CN105238871A - 一种检测人idh1基因突变的探针法及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测人IDH1基因突变的探针法及其试剂盒。该方法包括以下步骤：(1)在IDH1？R132H？PCR反应混合液中加入人基因组DNA，形成R132H反应体系并进行荧光定量PCR扩增，其中IDH1？R132H？PCR反应混合液中包括溶解在PCR预混液中的：IDH1？R132H上游引物、IDH1？R132H下游引物、IDH1？R132H探针、内参上游引物、内参下游引物和内参探针；(2)结果判断：根据PCR扩增的突变Ct值进行分析。该试剂盒包括：IDH1？R132H？PCR反应混合液。该探针法和试剂盒为临床上提供了一种速度快、灵敏度高、特异性强的IDH1基因突变检测体系。

Description

一种检测人IDH1基因突变的探针法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测基因突变的方法及其试剂盒，特别涉及一种检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法及其试剂盒。
背景技术
神经胶质瘤简称胶质瘤，是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，约占所有颅内原发肿瘤的一半，广义上是指所有神经上皮来源的肿瘤，狭义上则是指源于各类胶质细胞的肿瘤。通用WHO分级根据非典型性、核分裂指数、内皮细胞增殖和坏死程度分为4级：I级：以良性毛细胞型星形细胞瘤为主，占胶质瘤5％左右，通常可以治愈；II级：为一般的星形细胞瘤或混合性少突星形细胞瘤，占胶质瘤的30～40％左右；III级：为间变型星形细胞瘤，占胶质瘤的15～25％左右，一般由II级演变而来；IV级：为胶质母细胞瘤，占胶质瘤的1/3左右。低级别的胶质瘤在临床上主要是指WHO分类为星形细胞瘤I与II级，也包括少突胶质细胞瘤及混合性少突星形细胞瘤。
异柠檬酸脱氢酶(IDH)家族包括以NAD或NADP为辅助因子，催化异柠檬酸的氧化脱羧反应生成α-酮戊二酸的酶类，同时分别生成NADH或NADPH。在哺乳动物细胞中，IDH同工酶有以下三种形式：依赖NAD的线粒体IDH1，依赖NADP的线粒体IDH2，依赖NADP的胞质IDH3。编码依赖NAD的人IDH1的IDH1基因位于染色体2q33.3，并且定位于细胞质和过氧化物酶体中；编码依赖NADP的线粒体IDH2酶的IDH2基因位于染色体15q26.1。尽管IDH1和IDH2都参与了细胞内氧化损伤的防御机制，但IDH1在脂质的代谢机制中也发挥了重要作用。
大量研究证实，代谢的异常是引发肿瘤发生、发展的因素之一。IDH基因突变发生在肿瘤的早期，并且原发灶和转移灶的IDH基因高度保持一致。一般认为，IDH基因状态不会因治疗而发生变化。IDH基因在多种肿瘤中发生了突变，其发生率在结直肠癌约为40％，胰腺癌为90％以上，肺癌约为15％。IDH1基因突变主要集中发生在第2外显子的12和13密码子R>H(≥90％)称为R132H，这些突变破坏了IDH1蛋白内在的GTPase活性，从而使得IDH1蛋白处于持续活性状态。美国国家综合癌症网络(NCCN)临床实践指南(第二版，2014)将有无IDH1/2基因突变作为评估低级别胶质瘤患者风险级别的指标之一。
以往胶质瘤诊断及其分级主要依赖组织病理学，但仅靠组织形态学，特别是立体定向取材小标本，使组织缺乏典型病变，常常不能根据肿瘤的密度、异型性、血管增生、坏死等进行分级。当取材为肿瘤(尤其是低级别胶质瘤)边缘，或肿瘤治疗后判断是否存在复发情况时，区分这些胶质细胞是肿瘤还是反应性增生就显得十分困难。而直接测序法检测基因突变则存在步骤繁琐、工序复杂、费时费力的不足。而本发明采用的荧光定量PCR方法是分子诊断领域应用的一种技术，该方法灵敏度高、可实时定量，是适合临床大规模使用的方法。
本发明还结合了扩增阻碍突变系统(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)ARMS于1989年建立，用于对已知突变基因进行检测。由于PCR过程中引物延伸是3’端开始的，所以3’末端的碱基对引物的延伸来说非常重要。根据这个原理，将突变与正常等位基因所不同的那个碱基安排在引物3’最末端，当反应进行时，如果引物3’末端碱基与模板DNA序列匹配则可以扩增，如果不匹配，则链延伸反应就会因3’,5’-磷酸二酯键形成障碍而受阻，从而达到区分检测等位基因的目的。
发明内容
为了实现对人IDH1基因突变的检测，从而为肿瘤病理分型、预后判断提供参考，本发明提供了一种检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法及其试剂盒，该探针法和试剂盒为临床上提供了一种速度快、灵敏度高、特异性强的IDH1基因突变检测体系。
一种检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，包括以下步骤：
(1)在IDH1R132HPCR反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成R132H反应体系并进行荧光定量PCR扩增，其中：
