CN104946739B - Egfr基因突变检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于EGFR基因突变检测试剂盒及其应用，其特征在于本试剂盒包含用于EGFR基因突变位点20条特异性扩增的引物、5条野生序列的高效封阻探针，4条EGFR基因特异性TaqMan荧光探针。该试剂盒可以检测突变拷贝数低至5～10拷贝，突变含量低至0.1％的标本。本发明可同时检测EGFR基因5种基因突变，灵敏度高，操作简单，检测廉价，临床应用范围广，样本可以为新鲜的病理组织，石蜡包埋组织、胸腔液、血清或血浆，检测速度快，检测过程只需要90分钟即可完成。

Description

EGFR基因突变检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种EGFR基因突变检测试剂盒及其应用，具体涉及一种与肿瘤用药选择和诊断相关的EGFR基因突变的快速检测。属于生物技术和医学领域。

背景技术

世界卫生组织在2014年的世界癌症日到来之际发表《世界癌症报告》称，癌症已经成为全世界人类最大致死原因，发病率和死亡率均呈持续上升趋势。全球癌症发病率四年中升高11％，到2012年约有1410万病例，因癌症死亡人数高达820万。2012年的全球癌症新病例中有一半发生在亚洲，其中大部份发生在中国大陆。并预测未来20年内，世界癌症病例将增长75％，达到近2500万。中国肿瘤登记中心2013年初发布《2012中国肿瘤登记年报》显示，中国每年新发癌症病例约达312万，死亡病例超过200万，每分钟有6个人被确诊为癌症，每天有8550人成为癌症患者，每7到8人中就有一人因癌症而死。肺癌、胃癌、直肠癌、肝癌、食管癌成为中国人患病最多的癌症，乳腺癌、结直肠癌等癌症患者亦呈明显上升趋势。随着环境恶化，水质污染、雾霾以及食品安全方面形势的逐步严峻，专家预测，中国每年的癌症新发病例总数到2020年将达到400万左右，每年病例总数将达到600万。

肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，又称原发性支气管肺癌，根据其生物学特性可分为小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer，SCLC)和非小细胞肺癌(NonSmall Cell Lung Cancer，NSCLC)两大类，NSCLC主要包括鳞癌、腺癌、大细胞癌和腺鳞癌等，约占肺癌的80％～85％，大量的研究发现，某些基因变异与肺癌，尤其是与NSCLC型肺癌的发生密切相关，以这些基因突变作为靶标研制的靶向药物疗效显著，比如EGFR、ALK等。肿瘤的基因突变图谱具有地域性差异，EGFR基因突变在亚洲NSCLC患者中的突变频率可以达到60％以上。我国中科院季宏斌教授研究分析了202份肺腺癌患者的组织标本，其中在近69％的病人中检测到了EGFR基因的突变，合并KRAS基因突变的检测，覆盖率可以达到70％以上。

随着分子靶向治疗在肿瘤治疗领域的兴起，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)特罗凯、为提高非小细胞肺癌患者生存率和生活质量提供了新的思路，EGFR-TKI通过阻断信号传导通路中的表皮生长因子受体酪氨酸激酶区(EGFR Tyrosine Kinasedomain，EGFR-TK)达到抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、浸润和血管形成，增加化疗药物的敏感性，并促进肿瘤细胞凋亡，但遗憾的是并非所有的NSCLC型患者都能从中获益。EGFR18、19、21外显子突变的非小细胞肺癌患者使用表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂可大大提高患者生存率，而EGFR20外显子T790M变异和KRAS基因突变的患者会对该药产生耐药性。

