CN112322739B - 一种检测adgrg6高频突变位点的方法及试剂盒 - Google Patents

一种检测adgrg6高频突变位点的方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN112322739B
CN112322739B CN202011330770.4A CN202011330770A CN112322739B CN 112322739 B CN112322739 B CN 112322739B CN 202011330770 A CN202011330770 A CN 202011330770A CN 112322739 B CN112322739 B CN 112322739B
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
ixna
chr
control
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011330770.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112322739A (zh
Inventor
吴松
欧铜
徐银燕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Luohu Peoplel's Hospital
Original Assignee
Shenzhen Luohu Peoplel's Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Luohu Peoplel's Hospital filed Critical Shenzhen Luohu Peoplel's Hospital
Priority to CN202011330770.4A priority Critical patent/CN112322739B/zh
Publication of CN112322739A publication Critical patent/CN112322739A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112322739B publication Critical patent/CN112322739B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种检测ADGRG6高频突变位点的方法及试剂盒，其中，所述试剂盒包括chr.6:142,706,206 G>A突变位点的引物G>A‑F，引物G>A‑R及探针G>A‑PF；chr.6:142,706,209 C>T突变位点的引物C>T‑R，引物C>T‑F及探针C>T‑PR；内参引物Control‑F，内参引物Control‑R及探针Control‑PR。本发明提供的试剂盒能够有效检测ADGRG6高频突变位点的突变情况，其具有操作简单、灵敏度高、特异性高和成本低等优点，非常适用于临床ADGRG6序列高频突变位点的检测。

Description

一种检测ADGRG6高频突变位点的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及突变位点检测领域，特别涉及一种检测ADGRG6高频突变位点的方法及试剂盒。
背景技术
膀胱癌为泌尿生殖系统常见恶性肿瘤，近年来其发病率有上升的趋势，且发病趋于年轻化。目前，主要通过膀胱镜检查诊断膀胱癌，但其是一种有创检查，且费用高，部分患者因尿道生理原因不适合膀胱镜检。
因此需要探寻一些无创，灵敏度高，特异性好且操作方便的检测试剂盒，辅助膀胱癌的早期诊断及治疗。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种操作简单、灵敏度高、特异性高其成本较低的检测ADGRG6高频突变位点的方法及试剂盒。
本发明的技术方案如下：
一种检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒，其中，包括chr. 6: 142,706,206 G>A突变位点（参考基因组hg19）的引物G>A-F，引物G>A-R及探针G>A-PF；chr. 6:142,706,209 C>T突变位点（参考基因组hg19）的引物C>T-R，引物C>T-F及探针C>T-PR；内参引物Control-F，内参引物Control-R及探针Control-PR。
所述检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒，其中，所述引物G>A-F的序列如SEQ ID.1所示；所述引物G>A-R的序列如SEQ ID.2所示；所述探针G>A-PF的序列如SEQ ID.3所示。
所述检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒，其中，所述引物C>T-R的序列如SEQ ID.4所示，所述引物C>T-F的序列如SEQ ID.5所示；所述探针C>T-PR的序列如SEQ ID.6所示。
所述检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒，其中，所述内参引物Control-F的序列如SEQ ID.7所示，所述内参引物Control-R的序列如SEQ ID.8所示；所述探针Control-PR的序列如SEQ ID.9所示。