所述IDH1R132HPCR反应混合液中包括溶解在PCR预混液中的以下组分：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的IDH1R132H上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的IDH1R132H下游引物、具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的IDH1R132H探针、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.5所示序列的内参下游引物和具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的内参探针；
(2)结果判断：根据人类基因组DNA在R132H反应体系进行荧光定量PCR扩增时的突变Ct值进行分析。
一种检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，所述样品可以是利用脑胶质瘤样本术后冰冻组织或者石蜡组织或者活检穿刺组织作为检测标本，包括：间变性少突胶质瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、少突细胞瘤、部分脑胶质瘤前体组织和少量正常脑组织、垂体瘤组织样本。
一种检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其中R132H反应体系为：在16-20μlIDH1R132HPCR反应混合液中加入1-4μl、浓度为3-10ng/μl的人类基因组DNA，优选在18μlIDH1R132HPCR反应混合液中加入2μl、浓度为10ng/μl的人类基因组DNA；所述IDH1R132HPCR反应混合液中各组分在PCR预混液中的浓度为：所述IDH1R132H上游引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述IDH1R132H下游引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述IDH1R132H探针的浓度为2-4μM，优选3μM；所述内参上游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参下游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参探针的浓度为1-3μM，优选2μM。
一种检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其中PCR的扩增过程为：37℃3min；95℃3min；95℃15s，65℃45s，14个循环；95℃15s，60℃45s，24个循环，在60℃45s阶段收集荧光。
一种检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其中结果判断步骤中Ct值进行分析为：
当R132H反应体系中的内参ROX信号呈现“S”曲线、内参扩增曲线10≤Ct≤14时，可以判断待测样本R132H突变的阴性和阳性：当R132H反应体系中的△Ct≤9时为R132H突变阳性；当R132H反应体系中△Ct>9时为R132H突变阴性，其中△Ct＝待测样品扩增曲线的Ct值-内参扩增曲线的Ct值。
一种检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其中IDH1R132HPCR反应混合液的PCR预混液中还溶解有dUTP和尿嘧啶DNA糖基化酶；所述dUTP在PCR预混液中的浓度为0.05-0.8μM，优选0.2μM，所述尿嘧啶DNA糖基化酶在PCR预混液中的浓度为0.005-0.02U/μl，优选0.01U/μl。
一种检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，还使用了弱阳性对照液和/或空白对照液，所述弱阳性对照液为IDH1R132H突变率为10％的人类基因组DNA，或者是按照如下方法制备的弱阳性对照液：含有IDH1R132H突变的阳性质粒溶解在没有IDH1R132H突变的人类基因组DNA水溶液中，使得阳性质粒与没有IDH1R132H突变的人类基因组DNA的拷贝数为1:9，阳性质粒与没有R132H突变的人类基因组DNA在弱阳性对照液中的核酸总浓度为2-10ng/μl，优选为10ng/μl；所得水溶液与IDH1R132H突变率10％的人类基因组DNA按照本发明中的实时荧光定量PCRTaqman探针法、在相同的反应体系和扩增条件下进行PCR扩增，扩增曲线吻合。所述空白对照液是TE缓冲液。
一种检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，在16-20μl，优选18μl的IDH1R132HPCR反应混合液中加入1-4μl，优选2μl的弱阳性对照液，形成R132H反应体系的阳性质控反应体系，并进行荧光定量PCR扩增。
