JP2013518559A - 核酸増幅を用いる環状プライマー及びその応用 - Google Patents
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- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Abstract
特異性能が高く、プライマー二量体に構成しなく、設計が簡単で、遺伝子の表現量とSNPと稀突然変異との測定に合せるプライマーを作る。
【解決手段】
プライマーに一本のオリゴヌクレオチドを有し、その5’末端と3’末端に別々3個から20個までの塩基が存在され、適当な条件下で二本の鎖が互いに結合されて、プライマーが一個の環状構造に構築され、プライマーがターゲットシーケンスに識別されて且つ交雑される場合、二本の鎖が開けられ、環状構造を消して、ターゲットシーケンスの無存在場合、プライマーを焼戻すと、環状構造に自行的に構築される。プライマーの内部には通用のラベルシーケンスを持つか持てないかのもできる。通用のラベルシーケンスを持つプライマーが通用のラベルシーケンスのプライマーと一緒に二回目の増幅を行って、信号を拡大することができる核酸増幅を用いる環状プライマー及びその応用を提供する。
【選択図】図1a
Description
本発明の環状プライマーには二種類のプライマーの設計を有して、それぞれ、異なるニーズに対して、一種類が単な増幅環状プライマーに設計され、普通の遺伝子増幅に応用され、プライマー二量体が排除されて、もう一種類が二重増幅環状プライマーに設計され、まれな突然変異を高特異的に検出するのに応用される。
ターゲットシーケンスと組み合わせる結合区のTm値において、プライマー中にターゲットシーケンスと特異的に結合される区域のTm値が普通プライマーのTm値を保持して、ターゲットシーケンスのGC含有量に基づいて決められ、一般的にTm値が約55℃から65℃までに設定される。増幅時の焼戻し温度がプライマーのTm値と一致するか、あるいはプライマーのTm値よりも3℃から5℃までに低くすることもできる。
簡単な設計において、環状プライマーを設ける際にたいしてあまり要求せず、プライマーの3’端シーケンスがターゲットシーケンス増幅の一部分に設けられ、5’端に位置する幾つかの塩基がプライマーの3’端シーケンスと相補され、ラベルシーケンスがプライマーの内部に追加されるか追加されないかを決定でき、突然変異識別塩基が3’末端の第一個の塩基にもプライマー内部に位置され、ただ、プライマー二本鎖結合区のTm値が相応のPCR反応システム中に使う焼戻し温度と一致保持される、または抜きんでられるのみである。PCRプライマーを設計した人には誰でも設けられる。
遺伝子GGT>TGTに突然変異される方法は以下のステップを含む。
12 突然変異識別区
13 ラベルシーケンス
14 相補シーケンス
15 ターゲットシーケンス識別区
16 相補シーケンス
21 ターゲットシーケンス
22 ターゲットシーケンス
23 シーケンス
24 シーケンス
25 まれな突然変異シーケンス
26 まれな突然変異を持つシーケンス
27 突然変異を持つシーケンス
31 ターゲットシーケンス
32 識別区突然変異識別区
33 相補識別区
34 ターゲットシーケンス識別区
35 相補識別区
41 突然変異を持つターゲットシーケンス
42 ターゲットシーケンス
43 産物
44 産物
45 目標産物
Claims (19)
- プライマーに一本のオリゴヌクレオチドを有すことにおいて、当オリゴヌクレオチドの3’末端にターゲットシーケンスと相補するターゲットシーケンス識別区が設けられて、5’末端にターゲットシーケンス識別区と相補する3個から20個までの塩基が設けられて、適当な条件下で、5’末端と3’末端が互いに二本の鎖に結合され、プライマーが一個の環状構造に構築されて、プライマーがターゲットシーケンスと識別されて且つ交雑される場合、二本の鎖が開けられ、環状構造を消し、プライマーが自身の二本の鎖からターゲットシーケンスと結合する二本の鎖まで変わってDNAの延伸能力を得ることによって形成されていることを特徴とする核酸増幅を用いる環状プライマー。
- 前記環状プライマーにはさらに一個の突然変異識別区を有すことによって形成されていることを特徴とする請求項1に記載の核酸増幅を用いる環状プライマー。
- 前記突然変異識別区がターゲットシーケンス識別区の3’末端或いはターゲットシーケンス識別区の内部に位置されることによって形成されていることを特徴とする請求項2に記載の核酸増幅を用いる環状プライマー。
- 前記プライマーシーケンスのなかには、少なくとも一個の非自然のヌクレオシドを有すことによって形成されていることを特徴とする請求項1に記載の核酸増幅を用いる環状プライマー。
- 上流プライマーFと下流プライマーRが用いられることにおいて、その中に少なくとも一本のプライマーが環状プライマーに設けられ、当環状プライマーの3’末端がターゲットシーケンスと相補するターゲットシーケンス識別区に設けられ、5’末端がターゲットシーケンス識別区と相補する3個から20個までの塩基に設けられて、適当な条件下で、5’末端と3’末端が互いに二本の鎖に結合され、プライマーが一個の環状構造に構築されて、プライマーがターゲットシーケンスと識別されて且つ交雑される場合、二本の鎖が開けられ、環状構造を消し、プライマーが自身の二本の鎖からターゲットシーケンスと結合する二本の鎖まで変わってDNAの延伸能力を得ることによって形成されていることを特徴とする核酸が増幅させる方法。
