CN104805208A

CN104805208A - 用于检测人类kras基因7种热点突变的引物探针组合物、试剂盒及检测方法

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Publication number: CN104805208A
Application number: CN201510216088.5A
Authority: CN
Inventors: 陈英; 孙秀莲; 孙利; 王春苗; 张玉丽
Original assignee: SHANDONG WEIZHEN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHANDONG WEIZHEN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2015-04-30
Filing date: 2015-04-30
Publication date: 2015-07-29
Anticipated expiration: 2035-04-30
Also published as: CN104805208B

Abstract

本发明公开了一种用于检测人类KRAS基因7种热点突变的引物探针组合物，包括7对特异性引物和一种特异性探针，所述7对特异性引物由7种ARMS引物分别和一种通用下游引物组成。本发明还公开了包含该组合物的试剂盒以及使用试剂盒检测突变的方法。本发明引物探针组合物灵敏度高、特异性强，使用该试剂盒检测过程均为闭管反应，显著降低污染，并且加入UNG 酶防污染系统和内控系统，能更加准确、稳定地对样品进行分型检测，确保结果真实可信，且检测方法快速，能在100分钟内完成检测，结果判读简单客观，便于分析。

Description

用于检测人类KRAS基因7种热点突变的引物探针组合物、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测人类KRAS基因7种热点突变(即7种常见突变)的引物探针组合物、试剂盒和检测突变的方法，属于分子生物学领域。

背景技术

KRAS基因是RAS基因家族中的一种，定位在人类的12号染色体上，是一种原癌基因，对人类癌症影响很大。KRAS基因编码分子量为21kD的ras蛋白又名p21蛋白，p21蛋白位于细胞膜的内表面，具有GTP酶活性，参与细胞内的信号传导，结合GTP时为活化态，结合GDP时为失活态。KRAS基因在机体内好像分子开关，它在肿瘤细胞生长以及血管生成等过程的信号传导通路中起着重要调控作用，正常的KRAS基因可抑制肿瘤细胞生长，但发生异常时会诱导基因永久活化，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。KRAS基因被激活的方式有3种：基因点突变、基因大量表达、基因插入及转位。其中点突变最常见，多发生在2号外显子的12号密码子和13号密码子上(12、13占所有突变的90％)，密码子61、63、117、119和146较少见。KRAS基因第12和13位常见7种突变如下：

KRAS基因常见7种突变

KRAS基因是目前确认的肿瘤靶向治疗药物的重要基因标记物之一，KRAS基因突变是预测EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TK1)和表皮生长因子受体(EGFR)单克隆抗体(帕尼单抗和西妥昔单抗)靶向治疗抵抗的重要因素之一。在EGFR信号通路中，KRAS及其下游区小分子G蛋白是该信号通路的基本组成部分之一。KRAS基因突变后可以使该通路异常活化，不受EGFR上游信号指令的影响。此时，EGFR单抗与细胞膜表面EGFR结合，虽阻滞了信号通路的下传，但KRAS基因突变后可发生自身磷酸化，抗拒EGFR单抗的作用，从而对EGFR单抗药物治疗无效。因此，运用EGFR靶向药物治疗之前必须要进行KRAS基因突变检测，根据患者的基因突变状态选择合适的药物，提高治疗的针对性，最大程度的延长者的生存期。因此研究出指导肿瘤个体化治疗的KRAS基因突变的试剂盒十分关键。

目前KRAS基因突变检测的方法很多，如直接测序法，焦磷酸测序法，高分辨率溶解曲线检测法(High Resolution Melting Analysis，HRM)，高效液相色谱法，荧光定量PCR法等。其中最常见方法还是直接测序法，该法费用较低，但操作耗时长，并且它有两个明显的缺点：一是灵敏度低，一般需要突变基因丰度达到10％以上才能准确检测。二是由于后续需要对PCR产物进行处理，容易出现污染导致结果不准确。因此在本领域需要一种一次性、高效、快速、准确、全面地检测出KRAS基因七种热点突变的产品及方法，以便及时准确地获得KRAS基因突变的信息。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种检测人类KRAS基因7种热点突变的引物探针组合物，该引物探针组合物能够检测出人类KRAS基因2号外显子第12、13号的12CYS、12SER、12ARG、12VAL、12ASP、12ALA、13ASP 7种热点突变(即常见突变)，灵敏度高、特异性强。

