CN108300785A - 一种braf基因突变检测的引物探针组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基因突变的检测产品，具体涉及一种BRAF基因突变检测的引物探针组合及其应用，所述引物探针组合包括检测引物探针，所述检测引物探针包括BRAF基因V600E突变检测特异性引物对、BRAF基因特异性探针、扩增阻断探针和内参系统；其中，所述BRAF基因V600E突变检测特异性引物对的错配率为15‑30％。本发明对BRAF基因突变具有特异性强、灵敏度高、操作简单快速等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，可以对肿瘤组织样本进行检测，能够辅助临床治疗，具有重要价值。

Description

一种BRAF基因突变检测的引物探针组合及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种基因突变的检测产品，具体涉及一种BRAF基因突变检测的引物探针组合及其应用。
背景技术
根据全国肿瘤登记中心发布的《2014中国肿瘤登记年报》，每分钟就有6人确诊为癌症，即每天有8550个新增癌症患者，每年为312万。同时，死亡270万。我国近20年来癌症呈现年轻化、发病率、死亡率“三线”走高的趋势。加上治疗中的病人，保守估计全国活着的癌症患者共计500万人以上。肿瘤治疗市场容量在3000亿以上，并且逐年递增。
B-raf基因位于染色体7q34，是一种癌基因，编码一种丝/苏氨酸特异性激酶，是EGFR通路重要的转导因子，参与调控细胞生长、分化和凋亡多种生理过程。B-raf基因突变存在于非小细胞肺癌、结直肠癌、黑色素瘤和甲状腺癌等多种恶性肿瘤中，90％以上为V600E。B-raf V600E突变可导致部分KRAS基因野生型患者对EGFR-TKI及EGFR单抗药物治疗不敏感。因此，推荐肿瘤患者接受EGFR靶向药物治疗前，进行B-raf基因V600E突变的检测。
2011年版《NCCN结直肠癌临床实践指南》中明确指出结直肠癌患者应进行B-raf基因V600E突变的检测，如果患者存在V600E突变时，一线治疗进展后使用抗EGFR单抗治疗是无效的。B-raf基因突变检测能提高临床治疗的针对性，指导靶向药物的合理使用，避免无效或治疗不当造成的病人病情延误，降低治疗风险。
ARMS-PCR(Amplification Refractory Mutation System，突变扩增阻滞系统)技术，是一种利用序列特异性引物对模板进行选择性扩增而达到检测基因突变的方法。ARMS技术利用Taq DNA聚合酶缺少3'→5'外切酶活性，PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，针对不同的已知突变，设计适当的引物以检测出突变基因(即利用特异引物对突变靶序列进行高精准的PCR扩增放大)；同时利用探针对扩增产物进行检测，在实时荧光定量PCR平台上实现对样品DNA中稀有突变的检测。
市场上现有的个性化用药基因检测试剂，CN 105567854 A公开了一种检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的ARMS引物，其在ARMS实时荧光定量技术中引入了双内参系统，还增加了和突变位点一致的正常位点参照，使其成为双内参系统和双重判读规则的试剂盒。CN 104099425 A公开了一种用于检测B-raf基因突变的试剂盒，包括质控引物探针内标混合液和检测引物探针内标混合液，该试剂盒将扩增阻碍突变系统和末端磷酸化的野生型扩增阻断核酸序列相结合，将脱氧次黄嘌呤引入到检测B-raf基因V600E突变检测特异性正向ARMS引物中，使每个样本的检测平行进行质控PCR反应和检测PCR反应。但上述方法操作相对复杂，成本较高，病人不容易接受，难以在大范围内普及使用。
近年非常令人兴奋的是预测性基因检测的开展，利用基因检测技术在疾病发生前发现疾病发生的风险，提早预防，由于大部分肿瘤突变是体细胞突变，突变细胞常常与野生型细胞混合在一起，因此所获得的的DNA往往含大量的野生型背景，对体细胞突变的检测就需要一种高特异性和高灵敏度的检测方法。因此，高效、准确的检测BRAF基因突变就显得极为重要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种BRAF基因突变检测的引物探针组合及其应用，所述试剂盒能够检测速度快，具有很高的特异性和灵敏度。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种BRAF基因突变检测的引物探针组合，所述引物探针组合包括检测引物探针，所述检测引物探针包括BRAF基因V600E突变检测特异性引物对、BRAF基因特异性探针、扩增阻断探针和内参系统；
其中，所述BRAF基因V600E突变检测特异性引物对的错配率为15-30％。
本发明中，由于大部分肿瘤突变是体细胞突变，突变细胞常常与野生型细胞混合在一起，因此所获得的DNA往往含大量的野生型背景，因此引物、探针设计必须非常特异，发明人发现通过调节BRAF基因V600E突变检测特异性引物的错配率，使得绝大部分野生型背景与突变型检测无法结合，且通过增加G-C碱基的错配，使得20bp左右的引物就能达到与Taqman MGB探针5-10℃的Tm差值，使得引物和探针的Tm差异符合MGB探针的设计原则，从而实现对样本中非特异性序列进行阻断扩增的目的，进一步提高检测的准确度和特异性，且仅仅只需要10ng的DNA样品就能够完成检测，检测灵敏度达到0.5％。
