CN108277283A

CN108277283A - lncRNA组合在制备预测肾透明细胞癌预后及分子靶向药物治疗敏感性的产品中的应用

Info

Publication number: CN108277283A
Application number: CN201810234078.8A
Authority: CN
Inventors: 曲乐; 陈程; 王林辉; 周文泉; 何昊玮
Original assignee: Nanjing General Hospital of Nanjing Command PLA
Current assignee: Nanjing General Hospital of Nanjing Command PLA
Priority date: 2018-03-21
Filing date: 2018-03-21
Publication date: 2018-07-13
Anticipated expiration: 2038-03-21
Also published as: CN108277283B

Abstract

本发明公开了lncRNA组合在制备预测肾透明细胞癌预后及分子靶向药物治疗敏感性的产品中的应用。lncRNA或lncRNA组合作为检测靶点在制备预测肾透明细胞癌预后及分子靶向药物治疗敏感性的产品中的应用，所述的lncRNA或lncRNA组合选自SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.4中的任意一种或多种。本发明为肾透明细胞癌患者预后评估提供了新的临床手段，也为肾透明细胞癌术后辅助治疗提供了新的参考建议，对及时采取有效临床措施、制定个体化的诊治方案，最终提高肾透明细胞癌患者生存率，具有重要的临床意义和推广应用前景。

Description

lncRNA组合在制备预测肾透明细胞癌预后及分子靶向药物治疗敏感性的产品中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学和医学领域，具体涉及lncRNA组合在制备预测肾透明细胞癌预后及分子靶向药物治疗敏感性的产品中的应用。

背景技术

肾透明细胞癌是一种高度异质性的肿瘤，即使临床分期相同的患者，预后也存在显著差异。早期肾癌患者根治术后，20-30％的病人最终会出现复发转移；进展期肾透明细胞癌患者5年生存率不到30％，而且对目前一线的分子靶向治疗的疗效尚不明确。如果能够对早期肾透明细胞癌患者进行准确、有效地预后评估，将可以辅助临床实践选择、指导患者复查周期，实现对肿瘤进展早发现、早治疗。如果能够筛选出对术后辅助靶向药物治疗具有敏感性的进展期肾透明细胞癌患者，将可以有效提高分子靶向治疗的疗效和减少患者的痛苦和费用，实现对肿瘤进展的个体化治疗。因此，筛选鉴定新的、有效的肾透明细胞癌预后分子标志物模型，具有重要的临床意义。

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，其表达具有明显的组织和细胞特异性，作用方式多样，可以从表观遗传、转录、翻译等多个水平对基因表达进行调控。lncRNA能够广泛地参与细胞分化、个体发育等生命过程，其异常表达与包括肿瘤在内的多种人类重大疾病密切相关。lncRNA是近年来肿瘤研究的热点，其具有高度的器官特异性，因此lncRNAs有望成为肾透明细胞癌患者预后判定的生物学标志物，为肿瘤标志物研究开辟了一个全新的突破口，为肾透明细胞癌预后评估提供新方向。lncRNA作为肾透明细胞癌预后标志物的价值至今尚未见国际大样本多中心研究报道。

肿瘤组织学标志物的筛选鉴定和在疾病诊断、预后判定、疗效评估中的应用一直是医学领域的研究热点。非编码RNA作为肿瘤组织学标志物的研究取得了很大进展，例如已有多种microRNA被发现可以用于疾病的诊断、预后及疗效评估。但是，lncRNA在肿瘤组织学标志物中的应用研究还非常少。lncRNA预后风险评分模型作为肾透明细胞癌肿瘤组织学预后标志物的价值至今尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种lncRNA或lncRNA组合作为检测靶点在制备预测肾透明细胞癌预后及分子靶向药物治疗敏感性的产品中的应用。

本发明的另一目的是提供检测lncRNA或lncRNA组合的表达量的特异性引物或特异性探针核苷酸在制备预测肾透明细胞癌预后及分子靶向药物治疗敏感性的产品中的应用。

本发明的又一目的是提供一种预测肾透明细胞癌预后及分子靶向药物治疗敏感性的产品。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

lncRNA或lncRNA组合作为检测靶点在制备预测肾透明细胞癌预后及分子靶向药物治疗敏感性的产品中的应用，所述的lncRNA或lncRNA组合选自以下4种lncRNA中的任意1-4种：ENSG00000255774、ENSG00000248323、ENSG00000260911、ENSG00000231666；其对应的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示。

