CN110951880A - 检测下咽癌lncRNA标志物的试剂在制备诊断下咽癌产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及检测下咽癌lncRNA标志物的试剂在制备诊断下咽癌产品中的应用。所述lncRNA标志物为RP11‑156L14.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述RP11‑156L14.1与人类下咽癌发生密切相关，在下咽癌组织中呈现高水平表达，正常组织中低表达，人为敲低lncRNA RP11‑156L14.1可抑制下咽癌细胞的细胞增殖，细胞周期，细胞迁移和侵袭，表明RP11‑156L14.1在下咽癌发生过程中，可以作为诊断下咽癌的新的分子标记和药物靶标。

Description

检测下咽癌lncRNA标志物的试剂在制备诊断下咽癌产品中的 应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及检测下咽癌lncRNA标志物的试剂在制备诊断下咽癌产品中的应用。

背景技术

下咽癌是原发于下咽黏膜上皮的恶性肿瘤，好发于50-60岁男性，约占头颈部恶性肿瘤的1.4-5.0％，占全身恶性肿瘤的0.5％。下咽癌中95％以上为鳞状细胞癌，其中56％-71％的肿瘤细胞分化较差，易于黏膜下广泛扩散。下咽癌好发部位依次为：梨状窝区(70-80％)，下咽后壁区(5-22％)，环后区(3-12％)。由于下咽癌具有以下特性：位置隐蔽，早期多无特异性症状，各种临床症状出现相对较晚；局部呈侵袭性生长并沿黏膜下浸润；易发生颈部淋巴结转移和远处转移(就诊时50％-60％有颈淋巴结转移)，为临床诊疗带来一定难度，故预后较差。

因此，通过较为准确、简便的方法检测相关指标，正确评估该恶性肿瘤生物学行为，有助于及时、合理采取综合治疗措施，有利于提高患者生存率。

长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。研究表明，lncRNA在剂量补偿效应(Dosage compensationeffect)、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用，成为遗传学研究热点。研究发现，lncRNA在多种肿瘤细胞中存在表达异常，寻找下咽癌lncRNA标志物、进一步了解lncRNA在下咽癌病变早期的生物学功能具有重要的意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了检测下咽癌lncRNA标志物的试剂在制备诊断下咽癌产品中的应用，所述下咽癌lncRNA标志物为RP11-156L14.1，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

进一步的，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测RP11-156L14.1表达量时使用的PCR扩增引物。

更进一步的，所述引物如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

进一步步的，所述下咽癌是由人下咽癌细胞FaDu引起的。

本发明还提供了所述下咽癌lncRNA标志物表达的试剂在制备预防或防治下咽癌的药物组合物中的应用。

本发明还提供了RP11-156L14.1在制备预防或防治下咽鳞状细胞癌的药物组合物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的长链非编码RNARP11-156L14.1与人类下咽癌发生密切相关，在下咽癌组织中呈现高水平表达，正常组织中低表达，人为敲低lncRNA RP11-156L14.1可抑制下咽癌细胞中的细胞增殖，细胞周期，细胞迁移和侵袭，表明RP11-156L14.1在下咽癌发生过程中，可以作为诊断下咽癌的新的分子标记和药物靶标。

附图说明

图1为实施例1下咽癌组织与正常组织中RP11-156L14.1的差异表达。

图2为实施例2结果图，其中，图2A为RP11-156L14.1过表达情况统计图，图2B为RP11-156L14.1沉默情况的统计图，图2C为MIT法检测RP11-156L14.1过表达细胞存活率结果，图2D为MIT法检测RP11-156L14.1沉默细胞存活率结果，图2E为沉默/过表达RP11-156L14.1对下咽癌细胞增殖的影响((1)为下咽癌细胞荧光图，(2)为细胞增殖抑制率统计图)，图2F为细胞克隆实验结果。

图3A为实施例2过表达RP11-156L14.1对下咽癌细胞周期的影响统计图，图3B为实施例2沉默RP11-156L14.1对下咽癌细胞周期的影响统计图。

图4为实施例3结果图，其中，图4A行为过表达RP11-156L14.1FaDu细胞的划痕实验结果((1)显微镜拍摄0h，48h两个时间段的划痕部位，(2)相对伤口闭合统计图)，图4B行为沉默RP11-156L14.1FaDu细胞的划痕实验结果((1)显微镜拍摄0h，48h两个时间段的划痕部位，(2)相对伤口闭合统计图),图4C行为transwell法检测过表达RP11-156L14.1FaDu细胞侵袭能力结果图((1)显微镜拍摄转染48h后FaDu细胞图，(2)迁移细胞统计，(3)侵入细胞统计)，图4D行为transwell法检测沉默RP11-156L14.1FaDu细胞侵袭能力结果图(((1)显微镜拍摄转染48h后FaDu细胞图片，(2)迁移细胞统计，(3)侵入细胞统计))，图4E为Westernblot检测结果。