本发明还提供了一种检测人类KRAS基因7种热点突变的试剂盒，该试剂盒能够快速、高效、准确的检测人类KRAS基因7种热点突变。

本发明还提供了使用上述试剂盒检测人类KRAS基因7种热点突变的检测方法，该方法能够防止假阴性和假阳性，能够一次性、高效、快速、准确、全面地检测出KRAS基因七种热点突变。

本发明中，引物和探针的设计是关键，首先根据Cosmic数据公布的KRAS基因2号外显子的12和13号密码子的野生型基因序列和7种突变基因序列，设计高特异性ARMS引物、通用下游引物、通用特异TaqMan探针(简称特异性探针，下同)、质控引物和质控TaqMan探针(简称质控探针，下同)。突变扩增阻滞系统(amplification refractory mutationsystem，ARMS)也叫等位基因特异性PCR，该法是在PCR基础上发展而成的，是一种直接用于点突变分析的PCR技术。由于PCR过程中引物延伸是3’端开始的，所以3’末端的碱基对引物的延伸来说处于至关重要的位置。根据这个原理，将突变与正常等位基因所不同的那个碱基安排在引物3’最末端，当反应进行时，如果引物3’末端碱基与模板DNA序列匹配则可以扩增，如果不匹配，则链延伸反应就会因3’,5’-磷酸二酯键形成障碍而受阻，从而达到区分检测等位基因的目的。为了增加引物的特异性，减少引物与靶DNA有错配时的错配延伸，可通过在引物3’端的第2-3个碱基引入另外一个或者两个错配碱基，使之与模板之间形成多重错配以阻止错误延伸。

为了检测人类KRAS基因2号外显子的第12和13号密码子的常见7种突变，本发明设计了7种ARMS引物，这7种ARMS引物分别和通用下游引物组成7对特异性引物，这7对特异性引物能够扩增这7种常见(热点)突变。ARMS引物和通用下游引物如下：

ARMS引物1：5’TTGTGGTAGTTGGAGCAGC3’

ARMS引物2：5’CTTGTGGTAGTTGGAGCTT3’

ARMS引物3：5’CTTGTGGTAGTTGGAGCGGA3’

ARMS引物4：5’CTTGTGGTAGTTGGAGCTC3’

ARMS引物5：5’CTTGTGGTAGTTGGAGCAA3’

ARMS引物6：5’TTGTGGTAGTTGGAGCTGT3’

ARMS引物7：5’TGGTAGTTGGAGCTGGTAA3’

通用下游引物:5’CTATTGTTGGATCATATTC3’。

所述通用的特异性探针为:5’AAGAGTGCCTTGACGATAC3’。

进一步的，上述引物探针组合物中还包括质控系统，用于指示样本DNA的提取质量和扩增效率；同时作为减数参与最终结果的判读，使得判读方式更为科学、准确。质控系统包括质控引物和质控TaqMan探针(简称质控探针)，具体的序列如下：

质控引物：

上游引物：5’AGGTAGAGGGGTGATGTG3’

下游引物：5’CTCAGTGTAGCCCAGGATG3’

质控探针：5’CAAGGTCATCCCTGAGCTGAACGG3’。

进一步的，上述引物探针组合物中还包括内控系统，内控系统可以监测使用该引物探针组合物进行荧光定量PCR反应时是否存在抑制，避免假阴性的产生。由于待检测的样品中的某些成分可能含有导致PCR出现部分或完全抑制，另外人为加样错误也可能导致假阴性结果的出现，因此采用内控系统来检测上述隐患，保证了检测结果的准确性。该内控系统包含内控引物和内控探针，内控系统可采用本领域技术人员熟知的、常用的内控系统，本发明中优选使用以下内控系统：

内控引物：

上游引物：5’TGGTGTAGTGGAAACTAGG3’

下游引物：5’CAAAAGCAGTACCATGGAC3’

