CN108796077B - 在cfDNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因修饰差异的引物对组及试剂盒 - Google Patents

在cfDNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因修饰差异的引物对组及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种在cfDNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因修饰差异的引物对组及试剂盒。本发明首先公开了一组在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因表观遗传学修饰差异的引物对组，该引物对组由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.15所示的核苷酸序列组成。本发明进一步公开了包含上述引物组的试剂盒。本发明在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因表观遗传学修饰差异的引物对组及试剂盒，该检测具有高敏感性和特异性，对肿瘤风险预测以及疗效评估具有重要的价值。

Description

在cfDNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因修饰差异的引 物对组及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域。更具体地，涉及一种在cfDNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因修饰差异的引物对组及试剂盒。
背景技术
1、液体活检：在肿瘤预防与治疗的临床需求中，液体活检已成为肿瘤风险预测、靶向药物用药指导以及疗效评估的重要手段，其中肿瘤的早期风险评估是肿瘤预防的最重要的环节。血液因其含有大量肿瘤相关信息无疑是液体检测的最佳样本，其中外周血游离DNA是目前液体活检关注的热点，该游离DNA存在于血浆或血清中，它既可能来自于正常细胞死亡的释放物，也可能来自于肿瘤或癌前病变细胞的死亡释放物，同时无论正常细胞还是肿瘤细胞均可主动释放。
2、结构性改变的检测：由于肿瘤细胞均涉及不同程度的基因突变，当前针对结构性改变的检测成为关注的热点，该靶标的检测在肿瘤实体组织相对容易，这是因为实体肿瘤组织中，含有突变的靶基因丰度较高，但在外周血中则较为困难，这是因为来自于肿瘤细胞的DNA(ctDNA)在外周血中的浓度很低，同时在靶基因中一些位点的突变频率也很低，另外需要强调的是，结构性改变发生的位点与频率在很多肿瘤中差异很大，并具有随机性，并且这些结构性改变在疾病的进程中还是一个不断积累的过程，所以这些因素的叠加将导致检测的敏感度显著下降。特别是在肿瘤的早期，来自于结构性改变的DNA在肿瘤外周血中的丰度更低，从而给检测带来了极大的挑战。尽管目前二代测序可以通过增加测序的深度来增加其敏感性，但一方面成本显著的增高。同时另一方面并不是基因所有结构性改变都与肿瘤有关，即有些突变并没有发现其与肿瘤的相关性。
3、表观遗传学修饰的检测：肿瘤的发生发展过程中，虽然关键基因的结构改变在其过程中起着非常重要的作用，但更多的还是表现在关键基因表观遗传学修饰的变化。
相对于基因结构改变的低丰度，基因的修饰变化则更为普遍，这样针对靶基因修饰的检测则具有更高的敏感性。表观遗传学研究发现，基因的修饰与其表达能力密切相关，这些修饰主要表现在DNA的甲基化和组蛋白的各种修饰上。近来研究发现，表观遗传学修饰位点既可发生在基因的启动子序列，也可发生在基因体(Gene Body，包含外显子、内含子以及两端的非翻译区)中。已知基因启动子的甲基化程度与基因表达呈负相关(影响转录因子以及RNA聚合酶的结合)，但对基因体中表观遗传学修饰的功能仍不清楚，当前的研究主要集中在对基因启动子区域的表观遗传学修饰上，而对基因体中各种表观遗传学修饰的变化则关注很少。
4、靶基因的选择：肿瘤相关的靶基因鉴定长期以来都是肿瘤分子检测的热点，基于肿瘤发生发展某个时间点的样本鉴定出的靶基因，仅代表肿瘤基因图谱中的一个截面，其中还包括有些是一过性的改变，不能反映出其在肿瘤发生、发展过程中的地位以及动态变化。这样找到在肿瘤发生、发展过程中持续作用的靶基因，并鉴定出其在此过程中的作用，是肿瘤风险防控以及疗效评价的迫切需要。
追溯造成基因突变的原因，发现基因组中的碱基突变并不是随机的，C>T的突变占很高的比例，进一步研究发现该突变是由胞嘧啶脱氨导致的，而该脱氨过程是在胞嘧啶脱氨酶作用下完成的。研究发现，胞嘧啶脱氨酶作为细胞应激反应的重要调控基因，其在几乎所有的肿瘤细胞中均为高表达，是造成细胞基因突变的原因，其持续性的高表达也是造成肿瘤细胞突变积累以及肿瘤异质性的主要因素。目前发现导致胞嘧啶脱氨的酶包括：APOBEC3s家族(Apolipoprotein B mRNA-editing catalytic polypeptide)，AID(Activation-induced Cytidine Deaminase)，其作用是造成单链DNA中的胞嘧啶脱氨基，形成尿嘧啶(U)，单链DNA的状态在此过程中具有重要的作用，而YB1作为单链DNA结合蛋白被报道在肿瘤中广泛性高表达。另外细胞负反馈调控机制显示，突变还可引起细胞切除修复蛋白的上调，如MLH1被报道在肿瘤中广泛性高表达。所以在胞嘧啶脱氨酶致DNA突变的过程中，其相关分子功不可没，最终在这些分子的相互配合下导致细胞出现基因的突变、缺失、融合以及染色体转位等多种异常。
