CN108795930B - 一种用于低丰度dna突变的富集技术及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，公开了一种用于低丰度DNA突变的富集引物、富集方法及试剂盒，用于低丰度DNA突变的检测方法及检测试剂盒。本发明基于PCR原理富集低丰度DNA突变，富集引物的正向引物包括2条短引物，长度为10‑16nt，2条短引物中AF引物可与野生型和突变型模板均匹配。AR引物设计有与突变位点互补的碱基，位于AR引物的中间位置或中间偏5’端位置，且AR引物3’端修饰有MGB基团。AF引物3’端与AR引物5’端与模板结合的位置间隔0‑5个碱基。本发明所述富集方法可将丰度在万分之一的突变型模板富集100～1000倍，富集产物可用多种方法进行后续分析，操作简单，应用灵活，灵敏度高。

Description

一种用于低丰度DNA突变的富集技术及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于低丰度DNA突变的富集技术及其应用，尤其是涉及一种用于低丰度DNA突变的富集引物、富集方法及试剂盒，用于低丰度DNA突变的检测方法及检测试剂盒。
背景技术
检测生物样本中低丰度DNA突变或微量等位基因在肿瘤早期筛查，产前诊断等领域具有重要意义。目前基于PCR检测低丰度DNA突变的技术主要有ARMS-PCR技术(amplification refractory mutation system PCR)、基于酶切的PCR富集技术、基于连接的PCR富集技术、基于Blocker阻碍的PCR富集技术、低变性温度的复合PCR富集技术(co-amplification at lower denaturation temperature PCR，COLD-PCR)以及Digital PCR技术。
ARMS-PCR技术是目前应用较广泛且较成熟的技术，该技术是将引物的3’端设为突变位点，当引物与突变型模板结合时才能启动扩增反应，与野生型模板结合时不能进行扩增或扩增效果弱，从而达到突变型与野生型的差异扩增，但该方法选择性一般为10-1～10-3，检测灵敏度低。基于酶切和连接的PCR富集技术检测成本比较低廉，但操作步骤复杂，且检测周期长，一般采用电泳检测或与Sanger测序相结合，选择性一般为10-2～10-4。COLD-PCR技术是基于杂交双链与完全互补双链有不同的变性温度，杂交链变性临界温度(Tc)低于完全互补双链的变性温度(Tm)，且Tc依赖于DNA序列，当PCR退火温度设为Tc时，突变型与野生型的杂交链解链，可使引物与其结合，进行扩增；而同源双链不变性，引物不能结合，不扩增，从而达到突变型和野生型的差异扩增，但该方法对温度极为敏感，对仪器要求比较严苛。Digital PCR技术是目前最常用的检测低丰度突变的技术，该方法可进行绝对定量，操作简单、突变选择性可达10-4～10-5，但该方法需要特定的仪器支持，成本高昂。
肺癌是目前发病率和死亡率增长最快、对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。而在所有肺癌患者中约有80％为非小细胞肺癌(NSCLC)，这其中约有20％的表皮生长因子受体(EGFR)发生突变。其中，L858R和T790M突变已成为非小细胞肺癌的研究热点，其主要检测方法是ARMS-PCR和测序，但两种技术检测灵敏度均较低，对血液中游离的核酸中突变难以检测。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种灵敏度高、特异性好、操作简单的用于低丰度DNA突变富集的引物、富集方法及试剂盒。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案。
一种用于低丰度DNA突变的富集引物，包括正向引物，所述正向引物由AF引物和AR引物组成，AF引物和AR引物长度均为10-16nt，AF引物位于AR引物的上游，AF引物3’端与AR引物5’端与模板结合的位置间隔0-5个碱基；AF引物与野生型模板和突变型模板均匹配，AR引物与突变型模板完全互补配对；AR引物中与突变位点互补的碱基位于AR引物的中间位置或中间偏5’端位置；AR引物3’端修饰有MGB基团。
本发明所述用于低丰度DNA突变的富集引物中的正向引物包括2条短引物，长度为10-16nt，2条短引物分别命名为AF引物和AR引物，AF引物可与野生型和突变型模板均匹配。AR引物设计有与突变位点互补的碱基，位于AR引物的中间位置或中间偏5’端位置。AR引物可与突变型模板完全互补配对，与野生型模板有一个突变碱基的不匹配，使其与突变型和野生型模板结合效率不同，且AR引物3’端修饰有MGB基团。AF引物3’端与AR引物5’端与模板结合的位置间隔0-5个碱基。