所述检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒，其中，还包括10*PCR 缓冲液、Mg2+、dNTPs以及HSTaq酶。
一种检测ADGRG6高频突变位点的方法，其中，包括步骤：
采用本发明所述的试剂盒对待测样品进行PCR扩增，得到扩增后样品；
测量扩增后样品的ΔCt值= Ct值FAM -Ct值HEX；
若chr. 6: 142,706,206 G>A突变位点体系扩增后样品的ΔCt值<14，则判定待测样品为chr. 6: 142,706,206 G>A突变位点突变型，若扩增后样品的ΔCt值>14，则判定待测样品为chr. 6: 142,706,206 G>A突变位点野生型。
若chr. 6:142,706,209 C>T突变位点体系扩增后样品的ΔCt值<14，则判定待测样品为chr. 6:142,706,209 C>T突变位点突变型，若扩增后样品的ΔCt值>14，则判定待测样品为chr. 6:142,706,209 C>T突变位点野生型。
有益效果：本发明提供了一种检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒，该试剂盒能够有效检测ADGRG6高频突变位点的突变情况，其具有操作简单、灵敏度高、特异性高和成本低等优点，非常适用于临床ADGRG6序列高频突变位点的检测。
附图说明
图1为本发明一种检测ADGRG6高频突变位点的方法较佳实施例的流程图。
图2为本发明实施例2中chr. 6: 142,706,206 G>A突变比例最低检测限的FAM及HEX荧光扩增曲线图。
图3为本发明实施例2中chr. 6:142,706,209 C>T突变比例最低检测限的FAM及HEX荧光扩增曲线图。
图4为本发明实施例3中样本编号为5 ng的人基因组DNA中chr. 6: 142,706,206G>A突变位点的FAM及HEX荧光扩增曲线图。
图5为本发明实施例3中样本编号为5 ng + 30 copy的人基因组与突变质粒混合DNA中chr. 6: 142,706,206 G>A突变位点的FAM及HEX荧光扩增曲线图。
图6为本发明实施例3中样本编号为5 ng的人基因组DNA中chr. 6:142,706,209 C>T突变位点的FAM及HEX荧光扩增曲线图。
图7为本发明实施例3中样本编号为5 ng + 30 copy的人基因组组与突变质粒混合DNA中chr. 6:142,706,209 C>T突变位点的FAM及HEX荧光扩增曲线图。
图8为本发明实施例7中膀胱癌样本-1 chr. 6: 142,706,206 G>A检测的FAM及HEX荧光扩增曲线图。
图9为本发明实施例7中膀胱癌样本-1 chr. 6: 142,706,206 G>A的测序结果分型结果图。
图10为本发明实施例7中膀胱癌样本-1 chr. 6:142,706,209 C>T检测的FAM及HEX荧光扩增曲线图。
图11为本发明实施例7中膀胱癌样本-1 chr. 6:142,706,209 C>T的测序结果分型结果图。
具体实施方式
本发明提供一种检测ADGRG6高频突变位点的方法及试剂盒，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
膀胱癌全基因组遗传突变特征普分析发现，ADGRG6基因在膀胱癌中存在高频突变现象，其突变频率仅低于TERT。ADGRG6是一种新型粘附G蛋白偶联受体，具有重要的生物学功能，其表达与突变关联肿瘤预后。ADGRG6基因的高频突变率及重要生物学功能提示其突变位点可作为膀胱癌早期辅助诊断或特异性靶向治疗的新靶点。
健康人群中，ADGRG6序列为野生型；在膀胱癌患者组织中可特异性检出ADGRG6基因的两个高频突变位点（chr. 6: 142,706,206 G>A 和 chr. 6:142,706,209 C>T），存在突变位点的ADGRG6序列为突变型。
本发明提出基于扩增阻碍突变系统（Amplification Refractory MutationSystem，ARMS）和荧光PCR技术可实现检测样本中ADGRG6高频突变位点chr. 6: 142,706,206 G>A 和 chr. 6:142,706,209 C>T的检测。基于ARMS-PCR引物的3' 端末位碱基必须与其模板DNA 互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性PCR 扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3' 碱基与模板配对时才能出现PCR 扩增带，从而检测出ADGRG6序列的两个高频突变。
为实现上述目的，本发明提供了一种检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒，其包括chr. 6: 142,706,206 G>A突变位点的引物G>A-F，引物G>A-R及探针G>A-PF；chr. 6:142,706,209 C>T突变位点的引物C>T-R，引物C>T-F及探针C>T-PR；内参引物Control-F，内参引物Control-R及探针Control-PR。
在本实施例中，所述引物G>A-F,引物 G>A-R及探针G>A-PF可识别并结合于位点chr. 6: 142,706,206 G>A突变的ADGRG6序列；引物C>T-R, 引物C>T-F及探针C>T-PR可识别并结合于chr. 6:142,706,209 C>T突变的ADGRG6序列；所述内参引物Control-F, 内参引物Control-R及探针Control-PR 可识别并结合于未突变的ADGRG6序列。所述G>A-PF和C>T-PR的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端连接有荧光猝灭基团BHQ-1，Control-PR的5’端连接有荧光报告基团HEX，3’端连接有荧光猝灭基团BHQ-1，故以下结果中FAM代表ADGRG6突变型序列，HEX代表野生型序列。