目前肿瘤相关基因突变检测方法主要有直接测序法(DNA sequencing)、实时荧光定量法(qPCR，包括Scorptions ARMS qPCR、PNA-LNA clamp qPCR等)、高分辨率熔解曲线(HRM)、PCR与质谱(mass spectrometry)及高效液相色谱法(high performance liquidchromatography，HPLC)联合检测法等。肿瘤相关基因表达水平的检测主要依赖于qPCR及基因芯片技术。直接测序法一直以来被认为是检测基因突变的金标准，该法费用较低，但操作耗时长，并且它有两个明显的缺点：一是灵敏度低，一般需要突变基因丰度达到20％以上才能准确检测。二是由于后续需要对PCR产物进行处理，容易出现污染导致结果不准确。荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR，qPCR)作为新一代分子生物学研究工具，已成为分子诊断、临床检验以及基础生物医学研究的主流技术平台，广泛应用于传染病、肿瘤、遗传病、心血管等疾病的分子诊断。肿瘤的异质性决定了肿瘤标本绝大多数为混合标本，通常情况下，微量突变模板与大量野生型模板存在于同一扩增体系中时，此时大量野生型模板优势扩增，导致微量突变模板的扩增受到抑制而检测不到。因此目前的qPCR和HRM技术最高也只能检测到1％的突变体。

随着近年来肿瘤基因组测序方面研究的发展，人们发现，几乎所有的癌症患者的肿瘤组织中都存在某些体细胞的变异，而这些变异在正常人中检测不到。有些基因突变不仅仅可以作为癌症早期检测的分子指标，还可以为分子靶向治疗提供用药指导，如EGFR、EGFR、EGFR基因等。

肿瘤细胞会向血液中释放基因组DNA，这些变异DNA也随之释放到外周血中，被称为循环肿瘤DNA(circμLating tμMor DNAs)。研究发现，ctDNAs在早期原位癌(primarycancer)患者血液中就已经开始出现。由于外周血循环DNA的半衰期短，因此循环肿瘤DNA能够真实反映患者病变组织基因突变的真实情况。

但是，由于外周血循环DNA含量很少，其中肿瘤特异性的突变DNA含量更是少之又少，尤其是早期癌症患者，在常规的核酸扩增体系中，微量突变模板与大量野生型模板存在于同一扩增体系中时，大量野生型模板优势扩增，导致微量突变模板的扩增受到抑制而检测不到。因此在本领域需要一种可以高效快速准确全面地检测出EGFR基因突变的产品及方法，以便及时准确地获得EGFR基因突变的信息。

本发明拟涉及一种EGFR基因突变检测试剂盒及其应用。所述的试剂盒采用新型位点特异性扩增引物选择性放大EGFR基因突变DNA，新型封闭探针封阻野生型EGFR基因模板，进一步提高突变模板选择性放大的特异性。该试剂盒检测特异性高，灵敏度高，检测低丰度EGFR突变的敏感性可达0.01％～0.1％。本检测试剂盒用于辅助临床医生筛选出病患EGFR基因突变情况，为临床医生用药提供指导和依据。

发明内容

本发明目的在于提供一种EGFR基因突变检测试剂盒及其应用，具有快速、准确、高灵敏的特点。所述的试剂盒采用新型位点特异性扩增引物选择性放大EGFR基因突变DNA，新型封闭探针封阻野生型EGFR基因模板，从而进一步提高突变模板选择性放大的特异性。其优势主要体现在将突变检测敏感度由目前市场上同类试剂盒检测EGFR基因突变的1％提高到0.01％～0.1％，检测特异性高，灵敏度高，可应用于除组织标本外的血清、血浆等标本的非创伤性检测。

本发明提供了一套用于检测EGFR基因突变的引物、探针及检测试剂盒，发明相关内容表述如下：

EGFR基因突变检测试剂盒，包含有引物探针的混合液，包含用于EGFR基因突变位点20条特异性扩增的引物、5条野生序列的高效封阻探针和4条EGFR基因特异性TaqMan荧光探针。所述的20条特异性扩增的引物为16条上游特异性扩增的引物和4条下游通用引物。此外，还包括2×PCR反应液(含DNA聚合酶，dNTP，dUTP，UNG酶，Mg²⁺等)，阳性参比品、阴性参比品以及无RNA酶和DNA酶的无菌水。