因此，胞嘧啶脱氨酶及其相关分子在肿瘤发生发展过程中具有重要的作用，对其进行检测具有重要的临床意义
发明内容
本发明的一个目的在于提供一组特异性强、灵敏度高的在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因表观遗传学修饰差异的引物对组，其对肿瘤的风险评估、疗效评价以及预后预测，具有重要的临床指导意义。
本发明的另一个目的在于提供一种操作简单、结果准确的在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因表观遗传学修饰差异的试剂盒。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
发明人研究发现，在高的变性温度(94℃)下，表观遗传学修饰对DNA的解链没有明显的影响，表现为完全解链,定量PCR扩增的Ct值标记为CtHT；但在低温变性条件(实验条件需要摸索)下，表观遗传学修饰则对DNA的解链有较大的影响，表现为解链程度的不同，进而影响PCR扩增的效率，定量PCR扩增的Ct值标记为CtLT，△Ct＝|CtHT–CtLT|。在定量PCR扩增过程中，发明人发现来自于正常人和肿瘤患者靶基因某些区域的DNA片段，在低温变性条件下，对其扩增效率的影响显著不同，这样通过选择低温变性条件可鉴定出正常来源以及肿瘤来源的靶基因。发明人研究发现在低温变性条件下，相对于正常人，肿瘤患者外周血游离DNA中靶基因某些区域片段更难以解链，表现为扩增效率的降低，△Ct值增大；为进一步证明这种差异来自于表观遗传学修饰的不同，发明人以稀释后的PCR产物为模板进行再次扩增(该PCR产物为没有任何修饰的裸露DNA)，发现其ΔCt值尽管与少部分正常人来源的DNA样本比较接近，但与大部分正常人和几乎所有肿瘤患者来源的DNA样本显著的不同。
以上结果表明：正常人来源与肿瘤来源的外周血游离DNA存在不同程度的表观遗传学修饰，这种修饰在DNA的提取过程中仍然得以保留，这样可根据正常人与肿瘤患者ΔCt值的不同，鉴定正常人与肿瘤患者胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因表观遗传学修饰的不同。进一步研究发现，在正常人与肿瘤患者外周血来源的游离DNA中，单个区域修饰差异的变化范围较大，为此进一步对靶基因的不同区域进行了综合分析，采用SPSS软件对不同区域的ΔCt值进行加权计算，不同区域xn的ΔCt标记为△Ctxn，通过赋予不同区域△Ctxn不同的系数，得到△Ct加权值。
发明人通过大量的筛选实验，获得了用于检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因不同区域片段表观遗传学修饰差异的引物对组，并得到了对应的△Ct，进一步对这些不同区域片段△Ct值的加权分析，得到了用以鉴别肿瘤与正常人来源的△Ct加权值以及检测阈值(CutOff值)，并据此对样本进行放大检测，并进行敏感性与特异性分析。
基于以上研究，本发明首先提供了一组在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因表观遗传学修饰差异的引物对组，该引物对组由序列表SEQ ID No.1至SEQID No.15所示的核苷酸序列组成；
其中，序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为扩增AID基因启动子区域片段长度为145bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.3为扩增该区域片段的探针；SEQ ID No.4和SEQ ID No.5分别为扩增AID基因外显子3区域片段长度为169bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.6为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.7和SEQ ID No.8分别为扩增APOBEC3B/C基因启动子区域片段长度为135bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.9为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.10和SEQ ID No.11分别为扩增YB1基因启动子区域片段长度为102bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.12为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.13和SEQ ID No.14分别为扩增MLH1基因外显子1区域片段长度为169bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.15为扩增该区域片段的探针。
进一步，本发明提供了一种在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因表观遗传学修饰差异的试剂盒，所述试剂盒包括由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.15所示的核苷酸序列组成的引物对组。