在一些实施方式中，所述引物G>A-F的序列如SEQ ID.1所示，具体为：5’ TAATTCTAACTAAGTATTTCACTCTTTGTAAA 3’；引物G>A-R的序列如SEQ ID.2所示，具体为：5’AGCACCGTATAAATGTTCTTGGA 3’；所述探针G>A-PF的序列如SEQ ID.3所示，具体为：5’6 FAM-CCTCTG/iXNA_T/GGTATT/iXNA_C/T/iXNA_C/CCT/iXNA_C/CAG-BHQ-1 3’。在本实施例中，所述序列中出现的/iXNA_T/、/iXNA_C/及/iXNA_G/表示锁核苷酸修饰，所述iXNA，即 LNA，又称“锁核酸”（Locked nucleic acid，LNA），是一种经过修饰的类寡核苷酸衍生物。iXNA_T、 iXNA_C以及iXNA_G结构可降低核糖结构的柔韧性，增加磷酸盐骨架局部结构的稳定性。因此，所述锁核苷酸修饰可以增加探针的融解温度，加强探针的稳定性，还可以增加实验的特异性跟灵敏性。在一些实施方式中，所述引物C>T-R的序列如SEQ ID.4所示，具体为：5’AGAATACCACAGAGGCTCTTTGTAAA 3’；所述引物C>T-F的序列如SEQ ID.5所示，具体为：5’CAAGGAGATTTATGATGGAGCAA 3’；所述探针C>T-PR的序列如SEQ ID.6所示，具体为：5’6 FAM-CTACTG/iXNA_G/CTAGAGT/iXNA_C/CATG/iXNA_T/GAAA/iXNA_T/ATG-BHQ-1 3’。在本实施例中，所述序列中出现的/iXNA_T/、/iXNA_C/及/iXNA_G/表示锁核苷酸修饰，，所述iXNA，即LNA，又称“锁核酸”（Locked nucleic acid，LNA），是一种经过修饰的类寡核苷酸衍生物。iXNA_T、iXNA_C以及iXNA_G结构可降低核糖结构的柔韧性，增加磷酸盐骨架局部结构的稳定性。因此，所述锁核苷酸修饰可以增加探针的融解温度，加强探针的稳定性，还可以增加实验的特异性跟灵敏性。
在一些实施方式中，所述内参引物Control-F的序列如SEQ ID.7所示，具体为：5’CTGCTTATTCCATCCAGTTCA 3’；所述内参引物Control-R的序列如SEQ ID.8所示，具体为：5’AGGTCCTCCAGTGTCTTC 3’；所述探针Control-PR的序列如SEQ ID.9所示，具体为：5’6 HEX-TGTACCTTGGATTCACTGGCCTGTC-BHQ-1 3’。在一些实施方式中，所述检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒还包括10*PCR 缓冲液、Mg2+、dNTPs以及HSTaq酶。在一些具体的实施方式中，所述检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒包括如表1，表2所示的反应体系：表1反应体系1
试剂 体积
10×PCR 缓冲液 5 ul
MgCl2（40 mM） 4 ul
dNTP（2.5 mM） 2.5 ul
G>-F(10 pM) 2.5 ul
G>A-R (10 pM) 2.5 ul
G>A-PR(10 pM) 0.5 ul
Control-F (10 pM) 0.2 ul
Control-R (10 pM) 0.2 ul
Control-PR (10 pM) 0.5 ul
HSTaq酶 0.2 ul
DNA模板 (0.2*TE，不超过2 ng/ul) 5 ul
无菌双蒸水 Up to 50 ul
表2反应体系2
试剂 体积
10×PCR 缓冲液 5 ul
MgCl2（40 mM） 4 ul
dNTP（2.5 mM） 2.5 ul
C>T-F(10 pM) 2.5 ul
C>T-R (10 pM) 2.5 ul
C>T-PF(10 pM) 0.5ul
Control-F (10 pM) 0.2 ul
Control-R (10 pM) 0.2 ul
Control-PR (10 pM) 0.5 ul
HSTaq酶 0.2 ul
DNA模板 (0.2*TE，不超过2 ng/ul) 5 ul
无菌双蒸水 Up to 50 ul
在一些实施方式中，基于所述试剂盒，还提供一种检测ADGRG6高频突变位点的方法，如图1所示，其包括步骤：
S10、采用本发明所述的试剂盒对待测样品进行PCR扩增，得到扩增后样品；
S20、测量扩增后样品的ΔCt值= Ct值FAM -Ct值HEX；
S30、若chr. 6: 142,706,206 G>A突变位点体系（反应体系1）扩增后样品的ΔCt值<14，则判定待测样品为chr. 6: 142,706,206 G>A突变位点突变型，若扩增后样品的ΔCt值>14，则判定待测样品为chr. 6: 142,706,206 G>A突变位点野生型；
S40、若chr. 6:142,706,209 C>T突变位点体系（反应体系2）扩增后样品的ΔCt值<14，则判定待测样品为chr. 6:142,706,209 C>T突变位点突变型，若扩增后样品的ΔCt值>14，则判定待测样品为chr. 6:142,706,209 C>T突变位点野生型。
