-1肺癌細胞形成球體能力的降低，以及上皮至間質轉型(EMT)-關聯蛋白質的表現量及細胞遷移及侵襲能力也降低。A549及CL1-1細胞在球體培養(TS-LC)或貼附性培養(CTR)下生長12天。圖11A顯示微陣列分析結果(將A549細胞培養於血清或無血清培養基中12天的比較)。圖11B顯示A549細胞中Col XVII的RT-PCR分析，以及A549及CL1-1細胞中Col XVII及層粘蛋白-5的西方墨點分析。圖11C顯示敲除Col XVII造成A549及CL1-1細胞形成球體的能力降低。圖11D呈現的西方墨點分析顯示敲除Col XVII使EMT標誌(包括鋅指轉錄因子及N-鈣粘蛋白)的表現下調，而E-鈣粘蛋白則上調。圖11E顯示在敲除Col XVII後遷移試驗的結果。圖11F顯示在敲除Col XVII後侵襲試驗的結果。圖11G顯示在A549及CL1-1細胞中敲除Col XVII後刮除癒合試驗的結果。結果以三個獨立試驗的平均值±標準差表示。星號代表由學生t檢定或單向ANOVA所決定的顯著差異。
圖12A-12E顯示敲除層粘蛋白-5可降低培養於球體培養中的A549及CL1-1肺癌細胞形成球體的能力，且上皮至間質轉型(EMT)-關聯蛋白質的表現量以及細胞遷移及侵襲能力也降低。圖12A顯示敲除層粘蛋白-5造成 A549及CL1-1細胞形成球體的能力降低。圖12B呈現西方墨點分析的結果，其顯示敲除層粘蛋白-5使EMT標誌(包括鋅指轉錄因子及N-鈣粘蛋白)的表現下調，而E-鈣粘蛋白則上調。圖12C顯示在敲除層粘蛋白-5後遷移試驗的結果。圖12D顯示在敲除層粘蛋白-5後侵襲試驗的結果。圖12E顯示在A549及CL1-1細胞中敲除層粘蛋白-5後刮除癒合試驗的結果。結果以三個獨立試驗的平均值±標準差表示。星號代表由學生t檢定或單向ANOVA所決定的顯著差異。
圖13A-13E顯示由PMA刺激而產生的第十七型膠原蛋白的脫落增強層粘蛋白-5的表現。敲除ADAM9或ADAM10抑制培養於球體培養的A549細胞中第十七型膠原蛋白的脫落，並降低層粘蛋白-5的表現。圖13A顯示，當分別添加PMA(100nM)及1,10-菲咯啉(1,10-phenanthroline)(20μM)於球體培養中的A549細胞並培養12天後，所得的代表性層粘蛋白-5、180-kDa全長的第十七型膠原蛋白(Col XVII 180)、以及120-kDa脫落的Coll XVII胞外結構域(Col XVII 120，胞外結構域)的免疫墨點結果。圖13B顯示，當添加環己醯亞胺(50μg/ml)以決定A459細胞中的層粘蛋白-5是否會隨時間降解的西方墨點分析結果。結果顯示當添加PMA時，A459細胞中層粘蛋白-5的降解會減少。圖13C顯示，當在A459細胞中將ADAM9或ADAM10敲除時的西方墨點分析結果，其顯示Col XVII 120表現量的增加，以及層粘蛋白-5表現量的減少。圖13D顯示，當添加PMA時，鋅指轉錄因子的表現量增加，且上皮至間質轉型(EMT)標誌被活化；當添加1,10-菲咯啉時，鋅指轉錄因子及EMT標誌的表現量皆降低。圖13E顯示在添加PMA或1,10-菲咯啉後，刮除癒合能力、細胞遷移及侵襲能力的結果。
圖14A-14F顯示在動物模式中，肺癌轉移的發生率可藉由Col XVII或層粘蛋白-5的敲除而降低。具有高度Col XVI及層粘蛋白-5表現量的患者在切除肺癌後，相較於其他表現圖譜而言，呈現出較差的預後。圖14A顯示尾部靜脈注射A549肺癌細胞的結果。培養於球體培養的A549細胞組別中呈現明顯的肺轉移。而對照組、敲除Col XVII及敲除層粘蛋白-5細胞的組別，在尾 部靜脈注射肺癌細胞12週後，則沒有明顯的肺轉移。圖14B顯示肺部切片的HE染色結果，其顯示出肺轉移現象，如同在接受尾部靜脈注射培養於球體培養的A549細胞所觀察到的一樣。20×，比例尺代表100μm；200×，比例尺代表50μm。圖14C顯示由兩個患有肺癌並進行肺部切除的病患身上所得的腫瘤樣本中，Col XVII及層粘蛋白-5的免疫組織化學染色代表性照片。比例尺代表50μm。圖14D-F顯示陽性表現Col XVII及/或層粘蛋白-5或陰性表現Col XVII及/或層粘蛋白-5的病患的存活曲線，其顯示陽性表現Col XVII及層粘蛋白-5的病患，相較於陰性表現Col XVII或層粘蛋白-5或兩者的病患而言，呈現較差的預後。
圖15A-15E顯示，敲除Col XVII或層粘蛋白-5會使球體培養下A549及CL1-1肺癌細胞中的磷酸化FAK、AKT及GSK3b表現量降低，這意味著Col XVII及層粘蛋白5涉及FAK/AKT/GSK3β路徑而調控上皮至間質轉型(EMT)表型。圖15A顯示，在貼附培養(CTR)或球體培養(TS-LC)下，A549及CL1-1細胞中磷酸化FAK、AKT及GSK3β表現量的西方墨點分析結果。圖15B顯示，在球體培養下，經敲除Col XVII的A549細胞中磷酸化FAK、AKT及GSK3β表現量的西方墨點分析結果。圖15C顯示，在球體培養下，經敲除層粘蛋白-5的A549細胞中磷酸化FAK、AKT及GSK3β表現量的西方墨點分析結果。圖15D顯示，在添加FAK抑制劑(20μM)及LY 294002(10μM)情況下，磷酸化FAK、AKT及GSK3β表現量的西方墨點分析結果。圖15E顯示免疫沉澱測定的結果，其顯示在球體培養下，A549肺癌細胞中鋅指轉錄因子的泛素化被抑制。
圖16a-g顯示經球體培養-滋養的TICs在懸浮條件下，呈現半橋粒樣斑塊。由懸滴培養所形成的HT29團塊癌細胞聚集(團塊/聚集)以及不含或含有針對Col XVII(siCol 17a1)及層粘蛋白-5(si層粘蛋白-5)的shRNA的HT29球體培養(SPH)所形成的球體，進行免疫螢光染色，接著以共聚焦顯微鏡進行驗證。CTR為對照的亂序shRNA。結果顯示於圖16a。比例尺=20μm。圖16b的TEM影像顯示，經球體培養所形成的野生型HT-29球體，存在半橋粒(箭頭處)，但在含有針對Col XVII及層粘蛋白-5的shRNA的細胞中，並不存在半橋粒。比例尺 =0.2μm。圖16c-d分別顯示由懸滴培養形成的團塊癌細胞及培養於球體條件中24小時的經球體培養-滋養的TICs，進行TUNEL檢測及西方墨點分析的結果。比例尺=10μm.圖16e-f顯示在圖16a中培養於球體條件下24小時的存活/死亡分析結果。比例尺=20μm。圖16g顯示，以胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶處理30分鐘後再進行球體培養24小時候所形成的球體的存活/死亡分析的結果。比例尺=20μm。
除非另有定義，本文使用的所有技術及科學術語具有與本領域技術人員對於本發明所屬領域的理解相同的涵義。
如本文所使用的，單數形式「一」，「一個」，及「該」包括複數對象，除非上下文另有明確說明。因此，例如，當提及「一個樣本」包括多個這樣的樣品及本領域技術人員已知的等同物。
術語「抑制」是指化合物、藥物或方法，以預防症狀發作的能力、減輕症狀、或消除疾病、病症或障礙的能力。
如本文所使用的術語「預防(prevent)」，「預防(preventing)」，「預防(prevention)」等是指降低受試者中發展出障礙或病症的概率，該受試者不具有障礙或病症，但具有風險或易發展成一種障礙或病症。
術語「癌化」是指引發原發性或轉移性腫瘤的生長，及促進侵襲性生長。
如本文所使用的術語「轉移」是指癌細胞，或癌症幹細胞的擴散從一個器官或部分到另一個非相鄰的器官或部分。
如本文所使用的術語「癌症幹細胞(CSCs)」是指癌細胞(發現於腫瘤或血液性癌症中)，其具有與正常幹細胞相關聯的特徵，特別是生成所有在特 定癌症樣品中發現的細胞種類的能力。因此，相較於一般生長於含培養基胎牛血清中的細胞培養而言，低很多的細胞數目即可讓CSCs呈現致癌性(腫瘤形成)。CSCs可經由自我更新及分化成多種細胞型態的幹細胞程序而產生腫瘤。術語「腫瘤幹細胞樣細胞」或「腫瘤起始細胞」基本上與「癌症幹細胞」為同義的術語。
術語「治療有效量」或「有效量」是指計算出以實現所期望的效果的預定量，即，可抑制、阻斷或逆轉細胞的活化、遷移或增殖。
如本文所使用的術語「化學試劑」，包括任何化學分子或化學元素，或化學分子及/或化學元素的組合。例如，術語「化學試劑」包括蛋白質及胜肽。
術語「抗體」是關於其衍生物、或其功能片段，其仍保留結合特異性。
本發明非預期地發現TICs藉由使PP2A失活，而使S727STAT3的磷酸化程度增加，造成第十七型膠原蛋白(Col XVII)的基因上調，其可穩定層粘蛋白5而形成半橋粒樣結構。標定在TICs中的PP2A-S727STAT3-Col XVII阻斷其自身的懸浮存活性以及腫瘤起始性。相反地，在塊型癌細胞中，Col XVII的基因上調、S727STAT3的磷酸化程度增加或抑制PP2A會增加其懸浮存活性及腫瘤起始性。在結腸直腸癌樣本中S727STAT3的磷酸化及Col XVII的表現與患者的預後及生存呈負相關。再者，在皮下異種移植模式及惡性胸腔積液模式中，經由目前的路徑進行TICs的標定後證實，與TIC懸浮存活相關的路徑是治療癌症的潛力標的。
