CN110273003A - 一种乳头状肾细胞癌患者预后复发检测标志工具及其风险评估模型的建立 - Google Patents

一种乳头状肾细胞癌患者预后复发检测标志工具及其风险评估模型的建立 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种乳头状肾细胞癌患者预后复发检测标志工具及其风险评估模型的建立，涉及乳头状肾细胞癌预后风险评估技术领域。所述检测标志工具为两组miRNA，其中第一组为总体生存率相关的miRNA，包括：miR‑1293、miR‑34a、miR‑551b、miR‑937、miR‑299和miR‑3199‑2；第二组为无复发生存率相关的miRNA，包括：miR‑7156、miR‑211和miR‑301b。预后复发风险评估模型的建立包括：检验数据的选择、鉴定差异表达的miRNA、miRNA候选者筛选、风险的评估、确定结果准确性、网络建设与功能注释等步骤，本发明克服了现有技术的不足，采用两组miRNA以及基于两组miRNA建立的评估模型来准确有效的对乳头状肾细胞癌患者进行预后的评估，提升临床的决策性，适宜推广使用。

Description

一种乳头状肾细胞癌患者预后复发检测标志工具及其风险评 估模型的建立
技术领域
本发明乳头状肾细胞癌预后风险评估技术领域，具体涉及一种乳头状肾细胞癌患者预后复发检测标志工具及其风险评估模型的建立。
背景技术
肾细胞癌(RCC)是全世界最常见的肿瘤之一，乳头型(pRCC)约占10％，是RCC第二常见的亚型，RCC的特点是因转移率高一般预后不良，且对放疗和化疗均不敏感，在新诊断患者中约有17％的已经发生转移。由于早期发现和肿瘤初期手术治疗可以提高5年生存率，因此探索新的生物标志物以提高诊断或预后的效率至关重要。
微小RNA(miRNA)通常在正常细胞或肿瘤细胞中存在，这种17-25长度的非编码RNA通过与3'UTR的结合在基因组材料的转录后调控中起关键作用。在过去的几十年中，许多miRNA被发现参与肿瘤发生，影响细胞增殖，分化或凋亡的过程。因此，这些miRNA可通过调节癌细胞生物途径在癌症发生中起抑癌基因或抑制因子的作用，前列腺癌也包括在其中。徐等人发现FLOT1在pRCC中与正常组织相比过表达，其表达可被miR-182-5p抑制；肖等人证明了miR-223-3p可通过下调SLC4A4的表达来促进ccRCC的增殖和转移；朱等人报道miR-363可通过特异性结合GHR下调其表达，从而进一步影响血管生成过程，并通过JAK2-STAT3轴影响RCC侵袭性；虽然已揭示miRNA在RCC或pRCC中的功能作用，但仍缺乏足够的证据表明miRNA可作为pRCC患者预后的预测标志物。
随着测序技术的迅速发展，越来越多的基于miRNA的预测信号正应用于预测肿瘤的预后。在此，建立了两个基于miRNA的预测特征系统，旨在分别预测pRCC患者的死亡或复发风险，这将有利于临床医生的临床决策过程。
发明内容
针对现有技术不足，本发明提供一种乳头状肾细胞癌患者预后复发检测标志工具及其风险评估模型的建立，采用两组miRNA以及基于两组miRNA建立的评估模型来准确有效的对乳头状肾细胞癌患进行预后的评估，提升临床的决策性，适宜推广使用。
为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：
一种乳头状肾细胞癌患者预后复发检测标志工具，所述检测标志工具为两组miRNA，其中第一组为总体生存率(OS)相关的miRNA，包括：miR-1293、miR-34a、miR-551b、miR-937、miR-299和miR-3199-2；第二组为无复发生存率(RFS)相关的miRNA，包括：miR-7156、miR-211和miR-301b。
预后复发风险评估模型的建立包括以下步骤：