内控探针：5’CCATAACTTCTTGCTAAGTCCTGAGCC3’。

LNA(Locked Nucleic Acid)是一种核酸类似物，和普通核酸分子的区别在于在其碳环的2’氧原子和4’碳原子位置引入亚甲基桥形成锁状结构，因此也称锁核酸，该结构特征使得LNA不但可与DNA或RNA互补序列形成正常的Watson-Crick键结，且所形成的双股结构比起一般的DNA:DNA、DNA:RNA、RNA:RNA结构更加稳定。通过NMR与X-ray结晶技术检测发现LNA:RNA与LNA:DNA双股结构近似于细胞内原本的双股核酸状态，因此其物理性质与一般核酸非常相似而容易操作。因此，优选的，本发明对ARMS引物的个别突变位点进行LNA修饰，以增强ARMS引物与突变型基因的特异性结合，从而增加了ARMS引物的灵敏度及稳定性。具体的，将ARMS引物2的第17位C碱基用LNA修饰，将ARMS引物4的第17位C碱基用LNA修饰，将ARMS引物6的第17位T碱基用LNA修饰，形成的碱基序列如下。加入LNA修饰使得同等拷贝的突变型重组质粒的CT值减小，即引物的扩增有效性增强。

ARMS引物2	CTTGTGGTAGTTGGAGCTT(3'端C碱基LNA修饰)
		ARMS引物4	CTTGTGGTAGTTGGAGCTC(3'端C碱基LNA修饰)
ARMS引物6	TTGTGGTAGTTGGAGCTGT(3'端T碱基LNA修饰)

进一步的，上述所有TaqMan探针(特异性探针、质控探针、内控探针)的5’端均标记有荧光报告基团，3’端均标记有荧光淬灭基团。荧光报告基团可以选择FAM、JOE、CY3、CY5等，荧光淬灭基团可以选择TAMRA、BHQ等。当采用荧光定量PCR技术进行PCR扩增检测时，在探针完整时，即随机状态和无PCR产物杂交状态时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收。ARMS-qPCR扩增过程中，当特异的PCR产物与TaqMan探针发生杂交反应时,热启动DNA聚合酶的5’端外切酶活性同时也把探针裂解，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板DNA的拷贝数的多少。

在本发明的具体实施例中，特异性探针和质控探针的5’端均修饰有FAM荧光报告基团，3’端均修饰有BHQ1荧光淬灭基团，内控探针的5’端修饰有HEX荧光报告基团，3’端修饰有BHQ1荧光淬灭基团。

本发明还提供了检测人类KRAS基因7种热点突变的试剂盒，该试剂盒包括7种ARMS引物和通用下游引物组成的7对特异性引物和特异性探针，进一步的还包括质控系统和/或内控系统。

进一步的，试剂盒还包括PCR混合反应液，所述PCR混合反应液包括DNA聚合酶、PCRBuffer、MgCl₂、dNTPs、dUTP和UNG酶。

进一步的，试剂盒还包括阳性对照混合液或/和空白对照混合液，所述空白对照混合液为超纯水，所述阳性对照混合液为7种重组质粒的混合物，所述7种重组质粒为含有KRAS基因2号外显子的第12和13号密码子的常见7种突变DNA的重组质粒，即阳性对照混合液为含有KRAS基因12CYS突变DNA的重组质粒、含有KRAS基因12SER突变DNA的重组质粒、含有KRAS基因12ARG突变DNA的重组质粒、含有KRAS基因12VAL突变DNA的重组质粒、含有KRAS基因12ASP突变DNA的重组质粒、含有KRAS基因12ALA突变DNA的重组质粒和含有KRAS基因13ASP突变DNA的重组质粒的混合物。所述重组质粒是7种突变DNA分别插入质粒形成的重组质粒。所述质粒可以是pEASY-T1。

本发明还提供了一种检测人类KRAS基因7种热点突变(即12CYS、12SER、12ARG、12VAL、12ASP、12ALA、13ASP)的方法，该方法包括使用上述检测人类KRAS基因7种热点突变的引物探针组合物或上述检测人类KRAS基因7种热点突变的试剂盒检测KRAS基因2号外显子的第12和13号密码子的常见7种突变的步骤。

进一步的，本发明检测方法采用荧光定量PCR技术检测突变，具体包括以下步骤：

(1)提取待检样本的DNA，作为PCR检测的基因模板；

(2)取7支突变检测管和1支质控管，向每支突变检测管中均加入待检样本的DNA、一对相应的特异性引物、特异性探针、PCR混合反应液、内控引物和内控探针，向质控管中加入待检样本的DNA、PCR混合反应液、质控引物和质控探针，然后进行实时荧光定量PCR扩增；