由于AF引物和AR引物2条引物较短，长度为10-16nt，其与模板结合效果较差，甚至不结合，因此当任一条引物在体系中单独存在时，不能启动聚合酶链式反应。只有当两条引物同时存在时，当AR引物与模板结合后，AF引物在碱基堆积力的作用下，即可与模板结合，启动扩增反应。由于AR引物3’端修饰有MGB基团，使其不能启动扩增反应，因此，本发明中可检测的突变为真实的突变，而非引物引入突变。本发明主要通过AR引物与突变型和野生型模板的差异结合，达到对突变型的选择性扩增，从而在低丰度混合模板中达到富集突变型模板的目的。
进一步的，本发明所述用于低丰度DNA突变的富集引物还包括反向引物R。所述反向引物长度为19-30nt，可与模板的正链即有义链，也称编码链结合的引物。
基于非小细胞肺癌T790M突变检测存在的问题，本发明提供了一种用于低丰度人T790M DNA突变的富集引物，包括正向引物，所述正向引物由T790M-AF引物和T790M-AR引物组成。所述T790M-AF引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述T790M-AR引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示且3’端修饰有MGB基团，所述T790M-AF引物的3’端与所述T790M-AR引物的5’端与模板的结合位置间隔3个碱基。
进一步的，所述用于低丰度人T790M DNA突变的富集引物，还包括反向引物T790M-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
具体的，各引物序列如下所示：
T790M-AF(11nt)：5’-CTCCACCGTGC-3’(SEQ ID No.1)；
T790M-AR(14nt)：5’-TCATCATGCAGCTC-3’(SEQ ID No.2)；
T790M-R(28nt)：5’-CAGACCACACTGAGCACTCAATAAAGAG-3’(SEQ ID No.3)；
其中，T790M-AR引物中加下划线粗体的碱基为突变碱基，且T790M-AR引物的3’端修饰有MGB基团，该引物与T790M突变型模板可以完全互补配对结合，与T790M野生型模板有一个碱基C>T的突变，不能与野生型模板完全互补配对。T790M-AF的3’端与T790M-AR的5’端与模板的结合位置间隔3个碱基。
基于非小细胞肺癌L858R突变检测存在的问题，本发明提供了一种用于低丰度人L858R DNA突变的富集引物，包括正向引物，所述正向引物由L858R-AF引物和L858R-AR引物组成，所述L858R-AF引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述L858R-AR引物核苷酸序列如SEQ ID No.5所示且3’端修饰有MGB基团，所述L858R-AF引物的3’端与所述L858R-AR引物的5’端与模板的结合位置间隔4个碱基。
进一步的，所述用于低丰度人L858R DNA突变的富集引物，还包括反向引物L858R-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
具体的，各引物序列如下所示：
L858R-AF(15nt)：5’-ATGTCAAGATCACAG-3’(SEQ ID No.4)；
L858R-AR(12nt)：5’-TGGGCGGGCCAA-3’(SEQ ID No.5)；
L858R-R(25nt)：5’-CCTCATTCACTGTCCCAGCAAGTAC-3’(SEQ ID No.6)；
其中，L858R-AR引物中加下划线粗体的碱基为突变碱基，且L858R-AR引物的3’端修饰有MGB基团，该引物与L858R突变型模板可以完全互补配对结合，与L858R野生型模板有一个碱基T>G的突变，不能与野生型模板完全互补配对。L858R-AF的3’端与L858R-AR的5’端与模板的结合位置间隔4个碱基。
本发明还提供了一种低丰度DNA突变的富集方法，以待测样本为模板，以上述突变富集的引物进行富集扩增。
进一步的，所述的富集方法中所述富集扩增的反应体系为：12.5体积份的2×突变富集试剂、2.5体积份突变富集引物混合液，5-10体积份的待测样本，补水至25体积份。
其中所述突变富集引物混合液由AF引物、AR引物和反向引物R组成。
在一些实施方案中，所述突变富集引物混合液中所述AF引物的引物浓度为0.5μM±0.1μM、AR引物的引物浓度为0.5μM±0.1μM、反向引物R的引物浓度为0.3μM±0.1μM。
本发明提供了一种低丰度人T790M DNA突变的富集方法，以待测样本为模板，以所述人T790M DNA突变富集引物进行富集扩增。
进一步的，所述的富集方法中所述富集扩增的反应体系为：12.5体积份的2×突变富集试剂、2.5体积份突变富集引物混合液，5-10体积份的待测样本，补水至25体积份。
