CN117947023A - 用于抑制SOX30基因表达的shRNA的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于抑制SOX30基因表达的shRNA在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。所述用于抑制SOX30基因表达的shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明基于SOX30基因的mRNA序列，设计筛选出两条shRNA可以显著降低SOX30基因在三阴性乳腺癌细胞中的表达。通过构建相应的shRNA慢病毒，之后用含目标shRNA序列的慢病毒感染三阴性乳腺癌HCC38细胞后，能有效调控和干扰SOX30基因的表达，从而抑制三阴性乳腺癌细胞侵袭和/或迁移的能力；因此该SOX30基因靶向的shRNA，具有降低SOX30的表达，有效抑制三阴性乳腺癌细胞的侵袭和/或迁移的能力。本发明为三阴性乳腺癌的治疗提供了一个新的基因靶点和药物，具备很高的临床实际应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于抑制SOX30基因表达的shRNA的应用。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，并以每年0.5％的速度持续增长。三阴性乳腺癌(TNBC)不表达雌激素受体ER，孕激素受体PR和人表皮生长因子HER2，因此TNBC患者不能从目前的靶向治疗中获益。与其他乳腺癌亚型相比，其预后通常较差，分级更高，更易复发转移，治疗十分困难。转移是绝大多数TNBC患者的主要死亡原因，因扩散到远处器官的TNBC患者的5年生存率仅为11％。
RNA干扰技术(RNAinterference,RNAi)是物种在进化上的一种高度保守的基因防御机制，即一种依赖于双链RNA特异性短序列实现转录后的基因沉默的技术。目前实验室常用的RNAi技术主要有siRNA寡核苷酸载体与shRNA慢病毒质粒表达载体。siRNA是短的双链RNA，大小在19-29nt左右，3’端有两个游离的碱基，可激活RNA的干扰，通过与目标mRNA互补序列结合，特异性地实现mRNA降解。但是siRNA在细胞中的表达是瞬时的，发挥作用的时间比较短。相对于siRNA，shRNA可以通过病毒介导的转染保持稳定，能够减少脱靶效应。shRNA包括两个短的反向重复序列，中间由茎环结构进行分割，组成一个类似发夹的结构。shRNA首先被插入到慢病毒载体上形成重组慢病毒质粒，慢病毒质粒与其他辅助质粒借助于293FT细胞形成慢病毒，最终用慢病毒转染细胞发挥shRNA的沉默作用。
SOX30作为重要的转录调控因子，在癌症发生发展过程中发挥着重要的作用。对于SOX30与肿瘤相关的研究发现，SOX30在不同亚型癌症中可能发挥不同的作用。目前没有关于SOX30基因在三阴性乳腺癌组织中表达情况及作用研究的相关报道。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的主要目的在于提供一种用于抑制SOX30基因表达的shRNA的应用，抑制SOX30基因表达的shRNA能显著抑制三阴性乳腺癌细胞的转移和侵袭能力。本发明所要解决的另一个技术问题在于提供抑制SOX30基因的shRNA在制备抗三阴性乳腺癌的药物中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种用于抑制SOX30基因表达的shRNA，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，所述SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的核苷酸序列如下所示：
| shRNA名称 | 序列 |
| shRNA-1 | GCTTGGGTTAGAGTGGAACAA |
| shRNA-2 | CCCTTCAGTAAGGACAGAAAT |
本发明还提供了一种shRNA慢病毒表达载体，所述shRNA慢病毒表达载体包含前述shRNA。
所述用于抑制SOX30基因表达的shRNA或所述shRNA慢病毒表达载体的用途，所述shRNA或shRNA慢病毒表达载体能够抑制三阴性乳腺癌细胞中SOX30基因的表达，从而显著抑制三阴性乳腺癌细胞的迁移和/或浸润能力。
所述用于抑制SOX30基因表达的shRNA或所述shRNA慢病毒表达载体的用途，用于获取抑制三阴性乳腺癌细胞转移的信息。
所述用于抑制SOX30基因表达的shRNA或所述shRNA慢病毒表达载体的用途，可以基于该靶序列开发制备抑制三阴性乳腺癌细胞迁移和/或浸润的基因药物。
其中，所述药物包含前述shRNA或前述shRNA慢病毒表达载体以及药学上可接受的载体。
其中所述药物的剂型为任何药物治疗学上可接受的剂型。
其中所述药物的剂量为任何药物治疗学上可接受的剂量。
本发明基于SOX30基因的mRNA序列，设计筛选出两条shRNA可以显著降低SOX30基因在三阴性乳腺癌细胞中的表达。通过构建含目标shRNA序列的SOX30干扰载体并用病毒包装，之后感染三阴性乳腺癌细胞系HCC38，用嘌呤霉素筛选出具有抗性的细胞用于实验，并设立对照组(不含有目标shRNA序列的慢病毒)。用Western blotting技术检测目的蛋白SOX30验证shRNA对三阴性乳腺癌细胞中SOX30基因表达的抑制作用；通过Transwell小室实验检测shRNA对HCC38细胞迁移和浸润能力的影响。