(3)收集荧光信号，通过荧光信号判断是否存在突变。

上述检测方法中，每支突变检测管中分别加入一对能够扩增一种常见突变的特异性引物，7对特异性引物分别单独加入7支突变检测管中。

上述检测方法中，按照以下方式判断是否存在突变：

首先，需要确定突变检测管中的荧光信号是否正常可用，方法是：如果突变检测管中的内控探针和特异性探针均无荧光信号检出(原因可能是加入样本含有PCR抑制剂或样本加入量不够，需要重新提取DNA后再做或增加样本加入量后再做)，则说明实验失败，需要重新进行实验；如果突变检测管中的特异性探针有荧光信号检出，则无论内控探针有无荧光信号被检出(突变序列的扩增有可能抑制内控序列的扩增，因此内控信号可能检不出来)，均说明实验结果正常，再按照下述规则判断是否存在突变：

a.当质控管荧光信号15≤CT≤24，而相应的突变检测管均无扩增曲线时，或者当相应的突变检测管与质控管荧光信号ΔCt＞10时，该待检样本结果判读为阴性，即无相应突变；

b.当质控管荧光信号15≤CT≤24，而相应的突变检测管扩增曲线阳性，且相应的突变检测管与质控管荧光信号ΔCt≤10时，该待检样本结果判读为阳性，即存在相应的突变；

c.当质控管荧光信号CT＜15时，表示待检样本DNA加入量过高，需减少待检样本DNA加入量重新检测；

d.当质控管荧光信号CT＞24或无扩增曲线时，表示待检样本DNA加入量过低或待检样本DNA提取失败，需增加待检样本DNA用量或重新提取待检样本DNA。

上述检测方法中，采用中高退火-低退火的PCR扩增程序，较普通touchdown程序更加高效地、特异地、灵敏地扩增突变型样本，减弱对野生型样本的扩增，从而进一步拉大突变型样本与野生型样本的CT值差距。PCR扩增条件为：

本发明中高退火-低退火PCR扩增程序中，前10个循环的退火温度为62℃，后35个循环的退火温度为58℃。在前10个循环的中高退火温度下，虽然引物整体扩增效率较低，但有利于ARMS引物与突变型样本的特异性扩增，有利于突变型样本的量的积累，而此时野生型样本极少扩增；从而使得后35个循环的低退火温度下，进一步拉开突变样本与野生样本的CT值，更加特异灵敏地区分突变型样本与野生型样本。另外，本扩增程序也在一定程度上减弱了因循环数过多而导致的非特异性，从而使得模板基因组DNA的用量进一步降低。

进一步的，步骤(2)中，在进行实时荧光定量PCR扩增时，每支突变检测管和质控管同时设置阳性对照实验和阴性对照实验，阳性对照是为了排除假阴性，用于判断试剂、仪器、操作是否有问题；阴性对照是为了排除假阳性，用于判断是否存在污染。阳性对照实验除了用7种突变型重组质粒的混合液(阳性对照混合液)代替待检样本的DNA外，其他成分和PCR扩增方法与质控管和突变检测管中的相同；阴性对照实验除了用超纯水代替待检样本的DNA外，其他成分和PCR扩增方法与质控管和突变检测管中的相同。

进一步的，上述检测方法中，所述待检样本选自：新鲜冰冻或者石蜡包埋的肿瘤组织。

本发明具有以下优点：

1.灵敏度高：可以在10ng野生型基因组DNA背景下准确检出1％的突变DNA；

2.特异性强：针对7种不同突变位点设计ARMS引物，个别引物的突变位点添加LNA修饰，增强了与突变型基因组的结合能力，从而增大突变型样本和野生型样本扩增效率的差异；将ARMS引物与通用下游引物PCR后的扩增产物进行测序，测序结果均为突变位点与下游引物之间的碱基序列，表明扩增产物为单一特异性扩增，不存在非特异扩增。

3、个别引物的突变位点添加LNA修饰，增强了引物的扩增有效性，以3×10²copies G12C突变型重组质粒为例，用不加LNA修饰的ARMS引物扩增，CT值＝27.03；用加LNA修饰的ARMS引物扩增，CT值＝23.88。这表明加入LNA修饰使得ARMS引物的扩增有效性增强，CT值减小。

4.使用荧光定量PCR技术进行检测，检测过程均为闭管反应，显著降低污染，并且加入UNG酶防污染系统和内控系统，能更加准确、稳定地对样品进行分型检测，确保结果真实可信；