其中所述突变富集引物混合液由T790M-AF引物、T790M-AR引物和反向引物T790M-R组成。
在一些实施方案中，所述突变富集引物混合液中所述T790M-AF引物的引物浓度为0.5μM±0.1μM、T790M-AR引物的引物浓度为0.5μM±0.1μM、反向引物T790M-R的引物浓度为0.3μM±0.1μM。
在一些实施方案中，所述的富集方法中，所述富集扩增的反应程序为95℃5min；95℃5s、58℃5s、68℃30s，循环40次。
本发明提供了一种用于低丰度人L858R DNA突变的富集方法，以待测样本为模板，以所述人L858R DNA突变富集引物进行富集扩增。
进一步的，所述的富集方法中所述富集扩增的反应体系为：12.5体积份的2×突变富集试剂、2.5体积份突变富集引物混合液，5-10体积份的待测样本，补水至25体积份。
其中所述突变富集引物混合液由L858R-AF引物、L858R-AR引物和反向引物L858R-R组成。
在一些实施方案中，所述突变富集引物混合液中所述L858R-AF引物的引物浓度为0.5μM±0.1μM、L858R-AR引物的引物浓度为0.5μM±0.1μM、反向引物L858R-R的引物浓度为0.3μM±0.1μM。
在一些实施方案中，所述的富集方法中，所述富集扩增的反应程序为95℃5min；95℃5s、58℃5s、68℃30s，循环40次。
本发明还提供了一种低丰度DNA突变的富集试剂盒，包括所述突变富集引物AF引物、AR引物和/或反向引物-R。
进一步的，所述富集试剂盒还包括突变富集试剂，所述突变富集试剂由dNTP、MgCl2、NH4Cl、pH8.0Tris-HCl、KCl、DNA聚合酶组成。
本发明还提供了一种用于低丰度人T790M DNA突变的富集试剂盒，包括所述人T790M DNA突变富集引物T790M-AF引物、T790M-AR引物和/或反向引物T790M-R。
进一步的，所述用于低丰度人T790M DNA突变的富集试剂盒还包括突变富集试剂。优选的，所述突变富集试剂由dNTP、MgCl2、NH4Cl、pH8.0 Tris-HCl、KCl、DNA聚合酶组成。
在一些实施方案中，所述用于低丰度人T790M DNA突变的富集试剂盒中所述突变富集试剂各组分及其浓度如为：0.4-0.6mM的dNTP、3-5mM的MgCl2、60mM NH4Cl、50mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM KCl、0.1-0.5U/μl DNA聚合酶。优选的，所述富集试剂盒中所述突变富集试剂组分及其浓度为：0.5mM的dNTP、4mM的MgCl2、60mM NH4Cl、50mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM KCl、0.2U/μl DNA聚合酶
本发明还提供了一种用于低丰度人L858R DNA突变的富集试剂盒，包括所述人L858R DNA突变富集引物L858R-AF引物、L858R-AR引物和/或反向引物L858R-R。
进一步的，所述用于低丰度人L858R DNA突变的富集试剂盒还包括突变富集试剂。优选的，所述突变富集试剂由dNTP、MgCl2、NH4Cl、pH8.0Tris-HCl、KCl、DNA聚合酶组成。
在一些实施方案中，所述用于低丰度人L858R DNA突变的富集试剂盒中所述突变富集试剂各组分及其浓度如为：0.4-0.6mM的dNTP、3-5mM的MgCl2、60mM NH4Cl、50mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM KCl、0.1-0.5U/μl DNA聚合酶。优选的，所述富集试剂盒中所述突变富集试剂组分及其浓度为：0.5mM的dNTP、4mM的MgCl2、60mM NH4Cl、50mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM KCl、0.2U/μl DNA聚合酶。
本发明提供了一种用于低丰度DNA突变的检测方法，以经上述富集方法富集后的扩增产物为模板进行扩增然后进行Sanger测序。
其中，所述扩增的反应体系为：12.5体积份的2×扩增试剂、2.5体积份扩增引物混合液，5-10体积份的富集后的扩增产物，补水至25体积份。
本发明还提供了一种用于低丰度人T790M DNA突变的检测方法，以所述用于低丰度人T790M DNA突变的富集方法富集后的扩增产物为模板，以人T790M测序扩增引物进行扩增，然后以测序通用引物进行Sanger测序。
其中所述人T790M测序扩增引物由CX-T790M-F和CX-T790M-R组成，所述CX-T790M-F的核酸序列如SEQ ID No.7所示，所述CX-T790M-R的核酸序列如SEQ ID No.8所示。
具体的，所述序列如下所示：