一种检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，在16-20μl，优选18μl的IDH1R132HPCR反应混合液中加入1-4μl，优选2μl的空白对照液，形成R132H反应体系的空白对照反应体系，并进行荧光定量PCR扩增。
一种检测人IDH1基因突变的试剂盒，包括IDH1R132HPCR反应混合液，其中所述IDH1R132HPCR反应混合液中包括溶解在PCR预混液中的以下组分：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的IDH1R132H上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的IDH1R132H下游引物、具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的IDH1R132H探针、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.5所示序列的内参下游引物和具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的内参探针。
一种检测人IDH1基因突变的试剂盒，其中所述IDH1R132HPCR反应混合液中各组分在PCR预混液中的浓度为：所述IDH1R132H上游引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述IDH1R132H下游引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述IDH1R132H探针的浓度为2-4μM，优选3μM；所述内参上游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参下游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参探针的浓度为1-3μM，优选2μM。
一种检测人IDH1基因突变的试剂盒，其中所述IDH1R132H反应混合液的PCR预混液中还溶解有dUTP和尿嘧啶DNA糖基化酶；所述dUTP在PCR预混液中的浓度为0.05-0.8μM，优选0.2μM，所述尿嘧啶DNA糖基化酶在PCR预混液中的浓度为0.005-0.02U/μl，优选0.01U/μl。
一种检测人IDH1基因突变的试剂盒，还包括弱阳性对照液和/或空白对照液；其中所述弱阳性对照液为IDH1R132H突变率10％的人类基因组DNA，或者是按照如下方法制备的弱阳性对照液：含有IDH1R132H突变的阳性质粒溶解在没有IDH1R132H突变的人类基因组DNA水溶液中，使得阳性质粒与没有IDH1R132H突变的人类基因组DNA的拷贝数为1:9，所述阳性质粒与没有IDH1R132H突变的人类基因组DNA在弱阳性对照液中的核酸总浓度为2-10ng/μl，优选为10ng/μl；所得水溶液与IDH1R132H突变率为10％的人类基因组DNA按照本发明中的实时荧光定量PCRTaqman探针法、在相同的反应体系和扩增条件下进行PCR扩增，扩增曲线吻合。所述空白对照液是TE缓冲液。
本发明中所述IDH1R132H上游引物序列为SEQIDNo.1：gatgggtaaaacctatcatcataggaca；所述IDH1R132H下游引物序列为SEQIDNo.2：aaacatgcaaaatcacattattgcc；所述IDH1R132H探针序列SEQIDNo.3：FAM-acaTgaCttActTgatcc-BHQ1，其中acaTgaCttActTgatcc中大写的第4、7、10、13位的碱基为相应碱基对应的LNA碱基，IDH1R132H探针序列5’端连接有荧光报告基团，优选为FAM，IDH1R132H探针序列3’端连接有淬灭基团，优选为BHQ1；所述内参上游引物序列为SEQIDNo.4：gataggcactgactctctctg；所述内参下游引物序列为SEQIDNo.5：agcatcaggagtggacagat；所述内参探针序列SEQIDNo.6：ROX-ctacccttggacccagaggttctttgag-BHQ2，内参探针序列5’端连接有荧光报告基团，该荧光报告基团与TERT通用探针所连接的不同，优选为ROX，内参探针序列3’端连接有淬灭接团，该淬灭接团与TERT通用探针所连接的不同，优选为BHQ2。
本发明中所述PCR预混液可通过商业化渠道购买得到，所述PCR预混液包括了：DNA聚合酶，Mg2+，dNTPs和稳定剂。如：thermoUniversalMasterMixII，TakaraPremixExTaq(ProbeqPCR)。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明中的Taqman探针法与Sanger法相比，检测速度快，灵敏度高，同时其检测结果与Sanger法检测结果的阳性符合率和阴性符合率均为100％；