作为所述应用的一种优选，所述的lncRNA组合优选由SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示的四种lncRNA组成。

作为所述应用的一种优选，所述的lncRNA或lncRNA组合的ncRNA或lncRNA组合作为检测靶点在制备采用实时定量PCR、试剂、试剂盒或芯片预测肾透明细胞癌预后及分子靶向药物治疗敏感性的产品中的应用。

检测本发明所述的lncRNA或lncRNA组合的表达量的特异性引物或特异性探针核苷酸在制备预测肾透明细胞癌预后及分子靶向药物治疗敏感性的产品中的应用。

所述的lncRNA组合优选由SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示的四种lncRNA组成。

所述的产品优选自实时定量PCR试剂、原位杂交、芯片或试剂盒；其中，所述芯片包括基因芯片，所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测lncRNA表达水平的针对SEQ ID No.1-4中一个或多个lncRNA的寡核苷酸探针；所述试剂盒包括基因检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测SEQ IDNo.1-4中一个或多个lncRNA表达水平的引物。

一种预测肾透明细胞癌预后及分子靶向药物治疗敏感性的产品，包含检测本发明所述的lncRNA或lncRNA组合的表达量的实时定量PCR试剂、原位杂交、芯片或试剂盒。

所述的产品，优选包括针对SEQ ID No.1-4中一对或多对lncRNA的特异性PCR引物；或者含有针对SEQ ID No.1-4中一个或多个lncRNA特异性探针核苷酸。

所述的产品，优选还包括产品使用说明书，说明书中记载对肾透明细胞癌患者的样本经过组织RNA抽提并质检后，利用检测SEQIDNo.1-4所示lncRNA的表达量，并利用β-actin作为内部参照进行校正；依据表达水平对每个lncRNA进行赋值后带入以下公式内，计算每位患者的RCClnc4 score值；然后与确定的cut-off值比较，小于该值的患者属于低危组，大于该值的患者属于高危组；

RCClnc4 score＝(-0.034×ENSG00000255774表达量)+(0.183×ENSG00000248323表达量)+(0.269×ENSG00000260911表达量)+(-1.772×ENSG00000231666表达量)。

所述的确定的cut-off值为RCClnc4 score值的中位数。

所述采用实时定量PCR预测肾透明细胞癌预后及靶向药物治疗敏感性的产品含有针对SEQ ID No.1-4中一对或多对lncRNA特异性引物；

所述预测肾透明细胞癌预后及靶向治疗敏感性的试剂含有针对SEQ ID No.1-4中一个或多个lncRNA特异性探针核苷酸；

所述预测肾透明细胞癌预后及靶向治疗敏感性的试剂盒含有针对SEQ ID No.1-4中一个或多个lncRNA特异性探针核苷酸；

所述预测肾透明细胞癌预后及靶向治疗敏感性的芯片含有针对SEQ ID No.1-4中一个或多个lncRNA特异性探针核苷酸；

所述产品通过检测SEQ ID No.1-4中一个或多个lncRNA表达水平来预测肾透明细胞癌的预后结果。所述产品通过检测标本中SEQ ID No.1-4中一个或多个lncRNA表达水平来预测肾透明细胞癌术后辅助靶向治疗的敏感性。

一种用于预测肾透明细胞癌预后及辅助靶向治疗敏感性的lncRNA预后风险评分模型，包括：对肾透明细胞癌患者的样本经过组织RNA抽提并质检后，利用检测SEQIDNo.1-4所示lncRNA的表达量，并利用β-actin作为内部参照进行校正；依据表达水平对每个lncRNA进行赋值后带入以下公式内，计算每位患者的RCClnc4 score值；然后与确定的cut-off值比较，小于该值的患者属于低危组，大于该值的患者属于高危组；

所述的用于预测肾透明细胞癌预后及辅助靶向治疗敏感性的lncRNA预后风险评分模型，优选利用实时定量PCR检测SEQIDNo.1-4所示lncRNA的表达量；所述的确定的cut-off值为RCClnc4score值的中位数。