在本实施例中，所述PCR扩增的反应程序如下所示：1、95℃条件下反应5 min；2、进行8个循环，每个循环包括：95℃条件下反应30 sec，65℃条件下反应30 sec，72℃条件下反应45 sec；3、进行40个循环，每个循环包括：95℃条件下反应30 sec，60℃条件下反应30sec，72℃条件下反应40 sec。
下面通过具体实施例对本发明一种检测ADGRG6高频突变位点的方法及试剂盒做进一步的解释说明：
实施例1
提供一种检测ADGRG6两个高频突变位点chr. 6: 142,706,206 G>A 和 chr. 6:142,706,209 C>T的试剂盒，其包括chr. 6: 142,706,206 G>A突变位点的引物G>A-F，引物G>A-R及探针G>A-PF；chr. 6:142,706,209 C>T突变位点的引物C>T-R，引物C>T-F及探针C>T-PR；内参引物Control-F，内参引物Control-R及探针Control-PR，其中，G>A-F：5’ TAATTCTAACTAAGTATTTCACTCTTTGTAAA 3’G>A-R：5’ AGCACCGTATAAATGTTCTTGGA 3’G>A-PF：5’6FAM- CCTCTG/iXNA_T/GGTATT/iXNA_C/T/iXNA_C/CCT/iXNA_C/CAG-BHQ-1 3’
C>T-R：5’ AGAATACCACAGAGGCTCTTTGTAAA 3’C>T-F：5’CAAGGAGATTTATGATGGAGCAA 3’C>T-PR: 5’6 FAM- CTACTG/iXNA_G/CTAGAGT/iXNA_C/
CATG/iXNA_T/GAAA/iXNA_T/ATG-BHQ-1 3’Control-F：5’CTGCTTATTCCATCCAGTTCA 3’Control-R：5’ AGGTCCTCCAGTGTCTTC 3’Control-PR：5’6 HEX-TGTACCTTGGATTCACTGGCCTGTC-BHQ-1 3’。实施例2研究实施例1反应体系中突变比例的最低检测限评估在突变比例最低检测限评估中，chr. 6: 142,706,206 G>A 和 chr. 6:142,706,209 C>T两种ADGRG6突变类型分别设置3个突变比例（人基因组DNA提取液中分别添加相应的突变质粒，人基因组DNA的终浓度为10 ng/ ul,突变质粒的终浓度分别为10、20与30copy/ul，其对应的突变比例分别约为0.33%、0.66%与1.00%； 3000拷贝的人单倍体基因组质量约为10 ng），每个特定的突变比例进行20次重复检测，通过3次重复试验，评估ADGRG6两种突变的最低检测限；最终确定两种突变位点在10 ng基因组DNA背景下不低于95%检出率的最低检测限均为30 copy/ul，即突变比例的最低检测限约为1.00%。ADGRG6两个高频突变位点chr. 6: 142,706,206 G>A 和 chr. 6:142,706,209 C>T的最低检测限的FAM及HEX荧光扩增曲线分别如图2和图3所示。实施例3本实施例利用实施例1所述试剂盒对不同提取浓度人基因组DNA背景中ADGRG6两个高频突变位点chr. 6: 142,706,206 G>A 和 chr. 6:142,706,209 C>T的检出情况进行检测。1、反应体系配置按表1，表2分别配置反应体系，严格的避光条件下，在冰上配置反应体系，按上述反应程序进行反应。所述DNA模板分为两组，A组为5 ng/ ul, 8 ng/ ul及10 ng/ ul的基因组DNA，B组为在A组的基因组DNA浓度基础上，每个浓度加入ADGRG6突变质粒DNA，使其终浓度为30 copy/ul。2、结果判断标准本发明试剂盒可用于检测ADGRG6两个高频突变位点，从而对ADGRG6突变情况进行诊断。检测结果可用ΔCt值= Ct值FAM -Ct值HEX判断：（1）ADGRG6chr. 6: 142,706,206 G>A突变位点野生型：FAM及HEX荧光扩增曲线平滑，呈“S”型；且ΔCt值>14；
（2）ADGRG6chr. 6: 142,706,206 G>A突变位点突变型：FAM及HEX荧光扩增曲线平滑，呈“S”型；且ΔCt值<14；
（3）ADGRG6chr. 6:142,706,209 C>T突变位点野生型：FAM及HEX荧光扩增曲线平滑，呈“S”型；且ΔCt值>14；
（4）ADGRG6chr. 6:142,706,209 C>T突变位点突变型：FAM及HEX荧光扩增曲线平滑，呈“S”型；且ΔCt值<14。
3、检测结果按上述配置的DNA模板中，各浓度的DNA具有均有两条平滑的扩增曲线，呈“S”型；检测结果均符合判断标准，检测结果如表3，表4所示，当提取的检测样本基因组DNA浓度大于5 ng/ ul， 突变序列的浓度在30 copy/ul且突变比例大于等于1%时，ADGRG6两个高频突变位点chr. 6: 142,706,206 G>A 和 chr. 6:142,706,209 C>T均能检出，且检测结果与实际分型符合率为100%。表3 混合质粒chr. 6: 142,706,206 G>A 突变位点检测结果
样本编号 Ct值FAM Ct值HEX ΔCt值 ADGRG6 chr. 6: 142,706,206 G>A 分型
5 ng（图4） 37.29 21.54 15.75 野生型
8 ng 37.20 21.30 15.90 野生型
10 ng 36.09 20.67 15.42 野生型
5 ng + 30 copy（图5） 32.94 22.64 10.3 突变型
8 ng + 30 copy 33.25 21.59 11.66 突变型