(1)检验数据的选择：从癌症基因组图谱TCGA数据库收集所有miRNA表达谱及其相关的乳头状肾细胞癌(pRCC)临床信息，将这些患者随机分为两部分，即训练集和验证集；
(2)鉴定差异表达的miRNA：采用基因差异表达分析LIMMA来评估比较pRCC组织与正常组织的miRNA表达差异，首先进行单变量Kaplan-Meier(K-M)生存分析，检测每一miRNA是否与pRCC患者OS或RFS显著相关，再将相关的miRNA提取作为LASSO套袋变量选择的候选标记；
(3)MiRNA候选者筛选：对上述训练集中202个pRCC患者的1000个数据点进行重新采样后，生成1000个矩阵，随后对所有OS/RFS相关矩阵进行LASSO cox回归分析，并进行十折交叉验证，根据标准误差(SE)及其调整参数λ，获取β系数(β-co-ef)大于0的一系列miRNA，选取其中自展值超过500的miRNA，筛选出一组基于OS相关的miRNA，和另一组基于RFS相关的miRNA，用于构建pRCC患者的多miRNA的预后预测标志物；
(4)风险的评估：计算上述筛选出的miRNA计算训练集和验证集中pRCC患者的死亡或复发相关风险评分，两组风险的临界值设为0，其中<0表示低风险，>0表示高风险；
(5)确定结果准确性：采用时间依赖性K-M曲线和受试者工作特征(ROC)曲线来确定风险分类方案的准确性，其中ROC曲线下面积(AUC)越高，则模型具有的稳定性和可靠性越高；
(6)网络建设与功能注释：将miRNA的下游靶基因由在线网站miRanda,miRDB和Targetscan进行预测，通过使用Cytoscape软件将miRNA-靶基因网络可视化，并通过使用R包“clusterProfiler”进行基因本体论(GO)、Reactome、Hallmark和KEGG途径富集分析，且Q值﹤0.5。
优选的，所述步骤(1)中临床信息包括OS和RFS。
优选的，所述步骤(2)中LIMMA分析的截止倍数变化值±2。
优选的，所述步骤(4)中评分公式为(βmiRNA#1×miRNA#1表达水平)+(βmiRNA#2×miRNA#2表达水平)+(βmiRNA#3×miRNA#3表达水平)+…+(βmiRNA#n×miRNA#n表达水平)。
本发明提供一种乳头状肾细胞癌患者预后复发检测标志工具及其风险评估模型的建立，与现有技术相比优点在于：建立了两种新的基于miRNA的OS和RFS预测pRCC的信号，为评估pRCC患者预后提供可靠工具，并且通过对pRCC患者的死亡或复发风险的准确预测有利于临床医生的临床决策，提升治疗效果，同时这两个新的基于miRNA的预测特征可以很好地区分pRCC患者的预后，并且本发明建设的模型具有可靠性和普遍适用性，适宜推广使用。
附图说明：
图1：建立与OS和RFS预测相关的多种miRNA标志物图谱：A中红色代表正常组织，蓝色代表肿瘤组织，在横坐标PC1上，红蓝点均分布在-0.06～-0.05之间，在纵坐标PC2上，蓝点分布在-0.1～0.075之间，红点分布在0.075～0.15之间；B中红色代表上调，蓝色代表下调，横坐标为log2差异倍数，纵坐标为log10差异的显著性(P-value)，pRCC组织和正常对照间不同表达miRNA的火山图，筛出92个上调的miRNA(倍数变化>2，P<0.05)，其中最高表达的miRNA是miR-599，肿瘤组织中较正常组织上调4.41倍，筛出101个下调的miRNA(倍数变化<-2，P<0.05)，miR-184在肿瘤组织中较正常组织下调约5.35倍；C中纵坐标为频率，直方图从左到右分别代表前22个OS相关miRNA的1000次重采样分布结果：hsa-mir-1293、miR-hsa-mir-34a、hsa-mir-551b、hsa-mir-937、hsa-mir-299、hsa-mir-3199-2、hsa-mir-320c-1、hsa-mir-320b-2、hsa-mir-4786、hsa-mir-495、hsa-mir-222、hsa-mir