所述的引物包含EGFR基因基因发生在第18、19、20和21号密码子的29种基因突变特异中的上游突变引物16条、下游通用引物4条。

所述的上游突变引物特征是3’末端为突变碱基。引物的Tm值在45℃～58℃，低于PCR反应复性温度3℃～10℃，以提高突变检测的特异性。

上游突变特异性引物：

所述的下游通用引物为EGFR基因第12、13密码子下游50～500碱基对范围内的一段序列，以及EGFR基因第61密码子下游50～500碱基对范围内的一段序列，该序列对突变没有选择性，可扩增所有的EGFR基因。

其中，18R：与Exl8F1～Ex18F3配对，19R与Ex19F1～Ex19F6配对，20R与Ex20F1～Ex20F5配对，21R与Ex21F1～Ex21F2配对。

所述的探针包括封阻探针5条，EGFR基因特异性TaqMan荧光探针4条。

所述的封阻探针与EGFR基因第18、19、20、21外显子突变热点野生型序列互补，其5’端锁核酸修饰，提高封阻探针的对Taq DNA聚合酶5’端外切酶活性的耐受能力；3’端磷酸基团修饰，阻断其3’端延伸功能；突变位点至少1-2个碱基LNA修饰，提高封阻探针的单碱基识别能力，前面有+的碱基为锁核酸碱基。锁核酸碱基与一般碱基相比，一个碱基的差异对探针Tm值的影响更大，因此在突变检测过程中，对核酸序列变异的识别能力更强，效率更高。

EGFR基因特异性TaqMan荧光探针5’端标记荧光基团，3’端标记荧光淬灭基团，下述4条探针分别针对EGFR基因18、19、20、21这4个外显子。

所述的引物探针组合如下：

组合1：

组合2：

组合3：

组合4：

组合5：

组合6：

组合7：

本发明所述的试剂盒还包含有：

(i)所述的2×PCR反应液每10μL含：0.25～1U DNA聚合酶，150～300μM dATP，150～300μM dCTP，150～300μM dGTP，150～300μM dTTP，150～300μM dUTP，0.25～2U UNG酶，1～4mMMgCl2等。优选的：0.5U DNA聚合酶，150μM dATP，150μM dCTP，150μM dGTP，100μMdTTP，50μM dUTP，0.5U UNG酶，2mM MgCl₂。

(ii)所述阳性参比品为EGFR突变阳性序列，可以为纯化PCR产物或者嵌入EGFR基因的人工质粒。

(iii)阴性参比品为EGFR野生型序列，可以为纯化PCR产物或者嵌入EGFR基因的人工质粒。

本发明提供了一套EGFR基因突变的检测方法，具体来说包括以下步骤：

[1]根据COSMIC数据公布的人类EGFR基因为野生型基因序列，针对EGFR的突变热点设计特异性引物和探针。

[2]提取检测样本中基因组DNA，检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织、血浆等。

[3]配制实时荧光PCR扩增反应体系，于荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR反应。

[4]反应条件为：95℃预变性10min；随后94℃15s，60℃20s，共15个循环；然后94℃15s，58℃20s，共35个循环。

根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测EGFR基因突变情况：Ct值为0或大于35判为阴性：Ct值小于等于35判为阳性。当阴性参比品Ct值为0或大于40，阳性参比品Ct值大于24小于27时结果可信。

本发明由于采用了特异性引物选择性扩增EGFR基因突变序列和用高效封阻探针封闭野生型DNA序列对引物对突变型序列进行信号放大时可能造成的干扰，以提高突变检测的特异性。

由本发明提供的试验盒能检测EGFR发生在第18、19、20和21号密码子的29种基因突变(如表1所示)