10 ng + 30 copy 32.11 20.82 11.29 突变型
表4 混合质粒chr. 6:142,706,209 C>T 突变位点检测结果
样本编号 Ct值FAM Ct值HEX ΔCt值 ADGRG6 chr. 6:142,706,209 C>T分型
5 ng（图6） 36.43 22.08 14.35 野生型
8 ng 36.83 21.37 15.46 野生型
10 ng 36.63 20.98 15.65 野生型
5 ng + 30 copy（图7） 34.86 22.54 12.32 突变型
8 ng + 30 copy 33.83 21.61 12.22 突变型
10 ng + 30 copy 34.33 20.96 13.37 突变型
表3，表4中，样本编号为5 ng的基因组DNA的chr. 6: 142,706,206 G>A 突变位点及chr. 6:142,706,209 C>T 突变位点的FAM及HEX荧光扩增曲线如图4和图6所示；样本编号为5 ng + 30copy的基因组与突变质粒混合DNA的chr. 6: 142,706,206 G>A 突变位点及chr. 6:142,706,209 C>T 突变位点的FAM及HEX荧光扩增曲线如图5和图7所示。
实施例4
研究反应体系中Mg2+添加体积对检测结果的影响
PCR反应体系中Mg2+以外其他组分的体积同表2，按反应程序，进行不同Mg2+添加体积的检测。分别配置添加以下Mg2+体积的反应体系：3 ul、4 ul、5 ul和6 ul。结果表明，当Mg2+在反应体系中的添加体积在3~6 ul时均能实现检测，其中，当Mg2+在反应体系中的添加体积为4 ul时，检测体系的扩增效率好且野生型与突变型Ct的差值最大（检测结果最佳），因此其它实施例中都采用的是添加4 ul Mg2+的反应体系。
实施例5
研究反应体系中dNTP添加体积对检测结果的影响
PCR反应体系中dNTP以外其他组分的体积同表2，按反应程序，进行不同dNTP添加体积的检测。分别配置添加以下dNTP体积的反应体系：2 ul、2.5 ul和3 ul。结果表明，当dNTP在反应体系中的添加体积在2~3 ul时均能实现检测，其中，当dNTP在反应体系中的添加体积为2.5 ul时，检测体系的扩增效率好且野生型与突变型Ct的差值最大（检测结果最佳），因此其它实施例中都采用的是添加2.5 ul dNTP的反应体系。
实施例6
研究反应体系中探针添加体积对检测结果的影响
PCR反应体系中探针以外其他组分的体积同表2，按反应程序，进行不同探针添加体积的检测。分别配置添加0.4 ul、0.5 ul与0.6 ul探针 C>T-PR的反应体系和0.4 ul、0.5ul与0.6 ul探针Control-PR的反应体系。结果表明，在反应体系中添加以上探针体积，均能实现检测，其中，当探针 C>T-PR和Control-PR在反应体系中的添加体积均为0.5 ul时，检测体系的扩增效率好且野生型与突变型Ct的差值最大（检测结果最佳），因此其它实施例中都采用的是添加G>A-PR /C>T-PR和Control-PR探针各0.5 ul的反应体系。
实施例7
本实施例对2例膀胱癌患者的临床样本进行了ADGRG6两个高频突变位点chr. 6:142,706,206 G>A 和 chr. 6:142,706,209 C>T的突变检测。取2例膀胱癌患者的膀胱癌组织，提取DNA后利用实施例1所述试剂盒，按照表1，表2所述检测方法进行检测。检测结果显示在2例膀胱癌组织样本中ADGRG6均发生了chr. 6: 142,706,206 G>A 和chr. 6:142,706,209 C>T位点的突变。其检测结果如表5，表6所示：
表5 临床样本chr. 6: 142,706,206 G>A位点突变检测结果
表6 临床样本chr. 6:142,706,209 C>T位点检测结果
所述表5中，膀胱癌样本-1 chr. 6: 142,706,206 G>A位点突变检测的FAM及HEX荧光扩增曲线图如图8所示，所述膀胱癌样本-1对应位点的测序结果如图9所示。所述表6中，膀胱癌样本-1 chr. 6:142,706,209 C>T位点突变检测的FAM及HEX荧光扩增曲线图如图10所示，所述膀胱癌样本-1对应位点的测序结果如图11所示。上述实验结果显示，检测的膀胱癌患者临床样本检出的ΔCt值均小于14，2例膀胱癌样本中均存在ADGRG6序列高频突变位点chr. 6: 142,706,206 G>A和chr. 6:142,706,209 C>T的突变，都属于突变型，其分型结果与一代测序结果完全符合。以上结果表明本发明试剂盒在用于ADGRG6序列高频突变位点检测时具有很好的准确性。
综上所述，本发明提供了一种检测ADGRG6高频突变位点的试剂盒，该试剂盒能够有效检测ADGRG6高频突变位点的突变情况，其具有操作简单、灵敏度高、特异性高和成本低等优点，非常适用于临床ADGRG6序列高频突变位点的检测。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
<110> 深圳市罗湖区人民医院
<120> 一种检测ADGRG6高频突变位点的方法及试剂盒
<160> 9
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 1
taattctaac taagtatttc actctttgta aa 32
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 2