-382、hsa-mir-539、hsa-mir-224、hsa-mir-487b、hsa-mir-320b-1、hsa-mir-375、hsa-mir-370、hsa-mir-379、hsa-mir-381、hsa-mir-758、hsa-mir-134；D中OS相关miRNA标志物比例风险回归模型的森林图，显示了95％CI的危险比和协变量的相关P值，表格由上到下分别为hsa-mir-1293(HR＝1.64，95％CI＝1.10-2.46，P＝0.016*)，hsa-mir-34a(HR＝0.55，95％CI＝0.39-0.78，P＜0.001***)，hsa-mir-551b(HR＝0.69，95％CI＝0.52-0.91，P＝0.01**)，hsa-mir-937(HR＝2.75，95％CI＝1.46-5.19，P＝0.002**)，hsa-mir-299(HR＝3.30，95％CI＝1.78-6.12，P＝＜0.001***)，hsa-mir-3199-2(HR＝2.22，95％CI＝0.88-5.59，P＝0.089)；E中纵坐标为频率，直方图从左到右分别代表前13个RFS相关miRNA的1000次重采样分布结果：hsa-mir-7156、hsa-mir-211、hsa-mir-301b、hsa-mir-394、hsa-let-7e、hsa-mir-34a、hsa-mir-497、hsa-mir-4791、hsa-mir-4786、hsa-mir-429、hsa-mir-758、hsa-mir-1229、hsa-mir-4777；F中RFS相关miRNA标志物比例风险回归模型的森林图，显示了95％CI的危险比和协变量的相关P值，表格由上到下分别为hsa-mir-7156(HR＝0.37，95％CI＝0.13-1.0，P＝0.055)，hsa-mir-211(HR＝0.63，95％CI＝0.38-1.1，P＝0.078)，hsa-mir-301b(HR＝1.56，95％CI＝0.94-2.6，P＝0.087)；
图2：训练集中pRCC患者OS-(A)RFS-(B)相关miRNA的Kaplan-Meier生存分析结果图；仅显示P<0.05的基因，其中红色代表高表达，蓝色代表低表达，横坐标为天数，纵坐标为生存概率，(A)K-M生存分析图依次代表hsa-mir-1293、hsa-mir-222、hsa-mir-299、hsa-mir-320b-1、hsa-mir-134、hsa-mir-224、hsa-mir-3199-2、hsa-mir-320b-2、hsa-mir-320c-1、hsa-mir-370、hsa-mir-379、hsa-mir-382、miR-hsa-mir-34a、hsa-mir-375、hsa-mir-381、hsa-mir-4786、hsa-mir-487b、hsa-mir-539、hsa-mir-758、hsa-mir-495、hsa-mir-551b、hsa-mir-937，其中mir-1293高表达生存概率波动范围1.0-0.5；低表达生存概率波动范围1.0-0.75；mir-34a高表达生存概率波动范围1.0-0.75，低表达生存概率波动范围1.0-0.5；mir-551b高表达生存概率波动范围1.0-0.85，低表达生存概率波动范围1.0-0.25；mir-937高表达生存概率波动范围1.0-0.5，低表达生存概率波动范围1.0-0.75；mir-299高表达生存概率波动范围1.0-0.4，低表达生存概率波动范围1.0-0.75；mir-3199-2高表达生存概率波动范围1.0-0.5，低表达生存概率波动范围1.0-0.75；(B)K-M生存分析图依次代表hsa-let-7e、hsa-mir-211、hsa-mir-34a、hsa-mir-429、hsa-mir-1229、hsa-mir-301b、hsa-mir-3941、hsa-mir-4777、hsa-mir-4786、hsa-mir-497、hsa-mir-758、hsa-mir-4791、hsa-mir-7156；其中mir-7156高表达生存概率维持在1.0水平，低表达生存概率波动范围1.0-0.0；mir-211高表达生存概率波动范围1.0-0.5，低表达生存概率波动范围1.0-0.5；mir-301b高表达生存概率波动范围1.0-0.75，低表达生存概率波动范围1.0-0.35；