与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
本发明中所涉及的shRNA-1和shRNA-2对HCC38细胞中SOX30基因的表达有显著的抑制作用；Transwell小室实验证实shRNA-1和shRNA-2都能抑制三阴性乳腺癌中HCC38细胞的迁移和/或浸润能力，能有效发挥抑制SOX30基因表达的作用，对三阴性乳腺癌起到基因治疗的目的，为三阴性乳腺癌的临床治疗提供新的靶向治疗药物；本发明提供的一种shRNA分子在未来三阴性乳腺癌的靶向基因药物研发和治疗中具有巨大的潜在价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1显示通过在线数据库分析SOX30在乳腺癌中的表达及预后情况。其中A为UALCAN数据库分析SOX30在不同亚型乳腺癌组织中的表达情况。B为UALCAN数据库分析SOX30在不同亚型乳腺癌细胞中的表达情况。C为Breast Cancer Gene-Expression Minerv4.9数据库分析SOX30在不同亚型乳腺癌组织中的表达情况。D是通过KM-plotter数据库分析SOX30在三阴性乳腺癌中的预后情况，包括总生存率OS和无复发生存率RFS。E是通过Breast Cancer Gene-Expression Miner v4.9数据库分析SOX30在三阴性乳腺癌中的预后情况。
图2显示SOX30在不同乳腺癌细胞中的表达情况和Western blotting验证SOX30在HCC38中的干扰效果。其中A为SOX30在不同乳腺癌细胞中的表达情况，B为Westernblotting验证SOX30在HCC38中的干扰效果；
图3显示通过transwell实验评估SOX30敲低后对HCC38细胞迁移侵袭能力的影响；
图4显示统计分析SOX30敲低后对HCC38细胞迁移和侵袭能力的影响；
图5为shRNA干扰SOX30表达后TNBC细胞在动物体内的肺转移情况。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。除了特别指明，以下实施例中所使用的技术手段和操作方法为本领域技术人员所熟知的常规手段和方法，所使用原料均为市售商品。
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实验材料：HCCC38细胞购自中国科学院昆明动物研究所，RPMI1640培养基购自Gibico公司，ShRNA慢病毒购自中国吉凯公司，Anti SOX30(ab272553)和AntiACTIN(ab8826)购自美国abcam公司，Tanswell小室购自美国康宁公司，Trizol，逆转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)和荧光定量试剂盒TBPremix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)购自中国TaKaRa公司，Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，嘌呤霉素购自碧云天。
实施例1：SOX30基因在三阴性乳腺癌患者中表达和预后情况分析
通过UALCAN数据库分析SOX30在不同亚型乳腺癌组织中的表达情况，结果如图1(A)所示，SOX30在三阴性乳腺癌组织中的表达水平显著高于正常组织及Luminal亚型和HER2+亚型；通过CCLE数据库分析SOX30在不同亚型乳腺癌细胞中的表达情况，结果如图1(B)所示，SOX30在三阴性乳腺癌细胞中的表达水平显著高于Luminal亚型HER2+亚型；通过Breast Cancer Gene-Expression Miner v4.9数据库分析SOX30在不同亚型乳腺癌组织中的表达情况，如图1(C)所示，同样显示SOX30在三阴性乳腺癌组织中的表达水平显著高于正常组织，癌旁组织及其它亚型；以上结果表明SOX30在三阴性乳腺癌中高表达。
通过KM-plotter数据库分析SOX30在三阴性乳腺癌中的预后情况，结果如图1(D)所示，SOX30高表达患者的总生存率和无复发生存率显著低于低表达患者；通过BreastCancer Gene-Expression Miner v4.9数据库分析SOX30在三阴性乳腺癌中的预后情况，结果如图1(E)所示SOX30高表达患者的总生存率显著低于低表达患者；以上结果表明SOX30高表达不利于乳腺癌患者预后。
实施例2：SOX30在不同乳腺癌细胞中的mRNA表达水平以及在HCC38细胞中构建敲低SOX30基因的稳定细胞株
测定SOX30在不同乳腺癌细胞中的mRNA表达水平包括以下步骤：