一方面，本發明提供一種抑制及預防受試者癌細胞及/或癌症幹細胞(CSCs)存活、癌化及轉移的方法，其包含將一種含有針對CSCs且具有可有效抑制且預防該癌症幹細胞形成半橋粒結構、存活、癌化及轉移的劑量的第十七型膠原蛋白(Col XVII)抑制劑的藥物組成物給藥予受試者。換句話說，本發明 提供一種針對癌症幹細胞(CSCs)的第十七型膠原蛋白(Col XVII)抑制劑的用途，其可用於製造一種抑制及預防癌細胞及/或CSCs存活、癌化及轉移的藥劑。
在本發明之一實施例中，Col XVII為S727-磷酸化的STAT3(S727STAT3)的標的，其藉由活化層粘蛋白5-FAK路徑而負責CSCs的懸浮存活性及腫瘤起始性。
本發明中，Col XVII抑制劑是一種能阻斷PP2A-S727STAT3-Col XVII路徑的成分、一種能抑制Col XVII本身的成分、或一種能抑制S727STAT3-Col XVII-層粘蛋白5-FAK路徑的成分，進而介導CSCs中的懸浮存活性及腫瘤起始性。在本發明之一具體實施例中，Col XVII抑制劑係選自由微RNA(miRNA)、小干擾RNA(siRNA)、化學試劑、抗體、存在於PP2A-S727STAT3-Col XVII路徑中酵素的抑制劑、存在於S727STAT3-Col XVII-層粘蛋白5-FAK路徑中酵素的抑制劑所組成的群組中。在一特定具體實施例中，該化學試劑為PP2A活化劑或STAT3抑制劑。特別地，PP2A活化劑為毛喉素(forskolin)、1,9-二脫氧毛喉素、或FTY720；而STAT3抑制劑係選自由PY*LKTK、SS610、S3I-M2001、STA-21、S3I-201、Stattic、IS3 295、CPA-1、CPA-7、肉盤菌內酯(Galiellalactone)、適體肽鏈(Peptide aptamers)、圈套ODN(Decoy ODN)、G-四聯體ODN、以及胜肽所組成的群組中。在另一特定具體實施例中，抗體為抗-Col XVII單株或多株抗體、或抗-層粘蛋白5單株或多株抗體。
在另一個方面，本發明還提供了用於抑制和預防生存能力，腫瘤發生和腫瘤細胞和/或癌症幹細胞的轉移的方法，包括膠原XVII抑製劑的有效量的藥物組合物。
本發明中，本發明的組成物包含Col XVII抑制劑，其中該Col XVII抑制劑是一種能阻斷PP2A-S727STAT3-Col XVII路徑的成分、一種能抑制Col XVII本身的成分、或一種能抑制S727STAT3-Col XVII-層粘蛋白5-FAK路徑的成分，進而介導CSCs中的懸浮存活性及腫瘤起始性。在本發明之一具體實施 例中，Col XVII抑制劑係選自由微RNA(miRNA)、小干擾RNA(siRNA)、化學試劑、抗體、存在於PP2A-S727STAT3-Col XVII路徑中酵素的抑制劑、存在於S727STAT3-Col XVII-層粘蛋白5-FAK路徑中酵素的抑制劑所組成的群組中。
一方面，本發明提供一種CSC表面蛋白或胞外蛋白而用於製造可預防致癌性或治療癌症的用途，其中該CSC表面蛋白或胞外蛋白為Col XVII。
本發明藉由以下的實例進一步說明，其係展示之目的，而不是限制本發明。
實例
實例1. 第十七型膠原蛋白(Col XVII)為S727-磷酸化STAT3( S727 STAT3)的下游標的，且介導癌症幹細胞的懸浮存活性：
I.材料及方法
1.試劑
處理試劑包括MG132(Merk,Schwalbach,Germany)、花萼海綿誘癌素A(Calyculin A)(Cell Signaling Technologies,Beverly,MA)、岡田酸(Okadaic acid)(Merk)、神經醯胺C6(Ceramide C6)(Santa Cruz Biotechnology Inc.,Santa Cruz,CA)、環己醯亞胺(Cyclohexamide)(Merk)、以及S3I-201(Merk)。
2.原代細胞及細胞株
本研究中所使用的所有人類材料，例如新鮮人類腫瘤樣本或組織塊，係由台北榮民總醫院(台北，台灣)的科學研究與倫理審查委員會(IRB)所核准。由楊文光博士(Wen K.Yang)(中國醫藥大學附設醫院，Taichung,Taiwan)提供的CCS及HCW原發性癌細胞分別為由患有結腸腺癌的63歲女性身上分離出的原發性腫瘤，以及由患有結腸腺癌的男性身上分離出的肝轉移瘤。HT29(人類結腸直腸癌細胞株)係由美國菌種收集所(American Type Culture Collection；ATCC) 獲得。所有CCS、HCW及HT29癌細胞皆培養於含有10%胎牛血清(FBS；Gibco)的DMEM-HG(Gibco,Grand Island,NY)中。A549(人類肺炎細胞株)係由ATCC獲得，並培養於含有10% FBS的Han’s F12(Gibco)中。MCF7(人類乳癌細胞株)係由ATCC獲得，並培養於含有10% FBS的DMEM/F12(Gibco)中。HTB186(人類髓母細胞瘤細胞株)係由ATCC獲得，並培養於含有10% FBS的MEM(Gibco)中。對於球體培養而言，將細胞培養於含有20ng/mL EGF(Peprotech,Rocky Hill,NJ)、10ng/mL bFGF(Peprotech)、及N2-添加劑(Gibco)，且含有或不含PKH26活細胞染劑(Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri)的無血清DMEM-F12(Gibco)中。對於PKH26染色而言，以1：1混合的2×染劑進行細胞染色10分鐘。對於分化培養而言，將經過15天的球體培養後的球體與低生長因子基質膠(growth factor-reduced matrigel)(Becton Dickinson,San Jose,CA)混合，並培養於含15% FBS的生長培養基中1個月。使用商業溶液(Becton Dickinson)回收細胞，而用於後續實驗中。
2.組織收集及流式細胞儀細胞細胞分選
組織收集係經由台北榮民總醫院的科學研究與倫理審查委員會所核准。在手術過程中收集3至4級結腸直腸癌樣本，並將其浸入生理食鹽水中，在1小時內送至實驗室，並以含有500U/mL青黴素(penicillin；盤尼西林)及500g/mL鏈黴素(streptomycin)(Gibco)的磷酸鹽緩衝液清洗5次。將樣本切碎成小碎片(2mm)，並重新懸浮在含有1mg/mL type I Colase(Sigma-Aldrich)的DMEM-HG(Gibco)中，在37℃下進行酵素消化反應2小時。使釋出的細胞樣品進行螢光活化細胞分選。
3.流式細胞儀分析及MACS-分離
4℃下，將來自球體的單細胞懸浮液係培養於經PE-結合的抗人類CD133單株抗體(MACS；Miltenyi Biotec Ltd.,Surrey,UK)中30分鐘，以PBS清洗兩次，並以FACScan流式細胞儀(Becton Dickinson)進行分析。使用ALDEFLUOR套組(StemCell Technologies,Durham,NC)分離含高量醛去氫酶(ALDH)酵素活性的細胞。簡言之，將單細胞懸浮於含有ALDH受質的ALDEFLUOR檢測緩衝液中，然後於37℃下，在沒有或含有特異性ALDH抑制劑，二乙基氨基苯甲醛(DEAB)作為對照組的情況下，培養30分鐘。以FACSAria流式細胞儀(Becton Dickinson)分選經染色的細胞。進行CD133+細胞的磁性細胞分離(MACS)(Auto-Macs；Miltenyi Biotec Ltd.)。
4.異種移植及體內懸浮試驗(in vivo suspension experiment)
試驗方案係由台北榮民總醫院的實驗動物中心核准。將無胸腺裸鼠(BALB/cAnN.Cg-Foxn1nu/CrlNarl，國家實驗動物中心)飼養於無特定病源的環境中。試驗所使用的小鼠週齡為6至8週。皮下注射(s.c.)腫瘤細胞，而於每週偵測腫瘤的生長，高達3個月。針對體內懸浮試驗，將分裝至0.5%甲基纖維素中且不含及含有基質膠(5%)的104個細胞，裝載到定向體內血管新生測試(Directed in vivo Angiogenesis Assay；DIVAA)血管反應器(angioreactor)(Trevigen,Gaithersburg,MD)中，並將其植入裸鼠的皮下。24小時後，從管子中收集細胞，並進行TUNEL檢測。
5. TUNEL測定法
