JP7461624B2 - Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法及びキット - Google Patents
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Description
本発明は、Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法及びキットに関する。
現在、世界１８０か国以上でＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対してＢ型肝炎ワクチン（ＨＢワクチン）接種が行われている。ＨＢＶには複数の遺伝子型（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ）が存在しており、本邦ではＧｅｎｏｔｙｐｅ Ｃ（ＨＢＶ／Ｃ）が最も多い。そのため、ＨＢＶ／Ｃに対応する組換え沈降ＨＢワクチン（酵母由来）であるビームゲン（登録商標）（以下、「登録商標」との記載を省略する）が使用されている。しかしながら、ビームゲン接種者のうち、約１０％はその中和抗体であるＨＢｓ抗体を獲得できないという問題があるが、その原因は未だ不明である。
発明者らは、日本人成人に対するビームゲン接種におけるワクチン低反応（ＨＢｓ抗体価が１０ｍＩＵ／ｍＬ以下）には、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子であるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４：０６－ＤＱＢ１＊０３：０１の２つのハロタイプが強く寄与することを明らかにしている。一方でビームゲン応答性（ＨＢｓ抗体価が１０ｍＩＵ／ｍＬ超）には、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子であるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３－ＤＱＢ１＊０６：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１－ＤＱＢ１＊０６：０２の２つのハロタイプ、並びに、ＢＴＮＬ２遺伝子が強く寄与することを明らかにしている（例えば、非特許文献１参照）。
Nishida N et al., "Key HLA-DRB1-DQB1 Haplotypes and Role of the BTNL2 Gene for Response to a Hepatitis B Vaccine.", Hepatology, Vol. 68, No. 3, pp. 848-858, 2018.
しかしながら、ＨＢワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因については未だ不明な点が多く、その検出方法は確立されていない。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、新規のＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法及びキットを提供する。
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１） Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法であって、被験者由来のＤＮＡ含有試料中のＣＥＬＦ２遺伝子座における１以上の一塩基多型を検出することを含む、方法。
（２） 前記一塩基多型が、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１０９０５８２２、ｒｓ７９２１１０３、ｒｓ１１２５６８４０、ｒｓ１０７５２２０６、ｒｓ７０８３７５６、ｒｓ７９０４９６１、ｒｓ３９７７１２６９５、ｒｓ９６３３７７６及びｒｓ１１５９５３６６からなる群より選択される少なくとも１種である、（１）に記載の方法。
（３） 前記一塩基多型が、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１１２５６８４０である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４） 前記被験者由来のＤＮＡ含有試料中のＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプを検出することを更に含む、（１）～（３）のいずれか一つに記載の方法。
（５） 前記被験者由来のＤＮＡ含有試料中のＢＴＮＬ２遺伝子座における一塩基多型を検出することを更に含む、（１）～（４）のいずれか一つに記載の方法。
（６） 前記被験者由来のＤＮＡ含有試料中のＩＬ１ＲＬ１遺伝子座、ＳＴＯＸ２遺伝子座、ＭＣＰＨ１遺伝子座、ＯＸＡ１Ｌ遺伝子座及びＢＣＬ１１Ｂ遺伝子座からなる群より選ばれる少なくとも１種以上の遺伝子座における一塩基多型を検出することを更に含む、（１）～（５）のいずれか一つに記載の方法。
