CN110331197A

CN110331197A - lncRNA在制备预测头颈鳞状细胞癌预后的产品中的应用

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Publication number: CN110331197A
Application number: CN201910096223.5A
Authority: CN
Inventors: 蔡耿明
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-01-23
Filing date: 2019-01-23
Publication date: 2019-10-15

Abstract

本发明涉及一种lncRNA在制备预测头颈鳞状细胞癌预后的产品中的应用，其中，lncRNA是RP11‑180M15.7、RP11‑197N18.2、AC021188.4、RP11‑474D1.3和RP11‑347C18.5的组合。在具体实施方式中，该产品可以是芯片或、试剂盒或检测装置，还可以是包括用于检测待测样本中RP11‑180M15.7、RP11‑197N18.2、AC021188.4、RP11‑474D1.3和RP11‑347C18.5的表达水平的试剂。该试剂可以是特异性识别RP11‑180M15.7、RP11‑197N18.2、AC021188.4、RP11‑474D1.3和RP11‑347C18.5的探针，还可以是特异性扩增RP11‑180M15.7、RP11‑197N18.2、AC021188.4、RP11‑474D1.3和RP11‑347C18.5的引物。通过本发明的应用或者产品，可以可靠地预测头颈鳞状细胞癌预后。

Description

lncRNA在制备预测头颈鳞状细胞癌预后的产品中的应用

技术领域

本发明涉及一种用于医疗的产品和应用，具体涉用于头颈鳞状细胞癌预后的产品或者装置。

背景技术

头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)是临床上常见的头颈部恶性肿瘤，其中以咽部鳞状细胞癌(pharyngeal squamous cell carcinoma，PSCC)、喉部鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)与口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma， OSCC)最为常见，约占全身恶性肿瘤的5％～10％，平均发病率约为10～15/10万。据研究报道，近年来，此类恶性程度较高的肿瘤其发病率呈上升趋势。尽管医疗科技的高速发展，头颈部鳞状细胞癌的早期诊断技术得到不断提高，临床上晚期病例仍占50％左右。在过去20多年中，手术方法、放疗、化疗技术都得到了很大提高，但是头颈部鳞状细胞癌，特别是晚期患者的五年生存率并没有明显提高。目前研究揭示：头颈癌是一种基因病，是由多种癌基因抗癌基因共同参与、多阶段多途径协同的过程。近年来已证实头颈癌的发生与诸多癌基因和抑癌基因及其产物的表达或结构异常密切相关，从细胞分子水平深入研究头颈癌的发生发展机制，特别是从基因、lncRNA水平上研究寻找头颈癌癌相关基因，对头颈癌的诊断、治疗和预防发挥着重要的作用

长非编码RNA，即lncRNA，被定义为长度大于200个核苷酸的RNA分子，其不含任何明显的蛋白质编码潜能，大多数lncRNA以低水平表达，在RNA深度测序方法出现之前很难被发现。长非编码(lnc)RNA是调节包括细胞核中核亚结构的组织，染色质状态的改变，以及通过与效应蛋白的相互作用调节基因表达并调节其活性的各种细胞过程的关键因素。最近的研究提供了越来越多的证据，证明长的非编码(lnc)RNA可能在通过调节蛋白质复合物在细胞功能及代谢的关键调节方面发挥作用。通过lncRNA动态调节转录和染色质状态。许多论文已经揭示出lncRNA的失调也可能影响真核基因组的调控，导致肿瘤进行性和不受控制的生长，因此，lncRNA可能在致癌和肿瘤抑制网络中具有重要作用。已有报道LncRNA通过调节细胞增殖，细胞凋亡和侵袭参与人类癌症的进展。但是迄今为止，尚没有成熟的使用lncRNA来判断头颈癌预后的技术出现。

发明内容

针对现有技术的状况，本发明提出一种lncRNA在制备预测头颈鳞状细胞癌预后的产品中的应用，其中，lncRNA是RP11-180M15.7、RP11-197N18.2、AC021188.4、RP11-474D1.3和 RP11-347C18.5的组合。

在具体实施方式中，该产品可以是芯片、试剂盒或检测装置。

在另一种具体实施方式中，还可以是包括用于检测待测样本中RP11-180M15.7、RP11-197N18.2、AC021188.4、RP11-474D1.3和RP11-347C18.5的表达水平的试剂。该试剂可以是特异性识别RP11-180M15.7、RP11-197N18.2、AC021188.4、RP11-474D1.3和 RP11-347C18.5的探针，还可以是特异性扩增RP11-180M15.7、RP11-197N18.2、AC021188.4、RP11-474D1.3和RP11-347C18.5的引物。