2、本发明在IDH1R132H探针序列中设计了LNA碱基，本发明中LNA碱基是对脱氧核糖核苷酸的戊糖进行了改变，其将糖限制为在A-DNA中见到的N-类型的构象，这种限制是通过1,2:5,6-二-O-异亚丙基-α-D-别呋喃糖中的2′-氧，4′-碳亚甲基键来实现，即它包含了2'-氧-4'碳亚甲基连接，这个连接限制了呋喃核糖环的灵活性，将其结构锁定成一个刚性的双环模式，因此而提高杂交效率和稳定性；含有LNA碱基的Taqman探针的灵敏度更高：本发明中的Taqman探针法检测R132H突变时可以检测出浓度为2ng/μL、突变率为1％的突变样本；将R132H突变序列克隆到T载体上，转化大肠杆菌，随后将该突变质粒DNA连续10倍梯度稀释；分别用Taqman探针法和申请号为201510611728.2的专利申请中SYBR染料法检测，检测机型为BioradCfx96PCR仪，结果显示，SYBR染料法检出下限约为50～100拷贝，而Taqman探针法检测下限约为5～10拷贝；
3、SYBR染料为嵌入DNA双链染料，主要缺点是会同时检测特异性和非特异性PCR产物积累，PCR反应中的DNA双链模版、引物二聚体及非特异扩增产物都会影响结果，而本申请Taqman探针法需要与靶序列完全匹配时才能产生荧光信号，因此Taqman探针法中引物二聚体对结果的影响小，检测的特异性强；
4、由于Taqman探针可以标记不同波长的荧光基团，本发明实现了在同一反应体系中同时扩增及检测样品基因组DNA及内参序列，可以充分实现对扩增效率、DNA模板加入量的实时监控，从而有效排除因起始模板量、人为操作等因素所导致的假阳性和假阴性的情况；而申请号为201510611728.2的专利申请中SYBR染色法需要在不同反应体系中分别扩增样品基因组DNA与内参序列；
5、与采用SYBR染料法相比，实时荧光定量PCR采用Taqman探针法时，反应体系中起始模板量对结果判定的影响更小，当20μl反应体系中分别含有200ng、100ng、50ng、20ng、10ng、5ng的没发生R132H突变的野生型基因组DNA或突变型基因组DNA，分别用本申请Taqman探针法与申请号为201510611728.2的专利申请中SYBR染料法进行检测，检测机型为BioradCfx96PCR仪，结果显示，SYBR染料法在起始模板量100ng以下时能区分野生型基因组DNA和突变型基因组DNA，而当起始模板量增加到200ng时会将野生型样本误判为突变型样本；而Taqman探针法在所有上述起始模板量时均能准确区分野生型样本和突变型样本；
6、本申请还在试剂盒中引入了dUTP-UNG防污染体系，能有效的防止PCR产物的气溶胶污染。
附图说明
图1是本发明IDH1R132H突变比例50％和突变比例1％的样品的检测结果。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1
试剂盒的组成
本发明试剂盒是用于检测IDH1基因突变的试剂盒，包括：IDH1R132HPCR反应混合液、弱阳性对照液和空白对照液，其中：
(1)IDH1R132HPCR反应混合液是在反应预混液TakaraPremixExTaq(ProbeqPCR)中加入如下浓度的各种物质：
IDH1R132H上游引物 3μM
IDH1R132H下游引物 3μM
IDH1R132H探针 3μM
内参上游引物 2μM
内参下游引物 2μM
内参探针 2μM
dUTP 0.2μM
尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG) 0.01U/μl
所述IDH1R132H上游引物序列为：gatgggtaaaacctatcatcataggaca；
所述IDH1R132H下游引物序列为：aaacatgcaaaatcacattattgcc；
所述IDH1R132H探针序列：FAM-acaTgaCttActTgatcc-BHQ1，其中acaTgaCttActTgatcc中大写碱基表示相应碱基对应的LNA碱基；
所述内参上游引物序列为：gataggcactgactctctctg；
所述内参下游引物序列为：agcatcaggagtggacagat；
所述内参探针序列：ROX-ctacccttggacccagaggttctttgag-BHQ2；
(2)弱阳性对照液是浓度是按照如下方法制备的：含有R132H突变的阳性质粒溶解在没有R132H突变的人类基因组DNA水溶液中，使得阳性质粒与人类基因组DNA的拷贝数为1:9，阳性质粒与没有R132H突变的人类基因组DNA在弱阳性对照液中的核酸总浓度为10ng/μl；所得水溶液与R132H突变率为10％的人类基因组DNA按照本发明中的实时荧光定量PCRTaqman探针法、在相同的反应体系和扩增条件下进行PCR扩增，扩增曲线吻合。
(3)空白对照液为TE缓冲液。
检测方法：
(1)临床患者样本基因组DNA提取：利用实体瘤术后冰冻组织或者石蜡组织或者活检穿刺组织作为检测标本，参照所购买的Qiagen的商用基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA提取；
(2)稀释基因组DNA：将所提基因组DNA溶于Tris-HCl缓冲液(10mmol/L，pH8.0)中，经NANODROP2000检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-HCl缓冲液(10mmol/L，pH8.0)调整基因组DNA浓度到10ng/μL作为PCR模板；