根据本发明，所述BRAF基因V600E突变检测特异性引物对的错配率为15-30％，例如可以是15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％，优选为20-25％。
根据本发明，所述扩增阻断探针与BRAF基因V600E突变检测特异性引物对中的下游引物的碱基重叠序列为3-10bp，例如可以是3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp或10bp，优选为6-9bp。
本发明中，阻碍探针与突变型的引物bp长度基本一致，且序列3’端最后一个碱基与野生型序列一致，且3’端用磷酸基团封闭，从而抑制V600E突变区野生型模板的非特异性扩增，大大增加BRAF突变检测的灵敏度和特异性。
根据本发明，发明人发现将扩增阻断探针的3’端进行磷酸化，有效的抑制了野生型基因的扩增，沉默了样本中非特异的连接，进一步提高检测的准确率。
优选地，所述BRAF基因特异性探针和所述扩增阻断探针的5’端带有荧光基团，所述荧光基团为FAM、HEX、TET、JOE、NED、VIC、CY3、CY5、ROX或TAMRA中的任意一种或至少两种的组合，优选为FAM和/或NED。
优选地，所述BRAF基因特异性探针和所述扩增阻断探针的3’端带有淬灭集团，所述淬灭基团选自MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Phosphorothioate(PS)中的任意一种的组合，优选为MGB，所述MGB修饰在3’端。
本发明中，发明人发现采用MGB作淬灭基团可以将探针的Tm值提高6-10℃左右，提高配对与非配对模板间的Tm值差异，用这种探针可以降低本底，因此检测的重复性和准确度得以大大提高。
根据本发明，所述BRAF基因V600E突变检测特异性引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.1-2所示，具体序列如下：
正向引物(SEQ ID NO.1)：CCTAAACTCTTCATAATGCTTGCTC；
反向引物(SEQ ID NO.2)：CACTCCATCGAGATTTCT.
根据本发明，所述BRAF基因特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体序列如下：CCTTTACTTACTACACCTCAGA.
优选地，所述扩增阻断探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体序列如下：CGAGATTTCACTGTAGC.
优选地，所述内参系统包括内参引物对和内参探针。
优选地，所述内参引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示，具体序列如下：
正向引物(SEQ ID NO.5)：GCGGGTTGTCCTTGAGAAAC；
反向引物(SEQ ID NO.6)：AATGGTCCACCCGGTACATC.
优选地，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体序列如下：CACAGAACTCGGGACC.
第二方面，本发明提供一种检测BRAF基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的引物探针组合物。
根据本发明，所述试剂盒还包括阴性质控、阳性质控和辅助试剂。
优选地，所述阴性质控为TE缓冲液。
优选地，所述阳性质控为BRAF基因V600E突变质粒，所述突变质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体序列如下：
TCTCACCTCATCCTAACACATTTCAAGCCCCAAAAATCTTAAAAGCAGGTTATATAGGCTAAATAGAACTAATCATTGTTTTAGACATACTTATTGACTCTAAGAGGAAAGATGAAGTACTATGTTTTAAAGAATATTATATTACAGAATTATAGAAATTAGATCTCTTACCTAAACTCTTCATAATGCTTGCTCTGATAGGAAAATGAGATCTACTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAGATATATTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGAGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATGGTAAGAATTGAGGCTATTTTTCCACTGATTAAATTTTTGGCCCTGAGATGCTGCTGAGTTACTAGAAAGTCATTGAAGGTCTCAACTATAGTATTTTCATAGTTCCCAGTATTCACAAAAATCAGTGTTCTTATTTTTTATGTAAATAGATTTTTTAACTTTTTTCTTTACCCTTAAAACGAATATTTTGAAACCAGTTTCAGTGTATTTCAAACAAAAATATATGTCTTATAAACAGT.
