CN110938696A

CN110938696A - 一种用于检测胃肠道间质瘤相关基因突变的试剂盒

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Publication number: CN110938696A
Application number: CN201911331906.0A
Authority: CN
Inventors: 熊慧; 曾海; 柳诚刚; 肖樊; 尹璐; 高峰英
Original assignee: WUHAN BIOTECH GENE ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: WUHAN BIOTECH GENE ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2019-12-21
Filing date: 2019-12-21
Publication date: 2020-03-31

Abstract

本发明公开了一种用于检测胃肠道间质瘤相关基因突变的试剂盒，所述胃肠道间质瘤相关基因包括C‑kit和PDGFRA基因，该试剂盒包括分别用于检测C‑kit基因第9号外显子、第11号外显子、第13号外显子、第17号外显子的引物和荧光探针，分别用于检测PDGFRA第12号外显子和第18号外显子的引物和荧光探针，所述引物和荧光探针可以精准检测C‑kit和PDGFRA基因是否发生突变，同时，该试剂盒中还加入相应特异的锁核酸探针，大大提高了胃肠道间质瘤相关基因突变的检出率。

Description

一种用于检测胃肠道间质瘤相关基因突变的试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种用于检测胃肠道间质瘤相关基因突变的试剂盒。

背景技术

胃肠道间质瘤(Gastrointestinal stromal tumors,GIST)是一类起源于胃肠道间叶组织的肿瘤，占消化道间叶肿瘤的大部分，Mazur等人根据电镜观察和免疫组织化学检测结果，于1983年首次提出了胃肠道间质肿瘤这个概念，大多数GIST患者存在原癌基因C-kit突变。原癌基因C-kit位于人的染色体4q11-12，该C-kit基因包含有21个外显子和20个内含子。C-kit基因的突变可以刺激肿瘤细胞的持续增生和抗凋亡信号的失控。C-kit基因的突变具有多种形式，如碱基对丢失、点突变、偶可见插入性突变。胃肠道间质瘤的C-kit基因的突变率高，且突变部位主要集中在550Lys-256Val氨基酸残基之间，发生在胞外区(外显子9突变约5％-10％)、邻近胞膜区(外显子11突变大约57％-71％)和激酶区(外显子13突变约5％，外显子17突变占5％)。

部分无C-kit基因突变的GIST患者可发现血小板源性生长因子受体(Platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)α基因突变。血小板源性生长因子受体是一种单链跨膜蛋白，属III型酪氨酸蛋白激酶家族。最常见的PDGFRA基因突变位点是编码位于第二酪氨酸激酶区活化环的区域(外显子18)，少数突变发生在近膜区(外显子12)，突变引起PDGFRA蛋白的功能改变，通常会导致非配体依赖性的二聚体形成、酪氨酸残基自主磷酸化及下游信号的激活，这种激活导致的最终结果是肿瘤的发生。基因突变的监测在胃肠道间质瘤的诊断治疗过程中势在必行。

现有的检测C-kit和PDGFRA基因突变的方法主要为传统Sanger测序法，但采用传统Sanger测序法检测C-kit基因突变时，其检测灵敏度低，不能准确检测出C-kit和PDGFRA基因是否发生突变，此法不适于临床应用。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种用于检测胃肠道间质瘤相关基因突变的试剂盒，可用来检测样本组织中C-kit和PDGFRA基因是否发生突变，检测快速、特异性高、灵敏度高。

本发明的技术方案是这样实现的：

第一方面，本发明提供了用于检测胃肠道间质瘤相关基因突变的引物探针组合物，其特征在于：所述胃肠道间质瘤相关基因为C-kit基因和PDGFRA基因，所述引物探针组合物包括引物1-12、荧光探针1-6和锁核酸探针1-6，所述引物1-8、荧光探针1-4和锁核酸探针1-4用于检测C-kit基因突变，所述引物9-12用于检测PDGFRA基因突变，具体如下：