偵測細胞凋亡(Roche Molecular Biochemicals,Indianapolis,IN)。以4%多聚甲醛固定細胞，並以PBS沖洗，然後以封閉溶液(3% H2O2溶於甲醇中)培養10分鐘。以PBS沖洗細胞，並在4℃下以溶於0.1%檸檬酸鈉的0.1% Triton X-100使細胞透化2分鐘，然後在37℃黑暗中培養於反應混合物中60分鐘。以PBS沖洗該混合物，然後以DAPI進行複染。以螢光顯微鏡進行免疫螢光觀察。
6.定量即時PCR(定量RT-PCR)
使用TRIzol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)萃取總RNA，並以Superscript III RT套組(Invitrogen)進行RNA的反轉錄。以FastStart SYBR Green Master(Roche Applied Science,Mannheim,Germany)及ABI Step One即時PCR系統儀(ABI Step One Real-Time PCR System machine)進行定量即時PCR。引子序列組表列於表1。
7.西方墨點法分析
使細胞裂解並以M-PER(Pierce,Rockford,IL)加上蛋白酶抑制劑混合物(protease inhibitor cocktail)(Pierce)進行蛋白質萃取，以BCA檢測法(Pierce)測定蛋白質濃度。以SDS-10%聚丙烯醯胺膠體進行蛋白質裂解物的等分試樣的分離，然後轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)薄膜上，並以TBST中的5%牛奶(Bio-Rad,Richmond,CA)進行封閉。以初級抗體，接著再以相對應的二級抗體，針對薄膜進行雜交反應，然後以化學冷光測定法(Millipore,Billerica,MA)偵測。使薄膜暴露於X光膜，以呈現條帶(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)。針對pSTAT3(S727)(1：1000)、pSTAT3(Y705)(1：1000),STAT3(1：2000)、PP2A C次單元(1：2000)、pAkt(S473)(1：1000)、β-微管蛋白(β-tubulin)(1：2000)、Flag(1：2000)、pAkt(T308)(1：1000)、Akt(1：2000)、ERK(1：2000)、pP38(T180及Y182)(1：1000)、P38(1：2000)、pJNK(1：1000)、以及pmTOR(S2448)(1：1000)的抗體購自Cell Signaling Technologies。針對pPP2A(Y307)(1：2000)、Oct4(1：500)、Nanog(1：500)、組蛋白H1(Histone H1)(1：1000)、以及Sox2(1：500)的抗體購自Santa Cruz Biotechnology Inc。抗pFAK(Y397)抗體(1：1000)購自GeneTex(San Antonio,TX)。 針對Col17a1的抗體購自Abcam。針對層粘蛋白γ2(Laminin γ2)(1：1000)購自Chemicon(Temecula,CA)。針對被剪切的半胱天冬酶(cleaved-caspase3)(1：1000)的抗體購自Epitomics(Burlingame,CA)。針對pERK(1：1000)的抗體購自Biosource(Camerillo,CA)。
8.免疫沉澱法
將細胞萃取物與抗PP2A Cell Signaling Technologies)及抗STAT3抗體(Cell Signaling Technologies)在4℃下一起溫和旋轉培養過夜。加入蛋白質G膠粒(protein G beads)(Millipore)收集免疫複合體，並在4℃下溫和旋轉培養1小時，接著進行離心。以冰的PBS清洗沉澱物。將沉澱物懸浮於SDS試樣緩衝液中，並以SDS-聚丙烯醯胺膠體膠體進行分析。以抗PP2A及STAT3抗體進行免疫墨點分析。
9.免疫螢光法
以4%多聚甲醛固定細胞，並以抗人類CDX2(Chemicon)(1：200)、pSTAT3(S727)(1：10)、裂解的半胱天冬酶(1：100)、β-微管蛋白(1：10)、Col17a1(1：50)、層粘蛋白γ2(1：50)、以及pPP2A(Y307)(1：50)初級抗體進行反應。以含有0.1% Triton X-100的PBS清洗細胞，並以經DyLightTM488、DyLightTM649或DyLightTM594-複合的對應二級抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)進行反應，再以DAPI進行複染。以螢光顯微鏡或共聚焦螢光顯微鏡進行免疫螢光觀察。
10.組織微陣列芯片及免疫化學測定法
人體組織或腫瘤標本樣品的使用係由台北榮民總醫院的科學研究與倫理審查委員會所核准。針對免疫化學染色法，石蠟包埋切片經過脫蠟及 再水化後，在95℃水中，將切片置於Declere工作溶液(Declere working solution)(Cell Marque,Austin,TX)中30分鐘進行抗體還原。以3%過氧化氫封閉內源性過氧化氫酶活性。藉由在PBS中清洗而去除殘餘酵素活性，並以Ultra V Block(Thermo Fisher Scientific,Fremont,CA)封閉非專一性染色5分鐘。然後，使切片與初級抗體pS727-STAT3(1：25)及Col17a1(1：50)反應，接著以對應的生物素化二級抗體(Vector Laboratories,Burlingame,CA)進行反應，以鏈霉親合素(streptavidin)-過氧化氫酶(LSAB Kit；Dako,Carpinteria,CA)進行處理，然後以二氨基聯苯胺進行染色。以Mayer’s蘇木紫進行複染，以Zeiss AxioImager Z1顯微鏡系統(Wetzlar,Germany)及自動擷取系統(TissueGnostics,Vienna,Austria)進行照相。以Tissue-Faxs軟體(TissueGnostics)獲取照片。使用HistoQuest軟體(TissueGnostics)測定陽性染色的細胞百分比。
11.質體重組
pHM6-CMV-PP2A(WT及H59K)質體由長庚大學(台北，台灣)的CW Chiang博士提供。將pHM6-CMV-PP2A(WT及H59K)質體次選殖至PCDNA3質體中。pXJ40-CMV-STAT3(S727A及Y705F)質體由不列顛哥倫比亞大學腦研究中心及醫學系(Brain Research Center and Department of Medicine,University of British Columbia)的Steven Plelech博士處獲得。經由將pXJ40-CMV-STAT3(S727A及Y705F)質體次選殖至pLKO-AS2.puro質體中，接著進行定點突變(site-directed mutagenesis)PCR而產生針對S727A(SA)、S727E(SE)、以及Y705F+S727E(YFSE)單點突變的STAT3之慢病毒系表現質體(lentiviral-based expression plasmids)。
12.慢病毒載體生產及細胞感染
shRNA表現質體及針對STAT3(TRCN-00000020840，TRCN-0000020843)或Col17a1(TRCN-0000118937，TRCN-0000118940)的菌株係由台灣行政院國家科學委員會的干擾性核醣核酸核心計畫(RNAi core of the National Science Council)所提供。使用Lipofectamine 2000(LF2000；Invitrogen,Carlsbad,CA)轉染試劑轉染293T細胞以進行慢病毒生產shRNA及點突變STAT3的過表現。在存有8μg/mL聚凝胺(polybrene)(Sigma-Aldrich)情況下進行細胞感染，並以嘌呤黴素(1g/mL)進行篩選。
13.非貼附性生長測試
使用含10% FBS的瓊脂糖培養基(1%)塗佈在培養皿底部。硬化後，將500、1000、及2500個細胞懸浮於含有10% FBS的瓊脂糖培養基(0.8%)中，並塗盤於培養皿底層上。以結晶紫染色在軟瓊脂糖培養中形成的群落，並在接種後2週計算數量。
14.基因表達譜
使用Qiagen RNeasy套組分離總RNA。在國立陽明大學(台北，台灣)基因組核心設施中完成標定cRNA的產生，以及使其雜交至Human U133 Plus 2 GeneChip arrays(Affymetrix)。使用由Ingenuity Co.開發的Ingenuity Pathway Analysis(IPA)網頁工具完成功能性註釋和過表達的功能性主題。將所有數據存於Gene Expression Omnibus(GEO)資料庫中，檢索號GSE43576。
15. ChIP測定