优选地，所述辅助试剂为Taq酶、dNTPs、MgCl2和PCR反应缓冲液。
第三方面，本发明提供一种利用如第二方面所述的试剂盒用于检测BRAF基因突变的方法，包括以下步骤：
(1)提取样本DNA；
(2)向步骤(1)样本DNA中加入PCR缓冲液、Taq酶、dNTPs、MgCl2、BRAF基因V600E突变检测特异性引物对、BRAF基因特异性探针、扩增阻断探针、内参引物对、内参探针、阳性质控和阴性质控；
(3)PCR扩增。
根据本发明，所述MgCl2的浓度为1-5mM，例如可以是1mM、2mM、3mM、4mM或5mM，优选为2-4mM。
优选地，所述dNTPs的浓度为0.1-1mM，例如可以是0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM或1mM，优选为0.1-0.8mM。
优选地，所述Taq酶的浓度为0.5-2U/μl，例如可以是0.5U/μl、0.6U/μl、0.7U/μl、0.8U/μl、0.9U/μl、1U/μl、1.2U/μl、1.3U/μl、1.4U/μl、1.5U/μl、1.6U/μl、1.7U/μl、1.8U/μl、1.9U/μl或2U/μl。
优选地，所述BRAF基因V600E突变检测特异性引物对的浓度为100-900nM，例如可以是100nM、150nM、180nM、200nM、250nM、280nM、300nM、320nM、350nM、380nM、400nM、420nM、450nM、480nM、500nM、550nM、580nM、600nM、650nM、680nM、700nM、750nM、800nM、850nM、880nM或900nM，优选为200-600nM。
优选地，所述BRAF基因特异性探针的浓度为100-400nM，例如可以是100nM、150nM、180nM、200nM、250nM、280nM、300nM、320nM、350nM、380nM或400nM，优选为100-200nM。
优选地，所述扩增阻断探针的浓度为100-300nM，例如可以是100nM、150nM、180nM、200nM、250nM、280nM或300nM，优选为100-150nM。
优选地，所述内参引物对的浓度为300-900nM，例如可以是300nM、320nM、350nM、380nM、400nM、420nM、450nM、480nM、500nM、550nM、580nM、600nM、650nM、680nM、700nM、750nM、800nM、850nM、880nM或900nM，优选为400-600nM。
优选地，所述内参探针的浓度为100-400nM，例如可以是100nM、150nM、180nM、200nM、250nM、280nM、300nM、320nM、350nM、380nM或400nM，优选为100-200nM。
优选地，所述阳性质控的浓度为200-1000copies/μl，例如可以是200copies/μl、230copies/μl、250copies/μl、280copies/μl、300copies/μl、320copies/μl、350copies/μl、380copies/μl、400copies/μl、420copies/μl、450copies/μl、480copies/μl、500copies/μl、520copies/μl、550copies/μl、580copies/μl、600copies/μl、620copies/μl、650copies/μl、680copies/μl、700copies/μl、720copies/μl、750copies/μl、780copies/μl、800copies/μl、820copies/μl、850copies/μl、880copies/μl、900copies/μl、920copies/μl、950copies/μl、980copies/μl或1000copies/μl，优选为300-800copies/μl。
根据本发明，步骤(3)所述的PCR扩增的条件为：
a)95℃预变性2min；
b)95℃变性15s，58℃延伸1min，5个循环；
c)95℃变性15s，60℃延伸1min，40个循环。
1)试剂盒有效性的判定：
阳性对照组有效：阳性对照组在ABI7500的FAM通道下均有典型的扩增曲线，确认无误后通过调节阈值将PC的Ct值均调至28±0.2，并将此阈值作为待检样本的阈值；
阴性对照组有效：阴性对照组在ABI7500的FAM通道下均无典型的扩增曲线或无Ct值，否则可能为试剂受到污染或操作过程中的污染，请排除污染源后重新检测。
2)检测样本有效性的判定：
若Ct值在17-24之间，表明加入的DNA量正常；
若Ct≤17，表明所加样本DNA过量，需稀释后在检测；
若Ct＞24，说明加入的样本DNA含有PCR抑制剂或DNA加入量不够，需重新提取DNA后再检测。
3)根据本发明，所述PCR结果突变的判定如下：
若结果检测通道的Ct值不大于34，则为阳性结果；
若结果检测通道的Ct值大于34，则为阴性结果。
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的引物探针组合和/或如第二方面所述的试剂盒用于制备辅助临床诊断、肿瘤相关靶向药物选择或甲状腺癌分子诊断试剂和/或药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
