CN106636368B

CN106636368B - miR-130a在卵巢癌的诊断、治疗及预后中的应用

Info

Publication number: CN106636368B
Application number: CN201611065025.5A
Authority: CN
Inventors: 刘招舰; 王玉琼; 张锡宇
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2016-11-28
Filing date: 2016-11-28
Publication date: 2020-07-21
Anticipated expiration: 2036-11-28
Also published as: CN106636368A

Abstract

本发明公开了一种miR‑130a在卵巢癌的诊断、治疗及预后中的应用，本发明通过体内和体外功能试验明确miR‑130a通过抑制TSC1mRNA的翻译，使得mTOR信号通路过表达，从而促进卵巢癌细胞的增殖和侵袭，并且抑制了细胞的自噬。以上数据证明，降低内源性的miR‑130a可以抑制卵巢癌肿瘤的生长、侵袭等恶性生物学行为。基于此，可以设计特异性的miR‑130a抑制剂，恢复体内TSC1的含量，抑制mTOR信号通路，从而达到治疗卵巢癌的目的。

Description

miR-130a在卵巢癌的诊断、治疗及预后中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种miR-130a在卵巢癌的诊断、治疗及预后中的应用。

背景技术

卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤，病死率一直位居妇科恶性肿瘤之首。虽然肿瘤细胞减灭术和铂类及紫杉类联合化疗使患者5年生存率有所改善，但半个世纪以来卵巢癌临床诊治并无突破性进展。究其根本原因在于对卵巢癌的发生发展的分子机制认识不清，缺乏临床实用的早期诊断手段和有效的治疗策略。因此，阐明卵巢癌发生发展的分子机制以及筛选与肿瘤发生发展和转移相关的分子标记物，对于其早期诊断和新防治靶点的确立具有重要价值。

大量研究表明PI3K/Akt-mTOR信号通路影响基因表达调控、细胞周期调控、细胞增殖及分化等。PI3K/Akt信号通路与多种癌症相关,包括黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌和胰腺癌。位于通路核心位置的TSC1/TSC2复合物起着极其重要的作用，该复合物是由TSC1的基因编码hamartin蛋白，马铃薯球蛋白(TSC2)交互形成，抑制信号转导的下游效应的哺乳动物雷帕霉素靶(MTOR)，从而抑制细胞的分裂增殖。大量文献资料显示TSC1基因在多种癌症中出现下调的趋势，如子宫内膜癌，乳腺癌。

microRNA(miRNA)是一类参与基因转录后调控的非编码小分子RNA，参与人体内包括肿瘤发生在内的多种生物学过程。近年来，miRNA的各种功能角色和相应机制在不断报道中。

发明内容

本发明基于对TSC1/TSC2复合物的研究认识，TSC2的3＇UTR仅仅为102bp，而TSC2的3＇UTR为4.8k，所以TSC1更容易受到microRNA的调控。过生物信息学分析，初步确定候选miRNA，瞬时转染miRNA mimics和inhibitors，通过western blot和Luciferase等方法明确靶向调控TSC1的miRNA；western blot检测miRNA对mTOR信号通路关键分子表达的影响；建立miRNA过表达和低表达的卵巢癌细胞系，研究miRNA及TSC1对卵巢癌细胞增殖、转化、侵袭能力及化疗敏感性的影响；最后通过动物实验明确靶向调控TSC1的miRNA与卵巢癌发生发展的关系。

通过以上研究方法，本发明发现：miR-130a在卵巢癌患者中高表达，同时与TSC1具有明显的负相关性，具有卵巢癌分子标记物的潜力。

因此，本发明提供了以下具体技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种检测miRNA-130a含量的试剂盒在制备对受试者的卵巢癌进行诊断、预后评估或治疗效果监测的药物中的应用。

其中，所述检测对象为受试者的卵巢组织，所述受试者为人。

一种用于诊断或预后评估卵巢癌的试剂盒，该试剂盒中包括能定量检测miR-130a的试剂。

其包括miR-130a前引物：5’-CAGTGCAATGTTAAAAGGGCAT-3’如SEQ ID NO：20所示，以及通用后引物。所述通用后引物，本领域技术人员可以常规合成。