用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养MCF7，T47D和MDA-MB-231细胞，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基培养乳腺癌细胞ZR-75-1，SK-BR-3，BT549，HS578T，HCC1937，HCC1806，HCC38，待测细胞长好后去除培养基，用PBS洗去残留培养基，加入1ml Trizol裂解细胞，冰上孵育10min后加入200ul氯仿，4℃，12000rpm离心10min，小心吸取上清液到新的无酶EP管中。加入等体积的异丙醇，轻轻地颠倒混匀约10次，冰上放置30min。4℃，12000rpm离心15min。弃上清，用1ml 75％乙醇洗涤RNA沉淀两次。4℃，12000rpm离心5min，弃上清，室温下风干5min。将RNA溶于15μ30μl DEPC水中。取2μl稀释5倍，取2μl RNA稀释液下测量在260nm和280nm吸光度。260nm/280nm比率应该是2.0，说明RNA的纯度较好。根据PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒操作说明进行反转录。根据TBPremix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)试剂盒进行qPCR实验。
结果表明SOX30在三阴性乳腺癌细胞中的表达相对较高，如图2A所示，其中SOX30在HCC38细胞中的mRNA表达水平最高。
在HCC38细胞中稳定敲低SOX30基因的制备，包括如下步骤：
1)细胞培养
三阴性乳腺癌细胞系HCC38用含10％胎牛血清的RPMI 1640(Gibco，China)培养基培养。
2)慢病毒载体构建
根据shRNA设计的原则，选择两条SOX基因的靶序列作为干扰位点(shRNA-1：GCTTGGGTTAGAGTGGAACAA；shRNA-2：CCCTTCAGTAAGGACAGAAAT)，以及引入对照序列(SEQ IDNO:3：TTCTCCGAACGTGTCACGT)，合成shRNA序列，并将shRNA-1和shRNA-2序列插入GV344载体中(该部分工作由上海吉凯基因医学科技股份有限公司完成)，将构建好的质粒进行慢病毒包装；其中shRNA慢病毒表达载体的序列分别如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示：
SOX30-shRNA-1(SEQ ID NO.4)：
CCGGGCTTGGGTTAGAGTGGAACAACTCGAGTTGTTCCACTCTAACCCAAGCTTTTT
SOX30-shRNA-2(SEQ ID NO.5)：
CCGGGCCTTCAGTAAGGACAGAAATCTCGAGATTTCTGTCCTTACTGAAGGGTTTTT
3)细胞转染
采用慢病毒感染的方式进行细胞转染，具体方法如下：将培养好的HCC38细胞均匀的铺到6孔板中，第二天细胞密度长至70％时，更换新鲜培养基，加入适量病毒悬液和病毒感染试剂，培养16h后更换培养基，48h后用加入含2ug/ml嘌呤霉素的培养基进行筛选，两周后得到具有抗性的细胞，可用于后续实验。
实施例3：Western blotting检测SOX30基因在HCC38细胞中的干扰效果
通过western blotting检测SOX30在HCC38对照细胞和SOX30干扰细胞中的蛋白表达水平。具体方法如下：
1)收集蛋白样品(Protein sample preparation)
使用蛋白裂解液实施例2中获得的具有抗性的细胞，加入蛋白酶抑制，冰上放置半小时，12000rpm，4℃离心10min，取上清并测定蛋白浓度。
2)电泳
①SDS-PAGE凝胶配制，采用碧云天SDS-PAGE凝胶试剂盒配置。
②样品处理
在收集的蛋白样品中加入适量SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。100℃加热10分钟，以充分变性蛋白。
③上样与电泳
把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内，电泳电压设置100V，设定时间为90分钟。
④转膜
使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，设定转膜电压80V，转膜时间为150分钟。
⑤封闭
转膜完毕后，把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗5分钟，以洗去膜上的转膜液。加入3％BSA封闭液，在摇床上缓慢摇动，封闭60分钟。
⑥一抗孵育
适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。在4℃缓慢摇动孵育过夜。加入TBST洗涤液，在摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟，共洗涤3次。
⑦二抗孵育
按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。加入稀释好的二抗，室温孵育一小时。加入TBST洗涤液，洗涤5-10分钟，共洗涤3次。
⑧蛋白检测
使用ECL荧光检测试剂通过显影检测蛋白。