(1)本发明通过调节BRAF基因V600E突变检测特异性引物的错配率，使得引物和探针的Tm有差异，实现对样本中非特异性序列进行阻断扩增的目的，进一步提高检测的准确度和特异性，且仅仅只需要10ng的DNA样品就能够完成检测，检测灵敏度达到0.5％；
(2)本发明试剂盒引入扩增阻断探针，有效的抑制了野生型基因的扩增，可从野生型背景中检测到1％突变等位基因，增加了一根3‘端进行磷酸化修饰的阻断探针，沉默了样本中非特异的连接，实现了高度的反应特异性和灵敏度；
(3)本发明试剂盒包含内参系统，更具有科学性和可靠性，更高的特异性和灵敏度，且本发明试剂盒检测速度快，全部检测过程只需要两个小时即可完成，检测通量大，一台仪器一次可完成48人份的检测；
(4)本发明对仪器设备的要求低，两通道的荧光定量PCR仪即可胜任检测工作，利于大规模的市场推广应用。
附图说明
图1本发明阳性样本1检测结果；
图2本发明阳性样本2检测结果；
图3本发明阳性样本3检测结果；
图4为本发明检测灵敏度结果图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1 试剂盒的组装
引物探针组合的设计，具体序列如下表1所示：
表1
其中，所述BRAF基因V600E突变检测特异性引物对的错配率为22％，所述扩增阻断探针与BRAF基因V600E突变检测特异性引物对中的下游引物的碱基重叠序列为9bp；
阴性质控品：所述阴性质控为TE缓冲液；
阳性质控品：BRAF基因V600E突变质粒，所述突变质粒的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示，具体序列如下：
TCTCACCTCATCCTAACACATTTCAAGCCCCAAAAATCTTAAAAGCAGGTTATATAGGCTAAATAGAACTAATCATTGTTTTAGACATACTTATTGACTCTAAGAGGAAAGATGAAGTACTATGTTTTAAAGAATATTATATTACAGAATTATAGAAATTAGATCTCTTACCTAAACTCTTCATAATGCTTGCTCTGATAGGAAAATGAGATCTACTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAGATATATTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGAGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATGGTAAGAATTGAGGCTATTTTTCCACTGATTAAATTTTTGGCCCTGAGATGCTGCTGAGTTACTAGAAAGTCATTGAAGGTCTCAACTATAGTATTTTCATAGTTCCCAGTATTCACAAAAATCAGTGTTCTTATTTTTTATGTAAATAGATTTTTTAACTTTTTTCTTTACCCTTAAAACGAATATTTTGAAACCAGTTTCAGTGTATTTCAAACAAAAATATATGTCTTATAAACAGT；
辅助试剂：Taq酶、dNTPs、MgCl2和PCR反应缓冲液；
将上述组分、说明书及离心管组装后装入试剂盒中。
实施例2 BRAF基因突变检测
采用实施例1中的试剂盒进行BRAF基因突变检测，包括如下步骤：
(1)样本DNA提取：
取结直肠癌(样本1)、非小细胞肺癌肿瘤(样本2)和甲状腺癌(样本3)的石蜡包埋病理组织切片，使用QIAGEN的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Cat.no.56404)提取石蜡包埋组织切片样本，所提DNA需用紫外分光光度计测定浓度和纯度，其DNA OD260/OD280的值应在1.8～2.0，浓度应在3.3～13.2ng/ul之间；
(2)配制体系，具体的体系组成如下表2所示：
表2
向上述反应体系中加入步骤(1)提取的DNA样本，DNA样本量小于15ng，加入至对应的PCR反应孔中，封上荧光定量PCR级别的封闭膜或盖上管盖，以2000rpm/min，离心30s，以确保反应混合液全部离入管底；
(3)将步骤(2)体系放入PCR仪，进行PCR扩增，具体的扩增条件如表3所示：
表3
阶段2的检测荧光通道为FAM，运行PCR反应程序，保存文件；
(4)结果判定：
1)试剂盒有效性的判定：
阳性对照组有效：阳性对照组在ABI7500的FAM通道下应均有典型的扩增曲线，确认无误后通过调节阈值将PC的Ct值均调至28±0.2，并将此阈值作为待检样本的阈值；
阴性对照组有效：阴性对照组在ABI7500的FAM通道下应均无典型的扩增曲线或无Ct值，否则可能为试剂受到污染或操作过程中的污染，请排除污染源后重新检测；
2)检测样本有效性的判定：
若Ct值在17-24之间，表明加入的DNA量正常；
3)根据本发明，所述PCR结果突变的结果如图1-3所示；
从图1-3可以看出，BRAF基因V600E突变检测试剂盒检测直肠癌(样本1)、非小细胞肺癌肿瘤(样本2)和甲状腺癌(样本3)的阳性样本时，有典型的扩增曲线，Ct值＜34，无非特异性扩增，且准确度达到0.5％；