表1：提供的试剂盒所能检测的基因突变类型

突变名称	突变类型	外显子	碱基变化
				Ex18m1	G719A	18	2156G→C
Ex18m2	G719S	18	2155G→A
				Ex18m3	G719C	18	2155G→T
Ex19m1	E746_A750del1	19	2235-2249del15
				Ex19m2	E746-T751insI	19	2235-2252delinsAAT
Ex19m3	E746-A750del2	19	2236-2250del15
				Ex19m4	E746-T751del	19	2236-2253del18
Ex19m5	L747-E749del	19	2236-2247del12
				Ex19m6	E746-S752insV	19	2237-2255del18insT
Ex19m7	E746-T751insA	19	2237-2251del15
				Ex19m8	L747-S752insA	19	2237-2255del18insA
Ex19m9	E746_S752insV	19	2237-2254del18
				Ex19m10	L747_A750delinsP	19	2238-2248del11insGC
Ex19m11	L747_T751delinsQ	19	2238-222del11insGCA
				Ex19m12	L747-A750insP	19	2239-2248insC
Ex19m13	L747-T751	19	2239-2253del15
				Ex19m14	L747-S752	19	2239-2256del18
Ex19m15	L747-T751insP	19	2239-2251del13insC
				Ex19m16	L747-P753insQ	19	2239-2258insCA
Ex19m17	L747-P753insS	19	2240-2257del18
				Ex19m18	L747-T751insS	19	2240-2251del12
Ex19m19	L747_T751del	19	2240_2254del15
				Ex20m1	T790M	20	2369C→T
Ex20m2	S768I	20	2303G→T
				Ex20m3	H773_V 774insH	20	2319_2320insCAC
Ex20m4	D770_N771insG	20	2310_2311insCAC
				Ex20m5	V769_D 770insASV	20	2307_2308insgccagcgtg
Ex21m1	L858R	21	2573T→G
				Ex21m2	L861Q	21	2582T→A

[1]灵敏度高，可以检出低至5～10拷贝的突变；

[2]特异性强，5～20ng的野生型基因组DNA不会产生非特异性信号；

[3]检测速度快，检测过程只需要90分钟即可完成；

[4]样本多样性：新鲜的病理组织，石蜡包埋组织、胸腔液、血清或血浆；

[5]稳定率高：通常肿瘤标本中突变的DNA模板序列的绝对数并不高，尤其是外周血循环血DNA，多数标本处于0.5％～10％之间，突变检测敏感度在1％左右的方法常常对其临界含量，也就是突变含量1％～5％的标本检测稳定性不佳。本发明提供的试剂盒可以检测低至0.01％～0.1％的突变，就大大保证了0.5％～10％之间标本的检测稳定性。其中，新鲜组织标本的检测率达57.5％，非小细胞肺癌的检测率达60％，高于DNA测序(详见实施例)。

附图说明

图1为7种引物探针组合分别扩增野生和突变型质粒电泳结果。

突变型质粒扩增呈现强阳性信号，野生型质粒扩增阴性，说明7种引物探针组合的检测特异性很好。

图2为KRAS基因突变检测试剂盒检测KRAS基因人工质粒。

A：当DNA模板终浓度为5×10³拷贝时，试剂盒能够检测突变含量0.1％的样本。

B：当DNA模板终浓度为5×10⁴拷贝时，试剂盒能够检测突变含量0.01％的样本。

具体实施方式

下面用具体的实施例来解释本发明的突出的特点和显著进步，但本发明决非仅局限于实施例。

实施例1：本发明提供的试剂盒检测EGFR基因人工质粒

1、人工质粒DNA纯化

用QIAprep Spin Miniprep(Qiagen)试剂盒纯化EGFR野生型和突变型人工质粒，方法如下：

取1.5ml菌液，8000rpm离心3min收集菌体，加入将含有RNase A酶的P1缓冲液250μL混匀，再加入相同体积的P2缓冲液，上下混匀至溶液变清(不要将反应时间超过5min)，加入350μL N3缓冲液，立刻混匀，13000rpm离心10min，上清液转移至QIAprep spin管中，13000rpm离心1min，弃液体；用0.5ml PB清洗一次，再加含无水乙醇的PE缓冲液0.75ml洗涤2次，将QIAprep spin移至新1.5ml离心管中，加50μL无菌水，静置1min，离心1min，收集滤液。