图5为实施例4结果图，其中，图5A为阴性对照和实验组荷瘤取材后体积对比图，图5B为阴性对照和实验组荷瘤取材体积比较的折线图，图5C为阴性对照和实验组荷瘤取材体积比较的柱形图，图5D为注射后14天时阴性对照和实验组荷瘤取材重量比较。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

RP11-156L14.1在下咽癌组织中的表达

1.材料

人下咽癌细胞FaDu，购自中国科学院上海细胞生物研究所，常规复苏后使用。

组织来源

2019年1月至2019年6月，我科收治下咽癌患者20例。患者均接受手术治疗，标本分别取自下咽组织及经过术后病理证实无癌侵犯的正常组织。新鲜标本手术切除后迅速保存于-80℃或者液氮中，待用。本实验经由我院医学伦理委员会批准，所有患者均被告知了用于科学研究中的内容，并签署了知情同意书。

(1)引物设计与合成

运用Primer Premier5.0软件设计RP11-156L14.1和内参U6的PCR反应引物。PCR引物序列交由上海公司合成，引物信息见表1。

表1序列信息

(2)RT-PCR检测

总RNA提取方法：

采用经典Trizol提取法提取总RNA，参照Invitrogen公司Trizol试剂说明书进行操作。

a.将-80℃保存的组织样品切取50mg左右，迅速将组织转移到预冷的研钵内，并不断加入液氮，研磨组织至粉末状。将1mLTrizol加入至研钵，保证样品完全溶解，室温静置，至透明状裂解液，再转移到DEPC水预处理过的离心管中，后需要室温放置5min，12000g 4℃离心15min；

b.如果提取细胞总RNA，就需要用4℃PBS洗涤培养皿中的细胞，再加入Trizol1ml，轻轻吹打，再室温静置，随后高速冷冻离心机离心，12000rpm，4℃离心5min，弃沉淀；

c.随后200μl氯仿加入到含有上述液体的离心管中，轻柔颠倒混匀充分，放置5min，待分层后离心；

e.4℃12000rpm离心15min，弃去下层有机相；

f.加入500μl异丙醇/ml Trizol，上下颠倒混匀，室温放置10-20min；

g.4℃，12000rpm转速离心10min，留下RNA沉淀于管底；

h.加入1ml 75％乙醇/ml Trizol，使沉淀悬浮；

i.8000rpm，4℃离心5min，把乙醇液体弃掉，RNA沉淀留于管底部；

j.室温中干燥5-10min；

k.将RNA沉淀用RNase-free H2O溶解，所得RNA置于-80℃长期保存；

l.取RNA1μl，加2×RNA上样缓冲液1μl，然后电泳，5V/cm电泳1h。

凝胶成像仪下观察结果；

m.紫外分光光度仪在波长260nm及280nm处分别测定RNA样本的吸OD值，取该比值在1.8～2.0之间的样本可用于逆转录反应；

逆转录反应，以上一步骤的RNA为模板，用OligdT为引物，cDNA反应体系为20μL，按逆转录试剂盒条件合成cDNA，步骤如下：

分别按照miRNA以及mRNA转录配比加入各成分，最后用RNase-free H2O补充至11μl，混匀、离心3-5s，按照对应程序上机，最后得到的cDNA冰浴冷却，-20℃保存。

荧光定量反应：以cDNA为模板，U6为内参。50μl扩增体系组成如下：SterilizedddH₂O体积22μl，2×PCR master体积25μl，F和R引物(10μmol/L)体积各1μl，逆转录产物cDNA体积1μl。

扩增条件如下：上机程序设置：95℃l0 min；95℃15s、60℃l min，35-40个循环；72℃延伸l0 min，熔解曲线分析，进行相对定量。

结果如图1所示，与正常相比，下咽癌组织中RP11-156L14.1的水平明显高于正常组织(P<0.05)，表明RP11-156L14.1的高表达与下咽癌显著相关。