agcaccgtat aaatgttctt gga 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 3
cctctgtggt attctccctc cag 23
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 4
agaataccac agaggctctt tgtaaa 26
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 5
caaggagatt tatgatggag caa 23
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 6
ctactggcta gagtccatgt gaaatatg 28
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 7
ctgcttattc catccagttc a 21
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 8
aggtcctcca gtgtcttc 18
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 9
tgtaccttgg attcactggc ctgtc 25

Claims (1)

1.一种检测ADGRG6突变位点的试剂盒，其特征在于，包括chr. 6: 142,706,206 G > A突变位点的引物G > A-F，引物G > A-R及探针G > A-PF；chr. 6:142,706,209 C > T突变位点的引物C > T-R，引物C > T-F及探针C > T-PR；内参引物Control-F，内参引物Control-R及探针Control-PR；所述引物G > A-F的序列如SEQ ID.1所示；所述引物G > A-R的序列如SEQ ID.2所示；所述探针G > A-PF的序列为5’ 6FAM-CCTCTG/iXNA_T/GGTATT/iXNA_C/T/iXNA_C/CCT/iXNA_C/CAG-BHQ-1 3’，其中/iXNA_T/、/iXNA_C/及/iXNA_G/表示锁核苷酸修饰，所述iXNA为LNA；
所述引物C > T-R的序列如SEQ ID.4所示，所述引物C > T-F的序列如SEQ ID.5所示；所述探针C > T-PR的序列为5’ 6FAM-CTACTG/iXNA_G/CTAGAGT/iXNA_C/CATG/iXNA_T/GAAA/iXNA_T/ATG-BHQ-1 3’，其中/iXNA_T/、/iXNA_C/及/iXNA_G/表示锁核苷酸修饰，所述iXNA为LNA；所述内参引物Control-F的序列如SEQ ID.7所示，所述内参引物Control-R的序列如SEQ ID.8所示；所述探针Control-PR的序列为5’ 6HEX-TGTACCTTGGATTCACTGGCCTGTC-BHQ-1 3’；
所述试剂盒用于检测ADGRG6突变位点时，包括步骤：
采用所述试剂盒对待测样品进行PCR扩增，得到扩增后样品；
测量扩增后样品的ΔCt值= Ct值FAM -Ct值HEX；
若chr. 6: 142,706,206 G > A突变位点体系扩增后样品的ΔCt值<14，则判定待测样品为chr. 6: 142,706,206 G > A突变位点突变型，若扩增后样品的ΔCt值>14，则判定待测样品为chr. 6: 142,706,206 G > A突变位点野生型；
若chr. 6:142,706,209 C > T突变位点体系扩增后样品的ΔCt值<14，则判定待测样品为chr. 6:142,706,209 C > T突变位点突变型，若扩增后样品的ΔCt值>14，则判定待测样品为chr. 6:142,706,209 C > T突变位点野生型；
所述试剂盒的反应体系包括反应体系1和反应体系2，
所述反应体系1包括：
10×PCR缓冲液 5μl，
MgCl2 40mM 4μl，
dNTP 2.5mM 2.5μl，
引物G>A-F 10pM 2.5μl，
引物G>A-R 10pM 2.5μl，
探针G>A-PR 10pM 0.5μl，
Control-F 10pM 0.2μl，
Control-R 10pM 0.2μl，
Control-PR 10pM 0.5μl，
HSTaq酶 0.2μl，
DNA模板 5μl，
添加无菌双蒸水至反应体系体积为50μl；
所述反应体系2包括：
10×PCR缓冲液 5μl，
MgCl2 40mM 4μl，
dNTP 2.5mM 2.5μl，
引物C>T-F 10pM 2.5μl，
引物C>T-R 10pM 2.5μl，
探针C>T-PF 10pM 0.5μl，
Control-F 10pM 0.2μl，
Control-R 10pM 0.2μl，
Control-PR 10pM 0.5μl，
HSTaq酶 0.2μl，
DNA模板 5μl，
添加无菌双蒸水至反应体系体积为 50μl。
CN202011330770.4A 2020-11-24 2020-11-24 一种检测adgrg6高频突变位点的方法及试剂盒 Active CN112322739B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011330770.4A CN112322739B (zh) 2020-11-24 2020-11-24 一种检测adgrg6高频突变位点的方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011330770.4A CN112322739B (zh) 2020-11-24 2020-11-24 一种检测adgrg6高频突变位点的方法及试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112322739A CN112322739A (zh) 2021-02-05