纯化后的质粒用Quant-iT PicoGreen(Invitrogen)试剂盒定量，用TE缓冲液稀释到DNA终浓度分别为1×104拷贝copies/μL、1×103拷贝copies/μL，突变质粒含量分别是0.01％、0.1％、1％、10％、100％。

2、荧光定量PCR体系的配制

将预先配置好的2×PCR反应液、引物探针混合液及DNA模板按一下配方配置，同时用不含核酸的TE缓冲液作为阴性对照。：

3、PCR反应及数据分析

反应条件为：95℃预变性10min，随后94℃15s，62℃20s，共15个循环；然后94℃15s，60℃20s检测FAM荧光信号，共35个循环。

图2是用PCR反应结果，DNA总量为5×10³拷贝可以检测低至0.1％的突变，DNA总量为5×10⁴拷贝可以检测低至0.01％的突变。

实施例2：本发明提供的试剂盒检测新鲜组织标本

1、组织标本中基因组DNA纯化

用QIAamp DNA Mini(Qiagen)试剂盒纯化新鲜组织标本中的基因组DNA，方法如下：

收集40份非小细胞肺癌患者新鲜组织标本，每份标本取25mg以内用剪刀剪切样本至小碎片，放在1.5mL离心管中，加入180μL ATL，20μL蛋白酶K，混匀，56℃孵育1～3h至样本溶解，每小时振荡2～3次；加入200μL AL，振荡15秒，70℃孵育10min；然后加入200μL无水乙醇，振荡15秒，小心将液体(包括沉淀)移至试剂盒提供柱子中，不要污染管口，8000rpm离心1min后，将柱子新的2ml离心管中，小心加入500μL AW1缓冲液，8000rpm离心1min，弃滤液；小心加入500μL AW2缓冲液，13000rpm离心3min，柱子转移至新的1.5ml离心管中，全速离心1min，再将柱子转移至另一新的1.5ml离心管中，小心加入200μL AE或蒸馏水，室温静置1min，8000rpm离心1min，收集滤液。

纯化后的基因组DNA用Quant-iT PicoGreen(Invitrogen)试剂盒定量，DNA浓度在20ng/μL～200ng/μL之间。

2、荧光定量PCR体系的配制

将预先配置好的2×PCR反应液、引物探针混合液及DNA模板按一下配方配置，同时用不含核酸的TE缓冲液作为阴性对照。：

3、PCR反应及数据分析

反应条件为：95℃预变性10min，随后94℃15s，62℃20s，共15个循环；然后94℃15s，60℃20s检测FAM荧光信号，共35个循环。

下表是试剂盒检测结果与DNA测序方法的比较，组织标本的试剂盒突变检出率为57.5％，高于DNA直接测序法。

实施例3：本发明提供的试剂盒检测血浆标本

1、血浆标本中基因组DNA纯化

收集80份非小细胞肺癌患者、10份小细胞肺癌患者及26份健康人外周血标本5mL，2500rpm离心10分钟，吸取上清2mL用于循环游离DNA纯化。

用QIAamp DNA Blood Midi(Qiagen)试剂盒纯化血浆标本中的循环游离DNA，方法如下：

2mL血清(或全血)加入200μL PK和2mL AL，彻底混匀15秒，56℃孵育10min；加入2mL无水乙醇，彻底混匀15秒，将液体转移到QIAamp Medi Spin Column中，8000rpm离心2min，弃滤液；再离心一次，将柱子转移到另一收集管中，加入5mL AW1缓冲液，8000rpm离心1min，弃滤液，加入5mL AW2缓冲液，13000rpm离心1min，弃滤液，13000rpm离心3min，将柱子转移到一干净收集管中，加入100μL AE，室温放置1min，8000rpm离心1min，收集滤液为DNA标本。