5.操作简单快速，能在100分钟内完成检测，并且结果判读简单客观，便于分析。

附图说明

图1本发明试剂盒对G12C突变型石蜡样本检测结果(突变检测管和质控管FAM信号)，突变检测管CT值24.20，质控管CT值18.17。

图2本发明试剂盒对G12C突变型石蜡样本检测结果(其余6支突变检测管与质控管FAM信号)，其余6支突变检测管CT值none，质控管CT值18.17。

图3本发明试剂盒对G12C突变型石蜡样本检测结果(7支突变检测管HEX信号(内控))，CT值分别为22.77、23.14、22.07、23.65、23.78、22.61、22.82。

图4 G12C突变型石蜡样本的测序验证结果。

具体实施方式

下面将结合附图以及进一步的详细说明来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。

下述实施例中，所用仪器和试剂如下：

实时荧光定量PCR仪：Bio-Rad CFX96。

石蜡样本DNA提取试剂盒：QIAamp DNA FFPE Tissue Kit，货号56404。

所有引物及探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

dUTP及UNG酶购自上海近岸蛋白科技有限公司。

PCR混合反应液[SuperReal PreMix(Probe)，货号FP206-02]购自天根生化科技(北京)有限公司。

超纯水购自英潍捷基(上海)贸易有限公司。

实施例1

1、根据Cosmic数据公布的KRAS基因2号外显子的12和13号密码子的野生型基因序列和7种突变基因序列，设计ARMS引物、通用下游引物、特异性探针、质控引物和质控探针，设计的引物和探针可以按照现有方法进行人工合成。

具体地，引物和探针如下所示：

其中，ARMS引物1和通用下游引物、ARMS引物2和通用下游引物、ARMS引物3和通用下游引物、ARMS引物4和通用下游引物、ARMS引物5和通用下游引物、ARMS引物6和通用下游引物、ARMS引物7和通用下游引物组成7对特异性引物，这7对特异性引物能够分别扩增KRAS基因的7种热点突变。

2、此外，还包括内控系统的内控引物和内控探针，如下所示：

上游内控引物(KRAS_IC_exon4_F8) 5’TGGTGTAGTGGAAACTAGG3’

下游内控引物(KRAS_IC_exon4_R5) 5’CAAAAGCAGTACCATGGAC3’

内控探针(KRAS_IC_exon4_TaqMan_probe) 5’HEX-CCATAACTTCTTGCTAAGTCCTGAGCC-3’BHQ1

3、试剂盒的设计：试剂盒包括上述7对特异性引物、一对内控引物、一对质控引物和特异性探针、内控探针、质控探针三种探针，除此之外，还包括PCR混合反应液，所述PCR混合反应液中含有DNA聚合酶、PCR Buffer、MgCl₂、dNTPs、dUTP、UNG酶等成分，在下述实施例中，所用的PCR混合反应液是通过向天根公司的[SuperReal PreMix(Probe)，货号FP206-02]中加入dUTP和UNG酶成分的方式构成的，该SuperReal PreMix(Probe)中包含两个热启动酶——化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶，具有更好的扩增效果。

进一步的，试剂盒中还包括阳性对照混合液和阴性对照混合液，所述阳性对照混合液为含有KRAS基因常见突变型DNA的7种重组质粒的混合液；所述阴性对照混合液为超纯水。

实施例2

采用本发明实施例1的试剂盒检测KRAS基因突变，包括以下步骤：

(1)待测样品处理和模板提取；

取新鲜冰冻或者石蜡包埋的人肿瘤组织，用提取试剂盒提取提取DNA，并对其进行定量稀释至5ng/μL，作为PCR检测的模板。

(2)使用本发明试剂盒，取1支质控管和7支突变检测管，7支突变检测管中分别加入待测样品DNA模板、PCR混合反应液、特异性探针和内控引物和内控探针，每支突变检测管中还分别加入由相应的ARMS引物和通用下游引物组成的一对特异性引物；1支质控管中加入待测样品DNA模板、PCR混合反应液、1对质控引物和质控探针，进行KRAS基因突变分型的ARMS-qPCR检测，所用机型可以为Bio-Rad CFX96。

7支突变检测管和1支质控管中各组分含量及终浓度如下：

7支突变检测管(总体积20μL)：

1支质控管(总体积20μL)：

进行PCR扩增反应的条件为：

(3)结果判读：

首先，如果突变检测管中的内控探针和特异性探针均无荧光信号检出，则实验结果不正常，需要重新提取DNA后再做或增加样本加入量后再做；如果突变检测管中的特异性探针有荧光信号检出，则实验结果正常，按照下述规则判断是否存在突变：