CN112322739B true CN112322739B (zh) 2023-08-15

Family

ID=74307828

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011330770.4A Active CN112322739B (zh) 2020-11-24 2020-11-24 一种检测adgrg6高频突变位点的方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112322739B (zh)

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102367478A (zh) * 2011-10-25 2012-03-07 浙江大学 用于KRAS基因突变分型的ARMS-qPCR检测试剂盒及检测方法
CN104164491A (zh) * 2014-07-21 2014-11-26 北京新基永康生物科技有限公司 用于幽门螺杆菌23S rDNA基因突变分型的ARMS-qPCR的检测方法及试剂盒
CN104805208A (zh) * 2015-04-30 2015-07-29 山东维真生物科技有限公司 用于检测人类kras基因7种热点突变的引物探针组合物、试剂盒及检测方法
CN105238871A (zh) * 2015-11-13 2016-01-13 北京泛生子基因科技有限公司 一种检测人idh1基因突变的探针法及其试剂盒
CN105441577A (zh) * 2016-01-13 2016-03-30 武汉海吉力生物科技有限公司 用于检测人类ckit基因7种突变的探针、引物及试剂盒
CN106282176A (zh) * 2015-06-25 2017-01-04 上海芯超生物科技有限公司 一种用于鉴定AGA926-928突变的ARMS-qPCR的引物组合及其应用
WO2017123559A2 (en) * 2016-01-11 2017-07-20 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric proteins and methods of regulating gene expression
CN108048531A (zh) * 2017-11-16 2018-05-18 苏州吉玛基因股份有限公司 一种高灵敏度检测稀有突变的超阻滞荧光定量pcr方法
CN108130362A (zh) * 2017-12-29 2018-06-08 安徽安龙基因科技有限公司 用于egfr基因突变检测的试剂盒及应用
CN108441562A (zh) * 2018-05-10 2018-08-24 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 检测Kras基因突变的引物、探针、试剂盒及应用
CN109251982A (zh) * 2018-08-14 2019-01-22 深圳市罗湖区人民医院 Adgrg6增强子的突变序列、检测方法、所用的特异性引物对和应用
CN111455046A (zh) * 2020-03-13 2020-07-28 深圳市罗湖区人民医院 一种adgrg6增强子突变的核酸检测方法及其试剂盒

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8700337B2 (en) * 2010-10-25 2014-04-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method and system for computing and integrating genetic and environmental health risks for a personal genome

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102367478A (zh) * 2011-10-25 2012-03-07 浙江大学 用于KRAS基因突变分型的ARMS-qPCR检测试剂盒及检测方法
CN104164491A (zh) * 2014-07-21 2014-11-26 北京新基永康生物科技有限公司 用于幽门螺杆菌23S rDNA基因突变分型的ARMS-qPCR的检测方法及试剂盒
CN104805208A (zh) * 2015-04-30 2015-07-29 山东维真生物科技有限公司 用于检测人类kras基因7种热点突变的引物探针组合物、试剂盒及检测方法
CN106282176A (zh) * 2015-06-25 2017-01-04 上海芯超生物科技有限公司 一种用于鉴定AGA926-928突变的ARMS-qPCR的引物组合及其应用
CN105238871A (zh) * 2015-11-13 2016-01-13 北京泛生子基因科技有限公司 一种检测人idh1基因突变的探针法及其试剂盒