图3：PRCC患者中miRNA预测标志物的表现图；其中A、B、C、D红色代表高风险，蓝色代表低风险，横坐标为天数，纵坐标为生存概率；(A)3条低风险成阶梯状下降，生存概率分别降至0.95，0.8，0.7，2条高风险成阶梯状下降，生存概率分别降至0.25,0.1，1条高风险先降至0.7后升至0.9；(B)2条低风险成阶梯状下降，生存概率分别降至0.75，0.5，1条低风险生存概率维持在1.0水平，2条高风险成阶梯状下降，生存概率分别降至0.2，0，1条高风险先降至0.9后升至0.95，训练集(A)和验证集(B)OS预测相关miRNA标志物低风险组和高风险组的Kaplan-Meier曲线，低风险组较高风险组患者总体生存期显著延长；(C)2条低风险成阶梯状下降，生存概率分别降至0.5，0.15，1条低风险生存概率维持在1.0水平，2条高风险成阶梯状下降，生存概率分别降至0.25，0.1，1条高风险先降至0.9后升至1.0；(D)3条低风险生存概率维持在1.0水平，2条高风险成阶梯状下降，生存概率分别降至0.25，0.1，1条高风险先降至0.95后升至1.0，训练集(C)和验证集(D)RFS预测相关miRNA标志物低风险组和高风险组的Kaplan-Meier曲线，高风险组较低风险组患者无复发生存期缩短；E、F、G、H横坐标为假阴性率，纵坐标为真阴性率，训练集(E)和验证集(F)OS预测相关miRNA标志物低风险组和高风险组的时间依赖性ROC曲线和AUC值，训练集AUC值为0.881(95％CI:0.772-0.990)，而验证集AUC值为0.929(95％CI:0.834-1.000)，训练集(G)和验证集(H)RFS预测相关miRNA标志物低风险组和高风险组的时间依赖性ROC曲线和AUC值，训练集AUC为730(95％CI:0.575-0.886)，而验证集(AUC＝0.737，95％CI:0.576-0.897)；
图4：miRNA-mRNA调节网络的预测图：(A)列出了OS相关miR-1293、miR-34a、miR-551b、miR-937、miR-299和miR-3199-2的靶基因；(B)列出了RFS相关miR-7156、miR-211和miR-301b的靶基因；
图5、图6：功能富集分析描述miRNA预测相关基因的生物学通路图；其中(A)(B)P＜0.0025红色；P:0.0025-0.0050浅红；P：0.0050-0.0075紫色；P＞0.0075蓝色；(C)P＝0.0437、(D)P＝0.0041、(E)P＝0.0021；(F)P＜0.002红色；P:0.002-0.004紫色；P＞0.004蓝色，OS预测相关的miRNA靶基因的富集分析：(A)GO-BP富集于囊泡介导的运输，信号释放和化学突触传递的调节通路，(B)GO-CC(细胞成分)富集于突触后，突触前，突触膜和囊泡运输通路，(C)Hallmark富集于pRCC OS的调节蛋白分泌通路，RFS预测相关的miRNA靶基因的富集分析：(D)GO-BP富集于神经轴突相关通路，(E)Hallmark富集于UV反应通路，(F)Go-MF(分子功能)富集于数种RNA酶的转录因子活性通路
图7：根据OS(A)和RFS(B)预测标志物对不同临床病理学亚组进行分层分析图；横坐标为天数，纵坐标为生存概率，红色代表高风险，蓝色代表低风险；