C-kit基因第9号外显子的引物1、2分别如序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

C-kit基因第9号外显子的荧光探针1如序列表中SEQ ID NO.3所示；

C-kit基因第9号外显子的锁核酸探针1如序列表中SEQ ID NO.4所示；

C-kit基因第11号外显子的引物3、4分别如序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

C-kit基因第11号外显子的荧光探针2如序列表中SEQ ID NO.7所示；

C-kit基因第11号外显子的锁核酸探针2如序列表中SEQ ID NO.8所示；

C-kit基因第13号外显子的引物5、6分别如序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；

C-kit基因第13号外显子的荧光探针3如序列表中SEQ ID NO.11所示；

C-kit基因第13号外显子的锁核酸探针3如序列表中SEQ ID NO.12所示；

C-kit基因第17号外显子的引物7、8分别如序列表中SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14所示；

C-kit基因第17号外显子的荧光探针4如序列表中SEQ ID NO.15所示；

C-kit基因第17号外显子的锁核酸探针4如序列表中SEQ ID NO.16所示；

PDGFRA基因第12号外显子的引物9、10分别如序列表中SEQ ID NO.17和SEQ IDNO.18所示；

PDGFRA基因第12号外显子的荧光探针5如序列表中SEQ ID NO.19所示；

PDGFRA基因第12号外显子的锁核酸探针5如序列表中SEQ ID NO.20所示；

PDGFRA基因第12号外显子的引物11、12分别如序列表中SEQ ID NO.21和SEQ IDNO.22所示；

PDGFRA基因第12号外显子的荧光探针6如序列表中SEQ ID NO.23所示；

PDGFRA基因第12号外显子的锁核酸探针6如序列表中SEQ ID NO.24所示；

各荧光探针的5’端均连接有荧光基团，各荧光探针的3’端均连接有能够淬灭相应5’端荧光基团发射的荧光信号的淬灭基团，各锁核酸探针的3’端均连接有PO4基团。

本发明在对胃肠道间质瘤相关基因C-kit和PDGFRA野生型序列和现有已知的所有突变型序列进行比对的基础上，针对突变频率比较高的C-kit基因第9号外显子、第11号外显子、第13号外显子和第17号外显子以及PDGFRA基因的第12号外显子和第18号外显子各设计多对引物和探针，经PCR反应优化，筛选出扩增效果最好的一种引物探针组合物，可准确检测上述几种突变类型，具有很好的特异性。

第二方面，本发明提供了一种用于检测胃肠道间质瘤相关基因突变的试剂盒，包括本发明第一方面所述的引物探针组合物。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述试剂盒应用于荧光定量PCR反应中，反应体系中所述引物探针组合物中各引物浓度为0.3μmol/L，各荧光探针浓度为0.2μmol/L。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述试剂盒还包括PCR反应液和测序反应液，所述PCR反应液包括含Mg²⁺的PCR扩增缓冲液、dNTPs和Taq DNA聚合酶，所述测序反应液包括2.5×BigDye和5×BigDye测序缓冲液。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述试剂盒还包括PCR产物纯化试剂，所述PCR产物纯化试剂包括3mol/L醋酸钠溶液、无水乙醇和甲酰胺。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为含C-kit和PDGFRA野生型基因片段的重组质粒，所述阳性质控品为含C-kit和PDGFRA突变型基因片段的重组质粒。

第三方面，本发明提供了一种非诊断目的检测胃肠道间质瘤相关基因突变的方法，采用本发明第二方面所述试剂盒，包括以下步骤：

S1、提取样本基因组DNA；

S2、以所述样本基因组DNA为模板，采用所述试剂盒进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；

S3、对所述PCR扩增产物进行纯化，得到纯化的PCR扩增产物；

S4、以所述纯化的PCR扩增产物为模板，进行测序PCR扩增，得到测序PCR扩增产物；

S5、对所述测序PCR扩增产物进行纯化，得到纯化的测序PCR扩增产物；

S6、将所述纯化的测序PCR扩增产物进行测序分析，并分别与C-kit和PDGFRA野生型基因序列进行比对，判定所述样本基因组DNA中C-kit和PDGFRA基因是否发生突变。

本发明的用于检测胃肠道间质瘤相关基因突变的试剂盒相对于现有技术具有以下有益效果：

(1)本发明试剂盒中提供的特异性引物探针组合物能够高灵敏地检测胃肠道间质瘤相关基因C-kit和PDGFRA是否发生突变，涵盖多个突变位点的检测，同时，对待测样本的基因片段采用荧光PCR进行扩增，扩增情况可以通过扩增曲线和Ct值判断；