纯化后的基因组DNA用Quant-iT PicoGreen(Invitrogen)试剂盒定量，DNA浓度在6ng/μL～40ng/μL之间。

2、荧光定量PCR体系的配制

将预先配置好的2×PCR反应液、引物探针混合液及DNA模板按一下配方配置，同时用不含核酸的TE缓冲液作为阴性对照。：

3、PCR反应及数据分析

反应条件为：95℃预变性10min，随后94℃15s，62℃20s，共15个循环；然后94℃15s，60℃20s检测FAM荧光信号，共35个循环。

下表是试剂盒检测结果与DNA测序方法的比较，癌症患者中，试剂盒突变检出率高于DNA测序；正常人中没有检出突变，试剂盒与DNA测序结果相同。

Claims (5)

1.一种EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒采用新型位点特异性扩增引物选择性放大EGFR基因突变DNA，新型封闭探针封阻野生型EGFR基因模板，从而进一步提高突变模板选择性放大的特异性；

所述的试剂盒包含有引物探针的混合液，包含用于EGFR基因突变位点20条特异性扩增的引物、5条野生序列的高效封阻探针和4条EGFR基因特异性TaqMan荧光探针；

所述的20条特异性扩增的引物为16条上游特异性扩增的引物和4条下游通用引物，

①所述的16条上游特异性扩增的引物序列为：

②所述的下游通用引物序列为：

其中，18R：与Ex18F1～Ex18F3配对，19R与Ex19F1～Ex19F6配对,20R与Ex20F1～Ex20F5配对,21R与Ex21F1～Ex21F2配对；

③上游突变引物特征是3’末端为突变碱基，引物的Tm值在45℃～58℃，低于PCR反应复性温度3℃～10℃，以提高突变检测的特异性；所述的下游通用引物为EGFR基因第12、13密码子下游50～500碱基对范围内的一段序列，以及EGFR基因第61密码子下游50～500碱基对范围内的一段序列，该序列对突变没有选择性，可扩增所有的EGFR基因；

①所述的5条野生序列的高效封阻探针的序列为：

②所述的封阻探针与EGFR基因第18、19、20、21外显子突变热点野生型序列互补，其5’端锁核酸修饰，提高封阻探针的对Taq DNA聚合酶5’端外切酶活性的耐受能力；3’端磷酸基团修饰，阻断其3’端延伸功能；突变位点至少1-2个碱基LNA修饰，提高封阻探针的单碱基识别能力，前面有+的碱基为锁核酸碱基。

2.按权利要求1所述的试剂盒，其特征在于4条特异性TaqMan荧光探针的序列为：

其中，3’端标记荧光淬灭基团，4条探针分别针对EGFR基因第18、19、20、21这4个外显子。

3.按权利要求2所述的试剂盒，其特征在于引物探针的组合为以下7种组合中任一种：

组合1：

组合2：

组合3：

组合4：

组合5：

组合6：

组合7：

4.按权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包含有：

(i)2×PCR反应液每10μL含：0.25～1U DNA聚合酶，150～300μM dATP，150～300μMdCTP，150～300μM dGTP，150～300μM dTTP，150～300μM dUTP，0.25～2U UNG酶，1～4mMMgCl₂；

(ii)阳性参比品为EGFR突变阳性序列，可以为纯化PCR产物或者嵌入EGFR基因的人工质粒；

(iii)阴性参比品为EGFR野生型序列，可以为纯化PCR产物或者嵌入EGFR基因的人工质粒。

5.按权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包含有：2×PCR反应液每10μL含：0.5U DNA聚合酶，150μM dATP，150μM dCTP，150μM dGTP，100μM dTTP，50μM dUTP，0.5U UNG酶，2mM MgCl₂。