实施例2

沉默和过表达RP11-156L14.1对FaDu增殖、周期的影响

本实施例中采用采用LipofectaminTM 2000试剂进行瞬时转染，实验步骤按说明书进行，步骤如下所示：

a.转染前1天，将1×10⁶个处于对数期的下咽癌细胞进行种细胞板，合适比例氧浓度条件下进行培养，加入不含双抗的完全培养基1500μL，使细胞在转染当天的细胞融合度可达到50-70％；

b.取转染培养基Opti-MEM体积250μL内加入5μL的RP11-156L14.1inhibitors/NC，使两者加入细胞的终浓度达到50nm，轻轻混匀后置于室温下孵育5分钟，RP11-156L14.1inhibitors为Shanghai GenePharma Co.,Ltd生产的LncRNA抑制剂；

c.取转染培养基Opti-MEM体积250μL内加入5μL的LipofectaminTM2000，轻轻混匀后置于室温下孵育5分钟，尽量在25分钟内与B步骤的液体混合；

d.液体轻轻混匀，在混匀过程中请勿剧烈振荡或吹打，混匀后的液体在室温下孵育20分钟；

e.将d步骤的混合液体加入6孔板中，轻轻混匀；

f.转染后的细胞继续培养4至6小时之后，可以除去含有混合试剂的细胞培养基，更换为新鲜的细胞完全培养基；

g.将6孔板放置合适条件下再培养24-96小时，并根据实验目的和要求进行相应的处理。

沉默/过表达RP11-156L14.1对细胞增殖的影响

操作步骤：

a.分别在转染后各个时间点吸去培养液，随即再加入浓度为0.5mg/ml的150μl的MTT溶液；

b.再培养4h，弃掉已经反应完全的溶液，加入DMSO试剂每孔体积在150μl；

c.摇床上避光混合10min，待液体呈现为均一的溶液且无任何沉淀结晶时，于全波段的酶标检测仪器上450nm处测OD值。

EdU试验

(1)细胞培养

取对数生长期的细胞，常规消化、离心、重悬并计数。将每孔4000细胞接种于6化板中，待细胞贴壁且密度合适后进行实验。

(2)EdU标记

1)将EdU(A液)按1:1000加入到完全培养基中；

2)每孔加入50μL己稀释好的EdU液，继续培养2小时；

3)PBS洗2次，每次5分钟。

(3)细胞固定

1)50μL聚甲醒固定20min，吸出多聚甲醒后用等量甘氨酸中和

摇床上晃动5min，弃甘氨酸；

2)每孔加入50μL的PBS，摇床上晃动5min，弃PBS；

3)每孔加入50μL的渗透剂，摇床上晃动10min，加入50μL的PBS清洗10min。

(4)Apollo染色反应液的配制，如表2所示，

表2 Apollo染色反应液组分

(5)Apollo染色

1)每孔加入50μL 1×Apollo染色液，室温避光放置30min，弃染色液；

2)每孔加入50μL渗透剂，2次，每次10分钟；

3)每孔加入甲醇50μL，2次，每次5min，PBS洗1次，5min。

(6)DNA染色液

1)每孔加入50μL DAPI染色液，室温避光孵育10min，弃染色液；2)每孔加入50μLPBS，清洗2次；加入50μL的PBS，荧光显微镜下拍照。

(7)计数。

沉默/过表达RP11-156L14.1对细胞克隆的影响

转染细胞用胰蛋白酶消化为单细胞悬液后接种于六孔板，每孔1000个细胞，置于37℃恒温培养箱中培养，每隔2天换液，培养约10d后，肉眼可观察到细胞克隆，取出六孔板，弃去培养上清，PBS清洗2次后，用4％多聚甲醛固定液固定细胞30min，适量结晶紫染色15min后，PBS洗涤2次，每孔重复3次，相机拍照记录细胞克隆，在显微镜下计数细胞克隆数。

沉默/过表达RP11-156L14.1对下咽癌细胞周期的影响

操作步骤：a.FaDu细胞在转染6小时后更换无血清培养基，血清饥饿24h后加入完全培养基，常规培养48h后收集细胞；

b.350g的转速离心5min，去掉上清，PBS溶液重新悬浮细胞，后再次350g离心，5min，重复此操作步骤两次，最后去掉上清PBS，只留离心管底部细胞沉淀；

c.加入500ul结合液，再分别加入5μl的Annexin V-FITC试剂和1μl PI(100ug/ul)染色液，再用移液器反复吹吸多次，放置常温黑暗处使其充分反应10分钟，然后需要在半个小时内上机检测，每份样品检测1万个细胞；