(2)本发明试剂盒还对应加入了锁核酸探针，锁核酸对DNA和RNA均具有很好的识别能力和强大的亲和力，且不易被酶解，将锁核酸作为探针与RNA/DNA链结合的复合体具有很高的热稳定性，但又对碱基错配敏感，一个碱基的错配可使RNA/DNA的熔解温度(Tm值)较大幅度地下降，在进行PCR扩增时，锁核酸能够与野生型序列结合，从而阻滞PCR延伸，导致野生型基因PCR扩增失败，而锁核酸不能与突变型序列结合，使得C-kit和PDGFRA基因突变型得以扩增，从而提高了C-kit和PDGFRA基因突变的检出率，且可用于检测单个碱基的突变。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例3中PCR扩增曲线图。

图2为本发明实施例3中C-kit基因第9号外显子502-503ins GCCTAT突变型测序峰图。

图3为本发明实施例3中C-kit基因第11号外显子557-558del TGGAAG突变型测序峰图。

图4为本发明实施例3中C-kit基因第13号外显子K642E突变型测序峰图。

图5为本发明实施例3中C-kit基因第17号外显子N822K突变型测序峰图。

图6为本发明实施例3中PDGFRA基因第12号外显子V561D突变型测序峰图。

图7为本发明实施例3中PDGFRA基因第18号外显子D842V突变型测序峰图。

图8为本发明实施例4中加入锁核酸探针和未加入锁核酸探针检测C-kit基因第17号外显子突变型的测序结果对比。

图9为本发明实施例4中加入锁核酸探针和未加入锁核酸探针检测PDGFRA基因第18号外显子突变型的测序结果对比。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，可以参考《分子克隆实验指南》(第四版)。实施例中所用的引物和探针委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例1

本发明实施例提供用于检测胃肠道间质瘤相关基因C-kit和PDGFRA突变的引物探针组合物，该用于检测C-kit和PDGFRA基因突变的引物探针组合物包括用于检测C-kit基因的第9号外显子突变的正反向引物、荧光探针和锁核酸探针，用于检测C-kit基因的第11号外显子的正方向引物、荧光探针和锁核酸探针，用于检测C-kit基因的第13号外显子的正反向引物、荧光探针和锁核酸探针，用于检测C-kit基因的第17号外显子的正反向引物、荧光探针和锁核酸探针，用于检测PDGFRA基因的第12号外显子的正反向引物、荧光探针和锁核酸探针，以及用于检测PDGFRA基因的第18号外显子的正反向引物、荧光探针和锁核酸探针，其中：

C-kit基因第9号外显子的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示；

C-kit基因第9号外显子的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示；

C-kit基因第9号外显子的荧光探针如序列表中SEQ ID NO.3所示；

C-kit基因第9号外显子突变类型为502-503ins的锁核酸探针，5’-GTTAA+AA+TA+G+GCA-3’-PO4，如序列表中SEQ ID NO.4所示；

C-kit基因第11号外显子的正向引物如序列表中SEQ ID NO.5所示；

C-kit基因第11号外显子的反向引物如序列表中SEQ ID NO.6所示；

C-kit基因第11号外显子的荧光探针如序列表中SEQ ID NO.7所示；

C-kit基因第11号外显子突变类型为557-558del的锁核酸探针：5’-AACC+TT+C+CA+C+TG-3’-PO4，如序列表中SEQ ID NO.8所示；

C-kit基因第13号外显子的正向引物如序列表中SEQ ID NO.9所示；

C-kit基因第13号外显子的反向引物如序列表中SEQ ID NO.10所示；

C-kit基因第13号外显子的荧光探针如序列表中SEQ ID NO.11所示；

C-kit基因第13号外显子突变类型为K642E的锁核酸探针：5’-GGAC+T+TT+GA+GTTC-3’-PO4，如序列表中SEQ ID NO.12所示；

C-kit基因第17号外显子的正向引物如序列表中SEQ ID NO.13所示；

C-kit基因第17号外显子的反向引物如序列表中SEQ ID NO.14所示；

C-kit基因第17号外显子的荧光探针如序列表中SEQ ID NO.15所示；

C-kit基因第17号外显子突变类型为D820G、S821C、N822K和Y823D的锁核酸探针：5’-CA+TAAT+TA+G+AA+TC+A-3’-PO4，如序列表中SEQ ID NO.16所示；