进一步，所述试剂盒还包括质控对照DNA样品；所述质控对照DNA样品为裸露的DNA，例如可以为不存在表观遗传学修饰的PCR产物；在质控对照DNA的检测过程中，为更好的模拟游离DNA的浓度，需要对PCR产物进行高度稀释使其与样本浓度相当，再作为模板重新扩增；
其中，所述质控对照DNA样品包括AID基因启动子区域片段长度为145bp裸露DNA、AID基因外显子3区域片段长度为169bp裸露DNA、APOBEC3B/C基因启动子区域片段长度为135bp裸露DNA、YB1基因启动子区域片段长度为102bp裸露DNA和MLH1基因外显子1区域片段长度为169bp裸露DNA。
进一步，所述试剂盒还包括PCR反应液和ddH2O。
本发明还提供了上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)抽提外周血游离DNA；
2)使用由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.15所示的核苷酸序列组成的引物对组，分别对外周血游离DNA及质控对照DNA样品在高温变性条件下和低温变性条件下进行实时荧光定量PCR扩增，得到胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因待测区域片段xn的△Ctxn和质控对照DNA样品xn'的△Ctxn'；
其中，△Ctxn＝|Ctxn-HT–Ctxn-LT|，Ctxn-HT表示胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因待测区域片段xn在高温变性条件下扩增的Ct值；Ctxn-LT表示胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因待测区域片段xn在低温变性条件下扩增的Ct值；
例如在本发明中△Ctxn可以为△Ctx1、△Ctx2、△Ctx3、△Ctx4、△Ctx5；△Ctx1代表AID基因启动子区域片段长度为145bp的△Ct值，△Ctx2代表AID基因外显子3区域片段长度为169bp的△Ct值，△Ct3代表APOBEC3B/C基因启动子区域片段长度为135bp的△Ct值，△Ctx4代表YB1基因启动子区域片段长度为102bp的△Ct值，△Ctx5代表MLH1基因外显子1区域片段长度为169bp的△Ct值；
△Ctxn'＝|Ctxn'-HT–Ctxn'-LT|，Ctxn'-HT表示质控对照DNA样品xn'在高温变性条件下扩增的Ct值；Ctxn'-LT表示质控对照DNA样品xn'在低温变性条件下扩增的Ct值；
例如在本发明中△Ctxn'可以为△Ctx1'、△Ctx2'、△Ctx3'、△Ctx4'、△Ctx5'，△Ctx1'代表AID基因启动子区域片段长度为145bp裸露DNA的△Ct值，△Ctx2'代表AID基因外显子3区域片段长度为169bp裸露DNA的△Ct值，△Ctx3'代表APOBEC3B/C基因启动子区域片段长度为135bp裸露DNA的△Ct值，△Ctx4'代表YB1基因启动子区域片段长度为102bp裸露DNA的△Ct值，△Ctx5'代表MLH1基因外显子1区域片段长度为169bp裸露DNA的△Ct值；
3)比较△Ctxn与△Ctxn'的差异判定胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因待测区域片段xn是否存在表观遗传学修饰：当△Ctxn＝△Ctxn'±[标准误]时，说明外周血游离DNA中胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因待测区域片段xn不存在表观遗传学修饰；否则说明外周血游离DNA中胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因待测区域片段xn存在表观遗传学修饰。
在本发明中所述高温变性条件为可以使得DNA完全解链的温度，优选的为94℃；所述低温变性条件为可以使得DNA部分解链的温度，需要根据实验进行确定，原则上是DNA可以被扩增的最低变性温度。
进一步，所述结果判定包括对胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因不同待测区域片段△Ctxn的加权计算，具体公式为：
△Ct加权值＝a*△Ctx1+b*△Ctx2+c*△Ctx3+d*△Ctx4+e*△Ctx5；
其中，a,b,c,d,e为回归分析对胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因不同待测区域片段对应的△Ct值给出的加权系数；△Ctx1代表AID基因启动子区域片段长度为145bp的△Ct值，△Ctx2代表AID基因外显子3区域片段长度为169bp的△Ct值，△Ctx3代表APOBEC3B/C基因启动子区域片段长度为135bp的△Ct值，△Ctx4代表YB1基因启动子区域片段长度为102bp的△Ct值，△Ctx5代表MLH1基因外显子1区域片段长度为169bp的△Ct值。
发明人研究发现，在肿瘤与正常人中，胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因单个区域片段的表观遗传学修饰差异的变化范围较大，进一步对这些区域片段进行了加权计算，经统计学分析找出具有统计学意义的阈值(Cut Off值)。所以本发明是对来自于肿瘤患者以及正常人群的胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因不同区域片段的△Ct值差异的综合分析。