本发明提供了一种建立肾透明细胞癌患者预后预测模型的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将患者分为训练组、内部验证组和外部验证组，从训练组受试者采集的标本中测定差异表达lncRNA；

(2)根据所述差异表达lncRNA，确定具有统计显著性的设定值范围；

(3)单因素变量Cox回归分析每个差异表达lncRNA对生存期的贡献，建立风险评分模型；

(4)使用内部验证组和外部验证组对风险评分模型进行验证，评价个体肾透明细胞癌预后的信息时，把患者的lncRNA的表达水平代入公式中，得出风险评分，然后与确定的cut-off值比较，小于该值的患者属于低危组，大于该值的患者属于高危组。验证所建模型的预测准确度。

本发明还提供了所述的lncRNA预后风险评分模型RCClnc4 score构建与鉴定方法:

(1)采用转录组测序数据检测肾透明细胞癌和正常肾脏组织，获得癌与癌旁组织差异表达的lncRNA；将TCGA的444例I-III期肾透明细胞癌患者随机分为训练组(n＝222)和内部验证组(n＝222)，并利用LASSO(the least absolute shrinkage and selectionoperator method)Cox回归模型从训练组中筛选出四条参与组成肾透明细胞癌预后模型的关键变量lncRNA：ENSG00000255774、ENSG00000248323、ENSG00000260911、ENSG00000231666。(如SEQIDNo.1-4所示)；

(2)计算上述4个lncRNA的表达权重，通过COX比例风险回归模型，计算每个患者RCClnc4score的风险指数，根据计算得出的RCClnc4 score值，将患者划分为高危和低危，判断患者复发风险大小，通过COX多因素比例风险回归模型及Time-dependent ROC曲线对所构建lncRNA模型的预测效能进行评价；

(3)将上述所得的lncRNA模型，在肾透明细胞癌患者中进行验证：获取独立的三组肾透明细胞癌患者队列的癌组织，经过组织RNA抽提并质检后，利用实时定量PCR检测如SEQIDNo.1-4所示lncRNA的表达量，并利用β-actin作为内部参照进行校正；依据表达水平对每个lncRNA进行赋值后带入依据单因素COX比例风险回归模型建立的模型公式内，计算每位患者的RCClnc4 score值；判断每位患者的复发风险，同时预测其对分子靶向药物治疗的敏感性；通过COX多因素比例风险回归模型及Time-dependent ROC曲线对lncRNA模型的预测效能进行评价。

具体而言，本发明所述的lncRNA预后风险评分模型RCClnc4构建与鉴定方法的步骤为:

(1)利用52对肾透明细胞癌和正常肾脏组织的转录组测序数据(from Americacohort from TCGA project(参见文献Cancer Genome Atlas ResearchNetwork.Comprehensive molecular characterization of clear cell renal cellcarcinoma[J].Nature,2013,499(7456):43))，筛选出51条差异表达的lncRNA，作为预测早期肾透明细胞癌(TNM I-III期)预后风险的候选lncRNA。我们将TCGA的444例I-III期肾透明细胞癌患者随机分为训练组(n＝222)和内部验证组(n＝222)，并利用LASSO(the leastabsolute shrinkage and selection operator method)Cox回归模型从训练组中筛选出四条参与组成肾透明细胞癌预后模型的关键变量lncRNA(如SEQ ID No.1-4所示)：ENSG00000255774、ENSG00000248323、ENSG00000260911、ENSG00000231666。根据四条lncRNA各自的预后单因素回归分析的系数，我们得到了计算肾透明细胞癌预后模型(RCClnc4)的计算公式：

RCClnc4 score＝(-0.034×ENSG00000255774表达量)+(0.183×ENSG00000248323表达量)+(0.269×ENSG00000260911表达量)+(-1.772×ENSG00000231666表达量).