本发明另一方面涉及预测头颈鳞状细胞癌预后的产品，所述产品用于检测待测样本中 RP11-180M15.7、RP11-197N18.2、AC021188.4、RP11-474D1.3和RP11-347C18.5等5个特征 lncRNA的表达水平。

在具体的实施方式中，所述产品为芯片、者试剂盒或检测装置。

在其他实施方式中，所述产品包括用于检测待测样本中RP11-180M15.7、 RP11-197N18.2、AC021188.4、RP11-474D1.3和RP11-347C18.5的表达水平的试剂。例如，特异性识别RP11-180M15.7、RP11-197N18.2、AC021188.4、RP11-474D1.3和RP11-347C18.5的探针；或特异性扩增RP11-180M15.7、RP11-197N18.2、AC021188.4、RP11-474D1.3和 RP11-347C18.5的引物。

在其他实施方式中，所述产品用于通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测RP11-180M15.7、RP11-197N18.2、AC021188.4、RP11-474D1.3和 RP11-347C18.5的表达水平。

在另一种具体的实施方式中，该产品是一种检测装置，包括：

数据采集模块，用于获取待测样本RP11-180M15.7、RP11-197N18.2、AC021188.4、RP11-474D1.3和RP11-347C18.5的表达值，

计算模块，用于将所述数据采集模块获取的每例待测样本RP11-180M15.7、 RP11-197N18.2、AC021188.4、RP11-474D1.3和RP11-347C18.5的表达值使用公式(1)进行风险评分，

风险值＝-0.42*Expr_{RP11-180M15.7}-5.18*Expr_{RP11-197N18.2}-1.78*Expr_AC021188.4-30.75Expr *_RP11-474D1.3-2.64*Expr_{RP11-347C18.5} 公式(1)

输出终端，用于输出所述计算模块得到的计算值。

进一步地，所述检测装置还包括对比模块，用于将所述计算模块得到的计算值与预定的阈值比较，小于所述阈值的患者属于低危组，大于所述阈值的患者属于高危组，并通过所述输出终端输出比较结果。

附图说明

图1是本发明一个实施例中一千次随机lncRNA频次统计图。

图2A示出6个疾病预后特征lncRNA的表达谱聚类结果。

图2B是无监督聚类后的Kaplan Meier生存分析结果图。

图2C是6个lncRNA的表达相关性分析。

图3中，3A、3B、3C图分别为绿色、褐色、洋红色magenta三个模块的基因最显著的前几个富集结果；3D：为三个模块的所有富集结果。

图4是5个疾病预后特征lncRNA构建的预后风险模型，横轴为样本，分A、B、C三个区。

图5A是风险打分模型的ROC曲线；

图5B是根据最优阈值对样本进行高低风险分类后的预后差异分析

图6是验证数据集验证五个lncRNA的预后模型，其中图6A是五个lncRNA的预后模型的AUC曲线，图6B是预后模型的K-M曲线。

具体实施方式

本发明的前述技术方案是基于若干个影响头颈部鳞状细胞癌预后的关键特征lncRNA的发现，并且在此基础上构建了疾病预后打分模型。

具体而言，申请人通过生物信息学的方法分析筛选出对预后有影响的lncRNA，得到 RP11-180M15.7、RP11-197N18.2、AC021188.4、RP11-474D1.3、RP11-347C18.5共5个lncRNA，它们与头颈癌的预后密切相关，同时它们参与多个癌症发生发展的KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书)通路。

本文将得到的三个共表达模块中的5个lncRNA通过R包簇Profiler做富集分析，发现富集到的通路是与如信号转导、细胞周期、DNA复制、卵母细胞减数分裂、p53信号通路、错配修复、剪接体、mRNA监督通路(surveillance pathway)等与癌症发生发展密切相关的通路。通过检测这5个lncRNA的表达水平可以对头颈鳞状细胞癌预后有较为准确的预测。