（１） Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法であって、被験者由来のＤＮＡ含有試料中のＣＥＬＦ２遺伝子座における１以上の一塩基多型を検出することを含む、方法。
（２） 前記一塩基多型が、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１０９０５８２２、ｒｓ７９２１１０３、ｒｓ１１２５６８４０、ｒｓ１０７５２２０６、ｒｓ７０８３７５６、ｒｓ７９０４９６１、ｒｓ３９７７１２６９５、ｒｓ９６３３７７６及びｒｓ１１５９５３６６からなる群より選択される少なくとも１種である、（１）に記載の方法。
（３） 前記一塩基多型が、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１１２５６８４０である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４） 前記被験者由来のＤＮＡ含有試料中のＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプを検出することを更に含む、（１）～（３）のいずれか一つに記載の方法。
（５） 前記被験者由来のＤＮＡ含有試料中のＢＴＮＬ２遺伝子座における一塩基多型を検出することを更に含む、（１）～（４）のいずれか一つに記載の方法。
（６） 前記被験者由来のＤＮＡ含有試料中のＩＬ１ＲＬ１遺伝子座、ＳＴＯＸ２遺伝子座、ＭＣＰＨ１遺伝子座、ＯＸＡ１Ｌ遺伝子座及びＢＣＬ１１Ｂ遺伝子座からなる群より選ばれる少なくとも１種以上の遺伝子座における一塩基多型を検出することを更に含む、（１）～（５）のいずれか一つに記載の方法。
（７） Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出するキットであって、
ＣＥＬＦ２遺伝子座における１以上の一塩基多型を検出する１以上の核酸プローブ又はプライマーを含む、キット。
（８） 前記一塩基多型が、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１０９０５８２２、ｒｓ７９２１１０３、ｒｓ１１２５６８４０、ｒｓ１０７５２２０６、ｒｓ７０８３７５６、ｒｓ７９０４９６１、ｒｓ３９７７１２６９５、ｒｓ９６３３７７６及びｒｓ１１５９５３６６からなる群より選択される少なくとも１種である、（７）に記載のキット。
（９） 前記被験者由来のＤＮＡ含有試料中のＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプを検出する１以上の核酸プローブ又はプライマーを含む、（７）又は（８）に記載のキット。
（１０） ＢＴＮＬ２遺伝子座における一塩基多型を検出する１以上の核酸プローブ又はプライマーを更に含む、（７）～（９）のいずれか一つに記載のキット。
（１１） ＩＬ１ＲＬ１遺伝子座、ＳＴＯＸ２遺伝子座、ＭＣＰＨ１遺伝子座、ＯＸＡ１Ｌ遺伝子座及びＢＣＬ１１Ｂ遺伝子座からなる群より選ばれる少なくとも１種以上の遺伝子座における一塩基多型を検出する１以上の核酸プローブ又はプライマーを更に含む、（７）～（１０）のいずれか一つに記載のキット。
ＣＥＬＦ２遺伝子座における１以上の一塩基多型を検出する１以上の核酸プローブ又はプライマーを含む、キット。
（８） 前記一塩基多型が、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１０９０５８２２、ｒｓ７９２１１０３、ｒｓ１１２５６８４０、ｒｓ１０７５２２０６、ｒｓ７０８３７５６、ｒｓ７９０４９６１、ｒｓ３９７７１２６９５、ｒｓ９６３３７７６及びｒｓ１１５９５３６６からなる群より選択される少なくとも１種である、（７）に記載のキット。
（９） 前記被験者由来のＤＮＡ含有試料中のＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプを検出する１以上の核酸プローブ又はプライマーを含む、（７）又は（８）に記載のキット。
（１０） ＢＴＮＬ２遺伝子座における一塩基多型を検出する１以上の核酸プローブ又はプライマーを更に含む、（７）～（９）のいずれか一つに記載のキット。
（１１） ＩＬ１ＲＬ１遺伝子座、ＳＴＯＸ２遺伝子座、ＭＣＰＨ１遺伝子座、ＯＸＡ１Ｌ遺伝子座及びＢＣＬ１１Ｂ遺伝子座からなる群より選ばれる少なくとも１種以上の遺伝子座における一塩基多型を検出する１以上の核酸プローブ又はプライマーを更に含む、（７）～（１０）のいずれか一つに記載のキット。
上記態様の方法及びキットによれば、被験者におけるＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を簡便且つ確実に検出することができる。
本発明の一実施形態に係るＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法及びキット（以下、「本実施形態の方法」、「本実施形態のキット」とそれぞれ略記する場合がある）の詳細を以下に説明する。