在本发明具体的实施方式中，针对来自40例正常人以及40例肿瘤患者的胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因不同待测区域片段进行了△Ctxn的检测，并进一步对这些待测区域片段的△Ctxn进行加权计算(SPSS软件分析)，得出如下公式：
△Ct加权值＝1.841*△Ctx1+0.058*△Ctx2+0.445*△Ctx3+1.624*△Ctx4+0.180*△Ctx5；
其中，△Ctx1代表AID基因启动子区域片段145bp的△Ct值，△Ctx2代表AID基因外显子3区域片段169bp的△Ct值，△Ct3代表APOBEC3B/C基因启动子区域片段135bp的△Ct值，△Ctx4代表YB1基因启动子区域片段102bp的△Ct值，△Ctx5代表MLH1基因外显子1区域片段169bp的△Ct值。
进一步，根据△Ct加权值得到的阈值进行结果判定。本发明在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因的引物对组及试剂盒，研究数据显示该检测具有较高的敏感性与特异性(ROC曲线的覆盖面积>90％)，特别是敏感性显著优于目前临床上使用的经典肿瘤标志物。
本发明的有益效果如下：
1、高敏感性：在正常人与肿瘤患者的外周血游离DNA中，检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因不同区域表观遗传学修饰的差异，并进一步通过对胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因多个区域片段的联合分析，显著提高了检测的敏感性。
2、特异性：由于胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因在几乎所有肿瘤细胞中均出现异常表达，对其进行检测具有肿瘤的特异性。
3、直接性：常规的蛋白肿瘤标志物通常是检测代谢指标的异常，是间接指标，而外周血游离DNA是直接来自于细胞本身，是直接性指标，更加真实可信。
4、实时性：同时由于外周血游离DNA在体内的代谢很快(半衰期仅有十几分钟)，这样可以对治疗效果进行实时的评价。
5、稳定性：相对于蛋白质标志物而言，DNA的稳定性较好，对样本的储存运输等条件要求相对较低。
6、预警性：由于肿瘤的发生的根本原因是基因组调控异常，胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因基因已被证明在肿瘤的发生与发展过程中具有极其重要的作用，正是由于该类基因的高表达导致了后续DNA突变的发生。因此该检测方法对肿瘤风险预测具有重大的意义。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出不同来源DNA在低温变性条件下解链程度差异与扩增效率的关系(示意图)。
图2示出正常人与肿瘤患者中△Ct加权值分布范围。
图3示出检测结果的ROC曲线分析，其中AUC为曲线下面积。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
发明人研究发现，在高的变性温度(94℃)下，表观遗传学修饰对DNA的解链没有明显的影响，表现为完全解链,定量PCR扩增的Ct值标记为CtHT；但在低温变性条件(实验条件需要摸索)下，表观遗传学修饰则对DNA的解链有较大的影响，表现为解链程度的不同，进而影响PCR扩增的效率，定量PCR扩增的Ct值标记为CtLT，△Ct＝|CtHT–CtLT|。在定量PCR扩增过程中，发明人发现来自于正常人和肿瘤患者靶基因某些区域的DNA片段，在低温变性条件下，对其扩增效率的影响显著不同，这样通过选择低温变性条件可鉴别正常来源以及肿瘤来源的靶基因。如图1所示在低温变性条件下，相对于正常人，肿瘤患者外周血游离DNA中靶基因部分区域片段更难以解链，表现为扩增效率的降低，△Ct值增大；为进一步证明这种差异来自于表观遗传学修饰的不同，发明人以稀释后的PCR产物为模板进行再次扩增(该PCR产物为没有任何修饰的裸露DNA)，发现其ΔCt值尽管与来自与小部分正常人的DNA样本接近，但与绝大部分正常人以及几乎所有的肿瘤患者则有显著的差异。以上结果表明：正常人来源与肿瘤来源的外周血游离DNA存在不同程度的表观遗传学修饰。研究发现，在正常人与肿瘤患者外周血来源的游离DNA中，单个区域修饰差异的变化范围较大，进一步对靶基因的不同区域进行了ΔCtxn值加权计算(采用SPSS软件分析)，结果显示可显著提高检测的敏感性与特异性。这样根据正常人与肿瘤患者ΔCt值的不同，即可鉴别正常人与肿瘤患者胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因表观遗传学修饰的不同。
发明人通过大量的筛选实验，获得了用于检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因不同区域片段表观遗传学修饰差异的引物对组，并得到了对应的△Ct值，进一步对这些不同区域片段△Ct值进行加权分析，得到用以判断肿瘤与正常区别的检测阈值(Cut Off值)，并在正常人与肿瘤患者中，进行了该方法的敏感性与特异性分析。
实施例1在外周血游离DNA的检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因表观遗传学修饰差异的引物对组