图8：结合miRNA标志物与临床特征的多变量分析图：(A)OS预测相关miRNA标志物和临床特征的比例风险回归模型森林图，显示了95％CI的危险比和协变量的相关P值，表格由上到下分别为性别：女性作为参考，男性(HR＝0.54，95％CI＝0.21-1.4，P＝0.202)；年龄：＜60作为参考，＞60(HR＝1.25，95％CI＝0.51-3.1，P＝0.624)；阶段：I+II期作为参考，III+IV期(HR＝5.47，95％CI＝1.89-15.8，P＝0.002***)；初始治疗后无新肿瘤发生作为参考，有新肿瘤发生(HR＝1.23，95％CI＝0.42-3.6，P＝0.703)；分类：低风险作为参考，高风险(HR＝5.92，95％CI＝1.68-20.9，P＝0.006**)，III+IV期，OS标志物是可能增加死亡风险的独立因素，(B)OS预测相关miRNA标志物和临床特征的ROC曲线，ROC曲线显示列线图(AUC＝0.875，95％CI：0.727-1.000)和miRNA标志物(AUC＝0.870，95％CI：0.723-1.000)都是预测pRCC患者预后状态的良好工具，(C)RFS预测相关miRNA标志物和临床特征的比例风险回归模型森林图，显示了95％CI的危险比和协变量的相关P值，表格由上到下分别为性别：女性作为参考，男性(HR＝0.36，95％CI＝0.14-0.9，P＝0.028*)；年龄：＜60作为参考，＞60(HR＝1.51，95％CI＝0.61-3.7，P＝0.369)；阶段：I+II期作为参考，III+IV期(HR＝4.42，95％CI＝1.78-11.0，P＝0.001**)；分类：低风险作为参考，高风险(HR＝18.56，95％CI＝2.34-147.2，P＝0.006**)，III+IV期，RFS标志物是可能增加死亡风险的独立因素，而在男性中则作为保护因素，(D)RFS预测相关miRNA标志物和临床特征的ROC曲线，ROC曲线显示列线图(AUC＝0.811，95％CI：0.684-0.938)，miRNA标志物(AUC＝0.746，95％CI：0.626-0.866)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种乳头状肾细胞癌患者预后复发风险评估模型的建立包括以下步骤：
(1)检验数据的选择：从TCGA数据库收集所有miRNA表达谱及其相关的pRCC临床信息，其中临床信息包括OS和RFS，将这些患者随机分为两部分，即训练和验证组，其中202名患者被分配到训练组，而其余86名患者被分配到内部验证队列；
(2)鉴定差异表达的miRNA：采用LIMMA分析来评估比较pRCC组织与正常组织的miRNA表达差异，首先进行单变量Kaplan-Meier(K-M)生存分析，检测每一miRNA是否与pRCC患者OS或RFS显著相关，再将相关的miRNA提取作为LASSO套袋变量选择的候选标记；
(3)MiRNA候选者筛选：对上述训练集中202个pRCC患者的1000个数据点进行重新采样后，生成1000个矩阵，随后对所有OS/RFS相关矩阵进行LASSO cox回归分析，并进行十折交叉验证，根据标准误差(SE)及其调整参数λ，获取β系数(β-co-ef)大于0的一系列miRNA，选取其中自展值超过500的miRNA，筛选出一组基于OS相关的miRNA，和另一组基于RFS相关的miRNA，用于构建pRCC患者的多miRNA的预后预测标志物；
(4)风险的评估：计算上述筛选出的miRNA计算训练集和验证集中pRCC患者的死亡或复发相关风险评分，两组风险的临界值设为0，其中<0表示低风险，>0表示高风险；
(5)确定结果准确性：采用时间依赖性K-M曲线和受试者工作特征(ROC)曲线来确定风险分类方案的准确性，其中ROC曲线下面积(AUC)越高，则模型具有的稳定性和可靠性越高；