以市售套組(Upstate Biotechnology)進行染色質免疫沉澱(ChIP)測定。37℃下，以1%甲醛固定帶有穩定過量表現的S727E-突變STAT3的HT29細胞20分鐘，在冰上以裂解緩衝液裂解細胞10分鐘。將DNA-蛋白質複合體進 行超音波震盪成200及600個鹼基對(base pairs)。儲存一個等分試樣的染色質以做為輸入DNA，將剩餘的等分試樣稀釋於免疫沉澱(IP)緩衝液中，並與抗-Flag抗體(Sigma-Aldrich)一併培養過夜(4℃)。在鮭魚精子DNA/蛋白質A瓊脂糖微球上分離DNA-蛋白質複合體，並且進行洗脫(elution)。培養於65℃下4小時，進行反向交聯反應。以蛋白酶K移除蛋白質。以酚/氯仿萃取DNA，然後以特定引子進行STAT3結合保守序列的PCR增殖。
16.螢光素酶報導測定
以Secrete-Pair Dual Luminescence Assay kit(GeneCopoeia,Rockville,MD)進行螢光素酶測定。以Nucleofector技術(AMAXA Biosystems,Cologne,Germany)進行所有轉染。將野生型及突變型Col17a1啟動子選殖至pEZX-PG04報導質體中(GeneCopoeia)。
17.超微結構分析
4℃下，於2.5%戊二醛(磷酸鹽緩衝液)中固定球體過夜，以磷酸鹽緩衝液清洗後，於4℃下，以2%四氧化鋨(Millonig’s緩衝液)進行後固定90分鐘。使試樣經由一系列梯度酒精進行脫水，並於Epon 812-equivalent(TAAB Lab)中進行包埋。以甲苯胺藍(toluidine blue)染色半薄切片(1μm)，而用於光學顯微鏡分析。切取超薄切片(40-90nm)，並以醋酸鈾及檸檬酸鉛進行染色後以日立(Hitachi)H7600透射型電子顯微鏡進行分析。針對以酵素進行球體的前處理而言，將球體培養於含有胰凝乳蛋白酶(25ng/μl)及胰蛋白酶(25ng/μl)的培養基中5分鐘，接著以PBS清洗兩次後進行懸浮培養24小時。
18.由惡性胸腔積液中分離純化癌細胞
將無菌下取得並置於肝素化(10U/ml)瓶器中的惡性胸腔積液於室溫下以200g進行離心20分鐘，細胞，將細胞沉澱物再懸浮於30ml冷的1% BSA/2mM EDTA/PBS中。以錐蟲藍排除方法(Trypan Blue exclusion method)進行細胞計數，將細胞懸浮液倒入聚蔗糖梯度溶液(Ficoll gradient solution)中，並於室溫下以800g離心30分鐘。離心後，以1% BSA/2mM EDTA/PBS清洗在上層梯度中的細胞一次，然後在超低吸附培養皿(ultralow attachment plates)(Corning)中，以105細胞/ml的濃度將細胞培養於球體培養液中。每3天添加一半體積的球體培養液。
19.惡性胸腔積液小鼠模式
根據由Stathopoulos等人修訂的方案(Stathopoulos et al.,Current opinion in pulmonary medicine 15,343-352,2009)，使用雄性無胸腺裸鼠發展惡性胸腔積液的動物模式。簡言之，以劑量5mg/kg的2%甲苯噻嗪(Rompun)(Bayer Pharma,Puteaux,France)及30mg/kg的舒泰100(Zoletil 100)(VirbacR,Carros,France)，腹腔給藥(i.p.)以麻醉動物。經由胸腔壁，使用26號針頭，將200μl腫瘤細胞植入小鼠左側胸膜腔中(i.p.)。控制針具穿透肋間肌肉的深度，以預防肺部損傷及出血進入胸膜間隙。將小鼠放置於熱燈下維持體溫，直到其恢復後再讓其返回鼠籠。
統計分析
以學生t檢定(Student’s t-test)進行兩組間的比較分析。以ANOVA檢定進行三組間的比較分析。以時序檢驗法(Log-rank test)進行病患存活曲線的比較分析。以費雪精確性檢定(Fisher’s exact test)進行體內致癌性的比較分析。P值<0.05被認為具有統計顯著性。
II.結果
1. TICs顯示懸浮存活能力
為了避免因使用假定的表面標誌進行TICs的分離，以及篩選出較適合於超低吸附培養盤中懸浮存活的細胞，所產生的不可靠性，藉由在超低吸附(圖1a)及一般塑膠培養皿(圖1a)兩者中進行球體培養而使來自原發性癌細胞、CCS或HT29細胞株的TICs滋養。滋養的TICs形成二級及三級球體的能力提高(圖1b)、表現多能性因子(圖1c)、增加TIC表面標誌，例如CD133及CD166(圖1d)、減少結腸直腸的分化標誌，例如Cdx2(圖1e)、當重新播種於含血清的基質膠中會進行分化(圖1e)、以及接種在免疫不全小鼠皮下後會產生腫瘤(圖1f)。
在24小時懸浮且去除血清的培養條件下，無論使用哪種培養皿於滋養的TICs，CCS及HT29的滋養TICs顯示出較團塊癌細胞少的凋亡現象(apoptosis)(圖2a及2b)。再者，使用陽性ALDH活性所篩選出來自原發性肝轉移的結腸直腸癌細胞HCW及新鮮的結腸直腸癌樣本的TICs，較ALDH癌細胞而言，顯示出優異的懸浮存活性(圖2c)。與先前發現一致，本發明結果亦顯示半胱天冬酶3(caspase 3)的活化在介導經懸浮誘導的細胞死亡上扮演重要角色(圖2d)。由TICs所增加的懸浮存活性亦在含血清且使用poly-HEMA-塗佈的培養皿(圖2e)以及長期性軟瓊脂培養盤(圖2f)中得到證明。再者，來自CCS的TICs所得懸浮存活性的增加主要起因於CD133+，而非CD133-細胞(圖2g)。當在培養中使用TICs的有絲分裂-靜止性質而保留特定染劑，例如PKH26，來比較CCS球體培養15天後TICs及團塊癌細胞的存活性時，相較於PKH-陰性細胞而言，PKH-陽性細胞在球體中存活，其在TUNEL及經剪切的半胱天冬酶3中呈現陽性(圖2h)。
為了證明TICs也會增加體內懸浮存活性，在裸鼠皮下植入含有甲基纖維素交付細胞的石英管。移植24小時後顯示大部分來自CCS的滋養TICs存活下來，而團塊癌細胞則產生細胞凋亡，其可藉由在甲基纖維素中添加ECM而避免(圖2i)。這些數據一併說明，TICs在各種條件下，體外及體內兩種情況下，皆表現出較佳的懸浮存活性。
2.在S727上STAT3的磷酸化介導TICs的懸浮存活性
失巢凋亡(Anoikis)係指喪失細胞貼附性所誘導的凋亡，其係與細胞的分化狀態有關。免疫墨點分析顯示，懸浮中的TICs及團塊癌細胞間與失巢凋亡相關路徑的活化並無差別(圖3a)。由IL-6造成的JAK2-Y705STAT3路徑活化顯示出，其造成結腸直腸、肺及乳癌TICs的腫瘤起始能力提高。TICs中S727上STAT3的磷酸化較團塊癌細胞提高，而在Y705上磷酸化及許多Y705-磷酸化STAT3的標的基因間並無差別，包括MCL-1、cyclin-D及c-Myc(數據未呈現)，在TICs及團塊癌細胞間(圖3a)。再者，磷酸化的S727係位於細胞核中STAT3轉錄因子作用的位置(圖3b及3c)。一致地，S727磷酸化程度在長期球體培養的PKH-陽性細胞中亦提高(圖3d)。再者，敲除STAT3(圖3e)或過度表現S727A點突變的STAT3，其為不活化的形態，會使TICs中的凋亡增加(圖3f)，而過度表現S727E點突變的STAT3，其為活化型態，會使團塊癌細胞的凋亡減少(圖3g)。相似的結果亦可於體內研究中發現(圖3h及3i)。更重要地，在STAT3的Y705上的磷酸化對於藉由過度表現S727E點突變的STAT3而抑制團塊癌細胞的凋亡而言是可有可無的(圖3g及3i)，此說明S727STAT3的磷酸化介導TICs的懸浮存活性。
3.Col XVII作為S727-磷酸化STAT3的下游標的，並介導TICs的懸浮存活性
透過基因本體論(Gene Ontology)，分析隨著球體培養時間的增加所造成的基因上調(圖4a)，結果發現涉及球體培養的基因，在高度表現基因類別中特別地增高，例如癌症及細胞死亡類別的基因(圖4b)。令人驚訝地，在球體培養中基因上調量最高的基因為Col17a1(表2)，其尚未被報導出與癌細胞的致癌性及存活能力有關聯。本發明首先證實微陣列數據的可靠度(表2，圖4c)，以及使用定量RT-PCR、免疫墨點法及免疫螢光測定，證實在球體培養期間Col17a1的基因上調(圖4d及4e)。接著，證明在TICs中，S727A點突變的STAT3的過度表現使Col17a1的表現降低(圖4f)，而在團塊癌細胞中，S727E點突變的STAT3的過度表現使Col17a1的表現增加(圖4g)。最有趣地，Col17a基因的敲除使滋養的TICs(圖4h)以及表現S727E點突變的STAT3的團塊癌細胞之懸浮存活性降低(圖4i)。