CX-T790M-F：(SEQ ID No.7)TTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTTCCACCGTGCAGCTCATCA；
CX-T790M-R：(SEQ ID No.8)TGCTAGTTATTGCTCAGCGGCAGACCACACTGAGCACTCAATAAAGAG。
在一些实施方案中，所述CX-T790M-F和CX-T790M-R的浓度为2μM。
进一步的，所述用于低丰度人T790M DNA突变的检测方法中，所述扩增的反应体系为：12.5体积份的2×扩增试剂、2.5体积份扩增引物混合液，5-10体积份的富集后的扩增产物，补水至25体积份。
其中，所述扩增试剂由dNTP、MgCl2、pH8.0Tris-HCl、KCl、DNA聚合酶组成。
在一些实施方案中，所述扩增试剂各组分及浓度为0.5-0.7mM的dNTP、2-4mM的MgCl2、50mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM KCl、0.2U/μl DNA聚合酶。优选的，所述扩增试剂各组分及浓度为0.5mM的dNTP、3mM的MgCl2、50mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM KCl、0.2U/μl DNA聚合酶。
进一步的，所述用于低丰度人T790M DNA突变的检测方法中，所述扩增的反应程序为95℃5min；95℃10s、60℃60s，循环40次。
本发明还提供了一种用于低丰度人L858R DNA突变的检测方法，以所述用于低丰度人L858R DNA突变的富集方法富集后的扩增产物为模板，以人L858R测序扩增引物进行扩增，然后以测序通用引物进行Sanger测序。
其中，所述人L858R测序扩增引物由CX-L858R-F和CX-L858R-R组成，所述CX-L858R-F的核酸序列如SEQ ID No.9所示，所述CX-L858R-R的核酸序列如SEQ ID No.10所示。
具体的，所述序列如下所示：
CX-L858R-F：(SEQ ID No.9)TTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCATGTCAAGATCACAGATTTTGG；
CX-L858R-R：(SEQ ID No.10)TGCTAGTTATTGCTCAGCGGCCTCATTCACTGTCCCAGCAAGTAC。
在一些实施方案中，所述CX-L858R-F和CX-L858R-R的浓度为2μM。
进一步的，所述用于低丰度人L858R DNA突变的检测方法中，所述扩增的反应体系为：12.5体积份的2×扩增试剂、2.5体积份扩增引物混合液，5-10体积份的富集后的扩增产物，补水至25体积份。
其中，所述扩增试剂由dNTP、MgCl2、pH8.0Tris-HCl、KCl、DNA聚合酶组成。
在一些实施方案中，所述扩增试剂各组分及浓度为0.5-0.7mM的dNTP、2-4mM的MgCl2、50mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM KCl、0.2U/μl DNA聚合酶。优选的，所述扩增试剂各组分及浓度为0.5mM的dNTP、3mM的MgCl2、50mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM KCl、0.2U/μl DNA聚合酶。
进一步的，所述用于低丰度人L858R DNA突变的检测方法中，所述扩增的反应程序为95℃5min；95℃10s、60℃60s，循环40次。
本发明提供了一种用于低丰度DNA突变的检测试剂盒，包括测序扩增引物混合液和/或扩增试剂。
其中，所述扩增引物混合液由CX-F和CX-R组成。
在一些实施方案中，所述扩增引物混合液中所述CX-F的引物浓度为0.2μM±0.1μM、CX-R的引物浓度为0.2μM±0.1μM。
所述扩增试剂由dNTP、MgCl2、pH8.0Tris-HCl、KCl、DNA聚合酶组成。
进一步的，所述检测试剂盒，还包括所述突变富集引物、突变富集试剂、阳性质控品、阴性质控品、测序通用引物中至少一种。
其中，所述突变富集试剂由dNTP、MgCl2、NH4Cl、pH8.0Tris-HCl、KCl、DNA聚合酶组成；所述阳性质控品为含有突变序列的重组质粒、所述阴性质控品为EGFR基因未发生突变的人全血基因组核酸。
本发明提供了一种用于低丰度人T790M DNA突变的富集试剂盒，包括所述用于低丰度人T790M DNA突变的突变富集引物、突变富集试剂、测序扩增引物、扩增试剂、阳性质控品、阴性质控品、测序通用引物中至少一种。