从图4可以看出，在293细胞基因组DNA中加入1％、2％、10％、50％的V600E突变质粒时，有典型的扩增曲线，Ct值均＜34，无非特异性扩增。
实施例3
与实施例1-2相比，仅仅所述扩增阻断探针与BRAF基因V600E突变检测特异性引物对中的下游引物的碱基重叠序列为2bp，其他组分和条件与实施例1-2相同。
结果显示，则检测样本出现非特异性扩增。
实施例4
与实施例1-2相比，仅仅所述扩增阻断探针与BRAF基因V600E突变检测特异性引物对中的下游引物的碱基重叠序列为12bp，其他组分和条件与实施例1-2相同。
结果显示，则阻断探针与下游引物结合性增强，导致下游引物与上游引物结合率降低，扩增曲线荧光高度下降。
实施例5
与实施例1-2相比，仅仅所述淬灭基团选自BHQ-1，其他组分和条件与实施例1-2相同。
结果显示，猝灭基团BHQ-1的特异性没有MGB好，检测样本会出现轻微的非特异性。
对比例1
与实施例1-2相比，仅仅所述BRAF基因V600E突变检测特异性引物对的错配率为10％，其他组分和条件与实施例1-2相同。
结果显示，则检测样本检测限高，准确度降低，达到3％。
对比例2
与实施例1-2相比，仅仅所述BRAF基因V600E突变检测特异性引物对的错配率为35％，其他组分和条件与实施例1-2相同。
结果显示，发现该对比例PCR结果无荧光，无法完成PCR。
综上所述，本发明通过调节BRAF基因V600E突变检测特异性引物的错配率，使得引物和探针的Tm有差异，实现对样本中非特异性序列进行阻断扩增的目的，进一步提高检测的准确度和特异性，且仅仅只需要10ng的DNA样品就能够完成检测，检测灵敏度达到0.5％。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 无锡市申瑞生物制品有限公司
<120> 一种BRAF基因突变检测的引物探针组合及其应用
<130> 2018
<141> 2018-02-13
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 1
cctaaactct tcataatgct tgctc 25
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 2
cactccatcg agatttct 18
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 3
cctttactta ctacacctca ga 22
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 4
cgagatttca ctgtagc 17
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 5
gcgggttgtc cttgagaaac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 6
aatggtccac ccggtacatc 20
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 7
cacagaactc gggacc 16
<210> 8
<211> 601
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 8
tctcacctca tcctaacaca tttcaagccc caaaaatctt aaaagcaggt tatataggct 60
aaatagaact aatcattgtt ttagacatac ttattgactc taagaggaaa gatgaagtac 120
tatgttttaa agaatattat attacagaat tatagaaatt agatctctta cctaaactct 180
tcataatgct tgctctgata ggaaaatgag atctactgtt ttcctttact tactacacct 240
cagatatatt tcttcatgaa gacctcacag taaaaatagg tgattttggt ctagctacag 300
agaaatctcg atggagtggg tcccatcagt ttgaacagtt gtctggatcc attttgtgga 360
tggtaagaat tgaggctatt tttccactga ttaaattttt ggccctgaga tgctgctgag 420
ttactagaaa gtcattgaag gtctcaacta tagtattttc atagttccca gtattcacaa 480
aaatcagtgt tcttattttt tatgtaaata gattttttaa cttttttctt tacccttaaa 540
acgaatattt tgaaaccagt ttcagtgtat ttcaaacaaa aatatatgtc ttataaacag 600
t 601

Claims (10)