Col17a1啟動子的染色質免疫沉澱(ChIP)測定(圖4j)顯示，在表現S727E點突變的STAT3的HT29中，含有假定的第八個STAT3結合位點TTNNNN(N)AA(-610~-603)，而非其他結合位點的片段，會與抗-Flag抗體產生免疫沉澱(圖4k)。再者，啟動子螢光素酶報導測定中顯示，滋養的TICs之Col17a1啟動子活性較團塊癌細胞中高(圖4l)。本發明進一步證明在TICs中轉染S727A點突變的STAT3可使Col17a1啟動子失活(圖4l)，而在團塊癌細胞中轉染S727E點突變的STAT3則會活化野生型Col17a1啟動子活性，而非第八結合位點突變的Col17a1啟動子(圖4m)。這些數據共同說明Col17a1在TICs中由S727活化的STAT3所介導的懸浮存活性中扮演著必要的腳色。
表2：隨著球體培養時間的增加而造成的基因表現基因上調
4.由Col XVII介導的懸浮存活性取決於層粘蛋白5
先前報導顯示，Col XVII及層粘蛋白5為介導係胞貼附的半橋粒的成分。其次，據報導，層粘蛋白5可經由下游訊息傳導路徑而調控非貼附性存活(anchorage-independent survival)，例如FAK。本發明顯示出在TICs中，而非團塊癌細胞中，層粘蛋白5的蛋白質含量增高(圖5a)，且Col XVII及層粘蛋白5在TICs的細胞膜及細胞質中產生共位現象(圖5b)。本發明進一步顯示，在過度表現S727A點突變的STAT3之球體培養細胞中層粘蛋白5的蛋白質含量會減少(圖5c)，但在過度表現S727A點突變的STAT3之團塊癌細胞中層粘蛋白5的蛋白質含量會增高(圖5d)。再者，敲除TICs中的Col17a1使層粘蛋白5的蛋白質含量降低，但mRNA含量沒有(圖5e及5f)。有趣的是，層粘蛋白5蛋白質含量的降低是因為蛋白酶體(proteasome)的降解作用，其可藉由蛋白酶體抑制劑，MG132，進行處理後而恢復(圖5g)。再者，FAK是層粘蛋白5下游的介導物，在TICs中也被活化(圖 5h)，但在Col17a1被敲除(圖5i)，或者表現S727A點突變的STAT3的TICs(圖5j)中沒被活化。如預期，FAK在表現有S727E點突變的STAT3的團塊細胞中亦被活化(圖5k)。這些數據說明Col XVII藉由維持層粘蛋白5的穩定性而介導懸浮存活性。
5. Col XVII及層粘蛋白5形成有組織的結構而可支持懸浮存活
為了排除僅僅透過細胞聚集而介導在球體中的TICs所造成的懸浮存活性的可能性，本發明證明在球體中有Col XVII及層粘蛋白5的表現以及半橋粒樣斑塊的存在，其為在皮膚表皮及正常黏膜基底膜中的有組織的ECM超微結構，但在由懸滴培養而形成的團塊癌細胞中並沒有(圖6a及6b)。當進行懸浮培養24小時，存活/死亡分析顯示，所有在球體的細胞皆存活，而在團塊癌細胞聚集的中心處僅有少數細胞存活(圖6c)。經敲除Col17a1或層粘蛋白5的細胞，其形成球體的能力降低，且進行懸浮培養時，在球體中的大部細胞皆死亡(圖6d)。再者，以酵素進行球體的前處理5分鐘而降解半橋粒的成份造成細胞在懸浮培養中死亡，例如使用胰凝乳蛋白酶，而非使用不會降解半橋粒的胰蛋白酶(圖6e)。同時，這些數據說明Col XVII及層粘蛋白5在球體中形成有組織的結構，而在支持TICs的懸浮存活性上扮演重要角色。
6. PP2A扮演STAT3在S727位點上活化的上游調控因子並介導TICs的懸浮存活性
PP2A磷酸酶已被報導會藉由使S727去磷酸化而使STAT3去活化。Y307PP2A的磷酸化，其與抑制PP2A活性有關，在球體培養的滋養TICs(圖7a)及PKH-陽性細胞(圖7b)兩者皆有較高的磷酸化程度。以PP2A抑制劑，岡田酸(OA)及花萼海綿誘癌素A(CA)，處理團塊癌細胞，可提高STAT3的S727磷 酸化程度，其與劑量有關(圖7c)。相反地，以PP2A活化劑，ceramide C6，處理滋養的TICs，使STAT3的S727鄰酸化程度降低(圖7d)。免疫沉澱測試進一步顯示，PP2A與STAT3形成複合體(圖7e)，此說明在TICs中STAT3鄰酸化的調控係藉由與PP2A的直接交互作用。如預期的，過度表現野生型(WT)PP2A的TICs的懸浮存活性在體外及體內兩情況下皆明顯降低(圖7f，7h)。相反地，表現顯性失活(DN)型PP2A的團塊癌細胞在體外及體內兩情況下的懸浮存活性皆增高(圖7g，7i)。一致地，經由球體培養而滋養的TICs，以及由HCW原發性肝轉移癌細胞及新鮮結腸直腸癌樣本中分離而來的ALDH+細胞中，亦可證明PP2A-S727STAT3-Col XVII路徑的增強(圖7j)。
相較於團塊癌細胞而言，來自A549肺癌細胞、HTB186腦癌細胞及MCF7乳癌細胞而經球體培養而滋養的TICs顯示出Oct4、Nanog及Sox2表現量的增加(圖7k)，以及懸浮存活性的增加(圖7l)。再者，這些細胞，PP2A磷酸化程度、後續在S727為點上使STAT3活化程度、以及Col17a1的表現量增加，說明懸浮存活路徑是在來自各種腫瘤的滋養的TICs的一般特徵。
7. TICs的懸浮存活性決定腫瘤起始能力，且對應於臨床腫瘤分期及存活性
為了證明懸浮存活能力的提高對於TICs形成腫瘤是必要的且具有臨床意義，本發明首先顯示，抑制PP2A-S727STAT3-Col XVII路徑可抑制由TICs起始的腫瘤(圖8a)，而使該路徑活化可使團塊腫瘤細胞的腫瘤起始能力提高至與TICs相同的程度(圖8a)。本發明亦顯示，藉由使用特定抑制劑，S3I-201，於標定STAT3，可殺死懸浮培養中的TICs(圖8b及8c)，並且抑制腫瘤起始(圖8d)。 有趣的是，使用抗-Col XVII抗體於標定Col XVII亦可殺死懸浮培養中的TICs(圖8b及8c)，並且抑制腫瘤起始(圖8d)。
接著，本發明驗證來自150位結腸直腸癌病患的樣本，並顯示在STAT3中的S727磷酸化程度的提高，及在對應的腫瘤分期中Col17a1表現量的提高(圖8e)，而這兩個標誌的表現量與病患存活率呈現負相關(圖8f)。在進行多元存活性分析時，這兩個標誌的表現量與病患在第II+III期的存活性呈現負相關(p=0.046)。這些數據說明，TICs的懸浮存活路徑具有臨床意義，且可能可用於發展標定TICs的新戰略。
8.惡性胸腔積液中TICs的懸浮存活性及相關路徑的增加
肺癌的惡性胸腔積液是病患中真正的懸浮環境，且含有CD44+ TICs。以密度梯度離心法，由細胞學檢查確診的惡性胸腔積液中分離出癌細胞後，可觀察到聚集成球體的存活CD44+細胞，且可將其維持於球體培養中(圖9a及9b)。然而，並不會在良性胸腔積液中觀察到這些聚集的細胞(圖9a)。免疫螢光分析進一步顯示，這些CD44+細胞中Col XVII及層粘蛋白5兩者亦呈現陽性(圖9b及9c)。來自A549的滋養TICs，其為一種貼壁依賴型人類肺癌細胞株，其懸浮存活能力、PP2A-STAT3-Col XVII-層粘蛋白5路徑(圖7k-7m)以及Col XVII及層粘蛋白5的共位作用(圖9d)皆提高。因而進行免疫不全小鼠的惡性胸腔積液模式試驗，以證明每次最少使用103個細胞進行注射即可使滋養的TICs形成惡性胸腔積液，而對於單層培養的細胞而言，每次注射需要超過104個細胞才會形成惡性胸腔積液(圖9e)。再者，滋養的TICs形成惡性胸腔積液的能力可被針對Col XVII或層粘蛋白5的shRNA顯著的抑制，而對照組shRNA則不會(圖9e)。這些數據同 時說明，在真正懸浮條件下TICs的存活現象，以及由滋養的產生的懸浮存活性從頭增加，其係與Col XVII-層粘蛋白5路徑有關。
實例2：在肺癌類幹細胞(CSCs)中第十七型膠原蛋白及層粘蛋白-5的過度表現藉由FAK/AKT/GSK3β途徑而使上皮至間質轉型(EMT)活化，且其係與手術切除肺癌的預後差的患者有關
I.材料及方法
1.細胞株培養及試劑
肺癌細胞株A549及CL1-1係由美國菌種收集所(American Type Culture Collection)獲得。在37℃含有5% CO2的增濕大氣下，使細胞生長於含有10units/ml青黴素、10μg/ml鏈黴素、2mM谷氨醯胺、以及10%胎牛血清(FBS；Gibco)的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)培養基中(Gibco,Grand Island,NY)。為了滋養在球體培養中的癌幹細胞樣細胞(CSCs)，將肺癌細胞懸浮於由無血清DMEM/F12(Gibco)、N2補充培養基(Gibco)、人類重組表皮生長因子(EGF)(20ng/ml,PeproTech,Rocky Hill,NJ)、以及鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)(10ng/ml,PeproTech)構成的腫瘤球體培養基中。細胞群落直徑>100μm且面積>50%，顯示出三維結構及模糊的細胞邊界被定義為球體。在培養12天後計算球體數目。收取細胞並收集蛋白質裂解物以進行進一步實驗。處理試劑包括FAK抑制劑(20μM)(Calbiochem,San Diego,CA；Merk,Schwalbach,Germany)、LY294002(10μM)(Calbiochem)、1,10-菲咯啉(20μM)(Sigma-Aldrich；St.Louis,MO)、PMA(100nM)(Sigma-Aldrich)以及環己醯亞胺(50μg/ml)(Calbiochem)。