其中，所述突变富集试剂由dNTP、MgCl2、NH4Cl、pH8.0Tris-HCl、KCl、DNA聚合酶组成；所述人T790M测序扩增引物由CX-T790M-F和CX-T790M-R组成，所述CX-T790M-F的核酸序列如SEQ ID No.7所示，所述CX-T790M-R的核酸序列如SEQ ID No.8所示；所述扩增试剂由dNTP、MgCl2、pH8.0Tris-HCl、KCl、DNA聚合酶组成；所述T790M阳性质控品为含有T790M突变序列的重组质粒pUC-T790M-M、所述T790M阴性质控品为EGFR基因未发生突变的人全血基因组核酸。
本发明提供了一种低丰度人L858R DNA突变的富集试剂盒，包括所述用于低丰度人L858R DNA突变的突变富集引物、突变富集试剂、测序扩增引物、扩增试剂、阳性质控品、阴性质控品、测序通用引物中至少一种。
其中，所述突变富集试剂由dNTP、MgCl2、NH4Cl、pH8.0Tris-HCl、KCl、DNA聚合酶组成；所述人L858R测序扩增引物由CX-L858R-F和CX-L858R-R组成，所述CX-L858R-F的核酸序列如SEQ ID No.9所示，所述CX-L858R-R的核酸序列如SEQ ID No.10所示；所述扩增试剂由dNTP、MgCl2、pH8.0Tris-HCl、KCl、DNA聚合酶组成；所述L858R阳性质控品为含有L858R突变序列的重组质粒pUC-L858R-M、所述L858R阴性质控品为EGFR基因未发生突变的人全血基因组核酸。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种用于低丰度DNA突变的富集引物、富集方法及试剂盒，用于低丰度DNA突变的检测方法及检测试剂盒。本发明基于PCR原理富集低丰度DNA突变，富集引物的正向引物包括2条短引物，长度为10-16nt，2条短引物分别命名为AF引物和AR引物，AF引物可与野生型和突变型模板均匹配。AR引物设计有与突变位点互补的碱基，位于AR引物的中间位置或中间偏5’端位置。AR引物可与突变型模板完全互补配对，与野生型模板有一个突变碱基的不匹配，使其与突变型和野生型模板结合效率不同，且AR引物3’端修饰有MGB基团。AF引物3’端与AR引物5’端与模板结合的位置间隔0-5个碱基。
本发明所述用于低丰度DNA突变的富集方法有别于传统的Blocker阻碍技术，不需要合成特定的Blocker阻碍引物或探针，通过两段较短的引物就能达到对野生型和突变型模板的扩增差异。本发明主要是通过碱基堆积作用达到对野生型和突变型的扩增差异，当一段引物与DNA模板单链特异性结合后，可改变该模板的结构使其上游或下游本不能与模板结合的引物可与模板特异性结合，并在DNA聚合酶的作用下进行扩增。第二段引物与模板的结合依赖于第一段引物与模板的结合，由于第一段引物较短一般为10-16nt，其中一个碱基的改变可极大的影响其与模板结合的效率，当第一段引物与模板完全匹配时，其可与模板特异性结合，从而促进第二段引物与模板的结合起始扩增反应，当第一段引物与模板有一个碱基的差异时，该引物与模板不能结合或结合效果差，第二段引物不能通过碱基堆积作用与模板结合，而不能进行扩增。通过本发明的富集技术可将丰度在万分之一的突变型模板富集100～1000倍，达到百分之一～十分之一以上，富集产物可用多种方法进行后续分析，操作简单，应用灵活，灵敏度高，可有效的提高样本中突变DNA的相对含量，适用于血浆样本核酸的检测。
本发明所述用于低丰度DNA突变的检测方法需进行两轮PCR扩增，第一轮扩增用于富集突变模板，第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板进行扩增，将第二轮扩增产物进行Sanger测序，检测是否含有相应的核酸突变。进过第一轮扩增可达到Sanger测序的检测范围。本发明所述用于低丰度DNA突变的检测方法具有检测特异性好、灵敏度低、操作简单、成本低等优势。
本发明所述用于EGFR中T790M和L858R突变的检测试剂盒，检测灵敏度高，可达万分之一，特异性好，操作简单，检测周期短，成本低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为富集扩增原理图。
具体实施方式
本发明公开了一种用于低丰度DNA突变的富集技术及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中，所述通用测序引物序列如下：
TY-F：TAATACGACTCACTATAGGG；
TY-R：GCTAGTTATTGCTCAGCGG。
实施例1、一种用于T790M和L858R突变检测试剂盒
1.试剂盒中各引物
(1)用于T790M突变富集扩增的引物序列如下：
T790M-AF：5’-CTCCACCGTGC-3’
T790M-AR：5’-TCATCATGCAGCTC-3’
其中加下划线碱基为突变位点，且辅助引物3’末端修饰有MGB基团。