(2)计算上述4个lncRNA的表达权重，计算每个患者RCClnc4 score的风险指数，根据计算得出的RCClnc4 score值，将训练组(n＝222)、内部验证组(n＝222)以及来自日本的外部验证组(EGAS00001000509，n＝88(参见文献Sato Y,Yoshizato T,Shiraishi Y,etal.Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma[J].Naturegenetics,2013,45(8):860-867))中患者分别划分为高危和低危，判断患者复发风险大小，通过COX多因素比例风险回归模型及Time-dependent ROC曲线以及分层亚组分析对所构建lncRNA预后风险评分模型的预测效能进行评价；

(3)将上述所得的lncRNA预后风险评分模型，在肾透明细胞癌患者中利用实时定量PCR进行验证：获取长期随访的、来自中国的三个独立肾透明细胞癌队列(来自长海医院的独立验证组1(n＝1299),来自长征医院的独立验证组2(n＝346),来自西南医院的独立验证组3(n＝224))的1869例肾透明细胞癌患者队列的癌组织，经过组织RNA抽提并质检后，利用实时定量PCR检测如SEQIDNo.1-4所示lncRNA的表达量，并利用β-actin作为内部参照进行校正；依据表达水平对每个lncRNA进行赋值后带入依据单因素COX比例风险回归模型建立的模型公式内，计算每位患者的RCClnc4 score值；判断每位患者的复发风险，同时预测其对分子靶向药物治疗的敏感性；通过COX多因素比例风险回归模型及Time-dependentROC曲线以及分层亚组分析对lncRNA预后风险评分模型的预测效能进行评价。

在本发明中，所述“样本”包括细胞、组织、脏器、体液(血液、尿液等)等。优选的，所述样本为组织、血液。在本发明的具体实施方式中，所述样本为组织。

在本发明中，术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

本发明中的示例性探针包括PCR引物或基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。

所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

在本发明中，“预后”或“靶向治疗反应性”用来预测肾透明细胞癌患者的进展(包括复发、转移性扩散及耐药性)的可能性。术语“预后”用来说明本发明的患者在经过主要肿瘤的切除术后无癌症复发下生存特定期间的可能性。这种预测是通过对任一特定患者选择最适宜的疗法而在临床上可用来确定治疗。这种预测可在患者对治疗养生，例如能否易于对手术做出积极反应，或患者在手术结束后能否长期存活的判断成为宝贵的工具。术语“预后良好”或“良好预后”可表示为临床结果的积极临床结果的可能性的提高，术语“不良预后”或“预后不良”可表示为临床结果的积极临床结果的可能性的降低。

有益效果：

本发明经过严格细致的研究，提供了一种能够在制备预测肾透明细胞癌预后及分子靶向药物治疗敏感性的产品中应用的lncRNA或lncRNA组合；以及检测该组合的引物或探针，并进一步提供了预测肾透明细胞癌预后及分子靶向药物治疗敏感性的产品，产品说明书中记载了本发明构建的一种预测肾透明细胞癌预后及靶向治疗敏感性的lncRNA预后风险评分模型RCClnc4 score，其在6个独立队列中均呈现出较好预后预测效能，而且RCClnc4score能够对不同分期的肾透明细胞癌患者进行精确的预后预测；同时该模型还可预测术后分子靶向治疗疗效；与其他已知与疗效相关的临床病理因素相比，所述模型为一个独立的预测因素。本发明所述产品能够为肿瘤患者治疗提供一定的建议，为医生治疗选择提供参考，进而减少不必要治疗，实现个体化治疗，提高患者术后生存率。临床治疗中，在肾透明细胞癌患者诊断明确后，即可通过对上述lncRNA的检测，快速判断患者术后预后及对于术后辅助分子靶向治疗的敏感性，并根据结果选择合适的治疗方案，实现个体化治疗。

附图说明

图1为52对肾透明细胞癌和正常肾脏组织中51条差异表达的lncRNA表达水平的非监督聚类分析。

图2为LASSO Cox回归模型筛选参与组成肾透明细胞癌预后模型的关键变量lncRNA。

图3为RCClnc4低危组和高危组患者总体生存率的Time-dependent ROC曲线图和Kaplan-Meier生存曲线图；A为美国队列(训练组)，B为美国队列(内部验证组)，C为日本队列(外部验证组)

图4为RCClnc4低危组和高危组患者总体生存率的Time-dependent ROC曲线图和Kaplan-Meier生存曲线图；A为长海队列(独立验证组1)，B为美国队列(独立验证组2)，C为日本队列(独立验证组3)

图5为RCClnc4低危组和高危组患者无病生存率的Time-dependent ROC曲线图和Kaplan-Meier生存曲线图；A为长海队列(独立验证组1)，B为美国队列(独立验证组2)，C为日本队列(独立验证组3)

图6为术后接受靶向治疗和未接受治疗患者无病生存率的Kaplan-Meier生存曲线图；A为总体人群，B为RCClnc4高危组

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照制造试剂盒生产公司所建议的条件或按照常规实验条件，例如Sambrook等人，分子克隆；实验室手册(NewYork；Gold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件。

实施例1：建立RCClnc4模型

在前期的研究中，本发明人首先利用52对肾透明细胞癌和正常肾脏组织的转录组测序数据(from America cohort from TCGA project(参见文献Cancer Genome AtlasResearch Network.Comprehensive molecular characterization of clear cell renalcell carcinoma[J].Nature,2013,499(7456):43))，筛选出51条差异表达的lncRNA，非监督聚类分析表明这些lncRNA可以成功地区分癌和正常组织(图1)，仅有1例肿瘤组织例外，因此我们将这51条lncRNA作为预测早期肾透明细胞癌(TNM I-III期)预后风险的候选lncRNA。我们将TCGA的444例I-III期肾透明细胞癌患者随机分为训练组(n＝222)和内部验证组(n＝222)，两组之间临床病理特征未见明显差异(p>0.05)。接下来，我们利用LASSO(the least absolute shrinkage and selection operator method)Cox回归模型筛选出四条参与组成肾透明细胞癌预后模型的关键变量lncRNA(图2)：ENSG00000255774,ENSG00000248323,ENSG00000260911,and ENSG00000231666。根据四条lncRNA分别的预后单因素回归分析的系数，我们得到了计算肾透明细胞癌预后模型(RCClnc4)的计算公式：

RCClnc4 score＝(-0.034×ENSG00000255774)+(0.183×ENSG00000248323)+(0.269×ENSG00000260911)+(-1.772×ENSG00000231666).

实施例2：RCClnc4模型的初步验证

随后，我们选取训练组中RCClnc4 score的中位数(–0.323)作为cutoff值，将训练组肾透明细胞癌患者分为低危组和高危组，两组之间临床病理特征未见明显差异(p>0.05)。训练组中发生死亡事件的患者大部分集中在RCClnc4高危组，Kaplan-Meier生存曲线表明训练组中RCClnc4高危组的肾透明细胞癌患者的总体生存率更低(p<0.00001,hazard ration[HR]＝2.313[1.887–2.834],图3A)。我们进一步将上述计算公式和固定的cutoff值应用于同样来自TCGA的内部验证组和来自日本的外部验证组(EGAS00001000509，n＝88)，结果表明，RCClnc4 score仍然可以将相应队列分成预后显著不同的高危和地位组(内部验证组:p＝0.004,HR＝2.511[1.345–4.686],外部验证组:p＝0.017,HR＝6.121[1.380–27.159]，图3B，图3C)。

我们在三个队列中分别进行多因素回归分析，结果显示RCClnc4 score可以作为肾透明细胞癌预后差的独立危险因素(训练组:p＝0.001,HR＝2.563[1.455-4.513]；内部验证组:p＝0.0043,HR＝2.507[1.333-4.714]；外部验证组:p＝0.0473,HR＝4.659[1.018-21.316])。

实施例3：RCClnc4模型的进一步验证

接下来，我们利用长期随访的、来自中国的三个独立队列(来自长海医院的独立验证组1(n＝1299),来自长征医院的独立验证组2(n＝346),来自西南医院的独立验证组3(n＝224))的1869例肾透明细胞癌患者，对RCClnc4 score作为肾透明细胞癌预后标志模型的效能进行了验证。

采集上述肾透明细胞癌患者的手术切除癌组织标本；利用Qiagen公司的RneasyPlusMiniKit，按照试剂盒说明，抽提RNA样本；抽提后的RNA，利用NanoDrop2000光谱仪定量检测提取的总RNA的浓度及质量。所提取的RNA样本冻存于-80℃的深低温冰箱中。将上述采集的RNA样本用Takara公司的PrimeScript^TM RT reagent Kit(Perfect RealTime),按照试剂盒操作说明规定的标准操作步骤，对所提取的RNA样本进行逆转录，获取cDNA。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。根据SEQIDNo.1-4的RNA序列及β-actin序列设计特异性引物，并使用Takara公司的SYBR Premix ExTaq(TliRNaseHPlus)试剂盒，按照试剂盒操作说明所规定的标准操作步骤，利用实时定量PCR技术检测如SEQIDNo.1-4所示的RNA在所获取的cDNA中的表达量；之后根据β-actin的表达量，采用-ΔCt的方法对所有RNA的表达情况进行校正(△CT＝CT lncRNA–CTβ-actin RNA)。并依据四条lncRNA分别的预后单因素回归分析的系数，我们重新得到了基于PCR平台的计算肾透明细胞癌预后模型(RCClnc4)的计算公式：

RCClnc4 score＝(-0.373×ENST00000542064)+(0.691×LUCAT1)+(1.316×ENST00000570266)+(-1.117×ENST00000414848).

将lncRNA表达量(-ΔCt)，带入上述模型内，得到RCClnc4 score。随后，我们选取独立验证组1中RCClnc4 score的中位数(-5.781)作为固定的cutoff值，将独立验证组1-3肾透明细胞癌患者分别分为低危组和高危组，两组之间临床病理特征未见明显差异(p>0.05)。Kaplan-Meier生存曲线表明三个外部验证组中RCClnc4高危组的肾透明细胞癌患者的总体生存率(OS)更低(独立验证组1:p<0.001,HR＝5.106[3.930-6.633]；独立验证组2:p<0.001,HR＝7.997[3.998-15.999]；独立验证组3:p<0.001,HR＝3.836[1.983-7.418]，图4)，而且也具有更低的无病生存率(DFS)(独立验证组1:p<0.001,HR＝4.077[3.288-5.057]；独立验证组2:p<0.001,HR＝5.058[3.079-8.308]；独立验证组3:p<0.001,HR＝3.263[1.861-5.720]，图5)。

我们在三个外部验证队列中分别进行多因素回归分析，结果显示RCClnc4 score可以作为肾透明细胞癌预后差的独立危险因素(OS:独立验证组1:p<0.0001,HR＝4.972[3.824-6.464]；独立验证组2:p<0.0001,HR＝7.631[3.812-15.279]；独立验证组3:p<0.0001,HR＝3.891[2.011-7.529]；DFS:独立验证组1:p<0.0001,HR＝3.997[3.220-4.960]；独立验证组2:p<0.0001,HR＝4.994[3.037-8.212]；独立验证组3:p<0.0001,HR＝3.501[1.989-6.163])。

实施例4：RCClnc4模型对于术后辅助靶向治疗敏感性的预测作用

我们的国内肾透明细胞癌队列中，III期肾透明细胞癌患者有323人，其中有98人接受肾透明细胞癌根治术后的辅助靶向治疗，但Kaplan-Meier生存曲线表明术后辅助靶向治疗并没能显著提高患者的无病生存期(HR 0.776,95％CI 0.563-1.069；p＝0.121；图6A)，但在经RCClnc4 score归类的高危患者中，表现出对术后辅助靶向治疗的较好的反应性，其能够显著提高患者的无病生存期(HR 0.583,95％CI 0.379-0.897；p＝0.014；图6B)，而且高低危组患者之间的临床病理特征无显著差异(p>0.05)。此结果表明RCClnc4 score能够筛选出对术后辅助靶向治疗敏感的高危患者。

以上实施例中使用的引物如下表

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 中国人民解放军南京军区南京总医院

<120> lncRNA组合在制备预测肾透明细胞癌预后及分子靶向药物治疗敏感性的产品中的应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 11

<211> 726

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 11

gcaagacagc cacaccttga actctgactc aaggaagaga gtgggcagct caccagagag 60

gccagaggag gcggcaggaa ggtggggtct ctccagccag gggcttcctg aaagagctgc 120

cttctgagca ggccccccag gctaggaaga tgtgcacctg ccgagctggg caggagaggg 180

tggcccagtg gaggacccag catgggcaga ggtttggagg tggcaggtcc tgagggaagc 240

ggaaggcagc caggttgtga cagcctgtga ggacctcttg gctcccggag ccttctctct 300

cctggaatag agatgacacc gtgctgccat tgaactcaac ccgaaaaaat gatctgttgc 360

aaagctcaca ggaaataatg gagcaatgtt acacgataaa ctgtaaagtg tggtgagcat 420

gtgaacaagc gtccaggacc cagcgaagcc ccaggctact gggctaggcg tcagatgaga 480

agaggcagag ggcaacctcc tgtaggatct gaggccttca tgtgctcagc ccatggctgt 540

cgtcacggtg acgtgtgcat gcgatgtatc tgggccatcc ttgttcttga acgcgggcag 600

tgagtcccac ggtgatgtgg catgtcacga gctgaaggag gggcacctgc attcaggctt 660

gcgaaccagc gagacagcct ttggaccttt cggagcctca ctttcccaca ctaagaattg 720

gagtgg 726

<210> 12

<211> 828

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 12

caatgcccag acctccagaa accatgtgtc aagctcggat tgccttagac aggtgcaatt 60

taagaacagc tttcatcctc ttttctctca tattgtcaca ctatgtgttc tgacttctgg 120

ctcctttcct cacaagaagc tcacccagct ggaactctta tgggaccttg gcaccagaga 180

ccacaaattc ctctttgaag ttttctaaca gcaacaatgg tatttctgac ttggctttct 240

tgtatttctc tcacgttaac aaaattggtt cagcatctac catgggctac atgctgagct 300

acagagtttc gctctgtcgc ccaggctgga gtgcagtggc gcgcgatctc ggttcactgc 360

aagctccacc tcccgggttc acgccattct cctgcctcag cctcctgagt agctgggact 420

acaggcgccc gccaccacac ccaggaatcc aacttgctgt ttgctatcac atgtgctata 480

catgctgttg atgaaactgc taaaggggct gaatgtgact gacgtctttg gaaggatgag 540

acttagcgtg cctgtacagt tgtgtccaaa tgctgtcctc atctcccaat gaaaaggaac 600

aaaacccatc agaagatgtc agaagataag gatttttgtc ctgatgctac acttaccagc 660

tgtccctcag tgttctactt cttaaaaaaa gagagatgga taaacagagg caacccgagg 720

ataaaggcct tgctcagtgt cacacatttc agtcactaaa taagacacaa tggatgccag 780

tattctcatc ccctcacaaa taaagagcct tcaagctctt gcagtcaa 828

<210> 13

<211> 449

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 13

ggtggcctga tggccaagtg gcctcggatg ccaggctcaa tcctttgaac ttttcctgtg 60

ggctgtcagg acccatagaa ggtctttgag cagctcatag gtctctgaat caagagaagc 120

cacatctgga cctgatatag aagagactat tagagatcct gggcttgagg ctgattccat 180

gtcagatggg tcacttaggt ggtctccctt gggaagggga tgcatttatt ttgcatatgg 240

aagaaaatgc aaaggcagta tttgtaagga agagggcaga cgggggaaga ttttataatt 300

gttcaaaaac attcactggg atgtgtgtgg tggctcacgc ctataatccc agtgctttgg 360

gagggtgaag caggaggatc acttgaggcc aggagtttga gaccagcatg ggcaacatag 420

tgagacccta tctctacaaa aaataaaac 449

<210> 14

<211> 834

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 14

cctttgccca gcacacctgt cactcacctc aaccctttct ctcttttccc catctttctg 60

tggctagctc ctcctcattc tttaggtctc agtgtagata gcaccactat caggaaggag 120

tccagacact gccaggccta agaaatgtaa attaaatgct ctcaagggat gagagacact 180

ggaagctggg acgctcttgg aactctgttg ccatcatcaa ggcttccaga tacagccctc 240

taggtcatcc agaggtgcca gccagccctc accagtggtc agcttttcct cagtggagtg 300

gtaggtgagc cagtggagct tgctctgaag atactagagg gagccaaagc tgtctggccc 360

ttcagtgtga ctcagtttcc agactctttc tctttagaca taaatgaaga acaagtcaac 420