(6)网络建设与功能注释：将miRNA的下游靶基因由在线网站miRanda,miRDB和Targetscan进行预测，通过使用Cytoscape软件将miRNA-靶基因网络可视化，并通过使用R包“clusterProfiler”进行基因本体论(GO)、Reactome、Hallmark和KEGG途径富集分析，且Q值﹤0.5。
实施例2：
基于上述实施例1对pRCC和正常组织DEmiRs识别：
首先，主成分分析(PCA)显示肿瘤组织与正常组织转录组不同(图1A)。随后，通过LIMMA分析，从TCGA数据库的训练集列中获取差异基因分析(DEG)。筛出共92个上调的miRNA(倍数变化>2，P<0.05)(图1B)，其中最高表达的miRNA是miR-599，肿瘤组织中较正常组上调4.41倍；同样地，筛出另外101个下调的miRNA(倍数变化<-2，P<0.05)(图1B)，miR-184在肿瘤组织中较正常组织下调约5.35倍。
实施例2：
建立乳头状肾细胞癌OS和RFS预测相关的miRNA标志物：
基于上述实施例1，通过单变量cox计算在pRCC患者训练集中筛出OS和RFS相关的miRNA，发现22种OS相关的miRNA(图2A)，并发现13种RFS相关的miRNA(图2B)。然后，从训练集(每个OS相关miRNA对应一个RMIP)获得1000个重新取样的pRCC矩阵，列举从频率最高的到频率最低的miRNA(图1C和表1)。通过LASSO cox回归分析，获得六个miRNA标志物，用于预测pRCC患者的总体生存率，包括miR-1293(HR＝1.64，95％CI:1.10-2.46，P＝0.016，co-ef＝0.50)，miR-34a(HR＝0.55，95％CI:0.39-0.78，P<0.001，co-ef＝-0.59)，miR-551b(HR＝0.69，95％CI:0.52-0.91，P＝0.01，co-ef＝-0.37)，miR-937(HR＝2.75，95％CI:1.46-5.19，P＝0.002，co-ef＝1.01)，miR-299(HR＝3.30，95％CI:1.78-6.12，P<0.001，co-ef＝1.20)和miR-3199-2(HR＝2.22，95％CI:0.88-5.59，P＝0.089，co-ef＝0.80)。pRCC患者的OS风险评分公式为：0.50×miR-1293-0.59×miR-34a-0.37×miR-551b+1.01×miR-937+1.20×miR-299+0.80×miR-3199-2(图1D，表2)。
每个RFS相关miRNA也对应一个RMIP，从频繁最高到频率最低的依次列出(图1E和表3)。通过LASSO cox回归分析构建另一个RFS相关的miRNA预测标志物，结果显示miR-7156(HR＝0.37，95％CI:0.13-1.00，P＝0.055，co-ef＝-1.00)，miR-211(HR＝0.63，95％CI:0.38-1.10，P＝0.078，co-ef＝-0.46)andmiR-301b(HR＝1.56，95％CI:0.94-2.6，P＝0.087，co-ef＝0.45)作为RFS预测因子。RFS风险预测公式为：0.45×miR-301b-1.00×miR-7156-0.46×miR-211(图1F，表4)。
表1：通过LASSO Cox回归分析测量22种OS相关miRNA的重采样模型包含比例(RMIP)
表2：对训练集数据进行Cox回归分析确定6种OS相关miRNA的系数
表3：通过LASSO Cox回归分析测量13种RFS相关miRNA的重采样模型包含比例(RMIP)
表S6：对训练集数据进行Cox回归分析确定3种RFS相关miRNA的系数
实施例3：
OS和RFS分析：