关于卵巢癌的诊断、预后评估、治疗效果监测，其方法包括：检测受试者卵巢组织中miR-130a的表达量、TSC1的含量，以及miR-130a的表达量和TSC1的含量在时间上的变化(如不同卵巢癌发展时期，治疗前和治疗后等)。根据检测结果，可以将受试者分为卵巢癌或健康，治疗反应好和坏，预测存活期长和短等。例如：可以将受试者的miR-130a的表达量、TSC1的含量与来自健康受试者的参比值比较，如果miR-130a表达量明显高于miR-130a表达量参比值，而TSC1的含量明显低于TSC1含量参比值，则该患者被高度怀疑为卵巢癌。

本领域中，TSC1基因编码hamartin蛋白，与马铃薯球蛋白(TSC2)交互形成复合物，该复合物为mTOR信号通路的重要的抑制剂。

本发明的第二个方面，提供一种miR-130a抑制剂在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。

其中，所述miR-130a抑制剂是指抑制卵巢组织内miR-130a的表达水平的试剂。

进一步的，目前较为成熟的miR-130a抑制剂是指一段靶向于miR-130a的核苷酸序列，可以进入人体细胞内，靶向影响miR-130a的表达水平，目前合成工艺已相对完善。例如，该序列可为：5’-AUGCCCUUUUAACAUUGCACUG-3’，如SEQ ID NO：19所示，但不仅仅限于以上序列。

进一步的，miR-130a抑制剂在制备治疗通过抑制PI3K/Akt-mTOR信号通路的卵巢癌药物中的应用，其中，所述miR-130a的靶点为TSC1。

进一步的，可以利用NF-κB信号通路的拮抗剂，例如PDTC(吡咯烷二硫代氨基甲酸盐)，抑制该通路的激活，从而降低miR-130a在体内的含量。

本领域中技术人员知晓所述PI3K/Akt-mTOR信号通路，是指以mTOR复合物为主要成员的一个信号通路，活化的mTOR复合物可以磷酸化下游多个分子，例如40S核糖体蛋白S6激酶(S6K1)和真核细胞翻译起始因子4E-结合蛋白1(4E-BP1)从而促进蛋白质的合成和细胞的生长增殖。

本领域中技术人员知晓所述NF-kb信号通路，具体是指核因子-κB(Nuclearfactor-kappa B，NF-κB)是参与炎症过程的重要转录因子，目前是公认的炎症反应的关键性调节因子。在细胞内其与抑制蛋白IκB结合，以无活性的形式存在于细胞质中，当细胞受到炎性因子等刺激时，例如TNF-α即为该通路的一种特异性激活物，IκB发生磷酸化，从而被泛素结合酶识别而降解。NF-κB复合物被活化，进入细胞核，调节超过400种基因的转录，涉及到炎症，免疫调节，肿瘤细胞增殖、侵袭、转移、血管生成、耐药等多个方面。

本发明的第三个方面，提供一种miR-130a抑制剂，在制备卵巢癌细胞自噬诱导药物中的应用。

进一步的，miR-130a抑制剂联合雷帕霉素可以增强卵巢癌细胞自噬作用。

进一步的，miR-130a抑制剂在制备治疗通过抑制PI3K/Akt-mTOR信号通路的卵巢癌细胞自噬诱导药物中的应用，其中，所述miR-130a的靶点为TSC1。

进一步的，如上述所述，可以利用NF-κB信号通路的拮抗剂，例如PDTC(吡咯烷二硫代氨基甲酸盐)，抑制该通路的激活，从而降低miR-130a在体内的含量，从而达到卵巢癌的治疗的目的。

本发明通过western blot检测自噬相关的蛋白以及GFP-LC3单荧光体系示踪实验。分别比较miR-130a过表达和低表达对于细胞自噬的影响。雷帕霉素作为自噬的诱导剂而使用，本发明证明miR-130a抑制剂可以增强雷帕霉素的作用，使其自噬的效果增强。而miR-130a过表达后抑制了雷帕霉素所诱导的自噬现象。

本发明的第四个方面，提供一种miR-130a抑制剂在制备mTOR信号通路抑制剂中的应用。

经过研究发现，miR-130a抑制剂，能够恢复体内TSC1的含量，抑制mTOR信号通路，从而达到治疗卵巢癌的目的。

上述技术方案中的一个技术方案具有如下有益效果：

(1)为卵巢癌的诊断、病情评估和预后判断提供有效的分子标记物：本发明通过大量临床样本的验证，采用qPCR、western blot以及免疫组织化学染色等方法证明了miR-130a在卵巢癌患者中高表达，同时与TSC1具有明显的负相关性，具有卵巢癌分子标记物的潜力。