PDGFRA基因第12号外显子的正向引物如序列表中SEQ ID NO.17所示；

PDGFRA基因第12号外显子的反向引物如序列表中SEQ ID NO.18所示；

PDGFRA基因第12号外显子的荧光探针如序列表中SEQ ID NO.19所示；

PDGFRA基因第12号外显子突变类型为V561D的锁核酸探针如序列表中SEQIDNO.20所示；

PDGFRA基因第18号外显子的正向引物如序列表中SEQ ID NO.21所示；

PDGFRA基因第18号外显子的反向引物如序列表中SEQ ID NO.22所示；

PDGFRA基因第18号外显子的荧光探针如序列表中SEQ ID NO.23所示；

PDGFRA基因第18号外显子突变类型为D842V的锁核酸探针如序列表中SEQIDNO.24所示；

所有荧光探针的5’端均连接有FAM荧光基团，3’端均连接有BHQ淬灭基团；所有锁核酸探针的3’端均连接有PO4基团。

实施例2

本发明实施例提供一种用于检测胃肠道间质瘤相关基因C-kit和PDGFRA突变的试剂盒，该试剂盒包括本发明实施例1提供的引物探针组合物，各引物、荧光探针及锁核酸探针浓度均为10μmol/L，可检测C-kit基因的第9号、第11号、第13号和第17号外显子的突变以及PDGFRA基因的第12号和第18号外显子的突变。

该试剂盒还包括PCR反应液、测序反应液、PCR产物纯化试剂、阴性质控品和阳性质控品，所述PCR反应液包括含Mg²⁺的5×PCR扩增缓冲液、2.5mmol/L dNTPs和5U/μL Taq DNA聚合酶，所述测序反应液包括2.5×BigDye和5×BigDye测序缓冲液。

本实施例试剂盒采用乙醇/醋酸钠法对PCR产物进行纯化，所述PCR产物纯化试剂包括3mol/L醋酸钠溶液、无水乙醇、70％(v/v)乙醇和甲酰胺。

所述阴性质控品为含C-kit和PDGFRA野生型基因片段的重组质粒，所述阳性质控品为含C-kit和PDGFRA突变型基因片段的重组质粒。

本发明提供的用于检测检测胃肠道间质瘤相关基因C-kit和PDGFRA突变的试剂盒包括本发明实施例1提供的引物、荧光探针以及锁核酸探针，使得该试剂盒能够准确检测C-kit和PDGFRA基因是否发生突变，通过加入锁核酸探针，在PCR扩增过程中对突变型DNA进行富集，进一步提高突变型检测的灵敏度。

实施例3、胃肠道间质瘤相关基因突变的检测

收集20例临床诊断为胃肠道间质瘤患者胃肠道间质瘤组织切片，为保证实验的准确性，组织切片用传统测序法测序验证。

具体实施步骤为：

S1、提取样本基因组DNA

适用样本类型：10％中性福尔马林固定石蜡包埋胃肠道间质瘤组织切片。

待检测样本要求：

(1)石蜡包埋病理切片样品应确定含有肿瘤病变细胞，为了保证切片组织中含有足够比例的肿瘤细胞，需要加同一组织HE染色片一张；

(2)每例标本切5张8～10μm厚白片，肿瘤细胞区域大于5mm×5mm，连续切片，封存于1.5mL离心管中；

(3)石蜡包埋病理切片在常温条件下保存不要超过12个月，为确保DNA提取成功率，必须选择1年以内的石蜡包埋病理切片；

(4)石蜡包埋病理切片常温运输。

选用TIANGEN公司的石蜡包埋组织DNA提取试剂盒对样本石蜡包埋组织切片提取基因组DNA，操作步骤详见该试剂盒说明书。提取的样本基因组DNA采用紫外分光光度计测定浓度及质量，A₂₆₀/A₂₈₀比值大于1.8，A₂₆₀/A₂₃₀比值大于2.0，样本基因组DNA浓度在20ng/μL以上。如提取后的核酸储备液浓度范围不符合要求，应重新取材或扩大样本量再进行核酸提取。提取完的DNA应立即进行检测，否则请于-20℃或-80℃的温度条件下保存，-20℃可以保存1年，且反复冻融不超过5次。

S2、荧光PCR扩增

准备6个PCR反应管，分别对应C-kit基因的第9号外显子、第11号外显子、第13号外显子、第17号外显子和PDGFRA基因的第12号外显子、第18号外显子，用微量加样器在每一个PCR反应管内分别加入对应的引物、荧光探针、锁核酸探针，每管PCR反应体系为25μL，正向引物0.75μL、反向引物0.75μL、荧光探针0.5μL、锁核酸探针0.5μL、含Mg²⁺的5×PCR扩增缓冲液5μL、2.5mmol/L dNTPs 1.5μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，补去离子水至23μL，最后向各PCR反应管中加入提取的样本基因组DNA 2μL。再准备4个PCR反应管，分别对应C-kit基因检测阴性质控、阳性质控和PDGFRA基因检测阴性质控、阳性质控，按上述方法配制PCR反应体系，引物、荧光探针、锁核酸探针为与其检测基因种类相对应的任一组引物、荧光探针、锁核酸探针，模板DNA分别替换成等量的含C-kit野生型基因片段的重组质粒、含C-kit突变型基因片段的重组质粒、含PDGFRA野生型基因片段的重组质粒和含PDGFRA突变型基因片段的重组质粒。盖紧所有PCR反应管，进行PCR扩增反应。在荧光PCR仪上设置以下程序：

经过上述程序扩增后，得到PCR扩增产物，如图1所示，该扩增曲线均呈S型，且Ct值在20-30之间，可见扩增效果良好。

S3、纯化PCR扩增产物

将3mol/L醋酸钠溶液与无水乙醇按照1:15的体积比例混合分装到10个离心管中，每个离心管内加入16μL PCR反应混合液，充分振荡，在4℃12000rpm离心10min，小心弃上清；加150μL预冷的70％(v/v)乙醇，混匀后12000rpm离心10min，小心弃上清，重复1次，室温晾干。加入10μL的甲酰胺于离心管中，充分溶解DNA沉淀，静置3min稍离心，在金属浴上进行热变性(95℃4min)，冰中骤冷。

S4、测序PCR扩增

取纯化的PCR扩增产物3μL作为模板，再分别加入对应的正向引物1μL，加入2.5×BigDye 0.30μL、5×BigDye测序缓冲液0.45μL、去离子水1.25μL，进行测序PCR扩增，扩增条件如下：

经上述扩增条件，得到测序PCR扩增产物。

S5、纯化测序PCR扩增产物

按照步骤S3所述方法对测序PCR扩增产物进行纯化。纯化后当日上机测序；若不能当日测序，需将测序PCR扩增产物于-20℃保存，上机当日再纯化。

S6、测序分析

将纯化后的测序PCR扩增产物在ABI 3500系列基因分析仪上进行测序分析，并与C-kit和PDGFRA基因对应外显子野生型进行比对，判定样本中C-kit和PDGFRA基因是否发生突变，具体如下：

(1)C-kit基因的第9号外显子的突变热点为C-kit基因第9号外显子Ala502-Tyr503区段的6核苷酸重复突变。

C-kit基因的第9号外显子突变分析：将C-kit基因的第9号外显子的测序结果使用Chromas程序打开，按Ctrl+F键快速查找序列AAGACTTCT，将AAGACTTCT后面的序列与C-kit基因的野生型序列比对，如图2所示，其中，C-kit基因的第9号外显子的野生型核苷酸序列为：GCC TAT TTT AAC TTT GCA TTT AAA GGT AAC AAC AAA，通过比对分析确定病理切片组织发生了插入突变，该突变具体位于C-kit基因第9号外显子Ala502-Tyr503区段的6核苷酸重复突变，这与C-kit基因的第9号外显子的突变热点相符，即突变类型为502-503ins的C-kit基因第9号外显子突变。该结果与传统测序法测得的结果相符，由此可见，本发明实施例提供的试剂盒和检测C-kit基因突变的方法能够准确检测出C-kit基因的第9号外显子的突变。

(2)C-kit基因的第11号外显子的突变热点位于C-kit基因编码的蛋白序列上的第550位和第592位。

C-kit基因的第11号外显子突变分析：将C-kit基因的第11号外显子的测序结果使用Chromas程序打开，在“Edit”菜单下点击“Reverse+Complement”，按Ctrl+F键快速查找序列GTTGTTGAG，比对C-kit基因的第11号外显子的野生型序列，观察GTTGTTGAG序列前是否发生缺失突变，同时观察测序峰图是否存在杂合突变，如图3所示，其中，C-kit基因的第11号外显子的野生型核苷酸序列为：GAA GTA CAG TGG AAG GTT GTT GAG GAG ATA AAT。通过比对分析确定病理切片组织发生了缺失突变，其中标记处“TGGAAG”缺失与C-kit基因的第9号外显子的突变热点相同，同时，该结果与传统测序法测得的结果相符，由此可见，本发明实施例提供的试剂盒和检测C-kit基因突变的方法能够准确检测出C-kit基因的第11号外显子的突变。

(3)C-kit基因的第13号外显子的突变热点类型为K642E和V654A，其中，K642E类型的突变发生可以在第642和654位密码子，且第642密码子可突变为GAA，第654密码子可突变为GCG。

C-kit基因的第13号外显子突变分析：将C-kit的第13号外显子的测序结果使用Chromas程序打开，按Ctrl+F键快速查找序列TCTGAACTC，将TCTGAACTC后面的序列与C-kit基因的第13号外显子的野生型序列比对，如图4所示，其中，C-kit基因的第13号外显子的野生型核苷酸序列为：TCT GAA CTC AAA GTC CTG AGT TAC CTT GGT AAT CAC ATG AAT ATTGTG AAT CTA CTT。通过比对分析发现病理切片组织发生了K642E类型的突变，即C-kit基因的第13号外显子在第642密码子突变为GAA，该结果与传统测序法测得的结果相符，由此可见，本发明实施例提供的试剂盒和检测C-kit基因突变的方法能够准确检测出C-kit基因的第13号外显子的突变。

(4)C-kit基因的第17号外显子的突变主要发生于821-822密码子，还可见于816、820、823密码子等，第816、820～823位密码子可分别突变为GTC、TAT、TAT、AAA和GAT。

C-kit基因的第17号外显子突变分析：将C-kit的第17号外显子的测序结果使用Chromas程序打开，按Ctrl+F键快速查找序列CTAGCCAGA，将CTAGCCAGA后面的序列与C-kit基因的野生型序列比对，如图5所示，其中，C-kit基因的第17号外显子的野生型核苷酸序列为：CTA GCC AGA GAC ATC AAG AAT GAT TCT AAT TAT GTG GTT，通过比对分析发现病理切片组织C-kit基因的第17号外显子在822位密码子处发生了突变，突变为AAA，该结果与传统测序法测得的结果相符，由此可见，本发明实施例提供的试剂盒和检测C-kit基因突变的方法能够准确检测出C-kit基因的第17号外显子的突变。

(5)PDGFRA基因的第12号外显子突变为：第561位密码子由“GTC”突变为“GAC”。

PDGFRA基因的第12号外显子突变分析：将PDGFRA基因的第12号外显子的测序结果使用Chromas程序打开，在“Edit”菜单下点击“Reverse+Complement”，按Ctrl+F键快速查找序列CGCTGG比对PDGFRA基因的第12号外显子的野生型序列，如图6所示，其中，PDGFRA基因的第12号外显子的野生型核苷酸序列为：AAA CCG AGG TAT GAA ATT CGC TGG AGG GTCATT GAA TCA ATC AGC CCA GAT GGA CAT GAA TAT ATT TAT GTG GAC CCG ATG CAG CTGCCT TAT GAC TCA AGA TGG GAG TTT CCA AGA GAT GGA CTA GTG CTT GGT。通过比对分析确定病理切片组织在第561位密码子由“GTC”突变为“GAC”，该结果与传统测序法测得的结果相符，由此可见，本发明实施例提供的试剂盒和检测PDGFRA基因突变的方法能够准确检测出PDGFRA基因的第12号外显子的突变。

(6)PDGFRA基因的第18号外显子突变为：第842位密码子由“GAC”突变为“GTC”。

PDGFRA基因的第18号外显子突变分析：将PDGFRA基因的第18号外显子的测序结果使用Chromas程序打开，在“Edit”菜单下点击“Reverse+Complement”，按Ctrl+F键快速查找序列CTGGCCAGA，比对PDGFRA基因的第18号外显子的野生型序列，如图7所示，其中，PDGFRA基因的第18号外显子的野生型核苷酸序列为：TGT GTC CAC CGT GAT CTG GCT GCT CGCAAC GTC CTC CTG GCA CAA GGA AAA ATT GTG AAG ATC TGT GAC TTT GGC CTG GCC AGAGAC ATC ATG CAT GAT TCG AAC TAT GTG TCG AAA GGC AGT。通过比对分析确定病理切片组织在第842位密码子由“GAC”突变为“GTC”，该结果与传统测序法测得的结果相符，由此可见，本发明实施例提供的试剂盒和检测PDGFRA基因突变的方法能够准确检测出PDGFRA基因的第18号外显子的突变。

实施例4、锁核酸探针效果检验

本发明针对C-kit基因的第17号外显子和PDGFRA基因的第18号外显子两种待检测序列，每种各准备两个PCR反应管，配制PCR反应体系时一管中加入相对应的锁核酸探针，一管中不加入锁核酸探针，用等量去离子水代替，参照实施例3同样的方法检测C-kit基因的第17号外显子和PDGFRA基因的第18号外显子基因突变情况，以检验锁核酸探针在胃肠道间质瘤相关基因突变检测中的作用效果。

图8显示了加入锁核酸探针和未加入锁核酸探针检测C-kit基因第17号外显子突变的测序结果，如图8所示，加入锁核酸探针检测C-kit基因第17号外显子得到的测序结果相比未加入锁核酸探针的峰高更高，且杂峰更少。图9显示了加入锁核酸探针和未加入锁核酸探针检测PDGFRA基因第18号外显子的测序结果，如图9所示，加入锁核酸探针检测PDGFRA基因第18号外显子得到的测序结果也比未加入锁核酸探针的峰高更高。由此可见，当样本中突变基因含量较低时，加入锁核酸探针在PCR过程中可对特定突变型样本进行富集，从而能显著地提高突变型的检测灵敏度。

本发明提供的技术方案带来的有益效果是：提供用于检测胃肠道间质瘤相关基因突变的试剂盒及检测方法，能够精准检测C-kit和PDGFRA基因是否发生突变。锁核酸(Locked nucleic acid,LNA)是一种人工合成的反义寡核苷酸，其结构中β-D-呋喃核糖的2’-O、4’-C位通过不同的缩水作用形成环形的氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥刚性缩合结构，环形桥锁定了呋喃糖C3’-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，因此，锁核酸对DNA和RNA均具有很好的识别能力和强大的亲和力，且不易被酶解，将锁核酸作为探针与RNA/DNA链结合的复合体具有很高的热稳定性，但又对碱基错配敏感，一个碱基的错配可使RNA/DNA的熔解温度(Tm值)较大幅度地下降，通过加入锁核酸探针，在PCR过程中对突变型样本进行富集，进一步提高突变型的检测灵敏度，采用锁核酸探针可以大大提高检测C-kit和PDGFRA基因突变的灵敏度，同时，C-kit和PDGFRA基因检测的样本多来源于胃肠道间质瘤的病变细胞组织，该组织中往往还含有很多正常细胞，影响检测，本发明实施例采用与野生型基因序列匹配的锁核酸，在进行PCR扩增时，锁核酸能够与野生型序列结合，从而阻滞PCR延伸，导致PCR扩增失败，而锁核酸不能与突变型序列结合，使得C-kit和PDGFRA基因突变型得以扩增，从而提高了C-kit和PDGFRA基因突变的检出率。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉百泰基因工程有限公司

