ES2610616T3 - Cebador con conformación de bucle empleado en la amplificación de ácidos nucleicos y el uso del mismo - Google Patents

Cebador con conformación de bucle empleado en la amplificación de ácidos nucleicos y el uso del mismo Download PDF

Info

Publication number
ES2610616T3
ES2610616T3 ES09842062.3T ES09842062T ES2610616T3 ES 2610616 T3 ES2610616 T3 ES 2610616T3 ES 09842062 T ES09842062 T ES 09842062T ES 2610616 T3 ES2610616 T3 ES 2610616T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
primer
loop
sequence
mutation
amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES09842062.3T
Other languages
English (en)
Inventor
Li RUAN
Donghua He
Limou Zheng
Yan Chen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
XIAMEN AMOY DIAGNOSTICS CO Ltd
Original Assignee
XIAMEN AMOY DIAGNOSTICS CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by XIAMEN AMOY DIAGNOSTICS CO Ltd filed Critical XIAMEN AMOY DIAGNOSTICS CO Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2610616T3 publication Critical patent/ES2610616T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Un método para la amplificación de un ácido nucleico que comprende un sistema de tres cebadores, en el que dichos cebadores son el cebador directo F, el cebador inverso R y el cebador universal T, en donde al menos un cebador es un cebador con conformación de bucle en el cebador directo F y el cebador inverso R, el extremo 3' del cebador con conformación de bucle es la región de reconocimiento de la diana, y el extremo 5' tiene 3-20 bases complementarias con el extremo 3', en ciertas condiciones el extremo 3' y el extremo 5' del cebador directo F y/o el cebador inverso R pueden formar una doble hebra para dotar al cebador de una estructura con conformación de bucle, el interior del cebador directo F y el cebador inverso R tiene una misma secuencia de etiquetaje universal, respectivamente; en ciertas condiciones, el extremo 3' y el extremo 5' del cebador directo F y/o el cebador inverso R pueden formar una doble hebra para dotar al cebador de una estructura con conformación de bucle, cuando el cebador se reconoce y se hibrida a la secuencia diana, la estructura de doble hebra se abre y la estructura con conformación de bucle se pierde, y la doble hebra del cebador se transforma para ser la doble hebra combinada con la secuencia diana, así adquieren capacidad de extensión de ADN; el cebador universal T tiene la misma secuencia que la secuencia de etiquetaje universal en el cebador directo F y el cebador inverso R, en donde dicho cebador con conformación de bucle comprende además una región de reconocimiento de mutación.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
DESCRIPCION
Cebador con conformacion de bucle empleado en la amplificacion de acidos nucleicos y el uso del mismo Campo de la invencion
La invencion se refiere al diseno y la aplicacion de la amplificacion de un acido nucleico de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), mas particularmente, a la aplicacion para PCR en tiempo real, especialmente a la aplicacion para la deteccion de mutaciones y mutaciones raras.
Antecedentes de la invencion
La reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) es un metodo de amplificacion genica con un procedimiento simple, gran sensibilidad y excelente especificidad. Generalmente, el procedimiento esta comprendido por 20-50 ciclos que tienen cada uno tres etapas: desnaturalizacion, renaturalizacion y extension. El acido nucleico buscado se puede amplificar hasta millones de veces de su concentracion original en 1,5-3 h. En los ultimos anos, la amplificacion por PCR en tiempo real ha hecho innecesaria la electroforesis en gel de los productos de PCR, asf, la manipulacion posterior de productos de PCR no es necesaria, y se evitan oportunidades de contaminacion de la PCR. Debido a estas ventajas, la PCR en tiempo real se usa cada vez mas. Originalmente, la PCR en tiempo real se usa con colorantes fluorescentes, tales como SYBR GREEN, EVE GREEN etc., para detectar el producto de PCR. Mas recientemente, se aplican sondas de acido nucleico con marcadores fluorescentes en la PCR en tiempo real, tales como una sonda Taqman, una baliza molecular, una sonda de transformacion de energfa de resonancia de fluorescencia, cebadores, sondas, etc. Scorpion usados en la tecnologfa de 5'-exonucleasas. Aunque la PCR basada en colorantes fluorescentes es simple, no puede identificar la amplificacion no espedfica, especialmente la amplificacion no espedfica provocada por dfmeros de cebadores, de modo que hay muchas limitaciones en la aplicacion. Una sonda proporciona una segunda etapa de identificacion para los productos de amplificacion, por lo tanto, se evita la amplificacion no espedfica, de modo que su resultado es mas fiable. Pero la sonda tiene desventajas tales como un diseno complejo y gran coste sintetico, etc. Los inconvenientes de los dos metodos se basan en el hecho de que no pueden evitar la amplificacion no espedfica.
Las mutaciones raras se refieren a alelos mutantes que estan presentes a una concentracion, o numero de copias, relativamente baja en comparacion con los alelos normales. Se refiere especialmente a genes con una mutacion de una sola base. Generalmente, la relacion de gen de mutacion a gen silvestre es menor de 1/1.000, por ejemplo, un gen mutante embrionario vestigial contenido en la sangre de una mujer embarazada, o ADN mutante derivado de celulas tumorales contenido en sangre o tejido tumoral de un cancer. La deteccion de estas mutaciones raras puede ser un reto para las tecnologfas de deteccion de la tecnica anterior.
La clave para una PCR satisfactoria aplicada a la deteccion de mutaciones es disenar un par de cebadores con gran precision y complementariedad hacia ADN o ARN del gen diana. El sistema de mutacion refractario a la amplificacion, ARMS, se invento en 1989, tambien se denomina PCR espedfica de un alelo (AS-PCR) o PCR con cebadores espedficos de secuencias (PCR-SSP). Tiene el uso mas amplio de cualquier metodo de deteccion de mutaciones. La idea basica es disenar dos cebadores de ARMS directos, que tienen un cebador inverso comun para formar un sistema de PCR. La base espedfica del gen alelico se establece en el extremo 3' del cebador, esto se debe a que la ADN polimerasa de Taq no tiene actividad correctora de exonucleasa 3'-5', en la PCR, la base espedfica en el extremo 3' de los cebadores se combina con los sitios de un gen alelico silvestre o de mutacion; si la base esta desapareada, la reaccion de extension de ADN fallara debido a la incapacidad para formar el enlace fosfodiester 3'-5'. Sin embargo, la base del extremo 3' de cebadores de ARMS tiene una capacidad limitada para diferenciar entre desapareamientos diferentes, asf, tienen una capacidad limitada para diferenciar entre algunas mutaciones.
Metodos, composiciones, mezclas de reaccion y estuches para una amplificacion selectiva de multiples copias de una secuencia de acido nucleico espedfica o secuencia diana, que puede estar presente bien sola o bien como un componente de una mezcla homogenea o heterogenea de acidos nucleicos, se conocen del documento US 2007/0281317 A1.
El documento WO 00/79009 A2 divulga una composicion para cuantificar o detectar una o mas moleculas de acido nucleico diana en una muestra, en donde la composicion comprende uno o mas oligonucleotidos marcados detectablemente y una o mas moleculas de acido nucleico diana que se han de detectar o cuantificar. Los oligonucleotidos comprenden uno o mas marcadores detectables situados internamente y/o en o cerca de los extremos 3' y 5' de los oligonucleotidos y en donde el marcador sufre un cambio detectable en una propiedad observable al entrar a formar parte de una molecula de doble hebra .
El documento WO 2004/061134 A1 se refiere a un metodo para detectar polimorfismos de un solo nucleotido en un organismo a traves de un ensayo modificado de mutacion refractaria a la amplificacion que utiliza un par con
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
conformacion de horquilla que discrimina entre diferentes alelos al situar su nucleotido 3' en la posicion de un polimorfismo de un solo nucleotido.
Sumario de la invencion
La invencion se refiere a un nuevo cebador para la amplificacion de un acido nucleico. El cebador de la invencion tiene un concepto de diseno diferente en comparacion con cebadores anteriores. Al incorporar nuevas caractensticas de diseno, la especificidad del cebador se mejora notablemente. El cebador de la invencion tiene gran especificidad y diseno simple, no forma dfmeros del cebador y es adecuado para cuantificar niveles de expresion genica y detectar SNP y mutaciones raras.
Los cebadores de la invencion comprenden cebadores de un tipo, a saber cebadores de amplificacion dobles con
conformacion de bucle, que se pueden usar especialmente en un sistema de deteccion de mutaciones,
especialmente para un sistema de deteccion de mutaciones raras.
Los cebadores de amplificacion dobles con conformacion de bucle de la invencion proporcionan una secuencia de
etiquetaje universal dentro del cebador, la secuencia de etiquetaje y el cebador con conformacion de bucle se
introducen en un sistema de amplificacion por PCR en una cierta concentracion (generalmente, la secuencia de etiquetaje es mas de 10 veces la de los cebadores con conformacion de bucle), en los dos primeros ciclos de PCR, el cebador con conformacion de bucle reconoce la secuencia diana de mutacion con gran especificidad y produce una amplificacion mas temprana, a partir del tercer ciclo, debido a la mayor cantidad del cebador marcador, los productos de PCR de las fases mas tempranas se amplificaran mucho y rapidamente mediante el cebador de etiquetaje, manteniendo asf gran especificidad y sensibilidad para una secuencia diana de una mutacion rara.
Por lo tanto, los cebadores con conformacion de bucle de la invencion se pueden usar para detectar el acido nucleico diana en PCR en tiempo real.
El nucleotido del cebador de la invencion puede ser ADN, ARN, LNA o PNA o un nucleotido no natural.
La invencion tambien se refiere a la aplicacion del cebador con conformacion de bucle.
La invencion proporciona un nuevo cebador para la deteccion por PCR y la deteccion por PCR en tiempo real de la mutacion genica, especialmente para una mutacion rara. El cebador es un oligonucleotido, y el extremo 5' y el extremo 3' tienen 3-20 bases complementarias, en ciertas condiciones pueden formar una doble hebra para dotar al cebador de una estructura con conformacion de bucle, y el interior del cebador tiene una secuencia de etiquetaje universal, la base de reconocimiento se puede establecer en la primera base del extremo 3' o dentro del cebador. En ciertas condiciones, el extremo 3' forma una doble hebra intramolecular, y el interior del cebador forma una estructura con conformacion de bucle; cuando el cebador reconoce y se hibrida a la secuencia diana, la estructura de doble hebra intramolecular se abre y la estructura con conformacion de bucle se pierde, y la doble hebra del cebador se transforma para ser la doble hebra combinada con la secuencia diana, adquiriendo asf la capacidad de extension de ADN. La secuencia marcadora y el cebador con conformacion de bucle se introducen en un sistema de amplificacion por PCR en una concentracion apropiada (generalmente, la secuencia de etiquetaje es mas de 10 veces la de los cebadores con conformacion de bucle), en los dos primeros ciclos de PCR, el cebador con conformacion de bucle reconoce la secuencia diana de mutacion con gran especificidad y produce una amplificacion mas temprana, a partir del tercer ciclo, debido a la mayor cantidad del cebador de etiquetaje, los productos de PCR de las fases mas tempranas se amplificaran mucho y rapidamente mediante el cebador de etiquetaje, manteniendo asf gran especificidad y sensibilidad para una secuencia diana de una mutacion rara. Si no hay una secuencia diana presente, el cebador puede formar una estructura con conformacion de bucle en la etapa de renaturalizacion; puesto que el extremo 3' se forma como una estructura de doble hebra intramolecular, el extremo 3' no puede iniciar la extension de ADN, asf, no se producira amplificacion no espedfica (especialmente dfmeros del cebador). La base de reconocimiento para la secuencia de mutacion se puede establecer en el extremo 3' del cebador segun la especialidad de la secuencia diana. La especialidad del cebador se puede ajustar mediante la longitud de la doble hebra en el extremo 3' del propio cebador, cuando la secuencia diana tenga una o mas bases desapareadas con el cebador, la estructura con conformacion de bucle de la primera no se puede abrir, la estructura de doble hebra en el extremo 3' del cebador existira, y esto detiene la capacidad de extension del extremo 3', asf, no empezara la amplificacion. Referencia a la FIG 1a y FIG 1b.
Estructura del cebador con conformacion de bucle
Los cebadores con conformacion de bucle de la invencion comprenden un diseno, a saber un cebador de amplificacion doble con conformacion de bucle, para detectar una mutacion rara con gran especificidad.
Cebador de amplificacion doble con conformacion de bucle. El cebador es un solo oligonucleotido, y el extremo 5' y el extremo 3' tiene 3-20 bases complementarias, en condiciones apropiadas pueden formar una doble hebra para
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
dotar al cebador de una estructura con conformacion de bucle, y el interior del cebador tiene una secuencia de etiquetaje universal, la base distintiva se puede establecer en la primera base del extremo 3' o en el interior del cebador. En condiciones apropiadas, el extremo 3' puede formar una doble hebra intramolecular, y el interior del cebador forma una estructura con conformacion de bucle; cuando el cebador reconoce y se hibrida a la secuencia diana, la estructura de doble hebra se pierde, y el cebador forma una doble hebra con la secuencia diana, adquiriendo asf la capacidad de extension de ADN. La secuencia de etiquetaje y el cebador con conformacion de bucle se introducen en un sistema de amplificacion por PCR en una cierta concentracion (generalmente, el cebador de etiquetaje es mas de 10 veces con respecto a los cebadores con conformacion de bucle), en los dos primeros ciclos de PCR, el cebador con conformacion de bucle reconoce la secuencia diana de mutacion con gran especificidad y produce una amplificacion mas temprana, a partir del tercer ciclo, debido a la mayor cantidad del cebador de etiquetaje, los productos de PCR de las fases mas tempranas se amplificaran mucho y rapidamente mediante el cebador de etiquetaje, manteniendo asf gran especificidad y sensibilidad para la secuencia diana de mutacion. Si no hay secuencia diana presente, el cebador puede formar una estructura con conformacion de bucle en la etapa de renaturalizacion, el extremo 3' puede formar una doble hebra para detener la capacidad de extension de ADN por el extremo 3', asf no se producira la amplificacion no espedfica (especialmente dfmeros del cebador). El sitio de reconocimiento para la secuencia de mutacion se puede establecer en el extremo 3' o dentro del cebador segun la especialidad de la secuencia diana. La especificidad del cebador se puede ajustar mediante la longitud de la doble hebra en el extremo 3' del propio cebador, si la secuencia diana tiene uno o mas desapareamientos de bases con el cebador, la estructura con conformacion de bucle de la primera no se puede abrir, la estructura de doble hebra en el extremo 3' del cebador todavfa se formara y detendra la capacidad de extension del extremo 3', asf, no empezara la amplificacion. Referencia a la FIG 1a y FIG 1b.
En referencia a la FIG. 1a, segun los defectos de una mutacion rara que se detectan en la tecnica anterior, la presente invencion proporciona un metodo para detectar la mutacion rara. Segun la FIG. 1a, el sistema de la invencion comprende tres cebadores, un cebador directo de doble amplificacion F, un cebador inverso de doble amplificacion R y un cebador de etiquetaje universal T. En una realizacion preferida, el cebador directo F tiene cuatro dominios funcionales diferentes 11, 12, 13 y 14, en donde el dominio 11 se denomina dominio de reconocimiento de la diana, el dominio 12 se denomina dominio de reconocimiento de mutacion, el dominio de reconocimiento de mutacion se puede establecer en el extremo 3' o lejos del extremo 3' segun los tipos de la mutacion rara, el dominio 13 se denomina secuencia de etiquetaje y el dominio 14 se denomina secuencia complementaria. En una realizacion preferida, el cebador antidirecto R comprende tres dominios funcionales 13, 15 y 16, en donde el dominio 13 se denomina secuencia marcadora que tiene la misma secuencia que el domino 13 del cebador directo, el dominio 15 se denomina dominio de combinacion con la diana y el dominio 16 se denomina secuencia complementaria. En una realizacion preferida, el cebador universal T se ajusta al dominio 13 del cebador directo F y el cebador inverso R.
La FIG. 1b muestra el procedimiento de amplificacion buscada de la mutacion rara por los cebadores de la invencion. La amplificacion comprende tres fases, en la primera fase, la secuencia diana contiene la mutacion rara en un sistema con cebador directo F y cebador inverso R, a una temperatura de renaturalizacion alta, preferiblemente, la mejor temperatura de renaturalizacion es 60-66°C. El cebador universal T tiene una valor de la TM inferior a la temperatura, de modo que no se puede ajustar a la secuencia diana, mientras que el cebador directo F y cebador inverso R se pueden ajustar a la secuencia diana 21 y 22 con gran especificidad, y extenderse para obtener la secuencia 23 y 24, la secuencia 23 se ajusta al cebador inverso R a una temperatura de renaturalizacion para extenderse para obtener la secuencia 25, y asf alcanzar la acumulacion de la secuencia de la mutacion rara. Debido a la temperatura de renaturalizacion alta, el cebador tiene una eficacia combinatoria inferior a la secuencia diana, asf la acumulacion en la fase no puede obtener una acumulacion exponencial con gran eficacia.
En la segunda fase se usa el cebador universal T, el extremo 3' de la secuencia 25 de la mutacion rara acumulado en la primera fase tiene una secuencia complementaria al cebador universal T, a una temperatura de renaturalizacion inferior, preferiblemente, la temperatura de renaturalizacion es 54-58°C, a esta temperatura de renaturalizacion el cebador universal T se puede combinar con la secuencia 25 de la mutacion rara con gran eficacia, y extenderse para obtener la secuencia 26 que contiene mutacion rara, tanto la secuencia 25 como la 26 se pueden ajustar al cebador universal T, asf se pueden amplificar exponencialmente, y obtener una gran cantidad de secuencia 27 que contiene mutacion rara, por lo tanto se consigue la amplificacion de la secuencia de la mutacion rara.
El metodo de diseno de los cebadores con conformacion de bucle
Valor de la Tm del dominio combinado con la secuencia diana: El valor de la Tm del dominio combinado con la secuencia diana del cebador se puede mantener en un valor de la Tm de un cebador general, esto se puede determinar segun el contenido de GC de la secuencia diana, comunmente, el valor de la Tm puede ser 55-65°C. La temperatura de renaturalizacion en la amplificacion puede tener el mismo valor de la Tm o 3-5°C inferior que el valor de la Tm del cebador.
Valor de la Tm del dominio del interior de la doble hebra: generalmente, las bases complementarias del cebador son 3-20 pb, el valor de la Tm tiene el mismo valor que el cebador de amplificacion o 2-5°C superior que la temperatura
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
de renaturalizacion. Segun los resultados de las realizaciones preferidas de la invencion, si el cebador con conformacion de bucle se usa para detectar una mutacion de una sola base mediante PCR en tiempo real, el valor de la Tm puede ser 3-5°C superior que la temperatura de renaturalizacion. Segun el cebador para detectar una mutacion rara, el valor de la Tm del dominio de doble hebra puede ser 5-12°C superior que la temperatura de renaturalizacion.
El sitio de la base de reconocimiento de la mutacion: segun la mutacion puntual general, el sitio de reconocimiento se puede establecer en la primera base del extremo 3' del cebador; segun la mutacion por eliminacion y la insercion, el sitio de reconocimiento puede ser varias bases contiguas en el extremo 3' o cerca del extremo 3'; segun la condicion que pueda haber, las otras mutaciones similares cerca de la posicion de mutacion del gen diana, la base de reconocimiento de la mutacion se puede establecer dentro del cebador, en lugar de la primera base del extremo 3'.
La longitud del cebador: generalmente, la longitud total del cebador es 20-80 pb, el dominio de combinacion diana es 16-40 pb, el dominio complementario interno, es decir el dominio de doble hebra, el extremo 5' y el extremo 3' es 320 pb, respectivamente, el dominio con conformacion de bucle es 5-60 pb, la secuencia marcadora universal es 1630 pb.
El acido nucleico no natural: cualquier acido nucleico no natural, p. ej., LNA, PNA se puede usar en cualquier sitio del cebador.
La mejor estructura detectora del cebador con conformacion de bucle: el cebador con conformacion de bucle se puede usar para detectar por amplificacion en PCR en tiempo real. Los amplificadores para la PCR en tiempo real del cebador con conformacion de bucle comprenden: 7300, 7500, 7700 de Applied Biosystems (ABI), IQ Cycler de Bio-Rad, LightCycler2.0, LightCycler480 de Roche, Rotor-Gene 3000, 6000 de Corbett Research, MX3000P, MX3005P de Stratagene etc.
Ventajas del cebador con conformacion de bucle
Diseno simple: El extremo 3' del cebador es una parte de la secuencia diana, hay varias bases en el extremo 5' complementario al extremo 3', la secuencia marcadora se puede anadir o no anadir al interior del cebador, la base de reconocimiento de mutacion se puede establecer en la primera base del extremo 3' o dentro del cebador, solo el valor de la Tm de la doble hebra del cebador tiene la misma temperatura o superior que la temperatura de renaturalizacion en el sistema de PCR. Mediante la ensenanza de la invencion, cualquier experto en la tecnica puede disenar el cebador.
Sin dfmeros del cebador: antes de que la temperatura de predesnaturalizacion de PCR alcance la temperatura de desnaturalizacion, debido a que la doble hebra del propio cebador finalizaba la capacidad de extension de ADN; en los ultimos ciclos de PCR, en condiciones de mantenimiento de una cierta temperatura de renaturalizacion, el cebador que no se puede combinar con la secuencia diana formara una doble hebra intramolecular, y no se combinara con otro cebador, asf no se produciran dfmeros del cebador.
Gran especificidad: debido a que el cebador tiene una estructura de doble hebra complementaria inversa por sf mismo, solo cuando la fuerza de combinacion de la secuencia diana combinada con el dominio de combinacion diana del cebador es mas fuerte que la energfa de combinacion de la doble hebra complementaria inversa, el cebador se puede hibridar con la secuencia diana, la estructura con conformacion de bucle se puede abrir y el cebador puede obtener capacidad de extension de ADN. Si existen bases en la secuencia diana que no se ajusten al cebador, p. ej. una sola base desapareada, si la posicion de desapareamiento esta en el extremo 3' o dentro del cebador, el cebador mantendra la estructura con conformacion de bucle en primer lugar, y a continuacion se finaliza la capacidad de extension de ADN del cebador. Ademas, debido a que existe una estructura complementaria inversa en sf misma, la longitud del dominio complementario se puede ajustar para ajustar la especificacion del cebador en el diseno. Para una mutacion rara, por ejemplo, una mutacion somatica en un fondo de mayor cantidad de ADN silvestre, el cebador mantiene la especificacion, excepto que la secuencia complementaria compite con la especificacion de secuencia del extremo 3'.
Gran sensibilidad: el cebador de amplificacion doble con conformacion de bucle comprende una secuencia de etiquetaje universal, de modo que la secuencia diana se pueda amplificar durante dos fases. El ADN de la mutacion tiene menor contenido en la plantilla, y el cebador esta en un fondo en mayor cantidad de tipo silvestre, asf la amplificacion de la mutacion tiene menor eficacia, sin embargo, si se amplifica una copia, la secuencia diana sera rapidamente amplificada por el cebador de etiquetaje con gran contenido en el sistema.
Adecuado para un sistema de PCR multiple: debido a que el cebador puede mantener una gran especificidad por sf mismo y no producira dfmeros del cebador, y tiene secuencia de etiquetaje, despues de dos ciclos de amplificacion inicial, todo el producto de amplificacion sera amplificado por la misma secuencia marcadora, se evita asf el problema de la diferente eficacia de amplificacion de los cebadores y el problema de que los cebadores se vean
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
afectados entre ellos, de modo que el cebador de la invencion es muy adecuado para un sistema de PCR multiple, y se adapta a un sistema de deteccion para la expresion de multiples genes.
Adecuado para la amplificacion precisa para una sola mutacion de una region de acumulacion de mutaciones: la region genica que puede producir una mutacion por la que estan interesados los investigadores a menudo produda densamente mutaciones que no teman relacion con la investigacion, pero las mutaciones eran muy similares a las mutaciones por las que estan interesados los investigadores; en la tecnica anterior, el establecimiento de la base especificada en el extremo 3' en ARMS provocaba facilmente reacciones cruzadas, mientras que el cebador con conformacion de bucle puede establecer la base especificada dentro del cebador y contener mas dominio de la secuencia diana, asegurando asf una amplificacion precisa. Esto se muestra en la FIG. 2.
Smtesis simples: No se necesita ninguna maquina especial, se pueden usar para la smtesis amplificadores de ADN generales.
Campo de aplicacion amplio: se puede usar para amplificar plantillas diffciles con gran contenido de AT y gran contenido de GC, y detectara mutaciones puntuales, mutaciones por eliminacion o mutaciones por insercion.
Breve descripcion de los dibujos
La FIG. 1a muestra la estructura de un cebador de amplificacion doble con conformacion de bucle;
La FIG. 1b muestra el principio de reaccion en la deteccion por PCR de un cebador de amplificacion doble con conformacion de bucle.
La FIG. 2 muestra la amplificacion precisa para una sola mutacion rara de una region de agrupacion de mutaciones mediante un cebador de amplificacion doble con conformacion de bucle en la realizacion 1.
Realizacion preferida de la invencion
Realizacion 1
Cebador de amplificacion doble con conformacion de bucle usado en la amplificacion precisa para una sola mutacion rara de una region de agrupacion de mutaciones del codon 12 de K-ras
El gen K-ras tiene importantes funciones en el crecimiento y la diferenciacion celulares, existen aproximadamente 70% de canceres relacionados con la mutacion de los codones 12, 13, la otra mutacion del codon se produce en el sitio 59 y 61. Cada base de las tres bases en el codon 12 o 13 puede ser una mutacion, generalmente, la mutacion se produce en las bases primera o segunda, puede mutar para ser las otras tres bases excepto ella misma, o las bases tanto primera como segunda pueden estar mutadas. Por ejemplo, la primera base del codon 12 esta mutada en A, es decir GGT>TGT (Cosmic ID:480,) esta mutacion es una mutacion de punto caliente relacionada con la resistencia farmacologica al Erbitux, un farmaco para tratar el cancer de colon; aunque mutaban las bases tanto primera como segunda, p. ej. GGT>TGC (Cosmic ID:513), GGT>TTT (Cosmic ID:512), GGT>TAT (Cosmic ID:25081), estas tres mutaciones son una mutacion comun, y no es seguro que esten relacionadas con la resistencia farmacologica al Erbitux. Los cebadores de ARMS comunes detectan facilmente estas mutaciones como GGT>TGT por error.
Segun la secuencia silvestre y de mutacion GGT>TGT (Cosmic ID:480) del codon 12 publicada por Cosmic, se disenan un par de cebadores de amplificacion dobles con conformacion de bucle y una sonda, que son K-ras-M1-F, K-ras-M1-R, K-ras-P, respectivamente. Segun el gen silvestre de HGH publicado por Cosmic, se disenan un par de cebadores de amplificacion dobles con conformacion de bucle y una sonda como HGH-F, HGH-R, HGH-P, respectivamente.
El metodo para detectar la mutacion GGT>TGT de K-ras de una muestra de tejido combinado con parafina clmica mediante el sistema de PCR anterior comprende las siguientes etapas:
(1) tratamiento de la muestra y extraccion de la plantilla: muestras de tejido combinado con parafina clmica se cortan en rodajas hasta 5-10 pm, y se anade 1 ml de xileno para retirar la parafina, se recoge el deposito mediante una centnfuga y se anade 1 ml de etanol absoluto al deposito, se seca a temperatura ambiente o 37°C, se anade proteasa K y tampon ATL, se digiere a 56°C durante 1 h, se incuba a 90°C durante 1 h, se anaden 200 ml de tampon AL y se combina, a continuacion se anaden 200 pl de etanol absoluto y se combina, el sobrenadante se retira cuidadosamente hasta una columna giratoria de 2 ml QIA, 6.000*g (8.000 rpm) 1 min., a continuacion se anaden 500 pl de tampon AW1, 6.000*g (8.000 rpm) 1 min., se abre cuidadosamente la tapa y se anaden 500 pl de tampon AW2, 6.000*g (8.000 rpm) 1 min., el tubo vacfo se centrifuga a 20.000*g (14.000 rpm) durante 3 min., se anaden
100 |jl de tampon ATE en el medio de la pelfcula, se incuba durante 5 min., 20.000xg (14.000 rpm) 1 min. se recogen 3,3 jl para detectar el valor de OD, la muestra de ADN se diluye hasta 2 ng/jl, se recogen 5 jl para la PCR
(2) Sistema de amplificacion por PCR fluorescente que comprende:
1*tamp6n de PCR MgCl2
dNTP cada uno cebadores
7.0 mmol
1.0 mmol 0,5~1,0 jmol 5~10 jmol 0,5~1,0 jmol
1.0 U 5 jl 25 jl
secuencia marcadora T sondas
polimerasa de Taq plantilla volumen total
Secuencia de los cebadores y la sonda
imagen1
en donde las bases con subrayado son secuencia marcadora, las bases con marco en el extremo 5' son complementarias a las bases del extremo 3', las bases en negrita son la base de reconocimiento de mutacion;
10 K-ras-M1-R: GCAAGGGGTCAGTAAAGCGTCGTCCACAAAATGATTCTG, en donde las bases con subrayado son secuencia marcadora, la secuencia marcadora T es GCAAGGGGTCAGTAAAGCG°K-ras-P: FAM-5' TGCCTTGACGATACAGCT3'-BHQ. El sistema de control interno HGH-F: 5'-
GCAAGGGGTCAGTAAAGCGGCAGTGCCTTCCCAACCATT-3', HGH-R: 5'-
GCAAGGGGTCAGTAAAGCGCATTCCCCAAGAGCTTACAAACTC-3', en donde las bases con subrayado son 15 secuencia marcadora, HGH-P: HEX-5'TTGACAACGCTATGCTCCGC3' - BHQ.
La condicion de reaccion de PCR en tiempo real es: predesnaturalizacion a 96°C durante 15 ciclos de 3 min., a continuacion desnaturalizacion a 95°C 15 s, 64°C 25 s, extension a 72°C 10 s, 35 ciclos; 95°C 15 s; 58°C 25 s, 72 (deteccion de senal de fluorescencia de FAM), 72°C 15 s, extension °C 10 s, 35 ciclos. Los 35 ciclos finales detectan 20 las senales de FAM y HEX en etapas de renaturalizacion.
(3) deteccion: la fluorescencia se detecta en la fase de renaturalizacion mediante un amplificador de PCR en tiempo real MX3000p (SRATGENE), el tubo de PCR que contiene el lfquido de reaccion se detecta uno a uno en el amplificador de PCR de fluorescencia.
Juicio de los resultados: segun el valor de Ct mostrado en el amplificador de PCR de fluorescencia para detectar la 25 intensidad de fluorescencia de FAM y HEX en el sistema de reaccion, la senal de HEX que alcanza el umbral (Ct>18) significa que el contenido de ADN esta dentro del lfmite, y el resultado de la senal de FAM es fiable; si la senal de FAM se plantea segun el juicio de negativo y positivo, la curva de amplificacion por PCR con conformacion de S normal es positiva.
(4) Analisis de la especificacion
30 Deteccion de la especificacion: se toma como control ADN de la celula SW48, se detecta la mutacion GTG>TGT de K-ras de la muestra recogida, el resultado muestra que solo la muestra que contiene la mutacion GTG>TGT de K-ras tiene senal fluorescente, mientras que el ADN de la celula SW48 usado como control no tiene senal fluorescente. Ademas, se usan 100 muestras procedentes de un banco de sangre para identificar adicionalmente la especificacion de la PCR fluorescente. Los resultados muestran que las muestras de sangre procedentes del banco de sangre no 35 tienen senal fluorescente detectando mediante PCR fluorescente.
(5) Analisis de sensibilidad
El analisis cuantitativo se procesa mediante ADN plasirndico sintetico que contiene la mutacion GTG>TGT de K-ras, se toma el ADN de la muestra con contenido de 1000 copias despues de cuantificar y se diluye 10 veces, y se toman tres clases diluidas, a continuacion se toman 5 jl en cada una de las cuatro clases diluidas, se usan ocho grupos 40 paralelos para la PCR fluorescente. El metodo de la presente invencion tiene gran sensibilidad, se pueden detectar 1-10 copias/jl.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
(6) Selectividad
5 copias de ADN plasirndico sintetico que contienen mutacion GTG>TGT de K-ras se detectan por fluorescencia en un fondo de 1 ng, 5 ng, 10 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng, mostrado en la FIG. 6
La FIG. 6 muestra el resultado de deteccion de la amplificacion para la plantilla de mutacion rara en un fondo de diferente contenido mediante el cebador de amplificacion doble con conformacion de bucle de la presente invencion. La plantilla de mutacion se detecta en un fondo de 1 ng, 5 ng, 10 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng, respectivamente, la lmea 71 es 5 copias en fondo de 1 ng, la lmea 72 es 5 copias en fondo de 5 ng, la lmea 73 es 5 copias en fondo de 10 ng, la lmea 74 es 5 copias en fondo de 50 ng, la lmea 75 es 5 copias en fondo de 100 ng y la lmea 76 es 5 copias en fondo de 200 ng. El resultado muestra que el cebador de amplificacion doble con conformacion de bucle de la presente invencion tiene gran selectividad. En el sistema de reaccion, se producira la correspondiente amplificacion. Cuando las dos secuencias diana esten en las muestras, los productos del cebador silvestre (lmea 67) y el cebador de mutacion (lmea 68) se incrementan notablemente. Sin embargo, segun la diana silvestre, el incremento del producto esta provocado por la amplificacion del cebador silvestre (lmea 63), no por la amplificacion del cebador de mutacion (lmea 64). A la inversa, segun la diana de mutacion, el incremento del producto esta provocado por la amplificacion del cebador de mutacion (lmea 65), no por la amplificacion del cebador silvestre (lmea 66). Esto prueba que el cebador de la invencion diferencia la diana por uno o mas acidos nucleicos. Cuando no hay plantilla, no se encuentra amplificacion, cuando hay dos plantillas, se encuentran senales de amplificacion de las dos PCR.
Realizacion 4
Cebador de amplificacion doble con conformacion de bucle usado en la amplificacion precisa para una sola mutacion rara de la region de agrupacion de mutaciones del codon 12 de K-ras
El gen K-ras tiene importantes funciones en el crecimiento y la diferenciacion celulares, aproximadamente 70% de los canceres se relacionan con la mutacion de los codones 12, 13, la otra mutacion codonica se produce en el sitio 59 y 61. Cada base de las tres bases en el codon 12 o 13 puede ser una mutacion, generalmente, la mutacion se produce en las bases primera o segunda, puede estar mutada en las otras tres bases excepto ella misma, o las bases tanto primera como segunda pueden estar mutadas. Por ejemplo, la primera base del codon 12 esta mutada en A, es decir GGT>TGT (Cosmic ID:480,) esta mutacion es una mutacion de punto caliente relacionada con la resistencia farmacologica al Erbitux, un farmaco para tratar el cancer de colon; aunque mutaban las bases tanto primera como segunda, p. ej. GGT>TGC (Cosmic ID:513), GGT>TTT (Cosmic ID:512), GGT>TAT (Cosmic ID:25081), estas tres mutaciones son una mutacion comun, y no es seguro que esten relacionadas con la resistencia farmacologica al Erbitux. Los cebadores de ARMS comunes detectan facilmente estas mutaciones como GGT>TGT por error.
Segun la secuencia silvestre y de mutacion GGT>TGT (Cosmic ID:480) del codon 12 publicada por Cosmic, se disenan un par de cebadores de amplificacion dobles con conformacion de bucle y una sonda, que son K-ras-M1-F, K-ras-M1-R, K-ras-P, respectivamente. Segun el gen silvestre de HGH publicado por Cosmic, se disenan un par de cebadores de amplificacion dobles con conformacion de bucle y una sonda como HGH-F, HGH-R, HGH-P, respectivamente.
El metodo para detectar la mutacion GGT>TGT de K-ras de una muestra de tejido combinado con parafina clmica mediante el sistema de PCR anterior comprende las siguientes etapas:
(1) tratamiento de la muestra y extraccion de la plantilla: muestras de tejido combinado con parafina clmica se cortan en rodajas hasta 5-10 pm, y se anade 1 ml de xileno para retirar la parafina, se recoge el deposito mediante una centnfuga y se anade 1 ml de etanol absoluto al deposito, se seca a temperatura ambiente o 37°C, se anade proteasa K y tampon ATL, se digiere a 56°C durante 1 h, se incuba a 90°C durante 1 h, se anaden 200 ml de tampon AL y se combina, a continuacion se anaden 200 pl de etanol absoluto y se combina, el sobrenadante se retira cuidadosamente hasta una columna giratoria de 2 ml QIA, 6.000*g (8.000 rpm) 1 min., a continuacion se anaden 500 pl de tampon AW1, 6.000*g (8.000 rpm) 1 min., se abre cuidadosamente la tapa y se anaden 500 pl de tampon AW2, 6.000*g (8.000 rpm) 1 min., el tubo vacm se centrifuga a 20.000*g (14.000 rpm) durante 3 min., se anaden 100 pl de tampon ATE en el medio de la pelmula, se incuba durante 5 min., 20.000xg (14.000 rpm) 1 min. se recogen 3,3 pl para detectar el valor de OD, la muestra de ADN se diluye hasta 2 ng/pl, se recogen 5 pl para la PCR.
(2) Sistema de amplificacion por PCR fluorescente que comprende:
5
10
15
20
25
30
35
1*tampon de PCR
MgCl2
7,0 mmol
dNTP cada uno
1,0 mmol
cebadores
0,5~1,0 pmol
secuencia marcadora T
5~10 pmol
sondas
0,5~1,0 pmol
polimerasa de Taq
1,0 U
plantilla
5 pl
volumen total
25 pl
Secuencia de los cebadores y la sonda
imagen2
en donde las bases con subrayado son secuencia marcadora, las bases con marco en el extremo 5' son complementarias a las bases del extremo 3', las bases en negrita son la base de reconocimiento de mutacion; K-ras-MI-R: GCAAGGGGTCAGTAAAGCGTCGTCCACAAAATGATTCTG, en donde las bases con subrayado son secuencia marcadora, la secuencia marcadora T es GCAAGGGGTCAGTAAAGCG°K-ras-P: FAM-5' TGCCTTGACGATACAGCT3'-BHQ. El sistema de control interno HGH-F: 5'-
GCAAGGGGTCAGTAAAGCGGCAGTGCCTTCCCAACCATT-3', HGH-R: 5' -
GCAAGGGGTCAGTAAAGCGCATTCCCCAAGAGCTTACAAACTC-3', en donde las bases con subrayado son secuencia marcadora, HGH-P: HEX-5'TTGACAACGCTATGCTCCGC3' - BHQ.
La condicion de reaccion de PCR en tiempo real es: predesnaturalizacion a 96°C durante 15 ciclos de 3 min., a continuacion desnaturalizacion a 95°C 15 s, 64°C 25 s, extension a 72°C 10 s, 35 ciclos; 95°C 15 s; 58°C 25 s , 72 (deteccion de senal de fluorescencia de FAM), 72°C 15 s, extension °C 10 s, 35 ciclos. Los 35 ciclos finales detectan las senales de FAM y HEX en etapas de renaturalizacion.
(3) deteccion: la fluorescencia se detecta en la fase de renaturalizacion mediante un amplificador de PCR en tiempo real MX3000p (SRATGENE), el tubo de PCR que contiene el lfquido de reaccion se detecta uno a uno en el amplificador de PCR de fluorescencia.
Juicio de los resultados: segun el valor de Ct mostrado en el amplificador de PCR de fluorescencia para detectar la intensidad de fluorescencia de FAM y HEX en el sistema de reaccion, la senal de HEX que alcanza el umbral (Ct>18) significa que el contenido de ADN esta dentro del lfmite, y el resultado de la senal de FAM es fiable; si la senal de FAM se plantea segun el juicio de negativo y positivo, la curva de amplificacion por PCR con conformacion de S normal es positiva.
(4) Analisis de la especificacion
Deteccion de la especificacion: se toma como control ADN de la celula SW48, se detecta la mutacion GTG>TGT de K-ras de la muestra recogida, el resultado muestra que solo la muestra que contiene la mutacion GTG>TGT de K-ras tiene senal fluorescente, mientras que el ADN de la celula SW48 usado como control no tiene senal fluorescente. Ademas, se usan 100 muestras procedentes de un banco de sangre para identificar adicionalmente la especificacion de la PCR fluorescente. Los resultados muestran que las muestras de sangre procedentes del banco de sangre no tienen senal fluorescente detectando mediante PCR fluorescente.
(5) Analisis de sensibilidad
El analisis cuantitativo se procesa mediante ADN plasirndico sintetico que contiene la mutacion GTG>TGT de K-ras, se toma el ADN de la muestra con contenido de 1.000 copias despues de cuantificar y se diluye 10 veces, y se toman tres clases diluidas, a continuacion se toman 5 pl en cada una de las cuatro clases diluidas, se usan ocho grupos paralelos para la PCR fluorescente. El metodo de la presente invencion tiene gran sensibilidad, se pueden detectar 1-10 copias/pl.
(6) Selectividad
5 copias de ADN plasirndico sintetico que contienen mutacion GTG>TGT de K-ras se detectan por fluorescencia en un fondo de 1 ng, 5 ng, 10 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng, mostrado en la FIG. 6
La FIG. 6 muestra el resultado de deteccion de la amplificacion para la plantilla de mutacion rara en un fondo de 5 diferente contenido mediante el cebador de amplificacion doble con conformacion de bucle de la presente invencion. La plantilla de mutacion se detecta en un fondo de 1 ng, 5 ng, 10 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng, respectivamente, la lmea 71 es 5 copias en fondo de 1 ng, la lmea 72 es 5 copias en fondo de 5 ng, la lmea 73 es 5 copias en fondo de 10 ng, la lmea 74 es 5 copias en fondo de 50 ng, la lmea 75 es 5 copias en fondo de 100 ng y la lmea 76 es 5 copias en fondo de 200 ng. El resultado muestra que el cebador de amplificacion doble con conformacion de bucle de la 10 presente invencion tiene gran selectividad.

Claims (4)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para la amplificacion de un acido nucleico que comprende un sistema de tres cebadores, en el que dichos cebadores son el cebador directo F, el cebador inverso R y el cebador universal T, en donde
    al menos un cebador es un cebador con conformacion de bucle en el cebador directo F y el cebador inverso R, el extremo 3' del cebador con conformacion de bucle es la region de reconocimiento de la diana, y el extremo 5' tiene 3-20 bases complementarias con el extremo 3', en ciertas condiciones el extremo 3' y el extremo 5' del cebador directo F y/o el cebador inverso R pueden formar una doble hebra para dotar al cebador de una estructura con conformacion de bucle, el interior del cebador directo F y el cebador inverso R tiene una misma secuencia de etiquetaje universal, respectivamente;
    en ciertas condiciones, el extremo 3' y el extremo 5' del cebador directo F y/o el cebador inverso R pueden formar una doble hebra para dotar al cebador de una estructura con conformacion de bucle, cuando el cebador se reconoce y se hibrida a la secuencia diana, la estructura de doble hebra se abre y la estructura con conformacion de bucle se pierde, y la doble hebra del cebador se transforma para ser la doble hebra combinada con la secuencia diana, asf adquieren capacidad de extension de ADN; el cebador universal T tiene la misma secuencia que la secuencia de etiquetaje universal en el cebador directo F y el cebador inverso R, en donde dicho cebador con conformacion de bucle comprende ademas una region de reconocimiento de mutacion.
  2. 2. El metodo para la amplificacion de un acido nucleico segun la reivindicacion 1, en el que dicha region de reconocimiento de mutacion se establece en la primera base del extremo 3' o dentro de la region de reconocimiento de la diana.
  3. 3. El metodo para la amplificacion de un acido nucleico segun la reivindicacion 1, en el que la longitud total del cebador es 35-80 pb, la region de reconocimiento de la diana es 16-40 pb y la secuencia de etiquetaje universal ee 16-30 pb.
  4. 4. El metodo para la amplificacion de un acido nucleico segun la reivindicacion 1, en el que la cantidad anadida de la secuencia marcadora T es mas de 10 veces la cantidad total del cebador F y el cebador R.
ES09842062.3T 2009-03-26 2009-03-26 Cebador con conformación de bucle empleado en la amplificación de ácidos nucleicos y el uso del mismo Active ES2610616T3 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2009/071026 WO2010108325A1 (zh) 2009-03-26 2009-03-26 一种用于核酸扩增的环形引物及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2610616T3 true ES2610616T3 (es) 2017-04-28

Family

ID=42780141

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES09842062.3T Active ES2610616T3 (es) 2009-03-26 2009-03-26 Cebador con conformación de bucle empleado en la amplificación de ácidos nucleicos y el uso del mismo

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9644233B2 (es)
EP (1) EP2412718B1 (es)
JP (1) JP5818018B2 (es)
DK (1) DK2412718T3 (es)
ES (1) ES2610616T3 (es)
PL (1) PL2412718T3 (es)
PT (1) PT2412718T (es)
WO (1) WO2010108325A1 (es)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105102467B (zh) 2013-02-07 2019-01-22 新泽西鲁特格斯州立大学 高度选择性核酸扩增引物
KR102124058B1 (ko) * 2013-09-16 2020-06-17 삼성전자주식회사 폴리뉴클레오티드 및 그의 용도
KR101525495B1 (ko) * 2013-11-15 2015-06-03 (주)다이오진 덤벨 구조 올리고뉴클레오티드, 이를 포함한 핵산 증폭용 프라이머 및 이를 이용한 핵산 증폭 방법
KR101723207B1 (ko) * 2015-01-29 2017-04-05 (주)다이오진 덤벨 구조의 올리고뉴클레오티드 및 이를 이용한 유전자 변이 검출 방법
KR101742681B1 (ko) * 2015-01-30 2017-06-01 에스디 바이오센서 주식회사 상보적 염기서열 내지는 미스-매치된 염기를 포함하는 상보적인 염기서열과 연결된 pcr 프라이머 및 이를 이용한 핵산 증폭 방법
WO2016137031A1 (ko) * 2015-02-25 2016-09-01 (주)다이오진 덤벨 구조 올리고뉴클레오티드, 이를 포함한 핵산 증폭용 프라이머 및 이를 이용한 핵산 증폭 방법
KR101785687B1 (ko) * 2016-07-20 2017-10-17 (주)다이오진 다중 증폭 이중 시그널 증폭에 의한 타겟 핵산 서열의 검출 방법
CN111235261B (zh) * 2019-12-20 2022-11-04 江苏伟禾生物科技有限公司 用于检测人类血小板特异性抗原hpa 1～29基因分型的试剂盒
CN114134219A (zh) * 2021-12-14 2022-03-04 广州市金圻睿生物科技有限责任公司 一种多重核酸检测系统及其制备方法与应用
CN114032337A (zh) * 2021-12-14 2022-02-11 广州市金圻睿生物科技有限责任公司 一种呼吸道病原体检测试剂盒及其制备方法与应用
CN116121358A (zh) * 2022-11-11 2023-05-16 重庆浦济生命科技有限公司 用于精神药物基因检测的组合物、试剂盒及使用方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6277607B1 (en) * 1999-05-24 2001-08-21 Sanjay Tyagi High specificity primers, amplification methods and kits
NZ516278A (en) * 1999-06-22 2004-03-26 Invitrogen Corp Improved primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
CA2390309C (en) * 1999-11-08 2012-09-25 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Method for synthesizing the nucleic acid
US20060121487A1 (en) * 2002-12-27 2006-06-08 David Alland Method for single nucleotide polymorphism detection
US20050059049A1 (en) * 2003-07-07 2005-03-17 One Cell Systems, Inc. Hairpin-labeled probes and methods of use
US20070092880A1 (en) * 2003-07-16 2007-04-26 Crothers Donald M Invasive cleavage reaction with electrochemical readout
US7575863B2 (en) * 2004-05-28 2009-08-18 Applied Biosystems, Llc Methods, compositions, and kits comprising linker probes for quantifying polynucleotides
CN100374577C (zh) * 2004-06-25 2008-03-12 吴秉铨 用于检测b族链球菌特有序列的引物、短柄圆环探针、试剂盒及方法
CA2584576C (en) * 2004-10-18 2015-12-08 Brandeis University Reagents and methods for improving reproducibility and reducing mispriming in pcr amplification
US7833716B2 (en) * 2006-06-06 2010-11-16 Gen-Probe Incorporated Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods
DK1945821T3 (da) * 2006-06-06 2011-03-07 Gen Probe Inc Mærkede oligonukleotider og anvendelse deraf i fremgangsmåder til amplifikation af nukleinsyrer
JP4490988B2 (ja) * 2007-04-26 2010-06-30 株式会社東芝 血清アミロイドａ１（ｓａａ１）の遺伝子型を検出するための核酸プライマーセット、キット、及び該プライマーセットを用いた検出方法
US20090023190A1 (en) * 2007-06-20 2009-01-22 Kai Qin Lao Sequence amplification with loopable primers

Also Published As

Publication number Publication date
PL2412718T3 (pl) 2017-06-30
JP5818018B2 (ja) 2015-11-18
DK2412718T3 (en) 2017-01-30
WO2010108325A1 (zh) 2010-09-30
EP2412718A1 (en) 2012-02-01
US20110269192A1 (en) 2011-11-03
EP2412718A4 (en) 2013-02-06
US9644233B2 (en) 2017-05-09
PT2412718T (pt) 2016-12-30
EP2412718B1 (en) 2016-10-12
JP2013518559A (ja) 2013-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2610616T3 (es) Cebador con conformación de bucle empleado en la amplificación de ácidos nucleicos y el uso del mismo
US20220372586A1 (en) Ultraspecific Nucleic Acid Sensors for Low-Cost Liquid Biopsies
JP5637850B2 (ja) 標的核酸配列の増幅方法、それを用いた変異の検出方法、および、それに用いる試薬
US9359647B2 (en) Probe for detection of polymorphism in EGFR gene, amplification primer, and use thereof
KR102371222B1 (ko) 표적핵산 증폭방법 및 표적핵산 증폭용 조성물
JP2008520245A (ja) 切断−増幅法による核酸多様性の検出
US10745732B2 (en) Genetic marker for discriminating and detecting causative bacteria of fish Edwardsiellosis and Streptococcosis, and method for discriminating and detecting causative bacteria using same
CN113046424B (zh) 一种用于pcr检测的核酸组合物的制备方法及其制备的核酸组合物和pcr检测方法
WO2011071046A1 (ja) 疾患関連遺伝子の多型検出用プローブおよびその用途
JP2003518951A (ja) 多型核酸配列の同時増幅およびリアルタイム検出のための方法
JP5684737B2 (ja) 標的配列の増幅方法、多型検出方法およびそれに用いる試薬
WO2017090915A1 (ko) 유전성 난청 검출용 pna 프로브 및 이를 이용한 유전성 난청 검출방법
KR101386918B1 (ko) Ｖｋｏｒｃ１ 유전자의 -1639번째의 염기의 다형 검출법, 및 그것을 위한 핵산 프로브 및 키트
CN114277108B (zh) 用于snp位点检测的引物探针组合、试剂盒和方法
JP4491276B2 (ja) 標的ｄｎａ配列において一塩基変異多型の存在を検出する方法及びキット
JPWO2011077990A1 (ja) ｃ−ｋｉｔ遺伝子の多型検出用プローブおよびその用途
KR101677952B1 (ko) 연쇄구균 감염증 원인세균인 락토코카스 가비에의 판별 및 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인세균의 판별 및 검출 방법
KR102543156B1 (ko) 높은 특이도의 표적핵산 증폭방법 및 이를 이용한 표적핵산 증폭용 조성물
KR102575618B1 (ko) 가이드 프로브 및 클램핑 프로브를 이용한 표적핵산 증폭방법 및 이를 포함하는 표적핵산 증폭용 조성물
TW201814053A (zh) 檢測黃頭病毒基因一型的遺傳標記以及使用其檢測黃頭病毒基因一型的方法
KR101677948B1 (ko) 연쇄구균 감염증 원인세균인 스트렙토코카스 이니애의 판별 및 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인세균의 판별 및 검출 방법
KR101677951B1 (ko) 연쇄구균 감염증 원인세균인 스트렙토코카스 파라우베리스의 판별 및 검출용 유전자 마커, 및 이를 이용한 원인세균의 판별 및 검출 방법
WO2011052754A1 (ja) Ｅｇｆｒ遺伝子多型検出用プローブおよびその用途
KR20190071950A (ko) 노인성 난청 관련 유전형 판별용 pna 프로브 및 이를 이용한 노인성난청 관련 유전형 판별방법