针对胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因不同区域片段，设计PCR引物进行了大量的筛选实验，最终得到了一组特异性强、灵敏度高的在外周血游离DNA的检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因表观遗传学修饰差异的引物对组，该引物对组由序列表SEQ ID No.1至SEQ IDNo.15所示的核苷酸序列组成；
其中，序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为扩增AID基因启动子区域片段长度为145bp(AID-P-145)的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.3为扩增该区域片段的探针；SEQ ID No.4和SEQ ID No.5分别为扩增AID基因外显子3区域片段长度为169bp(AID-E3-169)的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.6为扩增该区域片段的探针；序列SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8分别为扩增APOBEC3B/C基因启动子区域片段长度为135bp(Apobec3B/C-P-135)的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.9为扩增该区域片段的探针；序列SEQ IDNo.10和SEQ ID No.11分别为扩增YB1基因启动子区域片段102bp(YB1-P-102)的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.12为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.13和SEQ IDNo.14分别为扩增MLH1基因外显子1区域片段长度为169bp(MLH1-E1-169)的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.15为扩增该区域片段的探针；具体序列如下：
AID-P-145(x1)扩增引物与探针
上游引物(AID-P-145-U)：
5'-TTGAAGTGTCTACTGTTACTGCC-3' (SEQ ID NO.1)
下游引物(AID-P-145-D)：
5'-CTGTCATAGGCAGAGTCACACA-3' (SEQ ID NO.2)
探针(AID-P-145-Taqman)
5'-FAM-CTAGCTATGGAGCATGGACTGGGC-BHQ1-3' (SEQ ID NO.3)
AID-E3-169(x2)扩增引物与探针
上游引物(AID-E3-169-U)
5'-TGGTCCTCTCTGTCTCTCCAGAAC-3' (SEQ ID NO.4)
下游引物(AID-E3-169-D)
5'-GGTTCCCTCGCAGAAAGTCGG-3' (SEQ ID NO.5)
探针(AID-E3-169-Taqman)
5'-FAM-CGGCTGCCACGTGGAATTGCTCTTCC-BHQ1-3' (SEQ ID NO.6)
Apobec3B/C-P-135(x3)扩增引物与探针
上游引物(APOBEC3B/C-P-135-U)
5'-GCCAGAGCCAGAGAAACATGAAG-3' (SEQ ID NO.7)
下游引物(APOBEC3B/C-P-135-D)
5'-TGCTTACAGCGTCCTTGCAGTTG-3' (SEQ ID NO.8)
探针(APOBEC3B/C-P-135-Taqman)
5'-FAM-CCGGGGCCTCCCACACCAATG-BHQ1-3' (SEQ ID NO.9)
YB1-P-102(x4)扩增引物与探针
上游引物(YB1-P-102-U)
5'-CGTCCTCTCGGGTACTCTATGG-3' (SEQ ID NO.10)
下游引物(YB1-P-102-D)
5'-TCAGTCGACCTACAACCGTTCCTG-3' (SEQ ID NO.11)
探针(YB1-P-102-Taqman)
5'-FAM-CTCCGCCGGCCGCCATAGAGACC-BHQ1-3' (SEQ ID NO.12)
MLH1-E1-169(x5)扩增引物与探针
上游引物(MLH1-E1-169-U)
5'-GAGAACTGGTACGGAGGGAGTC-3' (SEQ ID NO.13)
下游引物(MLH1-E1-169-D)
5'-AGAAGGCCTGACTGGCACGTC-3' (SEQ ID NO.14)
探针(MLH1-E1-169-Taqman)
5'-FAM-CCGGGCTCACTTAAGGGCTACGAC-BHQ1-3' (SEQ ID NO.15)
实施例2在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因表观遗传学修饰差异的试剂盒
在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因表观遗传学修饰差异的试剂盒，所述试剂盒包括由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.15所示的核苷酸序列组成的引物对组、PCR反应液(Premix Ex TaqTM)、质控对照DNA样品和ddH2O；