WO2017123559A2 (en) * 2016-01-11 2017-07-20 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric proteins and methods of regulating gene expression
CN105441577A (zh) * 2016-01-13 2016-03-30 武汉海吉力生物科技有限公司 用于检测人类ckit基因7种突变的探针、引物及试剂盒
CN108048531A (zh) * 2017-11-16 2018-05-18 苏州吉玛基因股份有限公司 一种高灵敏度检测稀有突变的超阻滞荧光定量pcr方法
CN108130362A (zh) * 2017-12-29 2018-06-08 安徽安龙基因科技有限公司 用于egfr基因突变检测的试剂盒及应用
CN108441562A (zh) * 2018-05-10 2018-08-24 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 检测Kras基因突变的引物、探针、试剂盒及应用
CN109251982A (zh) * 2018-08-14 2019-01-22 深圳市罗湖区人民医院 Adgrg6增强子的突变序列、检测方法、所用的特异性引物对和应用
CN111455046A (zh) * 2020-03-13 2020-07-28 深圳市罗湖区人民医院 一种adgrg6增强子突变的核酸检测方法及其试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Whole-genome sequencing identifies ADGRG6 enhancer mutations and FRS2 duplications as angiogenesis-related drivers in bladder cancer;Song等;《Nat Commun.》;第10卷(第1期);摘要、第2页左栏第1段-第10页右栏第3段、补充材料 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112322739A (zh) 2021-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20040005551A1 (en) Circulating epstein-barr virus DNA in the serum or plasma of patients for the prediction and detection of epstein-barr virus associated cancers apart from head, neck and lymphoid malignancies
WO2021073029A1 (zh) 一种膀胱癌驱动基因点突变和甲基化联合辅助诊断方法、试剂盒、系统及应用
CN111534514A (zh) 一种基于Crisper的新型冠状病毒的检测试剂盒
CN114891886B (zh) 用于诊断膀胱癌的核酸产品、试剂盒及应用
CN111793674A (zh) 一种宫颈癌相关基因甲基化检测方法
CN106498028B (zh) Egfr的t790m突变的诊断方法及试剂盒
CN110484625A (zh) 用于检测prky基因甲基化的引物探针组合物、试剂盒及检测方法
CN111808963A (zh) 一种用于早期肺癌无创筛查的组合物、应用与试剂盒及样本处理方法
CN112322739B (zh) 一种检测adgrg6高频突变位点的方法及试剂盒
CN111304305A (zh) 一种用于检测egfr基因甲基化的试剂盒及方法
CN117089614A (zh) 一种宫颈癌相关基因dna甲基化pcr-荧光探针法检测试剂盒
CN112391495A (zh) 一种高危人乳头瘤病毒分型检测方法与试剂盒
CN113862370B (zh) 用于筛查肝癌的引物和探针、试剂盒及其应用
CN114410795A (zh) 基于miRNA特征标记的肝癌早期检测
CN111621557B (zh) 鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒及其使用方法
CN112226507B (zh) 甲状腺乳头状癌血清标志物及应用
CN114807350A (zh) 用于甲状腺结节良恶性判别的生物标志物、多基因联检试剂盒及应用
CN108165633B (zh) 一种特异性阻抑引物体系及肿瘤ct-DNA突变检测的方法
CN113249508B (zh) 用于检测b族链球菌的特异性引物、探针和应用
CN114231636B (zh) 用于尿路上皮癌靶基因拷贝数qPCR定量检测的特异性引物、探针组合及应用
CN115094139B (zh) 检测甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用以及膀胱癌诊断试剂盒
CN113444791B (zh) 一种辅助筛查家族性甲状腺乳头状癌的arms-pcr试剂盒
WO2024036785A1 (zh) 胃癌早期筛查的dna甲基化标志物组合及试剂盒
CN106987622A (zh) 焦磷酸测序联合扩增阻滞技术检测kras基因12和13密码子低频突变引物及其应用
CN107164534B (zh) 用于检测cdkn2b基因变异的试剂盒及cdkn2b基因变异率的定量检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant