CN113046424A - 一种用于pcr检测的核酸组合物的制备方法及其制备的核酸组合物和pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于PCR检测的核酸组合物的制备方法及其制备的核酸组合物和PCR检测方法,涉及基因检测技术领域,该制备方法包括制备引物对和发卡探针;所述引物对中上游引物的5’端具有标签序列,所述标签序列的碱基序列与所述发卡探针的碱基序列相同。按照该制备方法进行制备的核酸组合物可用于检测绝大多数SNP位点,且无需针对不同的SNP位点进行特异性探针的设计,降低了SNP检测技术开发的难度,同时也降低了SNP检测试剂研发的成本。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,具体而言,涉及一种用于PCR检测的核酸组合物的制备方法及其制备的核酸组合物和PCR检测方法。
背景技术
单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,包括碱基的转换、颠换、缺失和插入。SNP是人类可遗传变异中最常见的一种,占所有已知多态性的90%以上,据估计,人类基因组中平均每1000个核苷酸就有一个SNP,人类30亿碱基中共有300万以上的SNPs。SNP因其具有分布密度高、遗传稳定性好、与疾病和表型关联度强、易于进行高通量检测等特点,被广泛应用于人类的疾病筛查、疾病诊断、疾病易感性检测以及个体化用药指导之中。
目前,很多方法可用于人类基因组SNP检测,例如PCR-琼脂糖凝胶法、PCR-斑点杂交法、PCR-单碱基延伸法、Sanger测序法、实时荧光PCR法、基因芯片法、数字PCR法以及二代测序法等。虽然SNP检测的方法较多,但综合考虑仪器设备成本、试剂耗材成本、方法开发难易程度、操作简便性及劳动强度、检测通量等,实时荧光PCR法仍是目前临床上人类基因组SNP检测最重要的技术方法之一。
实时荧光PCR(Real-time PCR,RT-PCR)通过对PCR扩增反应中的每一个循环产物荧光信号的实时监测从而实现对起始模板的定性及定量分析。根据检测原理的不同,实时荧光PCR法可分为探针法和非探针法两种,分别利用的是与靶序列特异杂交的探针和荧光染料对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,并结合相应的软件对产物进行分析。
荧光染料法是在PCR反应体系中,加入过量荧光染料,该染料只与双链DNA小沟结合,并不与单链DNA链结合,而且在游离状态不发出荧光,只有掺入DNA双链中才可以发光,因此,在PCR体系中,随着特异性PCR产物的指数扩增,染料掺入双链DNA中,其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。最常用的荧光染料有SYBR Green I、EvaGreen等。染料法经济实惠,可以做溶解曲线,缺点是特异性差,溶解曲线分辨率相对较低,只能区分特异性的产物,很难分辨单碱基的差异。
荧光标记探针法是在PCR扩增时,加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸,两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团,Taqman探针利用PCR扩增时Taq酶的5'→3'外切酶活性将探针酶切降解释放荧光信号,分子信标探针则是利用独特设计的发卡结构(茎环结构)的“结合-伸展”的结构改变完成荧光信号的释放,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,随着扩增的进行,实现了荧光信号的累积。
探针法通过探针可以提高收集信号的特异性,只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号,探针法还适用于进行多重反应,能够预测和提前进行反应条件的优化,灵敏度高,操作简单,仪器设备易普及且适合各种通量,缺点则是合成荧光探针价格昂贵,且每个SNP位点需设计两个等位基因的特异性探针,研发阶段成本较高。因此,开发一种具有探针法高灵敏度且成本相对低廉的新的SNP检测方法有着重要的意义。
目前,基于通用探针实时荧光PCR检测基因多态性的方法都存在着一定的问题,CN104946748A提供的通用探针仅适用于禾本科植物中的SNP检测,其每反应需合成4条探针;CN108220399A提供的通用探针检测方法则需要将实验分成两个阶段,第一阶段的产物需经凝胶电泳、纯化回收后再作为模板进行第二阶段的反应;CN105861706A提供的通用探针检测方法,每反应也需合成4条探针,并且荧光探针的长度达到40bp,使得所用探针的成本增加;CN106868111A提供了几种通用Taqman探针,但由于方法学的局限性,其所提供的探针距离上游引物均相对较远,探针被Taq酶切割的效率较差,因而其探针的用量远远高于常规Taqman探针的用量,增加了检测成本;CN106591475A提供的通用探针和检测方法,其荧光曲线为倒置型曲线,与常规的荧光扩增曲线不同,不利于结果的判读及其推广利用;CN105624296A提供了一组通用荧光发卡引物,但其探针仅利用鸟嘌呤碱基“G”对荧光基团进行淬灭,其淬灭效率偏低,探针用量相对较高。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于PCR检测的核酸组合物的制备方法及其制备的核酸组合物和PCR检测方法。
本发明是这样实现的:
第一方面,本发明实施例提供了一种用于PCR检测的核酸组合物的制备方法,其包括制备引物对和发卡探针;所述引物对中上游引物的5’端具有标签序列,所述标签序列的碱基序列与所述发卡探针的碱基序列相同。
第二方面,本发明实施例提供了一种用于PCR检测的核酸组合物,其包括由如前述实施例所述的用于PCR检测的核酸组合物的制备方法合成的核酸组合物。
第三方面,本发明实施例提供了一种PCR检测方法,其包括采用如前述实施例所述的用于PCR检测的核酸组合物对待测样本进行检测。
第四方面,本发明实施例提供了一种试剂盒,其包括如前述实施例所述的用于PCR检测的核酸组合物。
本发明具有以下有益效果:
本发明实施例提供了一种用于PCR检测的核酸组合物的制备方法及其制备的核酸组合物和PCR检测方法,该制备方法包括制备引物对和发卡探针;所述引物对中上游引物的5’端具有标签序列,所述标签序列的碱基序列与所述发卡探针的碱基序列相同。按照该制备方法进行制备的核酸组合物可用于检测绝大多数SNP位点,且无需针对不同的SNP位点进行特异性探针的设计,降低了SNP检测技术开发的难度,同时也降低了SNP检测试剂研发的成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提供的发卡探针及扩增引物结构示意图;
图2为本发明提供的发卡探针荧光PCR法进行SNP检测的技术原理图;
图3为本发明实施例1中的发卡探针结构示意图;
图4为本发明实施例2中阿司匹林用药位点ASPL01(rs1695)使用通用发卡探针荧光PCR法检测的结果;
图5为本发明实施例2中阿司匹林用药位点ASPL02(rs5918)使用通用发卡探针荧光PCR法检测的结果;
图6为本发明实施例2中阿司匹林用药位点ASPL03(rs730012)使用通用发卡探针荧光PCR法检测的结果;
图7为本发明实施例2中阿司匹林用药位点ASPL04(rs12041331)使用通用发卡探针荧光PCR法检测的结果;
图8为本发明实施例2中阿司匹林用药位点ASPL05(rs10306114)使用通用发卡探针荧光PCR法检测的结果;
图9为本发明实施例2中阿司匹林用药位点ASPL06(rs6065)使用通用发卡探针荧光PCR法检测的结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
首先,本发明实施例提供了一种用于PCR检测的核酸组合物的制备方法,其包括制备引物对和发卡探针;所述引物对中上游引物的5’端具有标签序列,所述标签序列的碱基序列与所述发卡探针的碱基序列相同。
经一系列创造性劳动,发明人提供了上述核酸组合物的制备方法,其适用于荧光PCR检测,该制备方法将发卡探针以扩增引物的方式掺入到PCR产物中,使得发卡探针与PCR扩增产物的结合更加的牢固,且发卡探针的设计使得只有掺入扩增产物中时才能释放荧光,而游离状态的探针不产生荧光,检测的特异性强。
此外,发卡探针与上游引物的标签序列相同的设计规则,使得相同的探针组可检测绝大多数的SNP位点,不需针对不同的SNP位点设计特异性探针,降低了SNP检测技术开发的难度,同时也显著降低SNP检测试剂研发时测试探针的成本。
在一些实施例中,所述发卡探针序列的5’端均标记有荧光淬灭基团,靠近3’末端倒数第二位的dT碱基上均标记有荧光基团;
优选地,所述荧光淬灭基团选自:BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、Eclipse和TAMRA中的任意一种;
所述荧光基团选自:FAM、VIC、TET、HEX、JOE、Texas Red、ROX、Cy3和Cy5中的任意一种。
具体的,所述发卡探针划分为3’端区、中心区以及5’端区;所述3’端区和所述5’端区的序列互为回文结构,以使所述发卡探针在游离状态下能形成发卡结构。
本文中的“发卡探针”可参照图1,通用发卡探针5’端和3’端均为回文结构,具有6个碱基的互补序列,发卡探针在游离状态下形成发卡结构(Hairpin structure),荧光基团与淬灭基团接近,此时探针不发射荧光信号;当含有特定标签序列的特异引物和模板匹配时,模板得以扩增。同时在产物中引入了标签序列及其互补序列,发卡探针则以标签互补序列为结合位置,在DNA聚合酶的作用下对模板进一步的扩增,从而通用发卡探针掺入到PCR产物中并形成DNA双链结构,发卡结构得以完全伸展,荧光基团与淬灭基团远离,荧光信号释放,随着热循环的不断进行,荧光信号逐渐积累并可被荧光检测仪器识别和记录;根据不同荧光通道信号值的改变,进而对受检样本的基因型进行判读(图2)。
优选地,所述发卡探针的个数与所述引物对中上游引物的个数一一对应。比如,当引物对中包括1个以上的上游引物时,发卡探针的个数与之相互对应,使得每条上游引物序列5’端的标签序列能够有发卡探针中其中一条相同。
优选地,所述引物对为用于检测SNP位点的AMRS引物对,所述AMRS引物对包括上游引物1、上游引物2和下游引物,所述上游引物1的5’端具有标签序列1,所述上游引物2的5’端具有所述标签序列2,且所述标签序列1与所述标签序列2选自不同碱基序列的发卡探针。
本文中的“ARMS”是指突变扩增阻滞系统(amplification refractory mutationsystem)又称等位基因特异性扩增法(allele specific amplification,ASA)。ARMS引物对具有2条上游引物和1条通用的下游引物,2条上游引物为等位基因特异的分型引物,分型引物3’端最后一个核苷酸位点为待检测的SNP位点。
检测每个SNP位点均需要2条上游引物和1条通用下游引物。本发明提供的引物对中的上游引物在结构上均可分为两个部分,靠近5’端的部分为通用标签序列(Tag),标签序列与对应的通用探针序列完全一致;靠近3’端的部分为等位基因特异性引物,可与靶区特异性结合。等位基因特异性引物的设计与一般ARMS引物设计方式一致,长度约18~30bp,Tm值约在55~63℃之间,2条分型引物的3’最末端一个碱基分别为所检测的SNP位点两种碱基类型。
具体地,所述等位基因特异性引物和所述下游引物的长度均为18~36bp,Tm值均为58~65℃。在一些实施例中,引物的该长度可选自18bp、20bp、22bp、24bp、26bp、28bp、30bp、32bp、34bp和36bp中的任意长度;Tm值可选自58℃、60℃、62℃、64℃和65℃中的任意数值。