为了检测这5个lncRNA的表达水平，本发明提供了预测头颈鳞状细胞癌预后的产品，该产品可以是芯片、试剂盒或检测装置等，其中，产品中包含特异性识别RP11-180M15.7、 RP11-197N18.2、AC021188.4、RP11-474D1.3和RP11-347C18.5的探针；或特异性扩增 RP11-180M15.7、RP11-197N18.2、AC021188.4、RP11-474D1.3和RP11-347C18.5的引物。

申请人用这5个疾病预后特征lncRNA构建预后打分风险模型，这个模型能有效的评判疾病的预后差异。

本发明中，申请人通过下述方法获得影响头颈部鳞状细胞癌的关键lncRNA，并构建风险打分模型：

数据下载和预处理：从癌症和肿瘤基因图谱——TCGA数据库下载头颈癌的RNAseq表达谱数据。数据集共有500个带有临床随访信息的样本，从中分离出编码基因和长链非编码基因(lncRNA)，同时随机将样本分为训练集和检验集两组样本，使用训练集来建立模型，使用检验集数据来作为外部数据验证模型的有效性。

初筛：筛选头颈癌患者癌症组织的扰动lncRNA。相同的疾病而不同病人之间的生存时间与lncRNA表达水平有这密切的关系，因此要先选择出那些在不同病人中lncRNA表达水平扰动较大的lncRNA，筛选在各个疾病样本中有变化的lncRNA。该筛选可以按照设定的规则进行，例如，可以按照这样的规则：lncRNA在各样本中表达水平的中位数大于所有lncRNA在各样本中表达水平的中位数的20％；还可以是这样的规则：lncRNA在各样本中表达水平的方差高于所有lncRNA在各样本中的表达水平的均方差的20％。

种子lncRNA的筛选：将得到的在疾病样本中符合变化条件的lncRNA使用R包Survival 分别做单因素生存分析，选择显著性水平p＜0.05的lncRNA作为种子lncRNA。

预后关键lncRNA筛选：通过初步的筛选得到的种子lncRNA过多难以用于临床诊断，需要构建基于稳健似然性(robust likelihood-based)生存模型，筛选特征lncRNA，找到出现频率最多的几个lncRNA作为最终的预后特征lncRNA。

在一种具体实施方式中，该预后关键lncRNA筛选是使用R包rbsurv，步骤如下：

1、将样本随机分为N*(1-p)个样本的训练集和N*p个样本的验证集，p＝1/3。将基因定位到样本的训练集中，并获得了该基因的参数估计值。然后我们用参数估计和样本的验证集来评估对数似然值。对每个基因重复该评估。

2、重复上述过程10次，从而获得每个基因的10个对数似然值。选择具有最大平均对数似然性的最佳基因g(1)。

我们通过评估每个两个基因模型搜索了下一个最佳基因，并选择了最大的平均对数似然值。

3、继续这种基因选择程序，产生了一系列模型。计算所有候选模型的赤池信息量准则 (AIC)，最终选择具有最小AIC的最优模型。

随机选择其中125个样本共一千次循环使用稳健似然性生存模型，找到出现频率最多的几个lncRNA作为最终的预后特征lncRNA。

预后特征lncRNA表达谱聚类：根据特征lncRNA的表达谱通过无监督层次聚类对各个样本进行分类，再进一步使用Kaplan Meier生存分析分析分类后的样本预后差异。

基因与lncRNA共表达网络构建：使用WGCNA法进行，这是使用基因表达数据来构建无尺度网络的系统生物学方法，已经为本领域现有技术。首先，选择差异lncRNA和差异基因的表达数据，然后使用R软件包WGCNA进行构建权重共表达网络，选择软阈值为6，筛选共表达模块。

共表达模块的富集分析：为了观察各个lncRNA所参与的共表达模块的功能，使用R软件包簇Profiler对各个模块进行KEGG通路富集分析，观察各个模块的功能。

风险评估模型的建立和评估：将得到的参与共表达模块的预后特征lncRNA采用多因素cox回归，基于回归系数，组合通过回归系数加权的lncRNA表达建立病人风险评估模型，得出每个病人的风险值；也就是说风险值是经过回归系数加权后lncRNA表达值的线性组合；每个病人的风险评估值按照下面的方法进行打分：

同时我们利用在训练集中训练得到β值去评估验证集中癌症病人风险。

风险评估模型与临床特征之间的关联分析：根据风险评估系统，计算样本的风险得分，以风险得分中位数为界限，将样分为高风险和低风险类型，并结合样本对应的各个临床信息，分析风险得分与各个临床特征之间的关系。