＜Ｂ型肝炎ワクチン（ＨＢワクチン）＞
本明細書において、Ｂ型肝炎ワクチンは、Ｂ型肝炎ウイルスの感染や再活性化を予防するために用いられるものであり、例えば、ヘプタバックス（登録商標）－ＩＩ（以下、「登録商標」との記載を省略する）等のＧｅｎｏｔｙｐｅ Ａ（ＨＢＶ／Ａ）由来のワクチン；Ｅｎｇｅｒｉｘ－Ｂ、Ｒｅｃｏｍｂｉｖａｘ ＨＢ等のＧｅｎｏｔｙｐｅ Ａ２（ＨＢＶ／Ａ２）由来のワクチン；ビームゲン等のＧｅｎｏｔｙｐｅ Ｃ（ＨＢＶ／Ｃ）由来のワクチン等が挙げられる。
中でも、本実施形態の方法で対象となるＨＢワクチンとしては、本邦においてはＧｅｎｏｔｙｐｅ Ｃ（ＨＢＶ／Ｃ）が最も多いことから、ＨＢＶ／Ｃに対応するＨＢワクチンが好ましく、ビームゲンがより好ましい。
本明細書において、Ｂ型肝炎ワクチンは、Ｂ型肝炎ウイルスの感染や再活性化を予防するために用いられるものであり、例えば、ヘプタバックス（登録商標）－ＩＩ（以下、「登録商標」との記載を省略する）等のＧｅｎｏｔｙｐｅ Ａ（ＨＢＶ／Ａ）由来のワクチン；Ｅｎｇｅｒｉｘ－Ｂ、Ｒｅｃｏｍｂｉｖａｘ ＨＢ等のＧｅｎｏｔｙｐｅ Ａ２（ＨＢＶ／Ａ２）由来のワクチン；ビームゲン等のＧｅｎｏｔｙｐｅ Ｃ（ＨＢＶ／Ｃ）由来のワクチン等が挙げられる。
中でも、本実施形態の方法で対象となるＨＢワクチンとしては、本邦においてはＧｅｎｏｔｙｐｅ Ｃ（ＨＢＶ／Ｃ）が最も多いことから、ＨＢＶ／Ｃに対応するＨＢワクチンが好ましく、ビームゲンがより好ましい。
＜Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法＞
本実施形態の方法は、Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法であって、被験者由来のＤＮＡ含有試料中のＣＥＬＦ２遺伝子座における１以上の一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを含む。
本実施形態の方法は、Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法であって、被験者由来のＤＮＡ含有試料中のＣＥＬＦ２遺伝子座における１以上の一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを含む。
発明者らは、ビームゲンワクチンを接種した日本人成人１１９３検体及びヘプタバックス－ＩＩを接種した日本人成人５５５検体について、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を行ない、Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性に関連するＳＮＰとして、ＣＥＬＦ２（ＣＵＧＢＰ Ｅｌａｖ－ｌｉｋｅ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ２）遺伝子座におけるＳＮＰを同定した。ＣＥＬＦ２遺伝子座におけるＳＮＰとしては、例えば、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１０９０５８２２、ｒｓ７９２１１０３、ｒｓ１１２５６８４０、ｒｓ１０７５２２０６、ｒｓ７０８３７５６、ｒｓ７９０４９６１、ｒｓ３９７７１２６９５、ｒｓ９６３３７７６、ｒｓ１１５９５３６６等が挙げられる。これらＳＮＰを１種単独で検出対象としてよく、２種以上組み合わせて検出対象としてもよい。中でも、ＣＥＬＦ２遺伝子座におけるＳＮＰとしては、後述する実施例に示すように、Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性への関連性が特に高かったことから、ｒｓ１１２５６８４０が好ましい。
本実施形態の方法によれば、被験者におけるＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を簡便且つ確実に検出することができる。
被験者由来のＤＮＡ含有試料としては、被験者の生体から採取されたものであれば特別な限定はないが、例えば、血液、血清、血漿、尿、パフィーコート、唾液、精液、胸部滲出液、脳脊髄液、涙液、痰、粘液、リンパ液、腹水、胸水、羊水、膀胱洗浄液、気管支肺胞洗浄液、毛髪、便、生体から直接採取された細胞又は組織等が挙げられ、これらに限定されない。これら試料からＤＮＡを抽出して、後述する検出に用いられる試料とすることが好ましい。
ＤＮＡの抽出方法としては、特別な限定はなく、公知の方法を用いて抽出することができる。例えば、フェノール／クロロホルム法、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）法等が挙げられる。ＤＮＡの抽出には、市販のキットを用いてもよい。当該キットとしては、例えば、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）等が挙げられる。
また、ＤＮＡは、ｍＲＮＡを抽出し、当該ｍＲＮＡを鋳型として合成されたｃＤＮＡであってもよい。ｍＲＮＡの抽出方法としては、特別な限定はなく、公知の方法を用いて抽出することができる。例えば、グアニジンイソチオシアネート法等が挙げられる。ｍＲＮＡの抽出には、市販のキットを用いてもよい。当該キットとしては、例えば、ＮｕｃｌｅｏＴｒａｐ（登録商標） ｍＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）等が挙げられる。ｃＤＮＡの合成方法についても、特別な限定はなく、公知の方法を用いて合成することができる。例えば、ランダムプライマー又はポリＴプライマーを用いて、ＲＮＡから逆転写酵素－ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によりｃＤＮＡを合成することができる。
ＣＥＬＦ２遺伝子座における１以上の上記ＳＮＰの検出は、公知のＳＮＰ検出法を用いて検出することができる。例えば、直接配列決定法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）法、ハイブリダイゼーション法、ＴａｑＭａｎ（登録商標） ＰＣＲ法（以下、「登録商標」との記載を省略する）、質量分析法等を用いる方法が挙げられる。
直接配列決定法は、上記被験者由来のＤＮＡ含有試料中の検出対象であるＣＥＬＦ２遺伝子座における１以上の上記ＳＮＰを含む領域を、ベクターにクローニングするか又はＰＣＲで増幅し、当該領域の塩基配列を決定することにより行う。クローニングの方法としては、適切なプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングすることにより、クローニングすることができる。また、適切なプライマーを用いてＰＣＲ反応により増幅し、適切なベクターに連結することによりクローニングすることができる。さらに、別のベクターにサブクローニングすることもできるが、これらに限定されない。ベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅ－Ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）、ｐＧＥＭ－Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）、ｐＡｍｐ（Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ製）、ｐ－Ｄｉｒｅｃｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）、ｐＣＲ２．１－ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ製）等の市販のプラスミドベクター、ウイルスベクター、人口染色体ベクターやコスミドベクターを用いることができる。塩基配列の決定としては、公知の方法を用いることができ、例えば、放射性マーカーヌクレオチドを使用する手動式配列決定法や、ダイターミネーターを使用する自動配列決定法が挙げられるが、これらに限定されない。このようにして得られた塩基配列に基づき、検体がＣＥＬＦ２遺伝子座における上記ＳＮＰを有するか否かを決定する。
ＰＣＲ法は、ＣＥＬＦ２遺伝子座における１以上の上記ＳＮＰを有する配列にのみハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー（以下、「ＣＥＬＦ２遺伝子座のＳＮＰ検出用プライマー」と称する場合がある）を用いて行う。上述のとおりＣＥＬＦ２遺伝子座には複数のＳＮＰが存在することから、ＣＥＬＦ２遺伝子座のＳＮＰ検出用プライマーは、全てのＳＮＰを検出し得るプライマーを１種単独で用いてもよく、各ＳＮＰを検出し得るプライマーを２種以上組み合わせて用いてもよい。このプライマーを使用して検体のＤＮＡを増幅する。ＣＥＬＦ２遺伝子座のＳＮＰ検出用プライマーがＰＣＲ産物を生成した場合には、検体はＣＥＬＦ２遺伝子座における１以上の上記ＳＮＰを有することになる。ＰＣＲ産物が生成されなかった場合には、検体にはＣＥＬＦ２遺伝子座における上記ＳＮＰがないことが示される。
ＲＦＬＰ法は、まず、検出対象のＣＥＬＦ２遺伝子座における１以上の上記ＳＮＰを含む領域をＰＣＲで増幅する。続いてこのＰＣＲ産物を、ＣＥＬＦ２遺伝子座における１以上の上記ＳＮＰを含む領域に適する制限酵素で切断する。制限酵素により消化されたＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイド染色で可視化する。当該断片長を、分子量マーカー、並びに、対照として、制限酵素処理していない上記ＰＣＲ産物等と比較して、検体におけるＣＥＬＦ２遺伝子座における１以上の上記ＳＮＰの存在を検出することができる。