T790M-R：5’-CAGACCACACTGAGCACTCAATAAAGAG-3’
(2)用于T790M Sanger测序扩增的引物序列：
上游引物CX-T790M-F：TTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTTCCACCGTGCAGCTCATCA
下游引物CX-T790M-R：TGCTAGTTATTGCTCAGCGGCAGACCACACTGAGCACTCAATAAAGAG
(3)用于L858R突变富集扩增的引物序列如下
L858R-AF：5’-ATGTCAAGATCACAG-3’
L858R-AR：5’-TGGGCGGGCCAA-3’
其中，L858R-AR引物中加下划线粗体的碱基为突变位点，且L858R-AR的3’端修饰有MGB基团。
L858R-R：5’-CCTCATTCACTGTCCCAGCAAGTAC-3’
(4)用于L858R Sanger测序扩增的引物序列如下：
CX-L858R-F：TTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCATGTCAAGATCACAGATTTTGG
CX-L858R-R：TGCTAGTTATTGCTCAGCGGCCTCATTCACTGTCCCAGCAAGTAC
(5)Sanger测序上机通用测序引物序列如下：
TY-F：TAATACGACTCACTATAGGG
TY-R：GCTAGTTATTGCTCAGCGG
2.用于T790M和L858R突变富集检测试剂
2×突变富集试剂：由以下组分组成：0.5mM的dNTP、4mM的MgCl2、60mM NH4Cl、50mMTris-HCl(pH8.0)、100mM KCl、0.2U/μl DNA聚合酶。
T790M突变富集引物：由T790M-AF、T790M-AR、T790M-R组成，各引物在反应体系中浓度分别为：T790M-AF为0.5μM、T790M-AR为0.5μM、T790M-R为0.3μM。
L858R突变富集引物：由L858R-AF、L858R-AR、L858R-R组成，各引物在反应体系中浓度分别为：T790M-AF为0.5μM、T790M-AR为0.5μM、T790M-R为0.3μM。
用于测序的2×扩增试剂：由以下组分组成：0.5mM的dNTP、3mM的MgCl2、50mMTris-HCl(pH8.0)、100mM KCl、0.2U/μl DNA聚合酶。
用于T790M第二轮扩增的测序引物混合液：由以下组分组成：CX-T790M-F和CX-T790M-R，各引物在反应体系中浓度分别为：CX-T790M-F为0.2μM、CX-T790M-R为0.2μM。
用于L858R第二轮扩增的测序引物混合液：由以下组分组成：CX-L858R-F和CX-L858R-R，各引物在反应体系中浓度分别为：CX-L858R-F为0.2μM、CX-L858R-R为0.2μM。
用于Sanger上机测序的引物为CF-F和CX-R，其浓度为10μM。
质控品：包括阴性质控品和阳性质控品。
T790M阳性质控品：含有T790M突变型序列的重组质粒pUC-T790M-M，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
L858R阳性质控品：含有L858R突变型序列的重组质粒pUC-L858R-M，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
阴性质控品：为EGFR基因未发生突变的人全血基因组核酸
3.突变富集检测试剂盒的使用方法
(1)突变的富集扩增
a.突变富集扩增反应液的配制：取一个八联排PCR管，于管中依次加入12.5μl的2×突变富集试剂、2.5μl相应的突变富集引物混合液，5-10μl的待测样本，补水至25μl，混合均匀。
b.将配制好的富集扩增反应液置于PCR仪中进行扩增反应，扩增程序设定为95℃5min，95℃5s、58℃5s、68℃30s循环40次。
c.将步骤b中的扩增产物稀释1000倍，作为测序扩增的模板。
(2)Sanger测序扩增
a.Sanger测序扩增反应液的配制：取一个八联排PCR反应管，于管中依次加入12.5μl的2×扩增试剂、2.5μl的测序引物混合液、5μl步骤(1)c稀释的模板、5μl双蒸水，混合均匀。
b.将配制好反应液的反应管置于PCR扩增仪中进行扩增反应，扩增程序设定为95℃5min，95℃10s、60℃60s循环40次。
c.将扩增产物及测序通用引物CX-F和CX-R送测序公司进行测序，对其测序结果进行分析。
实施例2、T790M和L858R突变检测试剂盒检测灵敏度验证