实验结果如图2所示，图2为Western blotting验证SOX30在HCC38中的干扰效果，从图中可以看出，与对照组比较，转染shRNA-1和shRNA-2的实验组的SOX30蛋白表达水平明显降低，表明本发明中的shRNA-1和shRNA-2均能有效干扰SOX30的表达水平。
实施例4：Transwell小室实验检测shRNA对HCC38细胞迁移和侵袭的影响
Transwell迁移实验:
1)待测细胞培养至对数生长期，消化细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤1次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为5×105/ml；
2)下室(即24孔板底部)加入600μl含10％血清的培养基，上室加入100μl细胞悬液，继续在培养16h；
3)将其下表面浸泡在4％多聚甲醇溶液中，固定30min，用结晶紫染色。显微镜下观察并计数。
Transwell侵袭实验：
1)待测细胞培养至对数生长期，消化细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤1次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为5×105/ml；
2)如进行侵袭实验，将Matrigel胶从-20℃取出于4℃冰箱过夜，在4℃条件下将Matrigel胶用无血清的细胞培养基稀释至300μl/ml，取100μl均匀涂抹一层于细胞培养池的PET膜上表面，然后将培养池轻轻放入24孔板孔内，37℃放置3h左右。
3)下室(即24孔板底部)加入600μl含10％血清的培养基，上室加入100μl细胞悬液，继续培养16h；
4)将其下表面浸泡在4％多聚甲醇溶液中，固定30min，用结晶紫染色。显微镜下观察并计数。
迁移侵袭实验结果如图3所示，从图中可知，shRNA-1和shRNA-2干扰SOX30转染的三阴性乳腺癌细胞HCC38后迁移和侵袭能力明显减弱，经统计分析，shRNA-1和shRNA-2干扰SOX30转染的三阴性乳腺癌细胞HCC38与对照相比迁移和侵袭细胞数量显著减少(P＜0.01)(图4)。以上实验结果表明通过干扰SOX30的表达能显著抑制三阴性乳腺癌细胞的转移和侵袭能力。
实施例5：动物模型实验检测SOX30经shRNA干扰后抑制TNBC转移的效果：
收集SOX30对照组和实验组(shRNA-1和shRNA-2)细胞，用PBS配置成1×106个/mL浓度的细胞悬液。取100μl细胞悬液注射入6-8周龄的裸鼠尾部静脉血管；待裸鼠体重明显变轻后处死取裸鼠肺部脏器拍照并制作石蜡切片进行HE染色；显微镜下检测并统计5个视野中肺部结节形成情况。
结果如图5所示，图5为shRNA干扰SOX30表达后TNBC细胞在动物体内的肺转移情况。实验结果如图5所示，通过shRNA干扰SOX30基因后，HCC38细胞在裸鼠体内的肺转移结节随SOX30表达的下调显著降低。
综上所述，本发明所提供的用于抑制SOX30基因表达的shRNA可作为靶向药物，通过shRNA抑制SOX30基因的表达，能抑制三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭能力，对于临床开发三阴性乳腺癌靶向药物具有较好的应用前景。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。
Claims (9)
1.一种用于抑制SOX30基因表达的shRNA，其特征在于，所述shRNA的核苷酸序列如SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
2.一种shRNA慢病毒表达载体，其特征在于，所述shRNA慢病毒表达载体包括权利要求1所述的shRNA的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的用于抑制SOX30基因表达的shRNA或权利要求2所述的shRNA慢病毒表达载体在抑制三阴性乳腺癌细胞中SOX30基因表达中非诊断治疗目的的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为抑制三阴性乳腺癌细胞的迁移或/和浸润能力。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为非诊断治疗目的的，用于获取抑制三阴性乳腺癌细胞转移的信息。
6.权利要求1所述的用于抑制SOX30基因表达的shRNA或权利要求2所述的shRNA慢病毒表达载体在制备抑制三阴性乳腺癌细胞转移的基因药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物包含权利要求1所述的用于抑制SOX30基因表达的shRNA或权利要求2所述的shRNA慢病毒表达载体以及药学上可接受的载体。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为任何药物治疗学上可接受的剂型。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物的剂量为任何药物治疗学上可接受的剂量。
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