ハイブリダイゼーション法は、検体由来のＤＮＡが、それに対し相補的なＤＮＡ分子（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ）とハイブリダイズする性質に基づき、検体におけるＣＥＬＦ２遺伝子座における１以上の上記ＳＮＰの有無を決定する方法である。コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション等のハイブリダイゼーション及び検出のための種々の技術を利用してこのハイブリダイゼーション法を行うことができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（２００１）；特にＳｅｃｔｉｏｎ６－７）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）；特にＳｅｃｔｉｏｎ６．３－６．４)、「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ２ｎｄ ｅｄ．」（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）；ハイブリダイゼーション条件については特にＳｅｃｔｉｏｎ２．１０）等を参照することができる。さらに、ハイブリダイゼーションはＤＮＡチップを利用して検出することもできる。当該方法としては、ＣＥＬＦ２遺伝子座における上記ＳＮＰに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを設計し、それを固相支持体に貼りつけたものを用いる。そして、検体由来のＤＮＡサンプルを当該ＤＮＡチップと接触させて、ハイブリダイゼーションを検出する。
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法は、ＣＥＬＦ２遺伝子座における上記ＳＮＰに特異的なＴａｑＭａｎプローブとＴａｑポリメラーゼを用い、ＳＮＰの検出とＳＮＰを含む領域の増幅とを同時並行で行う方法である。ＴａｑＭａｎプローブは、５’末端が蛍光物質、３’末端がクエンチャーで標識されている約２０塩基前後のオリゴヌクレオチドであり、目的のＳＮＰ部位にハイブリダイズするよう設計されている。Ｔａｑポリメラーゼは５’→３’ヌクレアーゼ活性がある。これらのＴａｑＭａｎプローブ及びＴａｑポリメラーゼ存在下で目的のＳＮＰ部位を含む領域を増幅するよう設計されたＰＣＲプライマーを用いて該ＳＮＰ部位を含む領域を増幅すると、増幅と並行して、ＴａｑＭａｎプローブが鋳型ＤＮＡの目的のＳＮＰ部位にハイブリダイズする。フォワードプライマー側からの伸長反応が、鋳型にハイブリダイズした、ＴａｑＭａｎプローブに到達すると、Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により、ＴａｑＭａｎプローブの５’末端に結合していた蛍光物質が切断される。その結果、遊離した蛍光物質はクエンチャーの影響を受けなくなり、蛍光を発生する。蛍光強度の測定により、ＳＮＰ検出が可能となる。
質量分析法を用いた方法としては、例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法を応用したＳＮＰタイピング方法として、プライマー伸長法と組み合わせた方法もあげられる。この方法はハイスループットな解析が可能であり、１）ＰＣＲ、２）ＰＣＲ産物の精製、３）プライマー伸長反応、４）伸長産物の精製、５）質量分析、６）ジェノタイプ決定、のステップにより解析する。まずＰＣＲによって、目的とするＳＮＰ部位を含む領域をゲノムＤＮＡから増幅する。ＰＣＲプライマーは、ＳＮＰ部位塩基と重複しないように設計する。そして、エキソヌクレアーゼとエビのアルカリホスファターゼを用いて酵素的除去方法により精製するかエタノール沈殿法を用いて精製する。次に、３’末端がＳＮＰ部位に直接隣接するように設計したジェノタイピングプライマーを用いて、プライマー伸長反応を行う。ＰＣＲ産物を高温で変性し、過剰のジェノタイピングプライマーを加えて、アニールさせる。ｄｄＮＴＰとＤＮＡポリメラーゼを反応系に添加し、サーマルサイクル反応させると、ジェノタイピングプライマーよりも１塩基長いオリゴマーが生じる。この伸長反応で生じる１塩基長いオリゴマーは、ジェノタイピングプライマーの上記設計により、アリルに応じて異なる。精製した伸長反応産物について質量分析を行い、マススペクトルから解析する。
その他の検出方法としては、ハイスループットが可能なＳＮＰタイピング法として、１分子蛍光分析法を応用した方法等が挙げられる。例えば、ＭＦ２０／１０Ｓ（オリンパス製）は、当該方法を採用したシステムである。具体的には、共焦点レーザー光学系と高感度光検出器を用いて、約１フェムトリットル（１０００兆分の１リットル）の超微小領域中で、相補的及び非相補的なプライマーを用いたＰＣＲ法によって増幅した蛍光ラベルプライマーの１分子レベルの並進拡散時間を計測及び解析するものである。
また、ＤＮＡチップによる方法も、ハイスループットが可能なタイピングの１つである。ＤＮＡチップは、基板上に多種類のＤＮＡプローブを整列して固定したもので、標識したＤＮＡ試料をチップ上でハイブリダイゼーションし、プローブによる蛍光シグナルを検出する。