1.模板制备：将阴性质控品为EGFR未突变的人全血基因组核酸定量并稀释至10000拷贝/μl备用。阳性质控品为含有突变型序列的重组质粒pUC-T790M-M和pUC-L858R-M，均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，将合成的质粒经转化大肠杆菌提取质粒，定量后稀释至104拷贝/μl。将稀释好的阳性质控品pUC-T790M-M和pUC-L858R-M分别和阴性质控品按如下比例0:100(纯野生型)、0.01：99.99(万分之一)、0.1:99.9(千分之一)、1:99(百分之一)、10:90(十分之一)、100:0(纯突变型)进行混合，配制T790M和L858R灵敏度标准品，标准品浓度分别为纯野生型、万分之一、千分之一、百分之一、十分之一、纯突变型。为了保证实验结果可信度，每个标准品浓度重复3次，以纯野生型作为阴性对照，纯突变型作为阳性对照。
2.各浓度标准品的突变富集扩增
按实施例1中步骤(1)的操作流程配制富集扩增反应液，在PCR反应管中依次加入12.5μl富集扩增试剂、2.5μl富集引物混合液、5μl双蒸水、制备的5μl纯野生型、万分之一、千分之一、百分之一、纯突变型的T790M和L858R的标准品分别加入到对应的反应管中。按实施例1中的扩增程序进行扩增。
3.Sanger测序扩增及测序
将步骤2富集得到的扩增产物稀释1000倍，按照实施例1中Sanger测序的方法进行Sanger测序扩增反应，以未经富集的纯野生型、万分之一、千分之一、百分之一、十分之一、纯突变型的标准品作为对照，同时进行扩增，然后送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序，对反馈测序结果进行分析比对，其结果下表1和2所示。
表1 T790M测序结果
Figure BDA0001723976410000141
表2 L858R测序结果
Figure BDA0001723976410000151
通过对比熔解曲线和Sanger测序的结果，说明本发明的方法对低丰度的突变有较好的富集能力，可有效的将万分之一的突变浓度富集至百分之一以上，达到Sanger测序的检测范围，说明该方法对突变的富集是有效的。
实施例3、T790M和L858R突变检测试剂盒对临床样本的检测
采集30例肺癌患者的血浆样本，其中已确定11例为EGFR基因T790M突变，13例为EGFR基因L858R突变，其余6例为其他突变或病因未明，此30例肺癌患者血浆样本均采自深圳市第三人民医院。将采集的样本采用Qiagen试剂盒进行核酸提取。然后按照本发明的方法进行检测，并与之前的检测结果进行对比，其结果如表3所示。
表3检测临床样本结果统计
Figure BDA0001723976410000161
Figure BDA0001723976410000171
由以上检测结果可以看出，采用本发明的检测方法与医院检测方法的一致性可达100％，特异性良好，且有1例病因未明病例采用本方法检测结果为T790M突变，由此可以看出本发明的方法检测结果准确，可检测出样本低丰度的突变，因此本发明可很好的应用于血浆中T790M和L858R突变位点的检测，可应用于临床突变检测研究。
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进反应参数。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的技术及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
序列表
<110> 博奥生物集团有限公司
<120> 一种用于低丰度DNA突变的富集技术及其应用
<130> MP1803475
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
ctccaccgtg c 11
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
tcatcatgca gctc 14
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
cagaccacac tgagcactca ataaagag 28
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
atgtcaagat cacag 15
<210> 5
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
tgggcgggcc aa 12
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
cctcattcac tgtcccagca agtac 25
<210> 7
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