基于上述实施例1，通过K-M曲线评估miRNA预测标志物是否可以区分低风险和高风险组中OS或RFS的差异；如图3所示，根据OS预测相关的miRNA公式，将训练集和验证集中pRCC患者分为低风险组或高风险组，训练集中低风险组较高风险组患者总体生存期显著延长，(P<0.001)(图3A)，在验证集中也显示相似的结果(P＝0.002)(图3B)。根据RFS预测相关的miRNA公式，训练集中高风险组较低风险组患者无复发生存率缩短，(P＝0.00091)(图3C)，在验证集中也显示相似的结果(P＝0.0063)(图3D)。
实施例4：
ROC曲线分析
为了评估miRNA预测标志物的辨别力和准确性，本研究对训练集和验证集的ROC曲线和AUC进行比较。如图3E所示，训练集中OS预测相关的miRNA标志物AUC值为0.881(95％CI:0.772-0.990)，而验证集AUC值为0.929(95％CI:0.834-1.000)(图3F)。
通过ROC曲线评估RFS相关的miRNA预测公式的可行性。训练集预测无复发生存率的AUC为730(95％CI:0.575-0.886)(图3G)，而验证集显示相似的结果(AUC＝0.737,95％CI:0.576-0.897)(图3H)；ROC曲线的结果表明，这些新的miRNA预测标志物可以很好地区分pRCC患者预后。
实施例5：
OS和RFS相关miRNA的网络构建和功能注释
Targetscan是一个在线计算机程序，用于延伸出所选miRNA的下游基因，用于所涉及生物途径的进一步分析；如图4A所示，列出了OS相关miR-1293，miR-34a，miR-551b，miR-937，miR-299和miR-3199-2的靶基因，如图4B所示，列出了RFS相关miR-7156，miR-211 andmiR-301b的靶基因。
随后，进行通路富集分析，探索参与癌变或肿瘤复发过程的潜在信号通路。对于OS预测相关的miRNA靶基因，GO-BP(生物过程)-富集于囊泡介导的运输，信号释放和化学突触传递的调节通路(图5A)。GO-CC(细胞成分)-富集于突触后，突触前，突触膜和囊泡运输通路(图5B)，而Hallmark-富集于pRCC OS的调节蛋白分泌通路(图6C)。对于RFS预测相关的miRNA靶基因，GO-BP-富集于神经轴突相关通路(图6D)，Go-MF(分子功能)-富集于数种RNA酶的转录因子活性通路(图6F)。此外，Hallmark分析表明，RFS预测相关miRNA的靶基因大多与UV反应通路相关(图6E)。结果表明，参与相关通路的靶基因可能与pRCC发生，发展和耐药性产生相关。
实施例6：
亚群分析：
评估单一和多个miRNA标志物应用于临床预后的价值，首先将OS和RFS标志物应用于临床因素的不同亚组，OS预测相关miR-1293，miR-34a，miR-551b，miR-937，miR-299和miR-3199-2标志物可以精确地预测低风险和高风险组的总体生存率，其在男性患者(P<0.0001)，女性患者(P＝0.018)，小于60岁(P＝0.00026)，大于60岁(P<0.0001)，I+II期患者(P＝0.014)，III期+IV患者(P＝0.0077)，无新肿瘤事件(P＝0.0077)和有新肿瘤事件(P＝0.0019)(图7A)。多个因子风险比的列线图分析发现III+IV期(HR＝5.47，95％CI：1.89-15.8，P<0.001)，OS标志物(HR＝5.92，95％CI：1.68-20.9，P<0.001)是可能增加死亡风险的独立因素(图8A)。ROC曲线显示列线图(AUC＝0.875，95％CI：0.727-1.000)和miRNA标志物(AUC＝0.870，95％CI：0.723-1.000)都是预测pRCC患者预后状态的良好工具(图8B)。