(3)加样进行PCR反应扩增：取2μL、10ng/μL的PCR模板加入18μlIDH1R132HPCR反应混合液中获得20μL的反应体系；每次检测均有阳性质控及空白对照，剩余DNA溶液分装后贮存于-20℃；
R132H反应体系及其阳性质控反应体系、空白对照反应体系如下表所列：
(4)实时荧光定量PCR仪器检测通道的选择：选择的荧光为FAM和ROX；
(5)PCR反应条件为：
(6)检测结果分析：
本发明中Ct值是指反应体系中的荧光信号到达设定的基线值时所经历的循环数，扩增曲线基线值设定为相对荧光单位500，并在此设定条件下确定Ct值；ROX信号检测内参扩增情况，FAM信号检测PCR模板、阳性质控和空白对照的扩增情况；
当R132H反应体系中的内参ROX信号呈现“S”曲线、内参扩增曲线10≤Ct≤14时，可以判断待测样本R132H突变的阴性和阳性：当R132H反应体系中的△Ct≤9时为R132H突变阳性；当R132H反应体系中△Ct>9时为R132H突变阴性，其中△Ct＝待测样品扩增曲线的Ct值-内参扩增曲线的Ct值；
R132H反应体系中内参ROX信号的作用：当R132H反应体系中的内参扩增曲线的Ct＞14表示加入的基因组DNA模板有PCR抑制物或浓度不足，需要重新提取基因组DNA或增加DNA用量后重复实验；内参扩增曲线的Ct＜10，提示加入的样品DNA过量，建议稀释DNA后重新进行实验；
空白对照反应体系的作用：空白对照反应体系中的FAM信号应不出现“S”扩增曲线或Ct≥24，若FAM信号的Ct＜24，则此实验结果视为无效，同时建议重复试验；
弱阳性反应体系的作用：弱阳性反应用于指示PCR反应体系是否有效及反应程序是否正确设置。弱阳性对照中，ROX扩增曲线应10≤Ct≤14，FAM扩增曲线应16≤Ct≤19。如果ROX和FAM扩增曲线不在此范围，则提示实验出现问题，建议检查试剂是否在有效期或PCR反应程序是否正确设置。
灵敏度分析：取定量后浓度为10ng/μL的R132H1％突变样本基因组DNA进行稀释，使其浓度分别为10ng/μL、5ng/μL、2ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL，按实施例1中的检测方法进行检测，每个R132H反应体系设置5个平行，结果表明，本发明灵敏度可以检测到2ng/μL的R132H1％突变样本。
实施例2荧光PCR方法对比Sanger的方法学验证
按照实施例1中的方法进行荧光定量PCR检测和数据分析，并同时开展Sanger验证，验证数据与结果如下：采用与Sanger方法学对比研究的方式评估本发明中人类IDH1基因突变检测试剂盒的方法，计划采用盲法对脑胶质瘤患者石蜡组织样本平行开展qPCR与Sanger方法学对比，得到qPCR与Sanger方法符合率的验证结果。
从目前已获得的375例脑胶质瘤患者的临床样本研究结果显示，共获得370例有效检测数据，与Sanger检测方法学对比验证结果显示，qPCR检测与Sanger验证一致率为100％。
用于盲法对比的样本来源于脑胶质瘤样本，包括：间变性少突胶质瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、少突细胞瘤、部分脑胶质瘤前体组织和垂体瘤组织样本。
验证分析结果
R132H位点统计数据
备注：PPA:阳性符合率；NPA:阴性符合率；OPA:总体符合率
从上表可知，在总共370例有效对比数据中，qPCR方法与Sanger方法相比，阳性符合率为100％，阴性符合率为100％，总体符合率为100％。
以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测人IDH1基因突变的试剂盒，其特征在于，包括IDH1R132HPCR反应混合液，其中所述IDH1R132HPCR反应混合液中包括溶解在PCR预混液中的以下组分：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的IDH1R132H上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的IDH1R132H下游引物、具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的IDH1R132H探针、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.5所示序列的内参下游引物和具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的内参探针。
2.根据权利要求1所述的检测人IDH1基因突变的试剂盒，其特征在于，所述IDH1R132HPCR反应混合液中各组分在PCR预混液中的浓度为：所述IDH1R132H上游引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述IDH1R132H下游引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述IDH1R132H探针的浓度为2-4μM，优选3μM；所述内参上游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参下游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参探针的浓度为1-3μM，优选2μM。