(2)为卵巢癌的诊断和治疗提供新的靶点：本发明通过体内和体外功能试验明确miR-130a通过抑制TSC1mRNA的翻译，使得mTOR信号通路过表达，从而促进卵巢癌细胞的增殖和侵袭，并且抑制了细胞的自噬。以上数据证明，降低内源性的miR-130a可以抑制卵巢癌癌灶的生长、侵袭等恶性生物学行为。基于此，可以设计特异性的miR-130a拮抗剂或抑制剂，恢复体内TSC1的含量，抑制mTOR信号通路，从而达到治疗卵巢癌的目的。

(3)本发明首次公布了miR-130a的靶点TSC1，TSC1作为mTOR信号通路的阀门具有重要的意义。本发明为mTOR信号通路的靶向调控找到了新的有效地方法，即通过miR-130amimics/inhibitor实现mTOR通路的激活和抑制。相比较于雷帕霉素抑制mTOR通路，此方法靶向性更强。

(4)本发明通过luciferase和CHIP等试验证明NF-kb可以结合到miR-130a的启动子区域，促进miR-130a的表达。从microRNA角度阐明了炎症在卵巢癌发生发展中的作用。即miR-130a为炎症通路NF-κB和mTOR信号通路之间的桥梁，我们可以认为慢性炎症通过激活NF-κB信号通路，促进miR-130a的高表达，miR-130a过表达后激活了mTOR通路，促进了卵巢癌的发生发展。

附图说明

图1是TSC1在卵巢癌组织中低表达的图。

图2是TSC1是miR-130a的直接靶基因的图。

图3是miR-130a提高细胞的增殖和侵袭能力的图。

图4是miR-130a抑制细胞的自噬的图。

图5是老鼠肺转移模型的构建的图。

图6是NF-kb信号通路促进miR-130a的表达的图。

图7是结论示意图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。

本发明中所使用引物如表1所示。

表1引物表

实施例1明确卵巢癌中miR-130a以及TSC1所扮演的角色

收集卵巢癌组织以及对照正常输卵管伞组织(组织均来源于山东大学齐鲁医院2009-2015)，并用组织研磨器冰上研磨，加入蛋白裂解液，冰上裂解20min，12000r/min4℃离心15min后取上清，BCA法测得蛋白浓度，并进行western blot和免疫组织化学染色的方法检测TSC1在卵巢癌组织和输卵管伞中的含量差异，结果显示在绝大多数卵巢癌组织中TSC1为低表达的(图1a)，灰度分析可以看出相比于正常输卵管伞组织，卵巢癌组织中TSC1的含量较低，两者有显著的统计学差异(p＜0.0001)(图1b)随后我们对含有43例输卵管伞组织和109例卵巢癌组织的组织芯片进行免疫组织化学染色，图1c为FT和HGSOC的典型染色图，对染色情况进行评分并统计分析，结果显示TSC1在卵巢癌中低表达(图1d)，且与卵巢癌的分期有关(图1e)即：FIGO分期越晚，TSC1含量越低，miR-130a则在卵巢癌患者中卵巢癌组织高表达(图2d)，同时与TSC1在同一患者组织中存在负相关性(图2e)。

实施例2确定调控miR-130a对TSC1的靶向调控作用

miRNA和3′-UTR的表达构建：

从吉玛基因公司购买miR-130a-3p、miR-27a-3p和miR-204-3p mimics以及阴性对照。miR-130a-inhibitor(是指序列5’-AUGCCCUUUUAACAUUGCACUG-3’，如SEQ ID NO：18所示)和阴性对照。瞬时转染卵巢癌细胞系，发现只有在转染了miR-130a后TSC1含量降低(图2a)同时我们发现miR-130a过表达后mTOR信号通路的关键蛋白的磷酸化水平明显升高，说明miR-130a激活了mTOR信号通路，反之miR-130a低表达后，mTOR信号通路被抑制(图2b)即miR-130a与mTOR信号通路的激活程度呈正相关。为了进一步的验证TSC1是miR-130a的直接靶基因，我们将TSC1 3’UTR区951bp序列通过Pmel和Xhol连接到pmirGLO(Promega)质粒上，构建野生型质粒。突变型质粒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。将野生型质粒和突变型质粒与miR-130a/NC共转染A2780细胞系，48小时后裂解细胞，进行荧光检测。结果如图2c miR-130a可以有效地抑制野生型质粒的荧光表达，但是不能抑制突变型的荧光表达，说明TSC1是miR-130a的靶基因。