实验结果：

为了探讨沉默和过表达RP11-156L14.1后对下咽癌细胞FaDu增殖的影响，我们转染RP11-156L14.1和si-RP11-156L14.1，图2A为RP11-156L14.1过表达情况统计图，图2B为RP11-156L14.1沉默情况的统计图；图2C为MIT法检测RP11-156L14.1过表达细胞存活率结果；图2D为MIT法检测RP11-156L14.1沉默细胞存活率结果；结果显示，下调RP11-156L14.1的表达抑制FaDu增殖，上调RP11-156L14.1的表达促进FaDu增殖。图2E为EDU实验结果，图2F为细胞克隆实验结果，EdU和细胞克隆实验也证实了下调RP11-156L14.1的表达抑制FaDu增殖，上调RP11-156L14.1的表达促进FaDu增殖。图3为沉默/过表达RP11-156L14.1对下咽癌细胞周期的影响统计图，结果表明，过表达RP11-156L14.1时，FaDu细胞G1期显著增加，沉默RP11-156L14.1时，FaDu细胞S期显著增加，表明下调RP11-156L14.1导致细胞周期阻滞。

实施例3

沉默/过表达RP11-156L14.1对下咽癌侵袭、迁移的影响

(1)将实施例2中处于转染后的对数生长期的下咽癌FaDu细胞消化后以2.5×10⁵个细胞接种到12孔板中，将培养板放到37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(2)待细胞长到完全贴壁后，用200μL无菌的枪头在每孔中划出一条垂直的直线。

(3)用PBS液洗细胞2-3遍，将脱壁的细胞洗去，加入含2％胎牛血清的RPMI-1640培养基1ml培基后放置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(4)分别在0h，48h两个时间段在倒置显微镜下拍下划痕的部位。计为0h，48h时进行观察进入划痕区细胞的距离，由此来判断转染沉默和过表达下咽癌细胞FaDu的迁移能力。

利用transwell小室检测细胞侵袭能力，即对穿过聚碳酸酯膜的细胞进行计数。按1:4的比例稀释Martrigel和DMEM培养基，每个小室的上室加入30μL混合液，置于37℃培养箱中过夜。具体步骤如下：

1)培养FaDu细胞至对数生长期，收集细胞，并用10％FBS的DMEM高糖培养基重悬细胞，计数后调成单细胞悬液备用。

2)向24孔板中放入transwell小室，向transwell小室加入200μL(10⁴个细胞)单细胞悬液，下室中加入500μLDMEM髙糖培养基(20％FBS)，置入37℃培养箱中过夜备用。

3)将transwell小室中的液体更换为20％FBS的无双抗DMEM髙糖培养基，体积为180μL。

4)细胞转染：同实施例2转染步骤。

5)将(2)和(3)的溶液混合，混匀后室温放置20min，在transwell小室每孔滴入20μL含有转染复合物的OPTI-MEM，轻轻晃动24孔板，使转染复合物均匀分布、置于37℃培养箱。

6)12h后，将transwell小室中的液体更换为含10％FBS的DMEM高糖培养基，体积为200μL。

7)转染48h后，吸取transwell小室中的培养基，拿出小室，PBS洗2遍，用棉签擦去上室面的细胞，加入结晶紫染色，室温放置10min。吹干后在显微镜下观察并拍照。每孔随机选取5个视野计数、进行统计分析。

迁移能力无包被基底膜，其它同此实验步骤。

结果如图4所示，图4A为过表达RP11-156L14.1FaDu细胞的划痕实验结果，图4B为沉默RP11-156L14.1FaDu细胞的划痕实验结果，划痕实验证实下调RP11-156L14.1降低了下咽癌细胞的迁移能力，图4C为transwell法检测过表达RP11-156L14.1FaDu细胞侵袭能力结果图，图4D为transwell法检测沉默RP11-156L14.1FaDu细胞侵袭能力结果图，FaDu细胞过表达RP11-156L14.1后，细胞数目增加；但下调RP11-156L14.1表达后，细胞数目明显减少。统计结果也表明下调RP11-156L14.1表达后细胞侵袭的数目显著减少(p<0.05)。说明下调RP11-156L14.1降低了下咽癌细胞的侵袭转移能力。

Western blot检测

配制12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)电泳胶，在齿梳孔中加入蛋白样本和蛋白Marker，等各指示带充分分开，能清晰获取目的条带时结束电泳(80V恒压，待样本进入分离胶时调整至100V)；电泳结束后，取出凝胶，PVDF膜覆盖于凝胶上，350mA恒流转膜2h，将凝胶上的目的条带转移至PVDF膜上，转膜过程需在冰上进行。转膜结束后，用5％脱脂牛奶室温封闭2h，孵育相应一抗，置于4℃冰箱内过夜，用TBS/T洗膜3次，37℃孵育二抗2h，TBS/T洗膜3次，用ECL化学发光系统检测。

检测结果如图4E所示，沉默RP11-156L14.1后，N-cadherin下调，E-cadherin上调。

实施例4

RP11-156L14.1对裸鼠移植瘤生长的影响

使用BALB/c的裸鼠购自西安交通大学动物中心，4-6周龄，雄性，体重16-18g。培养条件：SPF(specific pathogen free condition)级别，18℃-22℃，相对湿度65％，自由进食。

根据文献建立裸鼠动物模型，分为sh-NC和sh-RP11-156L14.1组，以75％酒精对右后肢外侧皮下进行局部消毒，每只小鼠注射0.2ml细胞悬液。整个操作过程在SPF条件下进行，保证无菌操作。接种后第5天，用游标卡尺测量肿瘤体积，隔一天测一次，直至实验结束。第28天处死动物，肿瘤体积的计算方法为：V(mm³)＝ab²/2(a代表肿瘤的最长长度，b为肿瘤最短长度)。剥离瘤体称重。

通过lipo2000转染sh-RP11-156L14.1和sh-NC，皮下注射到小鼠体内培养观察共14d，分别在5d，9d，13d时测量肿瘤大小，到14天后，取出肿瘤，检测肿瘤大小，重量。

图5A为阴性对照和实验组荷瘤取材后体积对比图，图5B为阴性对照和实验组荷瘤取材体积比较的折线图，图5C为阴性对照和实验组荷瘤取材体积比较的柱形图，5d时肿瘤组织开始生长；在9d时，sh-RP11-156L14.1组肿瘤组织已经小于sh-NC组(p<0.05)，在14d时sh-RP11-156L14.1组肿瘤组织体积显著小于sh-NC组(p<0.05)，

图5D为14天时，取出肿瘤组织时的重量，sh-NC组肿瘤组织的重量约为0.8g，而sh-RP11-156L14.1组肿瘤组织的重量约为0.4g，sh-NC组的肿瘤组织的重量显著大于sh-RP11-156L14.1组的重量(p<0.05)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 西安交通大学

<120> 检测下咽癌lncRNA标志物的试剂在制备诊断下咽癌产品中的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3145