1)质控管FAM信号15≤CT≤24，相应ARMS引物管均无扩增曲线或者与质控管FAM信号ΔCt＞10，该样本结果判读为阴性；

2)质控管FAM信号15≤CT≤24，相应ARMS引物管扩增曲线阳性，且其与质控管FAM信号ΔCt≤10，该样本结果判读为阳性；

3)质控管FAM信号CT＜15，提示样品加入量过高，需减少样本加入量再做；

4)质控管FAM信号CT＞24或阴性，提示样本加入量过低或样本提取失败，需要增加样本用量或重新提取。

此外，为更加确保检测结果的准确性，在用突变检测管和质控管进行ARMS-qPCR检测的同时，对每支突变检测管和每支质控管设置阴性对照(Negative Control)实验和阳性对照(Positive Control)实验，阳性对照实验是取阳性对照管，加入与突变检测管和质控管相同的成分，但是用阳性对照混合液代替待检样品DNA，阴性对照实验是取阴性对照管，加入与突变检测管和质控管相同的成分，但是用阴性对照混合液(超纯水)代替待检样品DNA，加好后按照上述步骤(2)相同的条件进行PCR扩增。阴性对照实验中特异性探针、内控探针和质控探针均无突变信号时，结果为正常，阳性对照实验中的7支突变检测管中特异性探针和内控探针均有信号，且1支质控管中质控探针有信号时，结果为正常。

灵敏度检测实验

将7种突变型重组质粒的每一种分别加入对应的突变检测管(突变检测管中包括一对相应的特异性引物、特异性探针、PCR混合反应液、内控引物和内控探针)，如G12A质粒加入G12A突变检测管，G12V质粒加入G12V突变检测管，各质粒用量依次递减2.4×10^-4ng、2.4×10^-5ng、2.4×10^-6ng、2.4×10^-7ng、2.4×10^-8ng(换算成拷贝数为3×10⁴copies、3×10³copies、3×10²copies、3×10copies、3×1copies)，同时设置同等拷贝数的野生型基因组作为对照，用量依次递减100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng。采用上述ARMS-qPCR检测方法检测各基因突变，实验结果显示，100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng的野生型基因组均无荧光信号升起，而2.4×10^-4ng、2.4×10^-5ng、2.4×10^-6ng、2.4×10^-7ng的突变型重组质粒均有荧光信号升起，2.4×10^-8ng的突变型重组质粒无荧光信号升起，结果表明本发明引物探针最低可以检出3×10copies突变型重组质粒，且特异性好，能将野生型基因和突变基因区分开来；

在2.4×10^-7ng重组质粒中依次混入0.1ng野生型基因组、1ng野生型基因组、10ng野生型基因组、100ng野生型基因组(即在3×10copies重组质粒中依次混入3×10copies野生型基因组、3×10²copies野生型基因组、3×10³copies野生型基因组、3×10⁴copies野生型基因组)，同时设置同等拷贝数的野生型基因组作为对照，用量依次递增，0.1ng野生型基因组、1ng野生型基因组、10ng野生型基因组、100ng野生型基因组；按照上述同样的方法将以上重组质粒混野生型基因组或野生型基因组分别加入对应的突变检测管进行检测。实验结果显示，在3×10copies重组质粒中混入3×10copies野生型基因组有荧光信号升起，在3×10copies重组质粒中混入3×10²copies野生型基因组有荧光信号升起，在3×10copies重组质粒中混入3×10³copies野生型基因组有荧光信号升起，在3×10copies重组质粒中混入3×10⁴copies野生型基因组没有荧光信号升起。结果表明，在3×10³copies野生型基因组背景下最低可以检出3×10copies重组质粒，即在10ng野生型基因组DNA背景下检出1％的突变DNA。

特异性检测实验

以G12C突变型为例验证本发明引物探针的特异性。采用上述试剂盒和方法对G12C突变型石蜡样本进行PCR扩增检测，7支突变检测管的HEX信号(内控)见图3，CT值分别为22.77、23.14、22.07、23.65、23.78、22.61、22.82，说明实验正常，结果可行。

G12C突变检测管和质控管中FAM信号见图1，G12C突变检测管CT值为24.20，质控管CT值为18.17。其余6支突变检测管与质控管中FAM信号见图2，其余6支突变检测管CT值为none，质控管CT值为18.17。说明本发明准确地检测出了G12C突变型。