采用本申请的核酸组合物用于SNP位点检测时,每组探针通常包括2条通用的发卡探针,2条探针对应双等位SNP的不同基因型。
在一些实施例中,本发明不对发卡探针的序列进行限定。优选地,所述发卡探针的序列选自如SEQ ID No.1~4所示序列中的任意一种。SEQ ID No.1~4所示序列的发卡探针的序列与人类基因组上的序列不同源或不完全同源,且探针序列内部除末端发卡结构外也无其他二级结构;通用发卡探针的熔解温度为60~68℃之间,探针发卡结构ΔG的范围为-1.6~-5.8Kcal/mol。相对于其他发卡探针而言,本发明实施例提供的发卡探针在游离状态时为非常稳定的发卡结构,而当模板存在时,发卡结构易于打开并与模板结合。
优选地,所述标签序列1~2的序列依次如SEQ ID No1~2所示,或如SEQ ID No.3~4所示。
需要说明的是,本发明实施例对引物和探针的合成方法不作任何限制,在知晓引物和探针的核酸序列的情况下,可通过常规的引物和探针的合成方法进行,在此不再赘述。
优选地,将所述上游引物1序列的3’末端碱基为与所述上游引物2的模板链上待测位点的碱基错配的错配碱基,将所述上游引物2序列的3’末端碱基为与所述上游引物1的模板链上待测位点的碱基错配的错配碱基;
将所述上游引物1和所述上游引物2序列3’端第2位或第3位的碱基替换为上游错配碱基,以使所述上游错配碱基与待替换的原始位置互补链的碱基形成错配。在等位基因特异性引物3’末端倒数第2位或第2位上引入错配碱基,能进一步提高反应的特异性。
DNA双螺旋中碱基之间的互补配对并非是随意的,其遵循腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)配对,鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对的原则,本文中的“错配”是指A与C或G配对的情况,或T与G或C配对的情况。
本文中的“将所述上游引物1和所述上游引物2序列3’端第2位或第3位的碱基替换为上游错配碱基,以使所述上游错配碱基与待替换的原始位置互补链的碱基形成错配”中“待替换的原始位置”是指“引物序列3’端第2位或第3位”。
优选地,参照表1,所述上游错配碱基的替换规则如下:
当上游引物序列3’末端碱基的错配为强错配效应组合时,则将需引入上游错配碱基的原始位置的碱基进行替换,使该上游错配碱基与该原始位置对应的互补链的碱基形成弱错配效应组合;
当上游引物序列3’末端碱基的错配为中度错配效应组合时,则将需引入上游错配碱基的原始位置的碱基进行替换,使该上游错配碱基与该原始位置对应的互补链碱基形成中度错配效应组合;
当上游引物序列3’末端碱基的错配为弱错配效应组合时,则将需引入上游错配碱基的原始位置的碱基进行替换,使该上游错配碱基与该原始位置对应的互补链碱基形成强错配效应组合;
其中,所述强错配效应组合包括A/G、C/T、C/C和T/T,所述中度错配效应组合包括A/A和G/G,所述弱错配效应组合包括A/C和G/T。
表1 ARMS引物设计错配碱基快速选择表
例如,当要检测的SNP位点碱基组合为A/G时,对于3’末端碱基为A碱基的ARMS上游引物,其3’末端碱基的错配为弱错配效应组合A/C(C为G碱基的互补链碱基),则其上游错配碱基应引入强错配相应组合,若需引入错配碱基位置的原始碱基为T(互补链碱基为A),则强错配效应组合为A/G,即可用G碱基替换T碱基以引入上游错配碱基。
再例如,对于3’末端碱基为G碱基的ARMS引物,其3’端末端碱基的错配为弱错配效应组合G/T(T为A碱基的互补链碱基),则其上游错配碱基应引入强错配相应组合,若需引入错配碱基位置的原始碱基为T(互补链碱基为A),则强错配效应组合为A/G,即可用G碱基替换T碱基以引入上游错配碱基。
例如,当要检测的SNP位点碱基组合为C/T时,需要引入错配碱基的位置原始碱基为G,查询“ARMS引物设计错配碱基快速选择表”表可知,对于3’末端为T碱基的ARMS引物,应用T碱基替换G碱基以引入错配碱基,而对于3’末端为C碱基的ARMS引物,应用C碱基替换G碱基以引入错配碱基。
碱基序列通常是从5’端到3’端进行读取,本文中的“3’末端碱基”是指序列从5’-3’端开始读取的最后一个碱基;同理,本文中“引物序列3’端第2位或第3位”同“3’端倒数第2位或第3位”,是指序列从5’-3’端开始读,倒数的第2位或第3位,或者从3’-5’开始读的第2位或第3位。
ARMS引物错配碱基的选择,主要基于碱基间的错配效应强度确定,基于上述错配碱基的替换原则设计获得的ARMS引物相对于其他引物而言具有更好的检测特异性。
其次,本发明实施例还提供了一种用于PCR检测的核酸组合物,其包括由前述任一实施方式所述的制备方法用于PCR检测的核酸组合物的制备方法制备的核酸组合物。
优选地,所述核酸组合物用于检测SNP位点。当待检测的SNP位点为rs1695时,ARMS的上游引物1和上游引物2的序列依次如SEQ ID No.5~6所示,下游引物如SEQ ID No.7所示;
当待检测的SNP位点为rs5918时,ARMS的上游引物1和上游引物2的碱基序列依次如SEQ ID No.8~9所示,下游引物的碱基序列如SEQ ID No.10所示;
当待检测的SNP位点为rs730012时,ARMS的上游引物1和上游引物2的碱基序列依次如SEQ ID No.11~12所示,下游引物的碱基序列如SEQ ID No.13所示;
当待检测的SNP位点为rs12041331时,ARMS的上游引物1和上游引物2的碱基序列依次如SEQ ID No.14~15所示,下游引物的碱基序列如SEQ ID No.16所示;
当待检测的SNP位点为rs10306114时,ARMS的上游引物1和上游引物2的碱基序列依次如SEQ ID No.17~18所示,下游引物的碱基序列如SEQ ID No.19所示;
当待检测的SNP位点为rs6065时,ARMS的上游引物1和上游引物2的碱基序列依次如SEQ ID No.20~21所示,下游引物的碱基序列如SEQ ID No.22所示。