2.抗體
針對ADAM9、磷酸化-AKT(Ser473)、β-肌動蛋白(β-actin)、磷酸化-FAK(Tyr397)、泛素(ubiquitin)及磷酸化-GSK3b(Ser9)的抗體係購自Cell Signaling(Boston,MA)。針對層粘蛋白-5(γ2鏈)、Sox2、Oct-3/4、Nanog及E-鈣粘蛋白(E-鈣粘蛋白)的抗體係來自Santa Cruz Biotechnology,Inc.(Santa Cruz,CA)。針對纖維連粘蛋白(纖維連粘蛋白)、波形蛋白(波形蛋白)及N-鈣粘蛋白的抗體係購自GeneTex(San Antonio,TX)。針對Col XVII、Col XVII(NC16A-3)及鋅指轉錄因子(鋅指轉錄因子)的抗體係購自Abcam(Cambridge,MA)。針對ADAM10的抗體係購自Millipore(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)。針對磷酸化-鋅指轉錄因子(phospho-鋅指轉錄因子)(Ser246)的抗體係購自OriGene Technologies,Inc.(Rockville,MD)。
3.西方墨點法分析
以M-PER(Pierce,Rockford,IL)加上蛋白酶抑制劑混合物(HaltTM；Pierce)製備細胞萃取物，以bicinchoninic acid(BCA)測定法(Pierce)測定蛋白質濃度。在SDS-10%聚丙烯醯胺膠體中進行等分試樣的蛋白質裂解物的分離，然後轉移至PVDF薄膜上，並以在TBST(20mM Tris-HCl[pH 7.6],137mM NaCl,1% Tween 20)中的5%墨點等級的牛奶(Bio-Rad,Hercules,CA)進行封閉。以所需的初級抗體偵測薄膜，並與相對應的二級抗體進行反應，使用化學冷光測定法(Millipore,Billerica,MA)偵測結果。使薄膜暴露於X光膜，以呈現條帶(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)。
4.慢病毒載體生產及細胞感染
shRNA表現質體及針對ADAM9(TRCN46978,TRCN46980)、ADAM10(TRCN6674,TRCN6675)、Col XVIIa1(TRCN118937,TRCN118941)及 層粘蛋白-5(TRCN119152,TRCN119156)的菌株係由中央研究院(台北，台灣)的干擾性核醣核酸核心設施(RNAi Core Facility)所提供。在存有8μg/mL聚凝胺(Sigma-Aldrich)情況下以慢病毒感染次匯合(Subconfluent)腫瘤細胞。在感染24小時後，移除培養液，並更換成含有嘌呤黴素(4g/mL)的新鮮培養液，以篩選出經感染48小時候的被感染細胞。
5.遷移試驗
使用Boyden腔室(Boyden chamber)進行細胞遷移試驗。試驗最後，移除在上層腔室及上層濾紙表面的細胞，而在下層濾紙表面的細胞則以乙醇固定，並以吉姆薩(Giemsa)(Sigma-Aldrich)進行染色。在200×放大倍率下，在每個濾紙上取10個隨機區域進行遷移細胞數目的計算。數據之計算為在沒有趨化因子或貼附培養下，其被視為是100%，的遷移細胞數目百分比。所有實驗進行三重複。
6.侵襲試驗
根據製造商的使用說明手冊，使用24孔的BD Biocoat基質膠侵襲室(BD Biocoat Matrigel Invasion Chamber)(Becton,Dickinson and Company,San Jose,CA)進行細胞侵襲試驗。簡言之，將細胞懸浮於補充有0.1%胎牛血清白蛋白(bovine serum albumin)(BSA)的DMEM中，並播種於上層培養池(insert)(2.5×104細胞/培養池)。在外側孔(Outer well)中填入含有10% FBS的DMEM作為趨化因子。培養24小時後，以吉姆薩(Sigma)染色含有侵襲細胞的薄膜，經清洗後將其固定在載玻片上。以光學顯微鏡計數含有侵襲細胞的整層薄膜。數據以每孔所含侵襲細胞的數目表示。每個試驗進行三重複，並重複試驗至少兩次。
7.細胞刮除癒合測定(Wound healing assay)
利用A549及CL1-1肺癌細胞在單層細胞培養的體外模式中遷移的能力來測定刮除癒合能力。將肺癌細胞播種於6孔培養皿(6-well plates)中並培養過夜。以200μl移液器吸管尖(pipette tip)刮除細胞而使其中斷。於24小時進行細胞遷移至培養皿中刮除區域的觀察。刮除區域填滿的百分比計算如下：[(平均刮除寬度-平均殘餘寬度)/平均刮除寬度]×100(%)。
8.微陣列及數據分析
本發明比較在球體(3D)培養及常規單層(2D)培養條件下培養A549肺癌細胞12天後的基因表現樣式。使用TRIzol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)並根據製造商的試驗方案分離總RNA。在國家微陣列及基因表現分析核心設施(National Microarray and Gene Expression Analysis Core Facility)(基因體醫學國家型研究計畫(National Research Program for Genomic Medicine)，台北，台灣)中處理每個樣本，並使用Affymetrix Human U133 plus 2.0 array chip(Affymetrix,Santa Clara,CA)進行分析。利用GeneSpring GX v12軟體(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)分析微陣列數據，並使用基因本體論術語進行分類。
9.定量即時聚合酶鏈鎖反應(PCR)
使用TRIzol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)萃取總RNA，在使用Superscript II(Invitrogen)，根據製造商的操作手冊進行RNA的反轉錄。以SYBR Green Master(GeneMark,Georgia Institute of Technology,Atlanta,GA)及ABI Step One即時PCR系統儀(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)分析樣本。用於PCR的特定引子如下：Col XVIIA1(正向，5'-AAAGGACCAATGGGACCACC-3'；反向，5'-TTCACCTCTTGGGCCTTGGT-3')。
10.免疫沉澱法
使500μg等份細胞裂解物與500μl IP裂解/清洗緩衝液(Pierce/Thermo Scientific)中的2μg抗體一同培養，4℃下溫和震盪過夜，然後加入25μl蛋白質A/G磁珠(Pierce/Thermo Scientific)，於4℃下持續以溫和震盪方式額外培養2小時。然後，以磁座收集磁珠，丟棄未結合的樣本。加入500μl裂解/清洗緩衝液(Pierce/Thermo Scientific)清洗沉澱物2-3次，接著更換成500μl超純水。溫和混合磁珠並以磁座收集，接著移除上清液，並以50μl樣本緩衝液進行稀釋。適當地震盪混合後，在100℃下10分鐘使樣本變性。以磁性分離磁珠，將上清液保存於新的微量離心管中。以適當抗體進行免疫墨點分析。
11.肺轉移動物模式
本研究中使用雄性Balb/C裸鼠，使其群聚並維持在無特定病源體的環境下(specific pathogen-free conditions)。使用7週齡的小鼠進行試驗。將不含/含有第十七型膠原蛋白或層粘蛋白-5敲除(siRNA)(3×105，5組，每組4-5隻小鼠)的腫瘤細胞A549(球體或非球體培養)從鼠尾靜脈進行注射，以評估12週後的肺轉移。將小鼠的肺部組織包埋於石蠟中，接著以HE進行染色。
12.病患及免疫組織化學分析
病患
在台北榮民總醫院(台北，台灣)中的98位經過手術切除肺癌的病患登錄在本研究中。這些病患皆沒接受新輔助化療或放療(neoadjuvant chemotherapy or radiotherapy)。審查並計算臨床數據，包括性別、年齡、惡性腫瘤TNM分類(TNM)狀態，以及疾病特異性存活率。台北榮民總醫院的科學研究與倫理審查委員會核准用於本研究的試驗方案(2013-10-030CC)。
免疫組織化學分析