其中，所述试剂盒还包括质控对照DNA样品；所述质控对照DNA样品为裸露的DNA，例如可以为不存在表观遗传学修饰的PCR产物；进一步为更好的模拟游离DNA的浓度，PCR产物需要高度稀释使其与样本浓度相当，再作为模板重新扩增；所述质控对照DNA样品包括AID基因启动子区域片段长度为145bp裸露DNA、AID基因外显子3区域片段长度为169bp裸露DNA、APOBEC3B/C基因启动子区域片段长度为135bp裸露DNA、YB1基因启动子区域片段长度为102bp裸露DNA和MLH1基因外显子1区域片段长度为169bp裸露DNA。
实施例3建立检测方法
1)抽提外周血游离DNA；
2)使用由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.15所示的核苷酸序列组成的引物对组，分别对外周血游离DNA及质控对照DNA样品在高温变性条件下和低温变性条件下进行实时荧光定量PCR扩增；所述反应体各引物组的qPCR反应体系见表1-5：
表1 x1序列的qPCR反应体系
Figure BDA0001678271030000111
表2 x2序列qPCR反应体系
Figure BDA0001678271030000112
表3 x3序列qPCR反应体系
Figure BDA0001678271030000113
表4 x4序列qPCR反应体系
Figure BDA0001678271030000121
表5 x5序列qPCR反应体系
Figure BDA0001678271030000122
反应条件为：
高温变性(High Temperature,HT)：预变性95℃5min；94℃5s，60℃(x1,x2,x3,x5)/58℃(x4)15秒，72℃30s；50个循环；
低温变性(Low Temperature,LT)：
预变性95℃5min；88℃(x2,x5)/86℃(x4)/85℃(x3,x1)15s，60℃(x1,x2,x3,x5)/58℃(x4)15秒，72℃30s；50个循环；
胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因待测区域片段xn的△Ctxn和质控对照DNA样品xn'的△Ctxn'；
其中，△Ctxn＝|Ctxn-HT–Ctxn-LT|，Ctxn-HT表示胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因待测区域片段xn在高温变性条件下扩增的Ct值；Ctxn-LT表示胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因待测区域片段xn在低温变性条件下扩增的Ct值；
在本发明中△Ctxn为△Ctx1、△Ctx2、△Ctx3、△Ctx4、△Ctx5；△Ctx1代表AID基因启动子区域片段长度为145bp的△Ct值，△Ctx2代表AID基因外显子3区域片段长度为169bp的△Ct值，△Ct3代表APOBEC3B/C基因启动子区域片段长度为135bp的△Ct值，△Ctx4代表YB1基因启动子区域片段长度为102bp的△Ct值，△Ctx5代表MLH1基因外显子1区域片段长度为169bp的△Ct值；
△Ctxn'＝|Ctxn'-HT–Ctxn'-LT|，Ctxn'-HT表示质控对照DNA样品xn'在高温变性条件下扩增的Ct值；Ctxn'-LT表示质控对照DNA样品xn'在低温变性条件下扩增的Ct值；
在本发明中△Ctxn'可以为△Ctx1'、△Ctx2'、△Ctx3'、△Ctx4'、△Ctx5'，△Ctx1'代表AID基因启动子区域片段长度为145bp裸露DNA的△Ct值，△Ctx2'代表AID基因外显子3区域片段长度为169bp裸露DNA的△Ct值，△Ctx3'代表APOBEC3B/C基因启动子区域片段长度为135bp裸露DNA的△Ct值，△Ctx4'代表YB1基因启动子区域片段长度为102bp裸露DNA的△Ct值，△Ctx5'代表MLH1基因外显子1区域片段长度为169bp裸露DNA的△Ct值；
进一步，所述结果判定进一步包括对胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因待测区域片段xn的△Ct值进行加权计算：
基于来自于40例正常人(表6)以及40例肿瘤患者(表7)的胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因不同待测区域片段△Ctxn值的差异进行分析，并对这些待测区域片段的△Ctxn进行加权计算(SPSS软件分析)，得出如下公式：
△Ct加权值＝1.841*△Ctx1+0.058*△Ctx2+0.445*△Ctx3+1.624*△Ctx4+0.180*△Ctx5；
其中，△Ctx1代表AID基因启动子区域片段长度为145bp的△Ct值，△Ctx2代表AID基因外显子3区域片段长度为169bp的△Ct值，△Ct3代表APOBEC3B/C基因启动子区域片段长度为135bp的△Ct值，△Ctx4代表YB1基因启动子区域片段长度为102bp的△Ct值，△Ctx5代表MLH1基因外显子1区域片段长度为169bp的△Ct值。
根据统计分析，设定阈值(Cut off值)为8.214。
实施例4
根据实施例3所述的检测方法对作为质控对照的DNA(靶基因不同区域扩增的PCR产物)进行稀释，并据此为模板进行再次扩增，计算相关分子基因△Ctxn'值及△Ct加权值'，结果如表6所示。
表6相关分子基因质控对照DNA片段的△Ctxn'值及△Ct加权值'*
Figure BDA0001678271030000141
*：表中的数值为6次独立实验结果的平均值。