cttgatgcct ttgagggttg gttcagcgga tgatgtgttg tggggttttc ccacaggtca 480

gcagtccaac taccagggcc agagccccat caaagaatct tcagtgccag ccagaaagaa 540

tgatgaactc ctcgtgtaaa gggagtttgg ggcaaccagt caaaccatgg cctcatggga 600

agcagctgac taggcaatga gagaggaata caaaagacaa ggcactgcga agccaagtct 660

ggttggggag aagaaaccaa tatgcctgaa acagggaacc agaaaggact cagacaaaac 720

tgctgacaag tatggggttt cttggggtag gtggtgaaaa tattccaaaa taagattata 780

gcgatgtttt aataatcccc tggatataat aaaaaaacat cgaattgtac actt 834

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cacaggaaat aatggagcaa tg 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgttcaagaa caaggatggc 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagtttcgct ctgtcgcc 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caagttggat tcctgggtgt 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aatcctttga acttttcctg tg 22

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccccgtctgc cctctt 16

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgggacgct cttggaac 18

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgctgacctg tgggaaaac 19

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aatcgtgcgt gacattaagg ag 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

actgtgttgg cgtacaggtc tt 22

Claims

1.lncRNA或lncRNA组合作为检测靶点在制备预测肾透明细胞癌预后及分子靶向药物治疗敏感性的产品中的应用，其特征在于所述的lncRNA或lncRNA组合选自以下4种lncRNA中的任意1-4种：SEQ ID NO.1所示的ENSG00000255774、SEQ ID NO.2所示的ENSG00000248323、SEQ ID NO.3所示的ENSG00000260911、SEQ ID NO.4所示的ENSG00000231666。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的lncRNA组合由SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.4所示的四种lncRNA组成。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的lncRNA或lncRNA组合作为检测靶点在制备采用实时定量PCR、试剂、试剂盒或芯片预测肾透明细胞癌预后及分子靶向药物治疗敏感性的产品中的应用。

4.检测权利要求1中所述的lncRNA或lncRNA组合的表达量的特异性引物或特异性探针核苷酸在制备预测肾透明细胞癌预后及分子靶向药物治疗敏感性的产品中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的lncRNA组合由SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.4所示的四种lncRNA组成。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于所述的产品选自实时定量PCR试剂、原位杂交、芯片或试剂盒；其中，所述芯片包括基因芯片，所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测lncRNA表达水平的针对SEQID No.1-4中一个或多个lncRNA的特异性探针核苷酸；所述试剂盒包括基因检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测SEQ ID No.1-4中一个或多个lncRNA表达水平的特异性引物。

7.一种预测肾透明细胞癌预后及分子靶向药物治疗敏感性的产品，其特征在于包含检测权利要求1或2中所述的lncRNA或lncRNA组合的表达量的实时定量PCR试剂、原位杂交、芯片或试剂盒。

8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于包括针对SEQ ID No.1-4中一个或多个lncRNA的特异性PCR引物；或者含有针对SEQ ID No.1-4中一个或多个lncRNA的特异性探针核苷酸。

9.根据权利要求7所述的产品，其特征在于还包括产品使用说明书，说明书中记载对肾透明细胞癌患者的样本经过组织RNA抽提并质检后，利用检测SEQIDNo.1-4所示lncRNA的表达量，并利用β-actin作为内部参照进行校正；依据表达水平对每个lncRNA进行赋值后带入以下公式内，计算每位患者的RCClnc4 score值；然后与确定的cut-off值比较，小于该值的患者属于低危组，大于该值的患者属于高危组；所述的公式如下：

10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于所述的确定的cut-off值为RCClnc4 score值的中位数。

11.一种用于预测肾透明细胞癌预后及辅助靶向治疗敏感性的lncRNA预后风险评分模型，其特征在于包括：对肾透明细胞癌患者的样本经过组织RNA抽提并质检后，利用检测SEQIDNo.1-4所示lncRNA的表达量，并利用β-actin作为内部参照进行校正；依据表达水平对每个lncRNA进行赋值后带入以下公式内，计算每位患者的RCClnc4 score值；然后与确定的cut-off值比较，小于该值的患者属于低危组，大于该值的患者属于高危组；

12.根据权利要求11所述的用于预测肾透明细胞癌预后及辅助靶向治疗敏感性的lncRNA预后风险评分模型，其特征在于利用实时定量PCR检测SEQIDNo.1-4所示lncRNA的表达量；所述的确定的cut-off值为RCClnc4 score值的中位数。