3.根据权利要求1或2所述的检测人IDH1基因突变的试剂盒，其特征在于，所述IDH1R132HPCR反应混合液的PCR预混液中还溶解有dUTP和尿嘧啶DNA糖基化酶；所述dUTP在PCR预混液中的浓度为0.05-0.8μM，优选0.2μM，所述尿嘧啶DNA糖基化酶在PCR预混液中的浓度为0.005-0.02U/μl，优选0.01U/μl。
4.根据权利要求1-3之一所述的检测人IDH1基因突变的试剂盒，其特征在于，还包括弱阳性对照液和/或空白对照液。
5.根据权利要求4所述的检测人IDH1基因突变的试剂盒，其特征在于，所述弱阳性对照液为IDH1R132H突变率为10％的人类基因组DNA，或者是按照如下方法制备的弱阳性对照液：含有IDH1R132H突变的阳性质粒溶解在没有IDH1R132H突变的人类基因组DNA水溶液中，使得阳性质粒与没有IDH1R132H突变的人类基因组DNA的拷贝数为1:9，所述阳性质粒与没有IDH1R132H突变的人类基因组DNA在弱阳性对照液中的核酸总浓度为2-10ng/μl，优选为10ng/μl；所述空白对照液是TE缓冲液。
6.一种检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在IDH1R132HPCR反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成R132H反应体系并进行荧光定量PCR扩增，其中：
所述IDH1R132HPCR反应混合液中包括溶解在PCR预混液中的以下组分：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的IDH1R132H上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的IDH1R132H下游引物、具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的IDH1R132H探针、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.5所示序列的内参下游引物和具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的内参探针；
(2)结果判断：根据人类基因组DNA在R132H反应体系进行荧光定量PCR扩增时的突变Ct值进行分析。
7.根据权利要求6所述的检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其特征在于，所述R132H反应体系为：在16-20μlIDH1R132HPCR反应混合液中加入1-4μl、浓度为2-10ng/μl的人类基因组DNA，优选在18μlIDH1R132HPCR反应混合液中加入2μl、浓度为10ng/μl的人类基因组DNA；所述IDH1R132HPCR反应混合液中各组分在PCR预混液中的浓度为：所述IDH1R132H上游引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述IDH1R132H下游引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述IDH1R132H探针的浓度为2-4μM，优选3μM；所述内参上游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参下游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参探针的浓度为1-3μM，优选2μM。
8.根据权利要求6或7所述的检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其特征在于，
PCR的扩增过程为：37℃3min；95℃3min；95℃15s，65℃45s，14个循环；95℃15s，60℃45s，24个循环，在60℃45s阶段收集荧光；
所述结果判断步骤中Ct值进行分析为：
当R132H反应体系中的内参ROX信号呈现“S”曲线、内参扩增曲线10≤Ct≤14时，可以判断待测样本R132H突变的阴性和阳性：当R132H反应体系中的△Ct≤9时为R132H突变阳性；当R132H反应体系中△Ct>9时为R132H突变阴性，其中△Ct＝待测样品扩增曲线的Ct值-内参扩增曲线的Ct值。
9.根据权利要求6-8之一所述的检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其特征在于，所述IDH1R132HPCR反应混合液的PCR预混液中还溶解有dUTP和尿嘧啶DNA糖基化酶；所述dUTP在PCR预混液中的浓度为0.05-0.8μM，优选0.2μM，所述尿嘧啶DNA糖基化酶在PCR预混液中的浓度为0.005-0.02U/μl，优选0.01U/μl。