下面通过具体实施例说明用于本发明的方法。

1：从TCGA RNASeq数据集中得到500个头颈癌样本一共14448个lncRNA的表达值，我们将500个样本随机平均分成训练集和检验集两组如Table 1所示，进一步的使用训练集构建模型。

表1：训练集、验证集和合集临床信息列表。

2：根据筛选条件从14448个lncRNA中共得到了6654个在各个疾病样本中有变化的lncRNA如Supplementary Table 1，通过筛选得到的6654个lncRNA在250个样本中的表达水平，进一步使用coxph对每一个lncRNA做单因素生存分析，共筛选得到685个有显著预后差异的lncRNA，p＜0.0。将得到的685个lncRNA作为后续的种子lncRNA。最显著的20个 lncRNA如表2。

表2：变化的lncRNA的单因素生存分析得到的前20个显著影响预后的lncRNA

3：筛选影响预后的特征lncRNA：一千次稳健似然分析结果显示共出现了644个lncRNA，频次最大的20个lncRNA如表3所示，644个lncRNA的频次统计图如图1所示，从图中可以看出频次在143与123之间存在较大的分割点，最终选择频次大于等于143的 lncRNA作为影响预后的特征lncRNA。

表3：一千次统计频次最高的20个lncRNA

4：疾病预后特征lncRNA表达谱无监督聚类分析和预后特征分析

将得到的6个疾病预后特征lncRNA的表达谱提取出来，使用特征lncRNA表达谱做无监督层次聚类，使用聚类为欧式距离，如图2A，从图中可以看出6个lncRNA表达水平能够将样本分成两类即簇1、簇2，样本数目分别为77、173个。

图2中，图2A示出6个疾病预后特征lncRNA的表达谱聚类结果，横轴表示样本，纵轴表示lncRNA，使用欧式距离计算距离；图2B：通过无监督聚类后分为簇1、簇2两组，进一步分析两组的预后差异；图2C：6个lncRNA的表达相关性分析，左下角部分为lncRNA间表达水平的散点图，右上角部分为表达相关性红到蓝表示相关系数从-1到+l，对角线为各 lncRNA的表达分布柱状图。

进一步地分析簇1和簇2的预后差异，使用Kaplan Meier做生存分析，如图2B，从图中可以看出簇1、簇2的病人具有显著的预后差异，这说明这6个lncRNA的表达水平能够有效的区分临床病人的高低风险。计算6个lncRNA的表达相关性如图2C所示，其中大部分lncRNA的表达相关性较低，这说明这些lncRNA之间所携带的信息量存在较小的交叉，冗余度较低。

5：lncRNA与基因共表达网络构建：使用基因与差异lncRNA合并之后进行网络的构建，使用的方法为R语言中的WGCNA软件包。研究表明共表达网络符合无尺度网络，即出现连接度为k的节点的对数log(k)与该节点出现的概率的对数log(P(k))要负相关，且相关系数要大于0.8。为了确保网络为无尺度网络，选择β＝6。

六个lncRNA中有五个被分配到了模块一(RP11-180M15.7，RP11-474D1.3)、模块二(RP11-197N18.2，RP11-347C18.5)和模块三(AC021188.4)三个模块中，这三个模块中的基因 /lncRNA分别为637、334、752个。

6：将得到的三个共表达模块中的基因使用R包簇Profiler做富集分析，有三个模块富集到55个KEGG通路中，如图3D所示。从图中可以看出不同的模块富集到不同的通路中，它们之间共同的通路极少，这暗示了这些模块各自独立的行使功能，其中绿色部分(图3A) 所富集到细胞周期、DNA复制、卵母细胞减数分裂、p53信号通路、错配修复等与癌症发生发展具有非常相关的通路中，褐色部分(图3B)模块富集到的通路与信号转导有关，洋红色部分(如：图3C)模块与剪接体、mRNA监督通路相关，三个模块富集到的这些通路中大部分与癌症的发生发展密切相关。

7：将得到的三个模块中的lncRNA使用多因素生存分析构建预后风险评估系统：

风险值＝-0.42*Expr_{RP11-180M15.7}-5.18*Expr_{RP11-197N18.2}-1.78*Expr_AC021188.4-30.75Expr *_RP11-474D1.3-2.64*Expr_{RP11-347C18.5}