<120> 一种用于检测胃肠道间质瘤相关基因突变的试剂盒

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

gccacatccc aagtgtttta tg 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

gagcctaaac atccccttaa attg 24

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

aggcagaagt cttgcccaca tcgttg 26

<210> 4

<211> 13

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

gttaaaatag gca 13

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 5

ccagagtgct ctaatgactg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 6

acctatcaaa aggggcgcaa 20

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 7

tacccaaaaa ggtgacatgg aaagccc 27

<210> 8

<211> 12

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 8

aaccttccac tg 12

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 9

gttgtcttcc ttcctacagg gaa 23

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 10

caagagagaa caacagtctg ggtaa 25

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 11

ccctgggtgc tggagctttc gg 22

<210> 12

<211> 13

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 12

ggactttgag ttc 13

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 13

gtgaacatca ttcaaggcgt act 23

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 14

aaaatgtgtg atatccctag acagg 25

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 15

tcctttgcag gactgtcaag cagagaatg 29

<210> 16

<211> 14

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 16

cataattaga atca 14

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 17

aagctctggt gcactgggac tt 22

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 18

attgtaaagt tgtgtgcaag gga 23

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 19

aaccgaggta tgaaattcgc tggagg 26

<210> 20

<211> 12

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 20

tcaatgaccc tc 12

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 21

atggcttgat cctgagtcat ttc 23

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 22

cactcaaacc tgggcaatct 20

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 23

tccaccgtga tctggctgct cg 22

<210> 24

<211> 13

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 24

atgatgtctc tgg 13

Claims

1.一种用于检测胃肠道间质瘤相关基因突变的引物探针组合物，其特征在于：所述胃肠道间质瘤相关基因为C-kit基因和PDGFRA基因，所述引物探针组合物包括引物1-12、荧光探针1-6和锁核酸探针1-6，所述引物1-8、荧光探针1-4和锁核酸探针1-4用于检测C-kit基因突变，所述引物9-12用于检测PDGFRA基因突变，所述引物1-12的碱基序列分别如序列表中SEQ ID NO.1、2、5、6、9、10、13、14、17、18、21、22所示，所述荧光探针1-6的碱基序列分别如序列表中SEQ ID NO.3、7、11、15、19、23所示，所述锁核酸探针1-6的碱基序列分别如序列表中SEQ ID NO.4、8、12、16、20、24所示，各锁核酸探针的3’端均连接有PO4基团。

2.一种用于检测胃肠道间质瘤相关基因突变的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物探针组合物。

3.如权利要求2所述的用于检测胃肠道间质瘤相关基因突变的试剂盒，其特征在于：应用于荧光定量PCR反应中，反应体系中所述引物探针组合物中各引物浓度为0.3μmol/L，各荧光探针浓度为0.2μmol/L。

4.如权利要求2所述的用于检测胃肠道间质瘤相关基因突变的试剂盒，其特征在于：还包括PCR反应液和测序反应液，所述PCR反应液包括含Mg²⁺的PCR扩增缓冲液、dNTPs和TaqDNA聚合酶，所述测序反应液包括2.5×BigDye和5×BigDye测序缓冲液。

5.如权利要求2所述的用于检测胃肠道间质瘤相关基因突变的试剂盒，其特征在于：还包括PCR产物纯化试剂，所述PCR产物纯化试剂包括3mol/L醋酸钠溶液、无水乙醇和甲酰胺。

6.如权利要求2所述的用于检测胃肠道间质瘤相关基因突变的试剂盒，其特征在于：还包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为含C-kit和PDGFRA野生型基因片段的重组质粒，所述阳性质控品为含C-kit和PDGFRA突变型基因片段的重组质粒。

7.一种非诊断目的检测胃肠道间质瘤相关基因突变的方法，采用权利要求2-6任一所述的试剂盒，其特征在于，包括以下步骤：

S1、提取样本基因组DNA；

S2、以所述样本基因组DNA为模板，采用所述试剂盒进行荧光定量PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；

S3、对所述PCR扩增产物进行纯化，得到纯化的PCR扩增产物；