实施例5
按照实施例3所述的检测方法对正常人组(40例正常人由北京交通大学校医院提供)和肿瘤组(40例肿瘤患者由解放军总医院肿瘤中心实验室提供)进行检测，并计算△Ct加权值，肿瘤患者与正常人的分布情况如图2所示，其中，正常人组的△Ct加权值见表7，肿瘤组的△Ct加权值见表8。
表7正常人组的△Ct加权值
Figure BDA0001678271030000142
Figure BDA0001678271030000151
注：加粗为高于阈值的样本
表8肿瘤组的△Ct加权值
Figure BDA0001678271030000152
Figure BDA0001678271030000161
注：加粗为低于阈值的样本
根据以上结果，本检测方法的敏感性、特异性与符合率如表9和图3所示，对上述结果进行的统计学检验分析，如表10所示。从表9中可以看出当阈值(Cut off值)为8.214时，40例肿瘤患者中有5例低于Cut off值，其中1例肝癌患者，1例为舌癌患者，2例均为胃癌术后，1例为肾癌术后；40例正常人中有4例高于Cut off值。其检测的敏感性为89.7％，特异性为87.2％，符合率为88.5％。从表10中可以看出正常人和肿瘤患者的差异具有极其显著性。从图3中可以看出ROC曲线下的覆盖面积达到了94.8％。可见，该检测方法具有较高的敏感性和特异性，其敏感性显著优于目前临床上使用的经典肿瘤标志物的检测方法，在肿瘤疗效评估中具有重要的价值。
表9检测结果分析
Figure BDA0001678271030000171
表10正常人和肿瘤患者检测结果的统计学分析
Figure BDA0001678271030000172
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
序列表
<110> 朱运峰
<120> 在cfDNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因修饰差异的引物对组及试剂盒
<130> JLC18I0376E
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgaagtgtc tactgttact gcc 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgtcatagg cagagtcaca ca 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctagctatgg agcatggact gggc 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggtcctctc tgtctctcca gaac 24
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggttccctcg cagaaagtcg g 21
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cggctgccac gtggaattgc tcttcc 26
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gccagagcca gagaaacatg aag 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgcttacagc gtccttgcag ttg 23
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccggggcctc ccacaccaat g 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgtcctctcg ggtactctat gg 22
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcagtcgacc tacaaccgtt cctg 24
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctccgccggc cgccatagag acc 23
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gagaactggt acggagggag tc 22
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agaaggcctg actggcacgt c 21
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccgggctcac ttaagggcta cgac 24

Claims (6)

1.一组在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因表观遗传学修饰差异的引物对和探针组，其特征在于，该引物对和探针组由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.15所示的核苷酸序列组成；