針對已切除的腫瘤組織進行Col XVII及層粘蛋白-5的免疫組織化學分析。將包埋腫瘤的石蠟塊切成4-μm切片，然後以標準脫蠟及再水合技術處理切片。使用抗-Col XVII抗體(1：50)及抗-層粘蛋白-5多株抗體(1：50)作為初級抗體，以分別偵測Col XVII及層粘蛋白-5的蛋白質表現。針對Col XVII及層粘蛋白-5的免疫染色，在癌細胞中細胞核週邊及其他>25%細胞質區域內可偵測到免疫反應，則定義為陽性表現。
13.統計分析
以至少三個獨立進行試驗的平均(±標準誤差或標準差)表示數值，藉以使細胞培養間的變異最小化。使用學生t檢定或單向ANOVA檢定。使用Kaplan-Meier法計算存活曲線，並使用時序檢驗法(Log-rank test)進行數據比較。P值<0.05被認為具有統計顯著性。
II.結果
1.球體培養中的肺癌細胞具有CSC的特徵，且EMT標誌有基因上調現象
培養於補充有EGF及bFGF的無血清培養基的肺腺癌A549及CL1-1細胞在懸浮下生長，並在5天內開始形成球體，而該球體緩慢增長至少12天(圖10A)。另一方面，這些培養在補充有10% FBS的DMEM中的肺癌細胞則良好地生長成單層，且在12天內不會形成球體。由西方墨點分析證明，在球體培養中，A549及CL1-1細胞的多能性標誌(pluripotency markers)Nanog、Sox2及Oct4表現量增高(圖10B)。此外，鋅指轉錄因子，其為參與誘導上皮至間質轉型(EMT)的轉錄因子，其表現量顯著地增高(圖10C)。一致地，球體培養中，間質標誌N-鈣粘蛋白、纖維連粘蛋白及波形蛋白的表現基因上調，而上皮標誌E-鈣粘蛋白 的表現基因下調(圖10C)。本研究證明，在球體培養中生長的A549及CL1-1細胞，相較於生長於單層的細胞而言，其遷移(圖10D)、侵襲(圖10E)及刮除閉合能力(圖10F)皆提高。這些數據說明，球體培養中的肺癌細胞呈現出CSC特徵，並表現EMT表型(phenotype)。
2.在球體培養中肺癌Col XVII基因上調對於維持EMT表型而言是需要的
為了鑑定負責EMT的基因，本發明進行微陣列分析以建立並比較在球體培養中生長以及單層生長12天的肺癌細胞的表現圖譜。基因本體論(GO)分析顯示在球體培養中差別表現的基因主要涉及細胞貼附、生物性貼附、細胞-細胞貼附、細胞-基材貼附、細胞-基質貼附、單有機體細胞程序以及白細胞遷移(圖11A)。在球體培養細胞中，上調最顯著的基因裡(Table 3)，本發明選擇Col XVII，其為膠原蛋白性穿膜蛋白以及真皮上皮錨複合體(dermoepidermal anchoring complex)的結構成份，作為進一步研究標的，此乃基於其涉及細胞外貼附及細胞內訊息傳導。為了證實微陣列數據，本發明顯示，當A549及CL1-1細胞在球體培養時，Col XVII在mRNA及蛋白質含量上有上調現象(圖11B)。進行基因功能喪失法(Loss-of-function approach)以證明Col XVII涉及EMT表型的維持。如圖11C所示，基於慢病毒的Col XVII shRNA敲除(KD)測試中，其使用兩個可標定Col XVII的獨立shRNA，兩者皆造成A549及CL1-1細胞形成球體的能力顯著地降低。相較於來自帶有對照組shRNA的細胞的球體培養而言，Col XVII被敲除的懸浮細胞在基質標誌，鋅指轉錄因子、纖維連粘蛋白、波形蛋白及N-鈣粘蛋白表現量下降至顯著低量，相反地，其表現出的上皮標誌，E-鈣粘蛋白，有較高的表現量(圖11D)。這些細胞也表現出降低的遷移能力(圖11E)、侵襲能力(圖11F)、以及 刮除閉合能力的下降(圖11G)。同時，這些數據說明，在肺癌球體培養中，Col XVII的上調對於維持EMT表型而言是需要的。
3.在肺癌細胞的球體培養中，層粘蛋白-5可能與第十七型膠原蛋白一同作用於支持EMT表型
Col XVII已被顯示可與層粘蛋白-5有交互作用，且，一同參與細胞/基質的交互作用。本發明後續驗證在CSCs中，層粘蛋白-5涉及經Col XVII-調控的EMT的維持。首先，本發明顯示，相較於單層培養，在球體培養中的A549及CL1-1細胞，其層粘蛋白5有上調現象(圖11B)。將層粘蛋白-5被敲除的A549及CL1-1細胞群落以及對照組敲除(KD)群落培養於球體培養基中。如示，層粘蛋白-5的敲除(KD)導致球體形成的減少(圖12A)，其亦伴隨著間質標誌，鋅指轉錄因子、N-鈣粘蛋白、纖維連粘蛋白及波形蛋白的表現量降低，以及E-鈣粘蛋白的表現量增高(圖12B)。敲除層粘蛋白5的細胞亦呈現出細胞遷移(圖12C)、侵襲(圖12D)及刮除閉合(圖12E)能力的降低。這些數據說明，在肺癌細胞的球體培養中，層粘蛋白-5可與Col XVII一同作用於支持EMT表型。
4.第十七型膠原蛋白的脫落對於維持在球體陪樣中的肺癌細胞的層粘蛋白-5表現及EMT表型
Col XVII被證明其可經歷蛋白酶剪切，所得的Col XVII胞外結構域顯示可促進角質細胞的移動性。因此，本發明驗證在球體陪養中是否會發生Col XVII的脫落。西方墨點分析顯示球體培養的細胞可產生全長的Col XVII(180kDa)及蛋白水解的胞外結構域片段(120kDa)(圖13A，左欄)。相對地，單層細胞則主要含有主要為全長的蛋白質(數據未呈現)。在存有PMA及1,10-菲咯啉情 況下將懸浮細胞培養於球體培養基中，COL XVII的啟動子及抑制劑脫落，其不僅分別造成COL XVII拓落的提高及減少，也正向及負向調控層粘蛋白5的含量(圖13A)，此說明了Col XVII的脫落涉及維持層粘蛋白-5蛋白質的含量。支持上，本發明數據顯示Col XVII的脫落不會影響層粘蛋白-5的mRNA的含量(數據未呈現)。然而，當在存有PMA情況下，將A549懸浮細胞培養於含有環己醯亞胺的球體培養基時，可促進Col XVII的脫落，而層粘蛋白5蛋白質即呈現出較長的半衰期(half life)(圖13B)。另一方面，在當細胞培養於含有1,10-菲咯啉的情況下，很快地，層粘蛋白5會被降解(圖13B)。使用KD法檢查ADAM9及ADAM10參與Col XVII的脫落。西方墨點分析顯示當ADAM9及ADAM10個別被敲除後，A549細胞中Col XVII 120以及層粘蛋白-5的含量降低(圖13C)。一致地，本發明亦顯示，由PMA所促進的Col XVII脫落使間質標誌的表現量增加，而上皮標誌E-鈣粘蛋白的表現量則減少(圖13D，左欄)。同時，以1,10-菲咯啉，或者ADAM9或ADAM10的敲除而抑制Col XVII的脫落可使間質標誌表現量減少，而使上皮標誌E-鈣粘蛋白的表現量增加(圖13D，左欄及幼欄)。因此，PMA會促進細胞遷移、侵襲及刮除閉合，而1,10-菲咯啉及ADAM9或ADAM10的敲除則會使其降低(圖13E)。同時，這些數據說明層粘蛋白-5作用於下游，藉以介導Col XVII在支持EMT表型的作用，且由ADAM9或ADAM10造成的Col XVII的脫落對於穩定層粘蛋白-5而言是需要的，而穩定層粘蛋白是一種維持球體培養中肺癌細胞的EMT表型所需的程序。
5.經球體培養的肺CSC在裸鼠中轉移至肺部的現象被Col XVII或層粘蛋白-5表現量的減少所抑制
為了證明Col XVII/層粘蛋白5的介導對於促進球體培養中肺癌細胞EMT表型的重要性，本發明進行實驗性轉移測試，藉由異種移植法將球體及單層細胞從尾部靜脈注射入裸鼠中。進行肺部巨觀及微觀分析以評估肺部轉移腫瘤的形成。根據肺部切片HE染色的粗略型態及顯微鏡分析，紀錄轉移至肺部的情況。如圖14A所示，從尾部靜脈注射單層細胞進行接種不會在12週時造成肺轉移。然而，接種經球體培養的A549導致在所有動物肺部中皆形成腫瘤(圖14A及14B)。更重要的是，敲除Col XVII或層粘蛋白5完全消除球體培養形成肺轉移的能力(圖14A及14B)。這些數據說明Col XVII及層粘蛋白-5在體內扮演著促進肺部CSCs的腫瘤轉移的功能性角色。
6. Col XVII及層粘蛋白-5的表現預測經歷肺癌切除的病患有較差的預後。
本發明後續探討Col XVII及層粘蛋白-5表現量的臨床顯著性，其係針對由一群98位接受肺部切除肺癌的病患中所得的腫瘤樣本，以免疫組織化學法分析其Col XVII及層粘蛋白-5的表現量(圖6C)。98位患有肺癌的病患之臨床人口統計資料顯示於表2中。由Kaplan-Meier分析顯示，腫瘤中Col XVII(圖14D)或層粘蛋白5(圖14E)呈現陽性染色的病患，相較於Col XVII及層粘蛋白5呈現陰性的病患而言，會表現出較差的存活率。Col XVII及層粘蛋白5兩者皆呈現陽性表現的病患，較Col XVII或層粘蛋白5呈陰性表現的病患而言，具有較差的預後(圖14F)。這些數據說明，Col XVII及層粘蛋白-5的免疫染色有利於預測經歷肺癌切除病患的預後。
7. Col XVII/層粘蛋白5藉由FAK/AKT/GSK3β途徑促進球體培養中肺癌細胞的EMT表型