将该G12C突变型石蜡样本进行测序，所得结果如图4所示，测序结果显示本发明试剂盒检测结果准确，特异性强，扩增产物为单一特异性扩增，不存在非特异扩增。

实施例3检测方法的实际应用

采用本发明试剂盒和检测方法检测肿瘤患者KRAS基因2号外显子的12、13号密码子是否存在突变，方法如下：

1、待检样本获取和模板提取

选择63例非小细胞肺癌患者和结直肠癌患者，取非小细胞肺癌患者肺部及结直肠癌患者肠道来源的石蜡包埋组织切片，作为检测样本，使用Qiagen公司的QIAamp石蜡包埋组织提取试剂盒(Cat No.56404)提取DNA,并对其进行定量稀释至5ng/μL，作为PCR检测的模板。

2、进行实时荧光定量PCR扩增

对上述63个样本分别进行PCR检测，方法为：每个样本DNA分别用7支突变检测管和1支质控管进行检测，7支突变检测管中分别加入样本DNA、PCR混合反应液、相应的特异性引物、特异性探针和内控系统；1支质控管中加入样本DNA、PCR混合反应液、1对质控引物和质控探针，进行KRAS基因突变分型的ARMS-qPCR检测；同时设置阳性和阴性对照实验。适用机型为Bio-Rad CFX96。

7支突变检测管：

1支质控管：

组分	体积(μL)	终浓度/L
			样本DNA	2	0.5mg
IR_GAPD_exon8_F3	0.4	0.2μM
			IR_GAPD_exon8_R1	0.4	0.2μM
IR_GAPD_TaqMan_probe	0.25	0.125μM
			2*SuperRealPreMix(Probe)	10	1*
超纯水	6.95

进行PCR扩增反应的条件为：

3、检测结果：

阴性对照实验和阳性对照实验结果显示正常，按照实施例2中的判读标准对结果进行判读，结果显示：

63例石蜡样本中，共检测出19例突变型，其中G12A突变阳性2例，G12C突变阳性1例，G12D突变阳性6例,G12S突变阳性3例,G12V突变阳性2例，G13D突变阳性5例；其余44例检测结果为阴性。

在进行ARMS-qPCR检测的同时，本发明对上述样本同时进行了测序验证，结果表明，63例的检测结果与测序结果符合，剩余1例用本试剂盒检测为G13D阳性而第一次测序检测为阴性，后重复测序验证为G13D阳性。

<110>山东维真生物公司

<120>用于检测人类KRAS基因7种热点突变的引物探针组合物、试剂盒及检测方法

<160>15

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

TTGTGGTAGT TGGAGCAGC 19

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

CTTGTGGTAG TTGGAGCTT 19

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

CTTGTGGTAG TTGGAGCGGA 20

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

CTTGTGGTAG TTGGAGCTC 19

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

CTTGTGGTAG TTGGAGCAA 19

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

TTGTGGTAGT TGGAGCTGT 19

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>7

TGGTAGTTGG AGCTGGTAA 19

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>8

CTATTGTTGG ATCATATTC 19

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>9

AAGAGTGCCT TGACGATAC 19

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>10

AGGTAGAGGG GTGATGTG 18

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>11

CTCAGTGTAG CCCAGGATG 19

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<400>12

CAAGGTCATC CCTGAGCTGA ACGG 24

<210>13

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>13

TGGTGTAGTG GAAACTAGG 19

<210>14

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>14

CAAAAGCAGT ACCATGGAC 19

<210>15

<211>27

<212>DNA

<213>人工合成

<400>15

CCATAACTTC TTGCTAAGTC CTGAGCC 27

Claims

1.一种检测人类KRAS基因7种热点突变的引物探针组合物，其特征是：包括7对特异性引物和一种特异性探针，所述7对特异性引物是由7种ARMS引物分别和一种通用下游引物组成的；所述引物和探针如下：

ARMS引物1：5’TTGTGGTAGTTGGAGCAGC3’

ARMS引物2：5’CTTGTGGTAGTTGGAGCTT3’

ARMS引物3：5’CTTGTGGTAGTTGGAGCGGA3’

ARMS引物4：5’CTTGTGGTAGTTGGAGCTC3’

ARMS引物5：5’CTTGTGGTAGTTGGAGCAA3’