其中，序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为扩增AID基因启动子区域片段长度为145bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.3为扩增该区域片段的探针；SEQ ID No.4和SEQ ID No.5分别为扩增AID基因外显子3区域片段长度为169bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.6为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.7和SEQ ID No.8分别为扩增APOBEC3B/C基因启动子区域片段长度为135bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.9为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.10和SEQ ID No.11分别为扩增YB1基因启动子区域片段长度为102bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.12为扩增该区域片段的探针；序列SEQ ID No.13和SEQ ID No.14分别为扩增MLH1基因外显子1区域片段长度为169bp的上游引物和下游引物，序列SEQ ID No.15为扩增该区域片段的探针。
2.一种在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因表观遗传学修饰差异的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物对和探针组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括质控对照DNA样品，其中，所述质控对照DNA样品包括AID基因启动子区域片段长度为145bp裸露DNA、AID基因外显子3区域片段长度为169bp裸露DNA、APOBEC3B/C基因启动子区域片段长度为135bp裸露DNA、YB1基因启动子区域片段102bp裸露DNA和MLH1基因外显子1区域片段长度为169bp裸露DNA。
4.一种非诊断目的在外周血游离DNA中检测胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因表观遗传学修饰差异的方法，其特征在于，使用如权利要求2-3任一所述的试剂盒，包括以下步骤：
抽提外周血游离DNA；
使用由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.15所示的核苷酸序列组成的引物对组，分别对外周血游离DNA及质控对照DNA样品在高温变性条件下和低温变性条件下进行实时荧光定量PCR扩增，得到胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因待测区域片段xn的△Ctxn和质控对照DNA样品xn'的△Ctxn'；
其中，△Ctxn＝|Ctxn-HT–Ctxn-LT|，Ctxn-HT表示胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因待测区域片段xn在高温变性条件下扩增的Ct值；Ctxn-LT表示胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因待测区域片段xn在低温变性条件下扩增的Ct值；
△Ctxn'＝|Ctxn'-HT–Ctxn'-LT|，Ctxn'-HT表示质控对照DNA样品xn'在高温变性条件下扩增的Ct值；Ctxn'-LT表示质控对照DNA样品xn'在低温变性条件下扩增的Ct值；
比较△Ctxn与△Ctxn'的差异判定胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因待测区域片段xn是否存在表观遗传学修饰：当△Ctxn＝△Ctxn'±[标准误]时，说明外周血游离DNA中胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因待测区域片段xn不存在表观遗传学修饰；否则说明外周血游离DNA中胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因待测区域片段xn存在表观遗传学修饰。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述结果判定进一步包括对胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因不同待测区域片段的△Ctxn的进行加权计算，具体公式为：
△Ct加权值＝a*△Ctx1+b*△Ctx2+c*△Ctx3+d*△Ctx4+e*△Ctx5；
其中，a,b,c,d,e为回归分析对胞嘧啶脱氨酶及相关分子基因不同待测区域片段对应的△Ct值给出的加权系数；
△Ctx1代表AID基因启动子区域片段长度为145bp的△Ct值，△Ctx2代表AID基因外显子3区域片段长度为169bp的△Ct值，△Ctx3代表APOBEC3B/C基因启动子区域片段长度为135bp的△Ct值，△Ctx4代表YB1基因启动子区域片段长度为102bp的△Ct值，△Ctx5代表MLH1基因外显子1区域片段长度为169bp的△Ct值。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，根据由△Ct加权值得到的阈值进行结果判定。
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