10.根据权利要求6-9之一所述的检测人IDH1基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其特征在于，还使用了弱阳性对照液和/或空白对照液，所述弱阳性对照液为IDH1R132H突变率为10％的人类基因组DNA，或者是按照如下方法制备的弱阳性对照液：含有IDH1R132H突变的阳性质粒溶解在没有IDH1R132H突变的人类基因组DNA水溶液中，使得阳性质粒与没有IDH1R132H突变的人类基因组DNA的拷贝数为1:9，阳性质粒与没有R132H突变的人类基因组DNA在弱阳性对照液中的核酸总浓度为2-10ng/μl，优选为10ng/μl；所述空白对照液是TE缓冲液。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105734137A (zh) * 2016-03-25 2016-07-06 上海今创医学检验所有限公司 一种检测人h3f3a基因突变的探针法及检测试剂盒
CN108342461A (zh) * 2018-05-04 2018-07-31 良培基因生物科技（武汉）有限公司 ddPCR技术检测IDH1基因变异的引物、试剂盒及检测方法
CN112322739A (zh) * 2020-11-24 2021-02-05 深圳市罗湖区人民医院 一种检测adgrg6高频突变位点的方法及试剂盒
CN113106156A (zh) * 2021-04-09 2021-07-13 中山市博爱医院 Idh1 r132h基因突变实时荧光定量pcr检测试剂及方法
CN113897421A (zh) * 2021-12-10 2022-01-07 北京思诺普斯生物科技有限公司 一种pcr基因检测试剂盒及其检测方法、扩增方法、应用
CN114752677A (zh) * 2022-06-13 2022-07-15 北京思诺普斯生物科技有限公司 一种快速检测idh1突变的引物组、试剂盒及扩增方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102220411A (zh) * 2010-04-16 2011-10-19 中山大学达安基因股份有限公司 一种一体化检测α、β突变型地中海贫血的试剂盒
CN103436613A (zh) * 2013-08-21 2013-12-11 中国人民解放军第二军医大学 Idh1/idh2基因突变的荧光pcr检测试剂盒及其用途
CN103451314A (zh) * 2013-09-30 2013-12-18 南京艾迪康医学检验所有限公司 检测idh1、idh2基因多态突变位点的引物、方法和试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102220411A (zh) * 2010-04-16 2011-10-19 中山大学达安基因股份有限公司 一种一体化检测α、β突变型地中海贫血的试剂盒
CN103436613A (zh) * 2013-08-21 2013-12-11 中国人民解放军第二军医大学 Idh1/idh2基因突变的荧光pcr检测试剂盒及其用途
CN103451314A (zh) * 2013-09-30 2013-12-18 南京艾迪康医学检验所有限公司 检测idh1、idh2基因多态突变位点的引物、方法和试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
邵立伟等: "星形细胞瘤中MGMT甲基化与IDH1突变的相关性", 《临床与实验病理学杂志》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105734137A (zh) * 2016-03-25 2016-07-06 上海今创医学检验所有限公司 一种检测人h3f3a基因突变的探针法及检测试剂盒
CN108342461A (zh) * 2018-05-04 2018-07-31 良培基因生物科技（武汉）有限公司 ddPCR技术检测IDH1基因变异的引物、试剂盒及检测方法
CN112322739A (zh) * 2020-11-24 2021-02-05 深圳市罗湖区人民医院 一种检测adgrg6高频突变位点的方法及试剂盒
CN112322739B (zh) * 2020-11-24 2023-08-15 深圳市罗湖区人民医院 一种检测adgrg6高频突变位点的方法及试剂盒
CN113106156A (zh) * 2021-04-09 2021-07-13 中山市博爱医院 Idh1 r132h基因突变实时荧光定量pcr检测试剂及方法
CN113897421A (zh) * 2021-12-10 2022-01-07 北京思诺普斯生物科技有限公司 一种pcr基因检测试剂盒及其检测方法、扩增方法、应用
CN114752677A (zh) * 2022-06-13 2022-07-15 北京思诺普斯生物科技有限公司 一种快速检测idh1突变的引物组、试剂盒及扩增方法和应用

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