ARMS引物6：5’TTGTGGTAGTTGGAGCTGT3’

ARMS引物7：5’TGGTAGTTGGAGCTGGTAA3’

通用下游引物: 5’CTATTGTTGGATCATATTC3’

特异性探针: 5’AAGAGTGCCTTGACGATAC3’。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征是：还包括质控系统或/和内控系统，所述质控系统为一对质控引物和相应的质控探针，所述内控系统为一对内控引物和相应的内控探针，具体如下：

质控引物：

上游引物：5’AGGTAGAGGGGTGATGTG3’

下游引物：5’CTCAGTGTAGCCCAGGATG3’

质控探针：5’ CAAGGTCATCCCTGAGCTGAACGG3’；

内控引物：

上游引物：5’TGGTGTAGTGGAAACTAGG3’

下游引物：5’CAAAAGCAGTACCATGGAC3’

内控探针：5’ CCATAACTTCTTGCTAAGTCCTGAGCC3’。

3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合物，其特征是：ARMS引物2的第17位C碱基用LNA修饰，ARMS引物4的第17位C碱基用LNA修饰，ARMS引物6的第17位T碱基用LNA修饰。

4.根据权利要求1、2或3所述的引物探针组合物，其特征是：所有探针的5’端均标记有荧光报告基团，3’端均标记有荧光淬灭基团；优选的，特异性探针和质控探针5’端均修饰有FAM，3’端均修饰有BHQ1，内控探针5’端修饰有HEX，3’端修饰有BHQ1。

5.一种检测人类KRAS基因7种热点突变的试剂盒，其特征是：包括权利要求1-4中任一项所述的检测人类KRAS基因7种热点突变的引物探针组合物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征是：还包括PCR混合反应液，或者是包括PCR混合反应液和下述a、b成分中的至少一种：

a. 阳性对照混合液，所述阳性对照混合液为7种重组质粒的混合物，所述7种重组质粒为含有KRAS基因2号外显子的第12和13号密码子的常见7种突变DNA的重组质粒；

b. 空白对照混合液，所述空白对照混合液为超纯水；

所述PCR混合反应液包括DNA聚合酶、PCR Buffer、MgCl2、dNTPs和UNG酶。

7.一种检测人类KRAS基因7种热点突变的方法，其特征是：包括使用权利要求1-4中任一项所述的检测人类KRAS基因7种热点突变的引物探针组合物或权利要求5或6所述的检测人类KRAS基因7种热点突变的试剂盒检测KRAS基因2号外显子的第12和13号密码子的常见7种突变的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征是：包括以下步骤：

（1）提取待检样本的DNA，作为PCR检测的基因模板；

（2）取7支突变检测管和1支质控管，向每支突变检测管中均加入待检样本的DNA、一对相应的特异性引物、特异性探针、PCR混合反应液、内控引物和内控探针，向质控管中加入待检样本的DNA、PCR混合反应液、质控引物和质控探针，然后进行实时荧光定量PCR扩增；

（3）收集荧光信号，通过荧光信号判断是否存在突变。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征是：步骤（3）中，如果突变检测管中的内控探针和特异性探针均无荧光信号检出，则说明实验失败，需要重新进行实验；如果突变检测管中的特异性探针有荧光信号检出，则无论内控探针有无荧光信号被检出，均说明实验结果正常，按照下述规则判断是否存在突变：

a.当质控管荧光信号 15≤CT≤24，而相应的突变检测管均无扩增曲线时，或者当相应的突变检测管与质控管荧光信号ΔCt＞10时，该待检样本结果判读为阴性，即无相应突变；

b.当质控管荧光信号 15≤CT≤24，而相应的突变检测管扩增曲线阳性，且相应的突变检测管与质控管荧光信号ΔCt≤10时，该待检样本结果判读为阳性，即存在相应的突变；

c. 当质控管荧光信号CT＜15时，表示待检样本DNA加入量过高，需减少待检样本DNA加入量重新检测；

d. 当质控管荧光信号CT＞24或无扩增曲线时，表示待检样本DNA加入量过低或待检样本DNA提取失败，需增加待检样本DNA用量或重新提取待检样本DNA。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征是：PCR扩增的条件为：先95.0℃ 30秒，然后95.0℃ 10秒------62.0℃ 15秒------72.0℃ 15秒连续10个循环，然后95.0℃ 10秒------58.0℃15秒------72.0℃ 15秒连续35个循环。