接著，本發明探討經由Col XVII/層粘蛋白5-介導而維持CSCs中的EMT表型的基本機制。據顯示，鋅指轉錄因子為一種高度不穩定的(highly labile)蛋白質，其經歷GSK3-調控的磷酸化以及泛素-介導的降解。本發明驗證AKT/GSK3路徑是否參與Col XVII/層粘蛋白5-所介導的鋅指轉錄因子上調。西方墨點分析顯示，相較於單層細胞培養而言，在球體培養中的A549及CL1-1細胞的磷酸化-AKT及磷酸化-GSK3含量較高(圖15A)。此外，亦觀察到磷酸化-FAK含量的提高(圖15A)。敲除Col XVII造成球體培養中A549及CLI-1細胞的層粘蛋白-5、磷酸化-FAK、磷酸化-AKT及磷酸化-GSK含量的減少(圖15B)。相似地，敲除層粘蛋白-5亦造成球體培養中磷酸化-FAK、磷酸化-AKT及磷酸化-GSK含量的減少(圖15C)。當將A549細胞培養於含有一種PI3-激酶抑制劑，LY294002，的球體培養基中，則在該球體培養中AKT的磷酸化被抑制，但FAK的磷酸化則無(圖15D)，且伴隨著磷酸化-GSK-3及鋅指轉錄因子含量的降低。將球體細胞培養在存有FAK抑制劑的情況下，造成磷酸化-FAK、磷酸化-AKT及磷酸化-GSK含量的降低。這些數據說明，FAK是Col XVII/層粘蛋白5下游因子，可藉由AKT/GSK3路徑誘導鋅指轉錄因子的表現。據顯示，在單層細胞培養中，磷酸化-鋅指轉錄因子的泛素化可立即被偵測，但在球體培養中則完全被抑制(圖15D)。抑制FAK/AKT/GSK3訊息傳導路徑的抑制劑可促進鋅指轉錄因子的磷酸化，以及泛素-介導的降解(圖15E)。這些數據說明，活化FAK/AKT/GSK3路徑，對於由Col XVII/層粘蛋白5-介導而使鋅指轉錄因子穩定化以及維持肺癌細胞在球體培養中的EMT表型是需要的。
8. Col XVII及層粘蛋白5形成有組織的結構以支持懸浮存活性
先前報告顯示，Col XVII及層粘蛋白5為半橋粒的要素，可介導細胞貼附。為了排除在球體中TICs造成的懸浮存活性係僅由細胞聚集所介導的可能性，本發明證明Col XVII及層粘蛋白5的表現(圖16a)，以及半橋粒樣斑塊的存在(圖16b)，其為一種在皮膚表皮及正常黏膜基底膜中的有組織的ECM超微結構，存在於球體中，但不存在於由懸滴培養而形成的團塊癌細胞聚集中，或由敲除Col XVII及層粘蛋白5的癌細胞所形成的球體中(圖16b)。當進行懸浮培養24小時後，TUNEL染色(圖16c)及被剪切的半胱天冬酶3及PARP1(圖16d)的含量，在團塊癌細胞聚集中較在滋養的TICs中為多。再者，存活/死亡分析顯示，所有在球體的細胞皆存活，而在團塊癌細胞聚集的中心處僅有少數細胞存活(圖16e)。經敲除Col17a1或層粘蛋白5的細胞，其形成球體的能力降低，且進行懸浮培養時，在球體中的大部細胞皆死亡(圖16e)，而當團塊癌細胞播種於單層培養時顯示出其在凋亡上無變化。再者，以酵素進行球體的前處理5分鐘而降解半橋粒的成份造成細胞在懸浮培養中死亡，例如使用胰凝乳蛋白酶，而非使用不會降解半橋粒的胰蛋白酶(圖16e)。這些數據一起說明Col XVII及層粘蛋白5在球體中形成有組織的結構，而在支持TICs的懸浮存活性上扮演重要角色。
咸信，本發明所屬領域的技術人員可依據本發明而不須進一步闡明的情況下使用本發明至其最廣的保護範圍。因此，所提供的說明書和申請專利範圍應被理解為示範目的，而不是以任何方式限制本發明的範圍。

Claims (7)

  1. 一種針對癌症幹細胞(CSCs)的第十七型膠原蛋白(Col XVII)抑制劑用於製造抑制及預防癌細胞及/或CSCs存活、癌化及轉移的藥劑的用途，其中該Col XVII抑制劑阻斷活化CSCs中的層粘蛋白5-FAK路徑而介導CSCs的懸浮存活性及腫瘤起始性。
  2. 如請求項1之用途，其中Col XVII抑制劑能阻斷PP2A-S727STAT3-Col XVII路徑、自身抑制Col XVII、或抑制S727STAT3-Col XVII-層粘蛋白5-FAK路徑。
  3. 如請求項2之用途，其中該Col XVII抑制劑係選自由微RNA(miRNA)、小干擾RNA(siRNA)、化學試劑、抗體、存在於PP2A-S727STAT3-Col XVII路徑中酵素的抑制劑、存在於S727STAT3-Col XVII-層粘蛋白5-FAK路徑中酵素的抑制劑所組成的群組中。
  4. 如請求項3之用途，其中該化學試劑為PP2A活化劑或STAT3抑制劑。
  5. 如請求項4之用途，其中該PP2A活化劑為毛喉素、1,9-二脫氧毛喉素、或FTY720。
  6. 如請求項4之用途，其中該STAT3抑制劑係選自由PY*LKTK、SS 610、S3I-M2001、STA-21、S3I-201、Stattic、IS3 295、CPA-1、CPA-7、肉盤菌內酯、適體肽鏈、圈套ODN、G-四聯體ODN、以及胜肽所組成的群組中。
  7. 如請求項3之用途，其中該抗體是抗-Col XVII單株或多株抗體、或抗-層粘蛋白5單株或多株抗體。
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Wangpu et al. The metastasis suppressor, NDRG1, inhibits “stemness” of colorectal cancer via down-regulation of nuclear β-catenin and CD44
Ying et al. Exosomes released from decidual macrophages deliver miR-153-3p, which inhibits trophoblastic biological behavior in unexplained recurrent spontaneous abortion
Messai et al. Cytokeratin 18 expression pattern correlates with renal cell carcinoma progression: relationship with Snail
Youn et al. MMP9 inhibition increases erythropoiesis in RPS14-deficient del (5q) MDS models through suppression of TGF-β pathways
Franzen et al. The desmosomal armadillo protein plakoglobin regulates prostate cancer cell adhesion and motility through vitronectin-dependent Src signaling
Dai et al. MiR-205 suppresses epithelial–mesenchymal transition and inhibits tumor growth of human glioma through down-regulation of HOXD9
Li et al. Loss of periplakin expression is associated with the tumorigenesis of colorectal carcinoma
Li et al. A systematic CRISPR screen reveals an IL-20/IL20RA-mediated immune crosstalk to prevent the ovarian cancer metastasis
EP1973574B1 (en) Use of inhibitors of scinderin and/or of ephrin-a1 for treating tumors
Serej et al. NANOG gene suppression and replacement of let-7 modulate the stemness, invasion, and apoptosis in breast cancer
Wei et al. Bmi-1 is essential for the oncogenic potential in CD133+ human laryngeal cancer cells
Moy et al. Functional genetic screen identifies ITPR3/calcium/RELB axis as a driver of colorectal cancer metastatic liver colonization
Kato et al. Enhanced CXCL12/CXCR4 signaling increases tumor progression in radiation‑resistant pancreatic cancer