- 前記環状プライマーにはさらに一個の突然変異識別区を有すことによって形成されていることを特徴とする請求項5に記載の核酸が増幅させる方法。
- 前記突然変異識別区がターゲットシーケンス識別区の3’末端或いはターゲットシーケンス識別区の内部に位置されることによって形成されていることを特徴とする請求項6に記載の核酸が増幅させる方法。
- 前記プライマーシーケンスのなかに、少なくとも一個の非自然のヌクレオシドを有すことによって形成されていることを特徴とする請求項5に記載の核酸が増幅させる方法。
- プライマーに一本のオリゴヌクレオチドを有すことにおいて、当オリゴヌクレオチドの3’末端がターゲットシーケンスと相補するターゲットシーケンス識別区に設けられて、5’末端がターゲットシーケンス識別区と相補する3個から20個までの塩基に設けられて、適当な条件下で、5’末端と3’末端が互いに二本の鎖に結合され、プライマーが一個の環状構造に構築されて、そして、プライマーの内部に一個の通用のラベルシーケンスが持てて、適当な条件下で、プライマーの3’末端が二本の鎖に形成され、プライマーの内部に環状構造が構築されて、プライマーがターゲットシーケンスと識別されて且つ交雑される場合、二本の鎖が開けられ、環状構造を消し、プライマーが自身の二本の鎖からターゲットシーケンスと結合する二本の鎖まで変わってDNAの延伸能力を得ることによって形成されていることを特徴とする核酸増幅を用いる環状プライマー。
- 前記環状プライマーにはさらに一個の突然変異識別区を有すことによって形成されていることを特徴とする請求項9に記載の核酸増幅を用いる環状プライマー。
- 前記突然変異識別区がターゲットシーケンス識別区の3’末端或いはターゲットシーケンス識別区の内部に位置されることによって形成されていることを特徴とする請求項10に記載の核酸増幅を用いる環状プライマー。
- 前記プライマーシーケンスのなかには、少なくとも一個の非自然のヌクレオシドを有すことによって形成されていることを特徴とする請求項9に記載の核酸増幅を用いる環状プライマー。
- プライマーの総長さが35bpから80bpまでに設けられて、ターゲットシーケンス結合区が16bpから40bpまでに設けられて、通用のラベルシーケンスが16bpから30bpまでに設けられることによって形成されていることを特徴とする請求項9に記載の核酸増幅を用いる環状プライマー。
- システムに三本のプライマーを有し、それぞれ、上流プライマーFと下流プライマーRと通用プライマーTとに分かれて、そのなかに、上流プライマーFと下流プライマーRに少なくとも一本の環状プライマーを有し、当環状プライマーの3’末端がターゲットシーケンスと相補するターゲットシーケンス識別区に設けられて、5’末端がターゲットシーケンス識別区と相補する3個から20個までの塩基に設けられて、適当な条件下で、5’末端と3’末端が互いに二本の鎖に結合され、プライマーが一個の環状構造に構築されて、上流プライマーFと下流プライマーRの内部に別々同じな通用プライマーが各一個持てて、適当な条件下で、環状プライマーの3’末端が自身に相補して二本の鎖に形成され、プライマーの内部に環状構造が構築され、プライマーがターゲットシーケンスと識別されて且つ交雑されると、二本の鎖が開けられ、環状構造を消し、プライマーが自身の二本の鎖からターゲットシーケンスと結合する二本の鎖までに変わってDNAの延伸能力を得て、通用プライマーTのシーケンスが上流プライマーFと下流プライマーRとのラベルシーケンスに完全に合わされることによって形成されていることを特徴とする環状プライマーで増幅させる方法。
- 前記環状プライマーにはさらに一個の突然変異識別区を有することによって形成されていることを特徴とする請求項14に記載の環状プライマーで増幅させる方法。
- 前記突然変異識別区がターゲットシーケンス識別区の3’末端或いはターゲットシーケンス識別区の内部に位置されることによって形成されていることを特徴とする請求項15に記載の環状プライマーで増幅させる方法。
- 環状プライマーの総長さが35bpから80bpまでに設けられて、ターゲットシーケンス結合区が16bpから40bpまでに設けられて、通用のラベルシーケンスが16bpから30bpまでに設けられることによって形成されていることを特徴とする請求項14に記載の環状プライマーで増幅させる方法。
- ラベルシーケンスTの追加量がプライマーFとプライマーRとの総追加量の10倍以上に設けられることによって形成されていることを特徴とする請求項14に記載の環状プライマーで増幅させる方法。
- 増幅に以下のステップ:
予め変性に設けられる第一のステップ;変性とプライマー焼き戻しとプライマー延伸循環の第一部分のPCR増幅に設けられる第二のステップ;変性とプライマー焼き戻しとプライマー延伸循環の第二部分のPCR増幅に設けられる第三のステップ;を有し、
第二ステップの増幅の焼き戻し温度が60℃から66℃までに設定され、第三ステップの増幅の焼き戻し温度が54℃から58℃までに設定されることによって形成されていることを特徴とする請求項14に記載の環状プライマーで増幅させる方法。
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