ttaatacgac tcactatagg ggaattgtga gcggataaca attcccctct tccaccgtgc 60
agctcatca 69
<210> 8
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
tgctagttat tgctcagcgg cagaccacac tgagcactca ataaagag 48
<210> 9
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
ttaatacgac tcactatagg ggaattgtga gcggataaca attcccatgt caagatcaca 60
gattttgg 68
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
tgctagttat tgctcagcgg cctcattcac tgtcccagca agtac 45

Claims (7)

1.一种用于低丰度DNA突变的富集引物，
当所述DNA突变为人T790M DNA突变时，所述用于低丰度人T790M DNA突变的富集引物，包括正向引物，所述正向引物由T790M-AF引物和T790M-AR引物组成，所述T790M-AF引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述T790M-AR引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示且3’端修饰有MGB基团，所述T790M-AF引物的3’端与所述T790M-AR引物的5’端与模板的结合位置间隔3个碱基；还包括反向引物T790M-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
当所述DNA突变为人L858R DNA突变时，所述用于低丰度人L858R DNA突变的富集引物，包括正向引物，所述正向引物由L858R-AF引物和L858R-AR引物组成，所述L858R-AF引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述L858R-AR引物核苷酸序列如SEQ ID No.5所示且3’端修饰有MGB基团，所述L858R-AF引物的3’端与所述L858R-AR引物的5’端与模板的结合位置间隔4个碱基；还包括反向引物L858R-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
2.一种非治疗和/或诊断目的的低丰度DNA突变的富集方法，以待测样本为模板，以权利要求1所述引物进行富集扩增。
3.根据权利要求2所述富集方法，其特征在于，
当所述DNA突变为人T790M DNA突变时，以待测样本为模板，以权利要求1所述用于低丰度人T790M DNA突变的富集引物进行富集扩增；
当所述DNA突变为人L858R DNA突变时，以待测样本为模板，以权利要求1所述用于低丰度人L858R DNA突变的富集引物进行富集扩增。
4.一种低丰度DNA突变的富集试剂盒，包括权利要求1所述引物；
当所述DNA突变为人T790M DNA突变时，包括权利要求1所述用于低丰度人T790M DNA突变的富集引物；
当所述DNA突变为人L858R DNA突变时，包括权利要求1所述用于低丰度人L858R DNA突变的富集引物；
还包括突变富集试剂，所述突变富集试剂由dNTP、MgCl2、NH4Cl、pH8.0 Tris-HCl、KCl、DNA聚合酶组成。
5.一种非治疗和/或诊断目的的低丰度DNA突变的检测方法，以权利要求2所述富集方法富集后的扩增产物为模板进行扩增然后进行Sanger测序。
6.根据权利要求5所述检测方法，其特征在于，
当所述DNA突变为人T790M DNA突变时，以权利要求3所述富集方法富集后的扩增产物为模板，以人T790M测序扩增引物进行扩增，然后以测序通用引物进行Sanger测序；所述人T790M测序扩增引物由CX-T790M-F和CX-T790M-R组成，所述CX-T790M-F的核酸序列如SEQID No.7所示，所述CX-T790M-R的核酸序列如SEQ ID No.8所示；
当所述DNA突变为人L858R DNA突变时，以权利要求3所述富集方法富集后的扩增产物为模板，以人L858R测序扩增引物进行扩增，然后以测序通用引物进行Sanger测序；所述人L858R测序扩增引物由CX-L858R-F和CX-L858R-R组成，所述CX-L858R-F的核酸序列如SEQID No.9所示，所述CX-L858R-R的核酸序列如SEQ ID No.10所示。
7.一种低丰度DNA突变的检测试剂盒， 包括权利要求1所述突变富集引物。
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