1.一种BRAF基因突变检测的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括检测引物探针，所述检测引物探针包括BRAF基因V600E突变检测特异性引物对、BRAF基因特异性探针、扩增阻断探针和内参系统；
其中，所述BRAF基因V600E突变检测特异性引物对的错配率为15-30％。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述BRAF基因V600E突变检测特异性引物对的错配率为20-25％；
优选地，所述扩增阻断探针与BRAF基因V600E突变检测特异性引物对中的下游引物的碱基重叠序列为3-10bp，优选为6-9bp。
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述扩增阻断探针的3’端磷酸化；
优选地，所述BRAF基因特异性探针和所述扩增阻断探针的5’端带有荧光基团；
优选地，所述荧光基团为FAM、HEX、TET、JOE、NED、VIC、CY3、CY5、ROX或TAMRA中的任意一种或至少两种的组合，优选为FAM和/或NED；
优选地，所述BRAF基因特异性探针和所述扩增阻断探针的3’端带有淬灭集团；
优选地，所述淬灭基团选自MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或Phosphorothioate中的任意一种或至少两种的组合，优选为MGB。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的引物探针组合，其特征在于，所述BRAF基因V600E突变检测特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；
优选地，所述BRAF基因特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
优选地，所述扩增阻断探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
优选地，所述内参系统包括内参引物对和内参探针；
优选地，所述内参引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示；
优选地，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
5.一种检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-4中任一项所述的引物探针组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控、阳性质控和辅助试剂；
优选地，所述阴性质控为TE缓冲液；
优选地，所述阳性质控为BRAF基因V600E突变质粒，所述突变质粒的核苷酸序列如SEQID NO.8所示；
优选地，所述辅助试剂为Taq酶、dNTPs、MgCl2和PCR反应缓冲液。
7.一种利用如权利要求5或6所述的试剂盒用于检测BRAF基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取样本DNA；
(2)向步骤(1)样本DNA中加入PCR缓冲液、Taq酶、dNTPs、MgCl2、BRAF基因V600E突变检测特异性引物对、BRAF基因特异性探针、扩增阻断探针、内参引物对、内参探针、阳性质控和阴性质控；
(3)PCR扩增。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述MgCl2的浓度为1-5mM，优选为2-4mM；
优选地，所述dNTPs的浓度为0.1-1mM，优选为0.1-0.8mM；
优选地，所述Taq酶的浓度为0.5-2U/μl；
优选地，所述BRAF基因V600E突变检测特异性引物对的浓度为100-900nM，优选为200-600nM；
优选地，所述BRAF基因特异性探针的浓度为100-400nM，优选为100-200nM；
优选地，所述扩增阻断探针的浓度为100-300nM，优选为100-150nM；
优选地，所述内参引物对的浓度为300-900nM，优选为400-600nM；
优选地，所述内参探针的浓度为100-400nM，优选为100-200nM；
优选地，所述阳性质控的浓度为200-1000copies/μl，优选为300-800copies/μl。
9.根据根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的PCR扩增的条件为：
a)95℃预变性2min；
b)95℃变性15s，58℃延伸1min，5个循环；
c)95℃变性15s，60℃延伸1min，40个循环；
优选地，所述PCR结果的判定如下：
若结果检测通道的Ct值不大于34，则为阳性结果；
若结果检测通道的Ct值大于34，则为阴性结果。
10.一种如权利要求1-4中任一项所述的引物探针组合和/或如权利要求5或6所述的试剂盒用于制备辅助临床诊断、肿瘤相关靶向药物选择或甲状腺癌分子诊断试剂和/或药物中的应用。
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