<212> DNA

<213> 人

<400> 1

agctttagtc cctgggaccg tttctgtgcc caaggagagg gagggcaggg gaaggatgga 60

atttcatcta gagtagcagg tcctggttgc ctggtaaatt atgcatcagg actgggctag 120

ccactgcctc cgttttctct gggctcctga gataacctcc acctgcctct agattctgtg 180

ccagctgatc gttatctatc tcatcaactc ttgttccatc aggaaactgc atcttggtgg 240

atgatgaacc aataaacctg gacacaatct cccgaataac accacacatg ccaacaaatg 300

acatcagcat tccagaatgt aagcggctgg aatctgatga agataagaac taacgaaaat 360

cccacatgag tcatgctaat atacacaaag agggctcaaa ttccaagaat caatttccag 420

atcagtaagc caagatcaga gcatggtaaa cacctatcat aaatgaaatg gtagaatcct 480

gacatggtgt ttaatgatgg ctttacaaag tatcacattt catagctgtg aactatcccc 540

aaatcatctc acaaaaaagg aaagatcaaa gaaaagggca attcagaaaa gatcttattt 600

ctctctctct cttgcatgaa aaagagcaca taaaatagaa gcagtggtta ccccagcgtg 660

gcccttcaga gaaccgaggt aactatggta actaagaacg gtcttttagt tcgcaaggtt 720

cgaattctag aactgttggt tggatttggg gtaagtccca taagggagag ctgcgaactt 780

caagtgtgga ctggttcatt ctctagggag atagcaacct tttcctaaaa aatcttggtt 840

cttcattgct ggagagaaga acaagccctg tgaagcagtc agagatcctt atacccagca 900

gacttaaggg tgtggtattc aaggaaaaaa acactttggg aaatagagaa gaaactgatc 960

aggaacacca gacttttctt tataaatacg tatattttaa gagcaacaaa acagagacaa 1020

ttttctcaaa ataagcaacc actaaaatgt caaggaagga cccatttatg acttaaaatt 1080

cccatggctc tctaacgaaa gcaatgctaa ttttggcctt gggaaagtgg aaaaaatata 1140

taattatgaa aagtcctcac ctttcttgca atttcttgag tttctcaggg tctgccttta 1200

tcttactggt ttccttttca tctgtgaaac cagaggctgc catcctgctc ccattatcat 1260

tttgatttgg gaaatgagac actgcaaaga aagtaaatgg tgtattttct tgcagagacc 1320

cagacacatg caaatggcct tctgagttca ttcttgatgg agaggagctg gaagaatcca 1380

ctaaggacaa attgccctgt ggatttagta agagatctgt atatagtgga gccccctgag 1440

gctggcttgt taaagtagta tcttctgctt ccctgacagc aaattcgtgt gcactgttta 1500

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gtggttggca aacatgaaac cctgagtttc cctctgagtc tgagctgtga actgaagtcg 1620

atgacattga caagtctact ggaatatcat ctctcagagc agaatgcatg aatgatgcag 1680

gagggttata ggatgaattc actgatgatc ttggagatat tggtctgcca gaaataaagt 1740

agtcaagaga attttgagaa ctgtttaaat agtctttcca gtatccttca gaatcatggg 1800

tgccaggcct atgttccaca gaaatacaat cactccatac attttcagca ttgacaccaa 1860

cctcttgtct gggctcggat ttggtgtccc acgaaagagg gctctttttc gcattttcac 1920

tgccacctct gtccttctct gtagcagatt ccctatcagg cagcccgggg tcttgggaca 1980

acctttgccc agcagaaggc cgctctgttg ctggctccat tgcattgctt attctcaatg 2040

agccatgact gggctcactt cttcttgaag aatgacctct gcaattttca gcattttctt 2100

caaaattttt atttttggcc tgaggggtcg atgtcccccc aaatctactt cttttgtgat 2160

gggaaggaga acagggtgag cgcacaccaa cccacagaca ttcttcagac tgggtttcct 2220

cttcagtgtc atcgctttct cttctgctgt tcaatgacaa aatggaataa aagtcttcat 2280

ctcggaacct aaatgatgcc tttcttggcc ctcctacagt ggtgggtgtg agtggtggcc 2340

ccgagaactc actcaatact tgaggactat tttttccttg gaaggcctgg gacagggctg 2400

gatgcagctc actctgggaa ggagcactcg ggtctccttt tttggctcta tcaggggcgt 2460

tctcagtcat tggctgtgac gatgggacca agtttcttct ctcttgattt ggcctcttca 2520

gcttagtgtt acacatcagg ccttcttgtt gaactacttg atctgcattg agaaaagaca 2580

catttatcgt tccagtaaaa gggcccatgg atgaaaggcc tctagcacca agtgcaaaat 2640

tgccctttaa atgcaacaga caagacctag agaagaaaac agacacggtc aaaatggctg 2700

gaggtacaag aggagcagag cccagcaggc ttcattttac tgccccgtat tctcctttgt 2760

acccctgtgg tcctagggaa atggggggac cctgaggata cagattcttt ctgcagaagc 2820

tcccggaaga ctggcccagc cccagccagt caggactgat gatgcgcaaa cctcacacta 2880

aatactggct tttgttccat acgtactgaa agggaaaacc accactctgg gaatgacttc 2940

tacaaaaacc accagccctt tctcatccac gttcattcaa tgtacattta tgacaccctg 3000

cctcccacgc agctttacaa gaacttaaga gaagtataac atgtcttggc agatcaggag 3060

gaaggctata ggagctggcg cccggggaac actggggatt ttggtcatgt ttactattta 3120

gtgaaaataa aaattataaa tcgct 3145

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aagggcccat ggatgaaagg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggaccacagg ggtacaaagg 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcgcgtcgtg aagcgttc 18

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtgcagggtc cgaggt 16

Claims (5)

1.检测下咽癌lncRNA标志物的试剂在制备诊断下咽癌产品中的应用，其特征在于，所述下咽癌lncRNA标志物为RP11-156L14.1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测RP11-156L14.1表达量时使用的PCR扩增引物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述下咽癌是由人下咽癌细胞FaDu引起的。

5.抑制权利要求1所述下咽癌lncRNA标志物表达的试剂在制备预防或防治下咽癌的药物组合物中的应用。

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