实施例3构建miR-130a过表达的细胞系。

将miR-130a的序列连接到pGIPZ质粒(可常规购买得到)上，慢病毒包装后转染A2780和SKOV3细胞，利用嘌呤霉素进行筛选。筛选后用western blot和qPCR检测miR-130a和TSC1的含量。细胞系构建成功后用平板克隆实验和软琼脂克隆形成实验检测细胞的增殖能力，以及Transwell实验检测细胞的侵袭能力。

1、稳转细胞系构建：

(1)病毒颗粒的产生

取状态良好的Phoenix amphotropic细胞，胰酶消化收集细胞并计数后按照3×10⁶个细胞/皿的密度接种于100mm细胞培养皿中，转染前的细胞培养液不能含有抗生素，放入细胞培养箱中培养过夜，观察当细胞密度达到70％-80％时进行质粒转染；

配制转染复合物：用1.6ml无血清的OPTI-MEM培养基分别稀释10μg的质粒DNA和36μl的脂质体,吹匀后室温孵育5min；

将两者混合，吹匀并避免产生气泡，室温孵育20min左右以形成DNA-脂质体混合物；

将上述DNA-脂质体复合物加入到铺好细胞的培养皿中置于培养箱中；

培养3h后取出，往培养皿中补加5ml OPTI-MEM培养基，继续培养6h左右之后换以6ml新鲜的无抗生素的DMEM完全培养基，放回培养箱中继续培养；

培养24h后收集含有病毒颗粒的上清液，暂存于4℃，并向皿中加入6ml新鲜完全培养基；

培养48h后再次收集上清并将两次收集的上清液混合，20000rpm，4℃离心2h，获得病毒颗粒沉淀；

用500μl培养基重悬病毒沉淀，进行下一步实验或储存于-80℃。

(2)感染宿主细胞

将待感染细胞按照3×10⁴个细胞/ml的密度接种到6孔板中，培养过夜；

铺板第二天，每孔加入含8μg/ml Polybreen(及50μl浓缩的病毒颗粒进行感染。晃动培养板(十字晃)使其混匀。放入培养箱中继续培养；

感染48h后，吸弃上清，更换含有2μg/ml嘌呤霉素的培养基进行筛选，每隔2天观察细胞生长状态，每3-4天更换一次含有嘌呤霉素的培养液，持续筛选2周后即可得到稳定转染目的质粒的细胞。

2、平板克隆：选取对数生长期细胞，膜蛋白酶消化，细胞计数，400个细胞每孔，接种于6孔板中，培养约10-14天，甲醇固定15min，结晶紫染色30min。镜下观察并进行计数。结果见图3a，我们可以观察到miR-130a过表达后细胞的克隆形成能力明显增强。

3、Transwell:配制Matrigel和DMEM的混合液，其体积比为1:10，每孔加入50μl,该混合液待胶凝固后，上室加入200μl细胞与无血清DMEM混悬液(A2780 20万/孔，SKOV3 10万/孔)，下室加入含有10％FBS的DMEM，培养48小时后，甲醇固定，结晶紫染色后镜下观察计数。

结果见图3c，miR-130a过表达细胞系的侵袭能力明显强于对照组。同时我们检测了侵袭相关的EMT通路中的关键蛋白，结果如图3d，miR-130a过表达后细胞内N-cadherin和Vimentin含量增加，而E-cadherin含量降低，此结果进一步证明了miR-130a可以促进细胞的侵袭能力。