该模型的一致性指数为一致率＝0.743，由此可以说明模型具有较高的可靠性。

8：风险得分与临床特征的关系：首先根据风险评估模型进行计算每个样本的风险得分，观察不同风险得分下的lncRNA表达情况和预后情况，如图4所示，从图中随着风险得分的增加，病人的死亡风险变大，随着风险得分的增加，5个lncRNA随着风险得分的增加表达水平逐渐降低。

图4是5个疾病预后特征lncRNA构建的预后风险模型，横轴为样本；A：样本风险得分排序；B：A图中不同风险得分对应的疾病预后生存时间，绿色表示随访时未死亡，红色表示已死亡，从图中可以看出随着风险得分的增加，病人的死亡风险变大；C图：A图中的不同风险得分下对应样本在5个特征lncRNA中的表达水平，从图中可以看出随着风险得分的增加，5个lncRNA表达水平逐渐降低。

9：打分模型的ROC分析筛选最佳的分类阈值：根据风险评估系统，计算测试集的风险得分，使用R包survivalROC对风险评估系统进行ROC分析，结果如图5A所示，从图中可以看出AUC线下面积为0.762，进一步的选择最佳的阈值-1.47对样本进行分类，并对分类后样本进行预后差异分析如图5B所示，从图中可以看出高低风险组的预后存在显著的差异。

图5中，图5A是风险打分模型的ROC曲线；图5B是根据最优阈值对样本进行高低风险分类后的预后差异分析。

10：数据集验证：为了验证这5个lncRNA与头颈癌预后相关具有可重复性和可移植性，使用验证数据集用于生存分析。对5个lncRNA做多因素生存分析结果，如图6所示，从图中可以看出5个lncRNA在验证数据集中也具有很好的分类效果，对疾病的预后的分类都非常的显著，这进一步说明所筛选的5个疾病关键lncRNA是显著影响头颈癌预后的关键lncRNA。

图6是验证数据集验证五个lncRNA的预后模型，图6A是五个lncRNA的预后模型的AUC曲线；图6B是预后模型的K-M曲线。

Claims

1.lncRNA在制备预测头颈鳞状细胞癌预后的产品中的应用，其特征在于，所述lncRNA是RP11-180M15.7、RP11-197N18.2、AC021188.4、RP11-474D1.3和RP11-347C18.5的组合。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为芯片、试剂盒或检测装置。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括用于检测待测样本RP11-180M15.7、RP11-197N18.2、AC021188.4、RP11-474D1.3和RP11-347C18.5表达水平的试剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：

特异性识别RP11-180M15.7、RP11-197N18.2、AC021188.4、RP11-474D1.3和RP11-347C18.5的探针；或

特异性扩增RP11-180M15.7、RP11-197N18.2、AC021188.4、RP11-474D1.3和RP11-347C18.5的引物。

5.一种预测头颈鳞状细胞癌预后的产品，其特征在于，所述产品用于检测待测样本中RP11-180M15.7、RP11-197N18.2、AC021188.4、RP11-474D1.3和RP11-347C18.5等5个特征lncRNA的表达水平。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品为芯片、试剂盒或检测装置。

7.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品包括用于检测待测样本中RP11-180M15.7、RP11-197N18.2、AC021188.4、RP11-474D1.3和RP11-347C18.5的表达水平的试剂。

8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述试剂包括：

9.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品用于通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测RP11-180M15.7、RP11-197N18.2、AC021188.4、RP11-474D1.3和RP11-347C18.5的表达水平。

10.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述检测装置包括：

计算模块，用于将所述数据采集模块获取的每例待测样本RP11-180M15.7、RP11-197N18.2、AC021188.4、RP11-474D1.3和RP11-347C18.5的表达值使用公式(1)进行风险评分，

风险值＝-0.42*Expr_{RP11-180M15.7}-5.18*Expr_{RP11-197N18.2}-1.78*Expr_AC021188.4-30.75Expr*_RP11-474D1.3-2.64*Expr_{RP11-347C18.5} 公式(1)，

输出终端，用于输出所述计算模块得到的计算值。

11.根据权利要求10所述的产品，其特征在于，所述检测装置还包括：

对比模块，用于将所述计算模块得到的计算值与预定的阈值比较，小于所述阈值的患者属于低危组，大于所述阈值的患者属于高危组，并通过所述输出终端输出比较结果。