RFS预测相关的miR-7156，miR-211和miR-301b标志物可以精确预测低风险组和高风险组的无复发生存率，其在男性患者(P＝0.00028)，小于60岁(P＝0.019)，大于60岁(P＝0.002)，I+II期患者(P＝0.0032)和III+IV期患者(P＝0.036)(图7B)。多个因子风险比的列线图分析发现III+IV期(HR＝4.42，95％CI：1.78-11.0，P＝0.001)，RFS标志物(HR＝18.56，95％CI：2.34-147.20，P＝0.006)是可能增加死亡风险的独立因素，而在男性中则作为保护因素(HR＝0.36，95％CI：0.14-0.90，P＝0.028)(图8C)。ROC曲线显示列线图(AUC＝0.811，95％CI：0.684-0.938)，miRNA标志物(AUC＝0.746，95％CI：0.626-0.866)都是预测pRCC患者复发状态的良好工具(图8D)。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (5)

1.一种乳头状肾细胞癌患者预后复发检测标志工具，其特征在于，所述检测标志工具为两组miRNA，其中第一组为总体生存率相关的miRNA，包括：miR-1293、miR-34a、miR-551b、miR-937、miR-299和miR-3199-2；第二组为无复发生存率相关的miRNA，包括：miR-7156、miR-211和miR-301b。
2.一种乳头状肾细胞癌患者预后复发风险评估模型的建立，其特征在于，预后复发风险评估模型的建立包括以下步骤：
(1)检验数据的选择：从癌症基因组图谱TCGA数据库收集所有miRNA表达谱及其相关的乳头状肾细胞癌临床信息，将这些患者随机分为两部分，即训练集和验证集；
(2)鉴定差异表达的miRNA：采用基因差异表达分析LIMMA来评估比较乳头状肾细胞癌组织与正常组织的miRNA表达差异，首先进行单变量Kaplan-Meier生存分析，检测每一miRNA是否与乳头状肾细胞癌患者总体生存率或无复发生存率显著相关，再将相关的miRNA提取作为LASSO套袋变量选择的候选标记；
(3)miRNA候选者筛选：对上述训练集中202个乳头状肾细胞癌患者的1000个数据点进行重新采样后，生成1000个矩阵，随后对所有总体生存率/无复发生存率相关矩阵进行LASSO cox回归分析，并进行十折交叉验证，据标准误差及其调整参数λ，获取β系数大于0的一系列miRNA，选取其中自展值超过500的miRNA，筛选出一组基于总体生存率相关的miRNA，和另一组基于无复发生存率相关的miRNA，用于构建乳头状肾细胞癌患者的多miRNA的预后预测标志物；
(4)风险的评估：计算上述筛选出的miRNA计算训练集和验证集中乳头状肾细胞癌患者的死亡或复发相关风险评分，两组风险的临界值设为0，其中<0表示低风险，>0表示高风险；
(5)确定结果准确性：采用时间依赖性Kaplan-Meier曲线和受试者工作特征曲线来确定风险分类方案的准确性，其中受试者工作特征曲线下面积越大，则模型稳定性和可靠性更高；
(6)网络建设与功能注释：将miRNA的下游靶基因由在线网站miRanda，miRDB和Targetscan进行预测，通过使用Cytoscape软件将miRNA-靶基因网络可视化，并通过使用R包“clusterProfiler”进行基因本体论、Reactome、Hallmark和KEGG途径富集分析，且Q值﹤0.5。
3.根据权利要求2所述的一种乳头状肾细胞癌患者预后复发风险评估模型的建立，其特征在于：所述步骤(1)中临床信息包括总体生存率OS和无复发生存率RFS。
4.根据权利要求2所述的一种乳头状肾细胞癌患者预后复发风险评估模型的建立，其特征在于：所述步骤(2)中LIMMA分析的截止倍数变化值±2。
5.根据权利要求2所述的一种乳头状肾细胞癌患者预后复发风险评估模型的建立，其特征在于：所述步骤(4)中评分公式为(βmiRNA#1×miRNA#1表达水平)+(βmiRNA#2×miRNA#2表达水平)+(βmiRNA#3×miRNA#3表达水平)+…+(βmiRNA#n×miRNA#n表达水平)。
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