4、软琼脂克隆形成实验：下层胶：1％琼脂糖胶：2×DMEM(20％FBS)＝4:1，上述混合液3mL加入6cm皿中，4℃凝固后取出。上层胶：0.7％琼脂糖胶：2×DMEM(20％FBS)＝1:1，细胞5000个/皿，细胞稀释于50ul培养基中，上述混合液和细胞悬液共同加入培养皿中。4℃凝固，在5min中以内取出，并置于细胞培养箱中，10-14天进行结晶紫染色并观察计数。结果如图3b，miR-130a过表达后细胞在软琼脂中克隆形成的能力明显增强。

综上所述，miR-130a可以促进细胞的增殖能力，克隆形成能力以及侵袭能力。

实施例4细胞自噬

通过western blot检测自噬相关的蛋白以及GFP-LC3单荧光体系示踪实验分别比较miR-130a过表达和低表达对于细胞自噬的影响。雷帕霉素作为自噬的诱导剂而使用，通过western blot和灰度分析检测自噬相关的分子标记物，我们证明，miR-130a过表达后抑制细胞自噬(图4a-b)同时我们发现miR-130a inhibitor可以增强雷帕霉素的作用，使其自噬的效果增强(图4c-d)。

GFP-LC3单荧光体系示踪实验

取生长状态良好，处于对数生长期，汇合度约为70％-80％的A2780GFP-LC3细胞(为稳定转染GFP-LC3质粒的A2780细胞)，胰酶消化收集细胞，按照3×10⁴个细胞/ml的密度将细胞接种于含有飞片(20mm)的六孔板中；培养过夜后，吸弃上清，实验组换以含10μM甲基莲心碱的新鲜培养液；对照组则换以含有等量于10μM甲基莲心碱剂量的DMSO的培养液，37℃，5％CO₂恒温培养箱中继续培养24h；吸弃上清，用PBS洗涤细胞2次，用75％磷酸甘油固定细胞并防止干片，于荧光显微镜下观察GFP-LC3融合蛋白的聚集情况并拍照；自噬小体的量化采用计数每个细胞中含有GFP-LC3自噬小体的平均数，从任意10个视野中计数至少100个细胞中含有GFP-LC3自噬小体的平均数。结果见图4e，在90nM雷帕霉素处理下miR-130a过表达的细胞内自噬小体的数目明显少于对照组，而在60nM雷帕霉素处理下，miR-130a低表达的细胞内自噬小体明显增多。即miR-130a可以抑制细胞自噬。

实施例5 NOD-Prkdcem26Cd52/Nju雌鼠肺转移模型的构建

8-10周龄NOD-Prkdcem26Cd52/Nju雌鼠对照和实验组各5只。对照组注射SKOV3-pGIPZ-NC细胞，实验组注射SKOV3-pGIPZ-miR-130a细胞，每只注射500万细胞，细胞稀释于120μlPBS中，于尾部静脉进行注射。8周后麻醉处死老鼠，取肺部浸泡于10％福尔马林溶液中，后石蜡包埋，然后进行切片，HE染色和免疫组织化学染色以观察肺部结节的形态和数目。

1、HE染色步骤

烤片：60度烤片30min。

脱蜡：二甲苯I15min——二甲苯15min——100％酒精5min——100％酒精5min——95％酒精5min——80％酒精5min——75％酒精5min，自来水中涮洗2-3次。

苏木素染色10min，用小水流轻轻冲洗玻片，注意：水流过大可将组织冲走。

盐酸酒精1-2秒，氨水5-10秒，自来水中涮洗2-3次。

伊红染色20min，自来水中涮洗2-3次。

脱水：75％酒精10s——80％酒精10s——95％酒精10s——100％酒精10s——100％酒精10s——二甲苯I3min——二甲苯3min。

2、免疫组织化学染色

脱蜡步骤同上。

抗原修复：加入修复液(柠檬酸钠)附有组织的一面朝上，置于洗涤盒中，微波高火加热40s，待出现沸腾，暂停30秒。此时进入15个循环的蒸煮。12秒open+48秒close，冷却至室温(30min-60min)；湿盒中3％过氧化氢37度孵育15-20min，PBS摇床洗3次*3min；血清封闭：滴加试剂A(蓝色液体)37度孵育25-30min；加一抗：室温2小时，加试剂B：37度孵育15-20min，PBS摇床洗3次*3min；加试剂B：37度孵育10-15min，PBS摇床洗3次*3min。

加显色液DAB，苏木素染色，盐酸酒精中浸泡2秒---氨水中7-10秒；进行脱水(步骤同上)。

图5a为裸鼠肺部HE和免疫组织化学染色图像，我们可以观测到注射miR-130a过表达细胞系的裸鼠，肺内转移灶更多，且肿瘤体积更大，肿瘤细胞内TSC1染色浅。与对照组相比有显著的统计学差异(图5b)。说明miR-130a促进卵巢癌细胞系的恶性生物学行为。

实施例6明确NF-kb与miR-130a的关系

我们发现炎性因子LPS可以促进miR-130a的表达水平，在加入PDTC(NF-κB信号通路的抑制剂)以后，LPS便很难引起miR-130a的高表达(图6a)，说明LPS可能是通过NF-κB信号通路发挥作用的，同时NF-κB信号通路特异性的激活剂TNF-α可以促进miR-130a的表达(图6b)，western blot也进一步证明TNF-α在激活NF-κB信号通路的同时激活了mTOR信号通路(图6c)，为了进一步验证NF-kb信号通路是miR-130a的上游通路，我们进行了Luciferase实验，pGL4.20-TATA-miR-130a-promoter-F1/F2是由浙江大学赵斌教授赠送，也可按照本领域的技术手段常规合成，F1/F2在miR-130a启动子区域所处的位置见图6d。结果见图6e，我们可以检测到含有F2片段的质粒在加入TNF-α后luciferase荧光可以被显著增强，说明miR-130a的启动子区域存在NF-kB的结合位点，主要分布在F2区域。同时，我们进行了CHIP实验确定miR-130a启动子区域存在NF-kb的结合位点。

CHIP：

A780细胞种于10cm皿中，TNF-α(1ng/ml)处理2h后用进行交联，裂解，超声将染色体断裂为200-500bp大小的片段。

根据组别加入免疫沉淀抗体：

阳性对照，RNA聚合酶抗体，每管加入1.0μg抗体；

阴性对照，鼠IgG抗体，每管加入1.0μg抗体；

实验组：NF-kb p65抗体，每管加入5μg；

Rotator，4℃过夜。

每管加入60μL的Protein G Agarose，Rotator上，4℃旋转1-2h。清洗珠子，并进行protein/DNA复合体的洗脱，解交联释放DNA。然后进行qPCR检测预测位点的含量，从而确定NF-kb与miR-130a启动子区域结合的位点。结果表明，p65的结合位点包括位点1、3和4，目前我们可以确定miR-130a的启动子区域有NF-κB的结合位点，包括位点1、3和4，但是我们不能排除还有其他结合位点的可能性，因为预测软件存在局限性。

综上所述，本发明的原理可以阐述为：慢性炎症所导致的炎性因子的异常表达(如TNF-α)可以激活NF-κB信号通路，促进NF-κB复合物进入细胞核，结合到miR-130a的启动子区域，促进miR-130a的高表达，而miR-130a通过抑制TSC1的表达激活了mTOR信号通路，促进细胞的增殖和侵袭，即细胞的恶性生物学行为增强，最终发展为卵巢癌。(见图7)

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> miR-130a 在卵巢癌的诊断、治疗及预后中的应用

<130> 2016

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cagtgcaatg ttaaaagggc at 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttccctttgt catcctatgc ct 22

<210> 3

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<212> DNA

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ttcacagtgg ctaagttccg c 21

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcttcggcag cacatatact aaaat 25

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caacaagcaa atgtcgggga g 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

catagggcca cggtcagaa 19

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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ggcatggact gtggtcatga g 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 24

<212> DNA

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aggaagcagc atctgagact tgaa 24

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tcaacctgct gttctgactg tc 22

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<211> 22

<212> DNA

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<400> 12

gagaagggag ctgagataca cc 22

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<212> DNA

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<211> 22

<212> DNA

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ggtgaggctg aaaggctgag tg 22

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<211> 23

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<400> 16

gcaggtgaag gcagatccag ttc 23

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

catgtttaaa caaggcattg attgcacttg a 31

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gccctcgagt gtagtgcaaa acaataaat 29

<210> 19

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 19

augcccuuuu aacauugcac ug 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400>20

cagtgcaatg ttaaaagggc at 22

Claims

1.miR-130a拮抗剂或抑制剂在制备TSC1激动剂中的应用。