本发明实施例还提供了一种PCR检测方法,其包括采用如前述任一实施例所述的用于PCR检测的核酸组合物对待测样本进行检测。
在一些实施例中,待测样本可选自包括有核酸的所有类型的样本,如全血样本、生物组织样本和非生物组织样本等。
优选地,当所述待测样本为全血样本时,在对全血样本进行检测前,所述检测方法还包括:
将待测的全血样本与试剂A的混合溶液进行离心,对离心后的沉淀物与试剂B混合;
将沉淀物与试剂B的混合溶液进行离心,将离心后的沉淀物与试剂C混合;
其中,在所述全血样本与所述试剂A的混合溶液中,所述试剂A中各组分及组分的终浓度为:220~420mM蔗糖,1~20mM Tris-HCl,1~10mM MgCl2,0.1v%~4v%Triton-X-100;在一些实施例中,蔗糖的终浓度可为220mM、240mM、260mM、280mM、300mM、320mM、340mM、360mM、380mM、400mM、420mM中的任意浓度,Tris-HCl的终浓度可为1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、12mM、14mM、16mM、18mM和20mM中的任意浓度;MgCl2的终浓度可为1mM、2mM、4mM、6mM、8mM和10mM中的任意浓度;Triton-X-100的终浓度可以为0.1%、0.5%、1%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%中的任意浓度。需要说明的是,“v%”是指体积浓度,或体积百分数。
在沉淀物与试剂B的混合溶液中,所述试剂B中各组分及组分的终浓度为:124~174mM NH4Cl,1~19mM KHCO3,0.01~0.10mM EDTA;在一些实施例中,NH4Cl的终浓度可以为124mM、130mM、135mM、140mM、145mM、150mM、155mM、160mM、165mM、170mM和174mM中的任意浓度;KHCO3的终浓度可以为1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、19mM中的任意浓度;EDTA的终浓度可以为0.01mM、0.02mM、0.04mM、0.06mM、0.08mM和0.10mM中的任意浓度。
在沉淀物与试剂C的混合溶液中,所述试剂C中各组分及组分的终浓度为:50~150mM NaCl,20~70mM Tris-HCl,20~70mM NaOH,0.1~10mM EDTA,0.001wt%~0.1wt%SDS。在一些实施例中,NaCl的终浓度可以为50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM和150mM中的任意浓度;Tris-HCl的终浓度可以为20mM、30mM、40mM、50mM、60mM和70mM中的任意浓度;NaOH的终浓度可以为20mM、30mM、40mM、50mM、60mM和70mM中的任意浓度;EDTA的终浓度可以为0.01mM、0.02mM、0.04mM、0.06mM、0.08mM和0.10mM中的任意浓度;SDS的终浓度可以为0.001%、0.01%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%中的任意浓度。需要说明的是,“wt%”是指质量浓度或质量分数。
常规核酸提取流程需耗时60~90min,而使用本发明实施例提供的PCR检测方法,全血样本仅需简单三步处理即可作为后续荧光定量PCR检测的模板使用,样本处理过程简便、快速,可在10min内完成模板的制备;全血样本快速处理方案样本需求量少,仅为常规核酸提取纯化用量的一半以下;且全血样本快速处理方案试剂成本较低。
优选地,所述全血样本与所述试剂A的混合溶液的离心条件为:2500~4500rpm,1~10min;在一些实施例中,离心的具体转速可以为2500rpm、2600rpm、2800rpm、3000rpm、3200rpm、3400rpm、3600rpm、3800rpm、4000rpm、4200rpm、4400rpm和4500rpm中的任意转速;离心时间可以为1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min和10min中的任意时间。
沉淀物与试剂B的混合溶液的离心条件为:4000~6000rpm,0.1~3min。在一些实施例中,该离心的转速可以为4000rpm、4200rpm、4400rpm、4600rpm、4800rpm、5000rpm、5200rpm、5400rpm、5600rpm、5800rpm和6000rpm中的任意转速;离心时间可以为0.1min、0.5min、1.0min、1.5min、2.0min、2.5min和3.0min中的任意时间。
此外,本发明实施例还提供了一种试剂盒,其包括如前述任一实施例所述的用于荧光定量PCR检测的核酸组合物。
优选地,所述试剂盒还包括试剂A、试剂B和试剂C;
所述试剂A包括以下组分:220~420mM蔗糖,1~20mM Tris-HCl,1~10mM MgCl2,0.1v%~4v%Triton-X-100,以及水;
所述试剂B包括以下组分:124~174mM NH4Cl,1~19mM KHCO3,0.01~0.10mMEDTA,以及水;
所述试剂C包括以下组分:50~150mM NaCl,20~70mM Tris-HCl,20~70mM NaOH,0.1~10mM EDTA,0.001wt%~0.1wt%SDS,以及水。
在一些实施例中,所述试剂盒还可以包括用于PCR检测的检测试剂,包括但不限于PCR反应液、海藻糖、DMSO、BSA、dNTP、ROX、MgCl2、热启动Taq DNA聚合酶(HotStart Taq)。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
1、发卡探针的设计。
本实施例提供的发卡探针为通用发卡探针,长度为25或26bp,且序列与人类基因组上的序列不完全同源。探针的5’端标记有荧光淬灭基团,靠近3’末端dT碱基上标记有荧光基团,发卡探针具有游离的3’-OH末端,可作为引物参与模板的扩增。本实施例提供4条通用发卡探针,见表2。
表2通用发卡探针
备注:划线部分为回文序列。
发卡探针的5’端均标记有BHQ1荧光淬灭基团,K11B和K15B靠近3’末端倒数第二位的dT碱基上标记有FAM荧光基团,K12B和K16B靠近3’末端倒数第二位的dT碱基上标记有HEX荧光基团,当进行SNP检测时,K11B、K12B常作为一组通用发卡探针使用,而K15B、K16B常作为另一组通用探针使用。
探针的发卡结构示意图见图3。探针设计完成后交由上海生工合成,纯化方式为高效液相色谱法(HPLC)。
2、引物对的设计。
本发明实施例每个反应体系中均包括3条引物,1条下游引物为普通引物,2条上游引物为等位基因特异的分型引物。分型引物的3’末端碱基为待检测的SNP位点,而且在其两条分型引物的5’端各连接有一段标签(Tag)序列,而通用发卡探针序列和分型引物的标签序列相同。
分型引物在结构上可分为两个部分,靠近5’端的为通用序列标签(Tag),通用标签序列与对应的通用探针序列完全或部分一致;靠近3’端的为等位基因特异性引物,可与靶区特异性结合;等位基因特异性引物的设计与一般ARMS引物设计方式一致,长度约18~30bp,Tm值约在55~63℃之间,2条分型引物的3’最末端碱基分别为所检测的SNP位点两种碱基类型;同时在等位基因特异性引物3’末端倒数第2位或第3位上引入上游错配碱基。
上游错配引物错配碱基的选择,主要基于碱基间的错配效应强度确定,当3’末端碱基的错配为强错配效应组合(A/G、C/T、C/C、T/T)时,则上游错配碱基应引入弱错配效应组合(A/C、G/T);当3’末端碱基的错配为中度错配效应组合(A/A、G/G)时,则上游错配碱基应引入中度错配效应组合(A/A、G/G)或弱错配效应组合(A/C、G/T);当3’末端碱基的错配为弱错配效应组合(A/C、G/T)时,则上游错配碱基应引入强错配效应组合(A/G、C/T、C/C、T/T)。
3、快速处理试剂。
快速处理试剂包括试剂A、试剂B和试剂C三个组分。试剂A按照表3配方进行配制,以配制500mL全血样本快速处理试剂-组分A为例:在1个1000mL的灭菌试剂瓶中依次加入蔗糖54.786g、1M Tris-HCl(pH8.0)溶液5mL、1M MgCl2溶液2.5mL、Triton-X-100 5mL,加入400mL灭菌超纯水溶解试剂,然后使用灭菌超纯水定容至500mL,轻轻颠倒混匀后室温保存备用。
表3试剂A
组分 | 终浓度 | 用量/500mL |
蔗糖 | 320mM | 54.786g |
Tris-HCl(1M,PH8.0) | 10mM | 5mL |
MgCl<sub>2</sub>(1M) | 5mM | 2.5mL |
Triton-X-100 | 1% | 5mL |
灭菌超纯水 | / | 400mL |
定容至 | 500mL |
试剂B按照表4配方进行配制,以配制500mL全血样本快速处理试剂-组分B为例:在1个1000mL的灭菌试剂瓶中依次加入NH4Cl 4.145g、KHCO3 0.500g、EDTA(0.5M)溶液100μL,加入400mL灭菌超纯水溶解试剂,然后使用灭菌超纯水定容至500mL,轻轻颠倒混匀后室温保存备用。
表4试剂B
组分 | 终浓度 | 500mL配制 |
NH<sub>4</sub>Cl | 155mM | 4.145g |
KHCO<sub>3</sub> | 10mM | 0.500g |
EDTA(0.5M) | 0.1mM | 100uL |
灭菌超纯水 | 400mL | |
定容至 | 500ML |
试剂C按照表5配方进行配制,以配制10mL全血样本快速处理试剂-组分C为例:在1个15mL的无菌离心管中依次加入1M NaCl溶液1000μL、1M Tris-HCl(pH8.0)溶液500μL、1MNaOH溶液500μL、0.5M EDTA(pH8.0)溶液20μL、10%SDS溶液10μL,然后加入7970μL灭菌超纯水,轻轻颠倒混匀后室温保存备用。
表5试剂C
组分 | 终浓度 | 体积/10mL |
NaCl(1M) | 100mM | 1000μL |
Tris-HCl(PH8.0,1M) | 50mM | 500μL |
NaOH(1M) | 50mM | 500μL |
EDTA(pH8.0,0.5M) | 1mM | 20μL |
10%SDS | 0.01% | 10μL |
灭菌超纯水 | / | 7970μL |
实施例2
基于实施例1提供的通用发卡探针,进行荧光定量PCR法的阿司匹林用药指导多态性位点检测。
阿司匹林是一种水杨酸衍生物,主要通过抑制环氧合酶阻碍前列腺素的合成,从而影响血栓素发挥抗血小板聚集作用。在目前的研究中,阿司匹林抵抗率、半抵抗率和敏感率分别为20.4%,4.4%和75.2%。阿司匹林主要不良反应是消化系统损害、血液系统损害、泌尿系统损害和皮肤损害等。目前与阿司匹林药效或不良反应的相关基因有PTGS1、GP1BA、LTC4S、GSTP1、ITGB3和PEAR1等(表6)。
表6阿司匹林用药指导基因位点
1、引物的设计。
本实施例选取与阿司匹林用药指导相关的6个位点进行SNP检测,这6个位点RS号分别为:rs1695、rs5918、rs730012、rs12041331、rs10306114、rs6065,分别命名为ASPL01~ASPL06,序列信息来源于Ensembl基因组数据库,并截取SNP位点上下游各200bp序列作为模板进行引物设计。普通引物设计后使用在线软件进行评估,并依据本发明设计的表1“ARMS引物设计错配碱基快速选择表”进行错配碱基的设置。
其中,ASPL04反应的等位基因特异引物在按照表1引入错配碱基时,其3’末端会出现发卡结构,因此,本实施例使用了其他碱基替换了表1中的推荐碱基。等位基因特异性引物设计完成后,在等位基因特异性引物序列的5’端分别添加了相应的标签序列(Tag),最终6个位点引物设计如表7。引物设计完成后上海生工进行人工合成,纯化方式选择HAP法。
表7阿司匹林用药指导相关SNP位点检测引物
注:引物中下划线部分为标签(Tag)序列。
2、引物混合液的配制。
将合成好的引物干粉经离心、溶解、定量、标准化至100μM后,按照表8中的体积要求分别配制6个反应的引物混合液Primer Mix,配制完成后于-20℃保存备用。
表8引物混合液配制
3、2×qPCR Mix混合液配制
2×qPCR Mix混合液按照表9配方进行配制,以配制1mL 2×qPCR Mix混合液为例:在1个1.5mL的无菌离心管中依次加入10×PCR Buffer溶液200μL、1M海藻糖溶液400μL、DMSO溶液60μL、10mg/mL BSA溶液20μL、25mM dNTP溶液16μL、5μM ROX溶液16μL、100mMMgCl2溶液34μL、5U/μL HotStart Taq酶40μL,然后加入214μL灭菌超纯水,轻轻颠倒混匀,长期储存于-20℃,短期保存可置于4℃。
表9 2×qPCR Mix混合液
组分 | 终浓度 | 体积/1mL |
10×PCR Buffer(Mg<sup>2+</sup>free) | 2× | 200μL |
海藻糖(1M) | 400mM | 400μL |
DMSO | 6% | 60μL |
BSA(10mg/mL) | 0.2μg/μL | 20μL |
dNTP(25mM) | 400μM | 16μL |
ROX(5μM) | 80nM | 16μL |
MgCl<sub>2</sub>(100mM) | 3.4mM | 34μL |
HotStart Taq(5U/μL) | 200U/mL | 40μL |
灭菌超纯水 | / | 214μL |
4、样本处理。
血液样本按以下步骤进行快速处理:
4.1、吸取100μL新鲜静脉血,转入1.5mL离心管中,加入1.0mL的试剂A,上下颠倒混匀10~15次,裂解红细胞,3500rpm离心5min。
4.2、弃去上清液,加入1.0mL试剂B,涡旋震荡10sec,重悬细胞沉淀(如果还有细胞沉淀,继续涡旋10sec,直至形成细胞悬浊液),5000rpm离心1min。
4.3、倒掉上清液,瞬时离心,使用移液器尽可能多的吸走上清液,加入100μL的试剂C,涡旋震荡30sec,溶解沉淀细胞,瞬时离心后备用(样本短期保存可置于2~8℃冰箱,长期保存请置于-20℃或-80℃冰箱)。
5、PCR反应体系配制。
ASPL01反应体系使用的通用发卡探针为K11B、K12B,其反应体系配制按照表10中反应体系1的要求进行配制,在200μL PCR管中依次加入2×qPCR Mix 10μL、Primer Mix0.20μL、K11B-FAM(10μM)0.30μL、K12B-HEX(10μM)0.24μL、Template 2μL,然后加入灭菌ddH2O 7.26μL,总反应体积为20μL;
ASPL02~ASPL06反应体系使用的通用发卡探针为K15B、K16B,其反应体系配制均按照表10中反应体系2的要求进行配制,在200μL PCR管中依次加入2×qPCR Mix 10μL、Primer Mix 0.20μL、K11B-FAM(10μM)、0.30μL、K12B-HEX(10μM)、0.24μL、Template 2μL,然后加入灭菌ddH2O 7.26μL,总反应体积为20μL。配置好的体系震荡混匀,瞬时离心后置于冰上备用。
表10 PCR反应体系配制
6、上机检测。
取出装有ASPL01~ASPL06 PCR反应体系的PCR管,放置在仪器样品槽相应位置,并记录放置顺序。按照表11设置仪器扩增相关参数,并开始进行PCR扩增程序。对ABI7500及ABI ViiA7,荧光通道选择FAM和VIC,天隆Gentier 48E机型荧光通道选择FAM和HEX。反应结束后,根据扩增曲线划定合适基线和荧光阈值,参考荧光定量PCR仪相应机型的用户指南,读取Ct(FAM)及Ct(HEX/VIC),进行基因型判读。
表11仪器核酸扩增参数
7、结果分析
阿司匹林用药位点ASPL01~ASPL06使用通用发卡探针荧光PCR检测方法的检测结果如下。
当无模板对照(NTC)无扩增信号,质控合格时,按照表12的标准对6个位点的结果进行判读。
表12阿司匹林用药位点ASPL01~ASPL06通用发卡探针荧光PCR法检测结果判读标准
ASPL01(rs1695,GSTP1:c.313A>G)检测到了AA、AG和GG全部三种基因型(图4);ASPL02(rs5918,ITGB3:c.176T>C)检测到TT、TC两种基因型(图5),ASPL03(rs730012,LTC4S:c.-444A>C)检测到AA、AC和CC全部三种基因型(图6);ASPL04(rs12041331,PEAR1:c.-9-3996G>A)检测到GG、GA和AA全部三种基因型(图7);ASPL05(rs10306114,PTGS1:c.-842A>G)检测到AA基因型(图8);ASPL06(rs6065,GP1BA:c.482C>T)检测到CC、CT和TT全部三种基因型(图9),其中ASPL02未检测到的CC基因型及ASPL05未检测到的AG、GG基因型,均为中国人群罕见或没有的基因型。
8、验证试验。
使用购买自Coriell Institute的24例千人基因组标准品验证基于通用发卡探针荧光PCR法的阿司匹林用药位点ASPL01~ASPL06检测结果的准确性。24例标准品经定量后稀释至15ng/μL作为阿司匹林用药位点ASPL01~ASPL06检测的模板,实验流程同本实施例中的步骤5~7,ASPL01~ASPL06位点的检测结果均与预期结果完全一致(表13)。
表13 24例Coriell标准品的阿司匹林用药位点ASPL01~ASPL06检测结果
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 为朔医学数据科技(北京)有限公司
<120> 一种用于PCR检测的核酸组合物的制备方法及其制备的核酸组合物和PCR检测方法
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gacgctgacc aagttcatgt agcgtc 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gagcctcgag tcaacggatt aggctc 26
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gagcgatctg tccatgtact cgctc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gaccgtgtag ctgtagatga cggtc 25
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gacgctgacc aagttcatgt agcgtcggac ctccgctgca aatccg 46
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
gagcctcgag tcaacggatt aggctcggac ctccgctgca aattca 46
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
ccctttcttt gttcagcccc c 21
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
gagcgatctg tccatgtact cgctcggtca gagcgaggtg agcacg 46
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
gaccgtgtag ctgtagatga cggtcggtca gagcgaggtg agccaa 46
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
ggcctgcagg aggtagagag tc 22
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
gagcgatctg tccatgtact cgctcccacc caccttatct gttctcg 47
<210> 12
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
gaccgtgtag ctgtagatga cggtcccacc caccttatct gttctct 47
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
gactccattc tgaagccaaa ggca 24
<210> 14
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
gagcgatctg tccatgtact cgctcccttc tgctgtctca cttgca 46
<210> 15
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
gaccgtgtag ctgtagatga cggtcccttc tgctgtctca cttcgg 46
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
gtggacaaga ggatccattt ctataga 27
<210> 17
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
gagcgatctg tccatgtact cgctcacaca aatctcctgg tgcagggc 48
<210> 18
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
gaccgtgtag ctgtagatga cggtcacaca aatctcctgg tgcagttt 48
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 19
cggcggtgga tgtgagtcta 20
<210> 20
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 20
gagcgatctg tccatgtact cgctccctgc acccagggct ccttat 46
<210> 21
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 21
gaccgtgtag ctgtagatga cggtccctgc acccagggct cctcac 46
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 22
gttagccaga ctgagcttct cca 23
Claims (10)
1.一种用于PCR检测的核酸组合物的制备方法,其特征在于,其包括制备引物对和发卡探针;所述引物对中上游引物的5’端具有标签序列,所述标签序列的碱基序列与所述发卡探针的碱基序列相同。
2.根据权利要求1所述的用于PCR检测的核酸组合物的制备方法,其特征在于,所述发卡探针的个数与所述引物对中上游引物的个数一一对应;
优选地,所述引物对为用于检测SNP位点的AMRS引物对,所述AMRS引物对包括上游引物1、上游引物2和下游引物,所述上游引物1的5’端具有标签序列1,所述上游引物2的5’端具有所述标签序列2,且所述标签序列1与所述标签序列2选自不同碱基序列的发卡探针。
3.根据权利要求2所述的用于PCR检测的核酸组合物的制备方法,其特征在于,所述发卡探针的序列选自如SEQ ID No.1~4所示序列中的任意一种;
优选地,所述标签序列1~2的序列依次如SEQ ID No1~2所示,或如SEQ ID No.3~4所示。
4.根据权利要求2所述的用于PCR检测的核酸组合物的制备方法,其特征在于,将所述上游引物1序列的3’末端碱基为与所述上游引物2的模板链上待测位点的碱基错配的错配碱基,将所述上游引物2序列的3’末端碱基为与所述上游引物1的模板链上待测位点的碱基错配的错配碱基;
将所述上游引物1和所述上游引物2序列3’端第2位或第3位的碱基替换为上游错配碱基,以使所述上游错配碱基与待替换的原始位置互补链的碱基形成错配。
5.根据权利要求4所述的制备方法用于PCR检测的核酸组合物的制备方法,其特征在于,所述上游错配碱基的替换规则如下:
当上游引物序列3’末端碱基的错配为强错配效应组合时,则将需引入上游错配碱基的原始位置的碱基进行替换,使该上游错配碱基与该原始位置对应的互补链的碱基形成弱错配效应组合;
当上游引物序列3’末端碱基的错配为中度错配效应组合时,则将需引入上游错配碱基的原始位置的碱基进行替换,使该上游错配碱基与该原始位置对应的互补链碱基形成中度错配效应组合;
当上游引物序列3’末端碱基的错配为弱错配效应组合时,则将需引入上游错配碱基的原始位置的碱基进行替换,使该上游错配碱基与该原始位置对应的互补链碱基形成强错配效应组合;
其中,所述强错配效应组合包括A/G、C/T、C/C和T/T,所述中度错配效应组合包括A/A和G/G,所述弱错配效应组合包括A/C和G/T。
6.根据权利要求1~5任一项所述的制备方法用于PCR检测的核酸组合物的制备方法,其特征在于,在所述发卡探针序列的5’端标记荧光淬灭基团,靠近3’末端倒数第二位的dT碱基上标记荧光基团;
优选地,所述荧光淬灭基团选自:BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、Eclipse和TAMRA中的任意一种;
所述荧光基团选自:FAM、VIC、TET、HEX、JOE、Texas Red、ROX、Cy3和Cy5中的任意一种。
7.一种用于PCR检测的核酸组合物,其特征在于,其包括由如权利要求1~6任一项所述的用于PCR检测的核酸组合物的制备方法合成的核酸组合物;
优选地,所述核酸组合物用于检测SNP位点,当待检测的SNP位点为rs1695时,ARMS的上游引物1和上游引物2的序列依次如SEQ ID No.5~6所示,下游引物的序列如SEQ ID No.7所示;
当待检测的SNP位点为rs5918时,ARMS的上游引物1和上游引物2的序列依次如SEQ IDNo.8~9所示,下游引物的序列如SEQ ID No.10所示;
当待检测的SNP位点为rs730012时,ARMS的上游引物1和上游引物2的序列依次如SEQID No.11~12所示,下游引物的序列如SEQ ID No.13所示;
当待检测的SNP位点为rs12041331时,ARMS的上游引物1和上游引物2的序列依次如SEQID No.14~15所示,下游引物的序列如SEQ ID No.16所示;
当待检测的SNP位点为rs10306114时,ARMS的上游引物1和上游引物2的序列依次如SEQID No.17~18所示,下游引物的序列如SEQ ID No.19所示;
当待检测的SNP位点为rs6065时,ARMS的上游引物1和上游引物2的序列依次如SEQ IDNo.20~21所示,下游引物的序列如SEQ ID No.22所示。
8.一种PCR检测方法,其特征在于,其包括采用如权利要求7所述的用于PCR检测的核酸组合物对待测样本进行检测。
9.根据权利要求8所述的PCR检测方法,其特征在于,当所述待测样本为全血样本时,在对全血样本进行检测前,所述检测方法还包括:
将待测的全血样本与试剂A的混合溶液进行离心,对离心后的沉淀物与试剂B混合;
将沉淀物与试剂B的混合溶液进行离心,将离心后的沉淀物与试剂C混合;
其中,在所述全血样本与所述试剂A的混合溶液中,所述试剂A中各组分及组分的终浓度为:220~420mM蔗糖,1~20mM Tris-HCl,1~10mM MgCl2,0.1v%~4v%Triton-X-100;
在沉淀物与所述试剂B的混合溶液中,所述试剂B中各组分及组分的终浓度为:124~174mM NH4Cl,1~19mM KHCO3,0.01~0.10mM EDTA;
在沉淀物与所述试剂C的混合溶液中,所述试剂C中各组分及组分的终浓度为:50~150mM NaCl,20~70mM Tris-HCl,20~70mM NaOH,0.1~10mM EDTA,0.001wt%~0.1wt%SDS;
优选地,所述全血样本与所述试剂A的混合溶液的离心条件为:2500~4500rpm,1~10min;
沉淀物与所述试剂B的混合溶液的离心条件为:4000~6000rpm,0.1~3min。
10.一种试剂盒,其特征在于,其包括如权利要求7所述的用于PCR检测的核酸组合物;
优选地,所述试剂盒还包括试剂A、试剂B和试剂C;
在所述试剂A中,试剂A的各组分及其终浓度如下:220~420mM蔗糖,1~20mM Tris-HCl,1~10mM MgCl2,0.1v%~4v%Triton-X-100,以及水;
在所述试剂B中,所述试剂B的各组分及其终浓度如下:124~174mM NH4Cl,1~19mMKHCO3,0.01~0.10mM EDTA,以及水;
在所述试剂C中,所述试剂C的各组分及其终浓度如下:50~150mM NaCl,20~70mMTris-HCl,20~70mM NaOH,0.1~10mM EDTA,0.001wt%~0.1wt%SDS,以及水。
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