ＰＣＲ法以外の遺伝子増幅法を利用したＳＮＰタイピング方法の例として、Ｓｎｉｐｐｅｒ法が挙げられる。当該方法は、環状一本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼがその上を移動しながら相補鎖ＤＮＡを合成するＤＮＡ増幅方法であるＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を応用したＳＮＰタイピング法である。プローブは８０塩基長以上９０塩基長以下のオリゴＤＮＡで、標的ＳＮＰ部位の５’末端及び３’末端近傍のそれぞれに相補的な１０塩基長２０塩基長以下の配列を両末端に含んでおり、標的ＤＮＡにアニールして環状になるように設計されている。また、プローブの３’末端が標的ＳＮＰ部位に相補的配列となるよう設計されている。プローブの３’末端が標的ＳＮＰ部位と完全に相補的であれば、プローブは環状化されるが、プローブの３’末端がミスマッチであるとプローブは環状化されない。またプローブには、４０塩基長以上５０塩基長以下のバックボーン配列があり、２種類のＲＣＡ増幅プライマーと相補的な配列が含まれる。
ＰＣＲ法以外の遺伝子増幅法を利用したＳＮＰタイピング方法の他の例としては、例えば、ＵＣＡＮ法やＬＡＭＰ法を利用したタイピング方法が挙げられる。
ＵＣＡＮ法は、タカラバイオが開発した遺伝子等温増幅法であるＩＣＡＮ法を応用した方法である。ＵＣＡＮ法では、プライマー前駆体としてＤＮＡ－ＲＮＡ－ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド（ＤＲＤ）を用いる。このＤＲＤプライマー前駆体は、ＤＮＡポリメラーゼによる鋳型ＤＮＡの複製が起こらないように、３’末端のＤＮＡが修飾されており、ＳＮＰサイトにＲＮＡ部分が結合するように設計されている。このＤＲＤプライマー前駆体を鋳型とインキュベートすると、ＤＲＤプライマーと鋳型が完全にマッチしている場合のみ、共存するＲＮａｓｅ Ｈが対合したＤＲＤプライマーのＲＮＡ部分を切断する。これにより、プライマー３’末端は修飾ＤＮＡが外れて新しくなるため、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進み、鋳型ＤＮＡが増幅される。一方、ＤＲＤプライマーと鋳型ＤＮＡがマッチしない場合、ＲＮａｓｅ ＨはＤＲＤプライマーを切断せず、ＤＮＡ増幅も起こらない。パーフェクトマッチしたＤＲＤプライマー前駆体がＲＮａｓｅ Ｈによって切断された後の増幅反応は、ＩＣＡＮ反応メカニズムによって進行する。
ＬＡＭＰ法は、栄研化学によって開発された遺伝子等温増幅法で、標的遺伝子の６箇所の領域（３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、５’末端側からＢ３、Ｂ２、Ｂ１）を規定し、当該６領域に対する４種類のプライマー（ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマー）を用いて増幅する。タイピングを目的とする場合は、Ｆ１－Ｂ１間は標的ＳＮＰ部位（１塩基）のみでよく、ＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマーを、その５’末端にＳＮＰの１塩基がくるように設計する。ＳＮＰがない場合、ＬＡＭＰ法の起点構造であるダンベル構造からＤＮＡの合成反応が起こり、増幅反応が連続的に進行する。ＳＮＰがある場合は、ダンベル構造からのＤＮＡ合成反応が起こらず、増幅反応は進行しない。
インベーダー（Ｉｎｖａｄｅｒ）法は、核酸増幅法を用いず、２種類の非蛍光標識プローブ（アレルプローブ、インベーダープローブ） と１種類の蛍光標識プローブ（ＦＲＥＴプローブ）及びエンドヌクレアーゼであるＣｌｅａｖａｓｅを用いる方法である。アレルプローブは、鋳型ＤＮＡに対しＳＮＰ部位から３’末端側に相補的な配列があり、プローブの５’末端側にフラップという鋳型ＤＮＡと無関係な配列がある。インベーダープローブは、鋳型ＤＮＡのＳＮＰ部位から５’末端側に相補的な配列があり、ＳＮＰ部位に相当する部分の塩基は任意の塩基がある。ＦＲＥＴプローブは、３’末端側にフラップ配列に相補的な配列がある。一方の５’末端側は蛍光色素及びクエンチャーで標識されているが、ＦＲＥＴプローブは分子内で２本鎖を形成するよう設計されており、通常は消光されている。これらを鋳型ＤＮＡと反応させると、アレルプローブが鋳型ＤＮＡと２本鎖を形成したときに、ＳＮＰ部位にインベーダープローブの３’末端（任意塩基部分）が侵入する。Ｃｌｅａｖａｓｅは、当該塩基が侵入した構造を認識して、アレルプローブのフラップ部分を切断する。次に、この遊離したフラップがＦＲＥＴプローブの相補配列と結合すると、フラップの３’末端がＦＲＥＴプローブの分子内二本鎖部分に侵入する。Ｃｌｅａｖａｓｅは、上記アレルプローブとインベーダープローブの場合と同様に、このＦＲＥＴプローブにフラップの塩基が侵入した構造を認識し、ＦＲＥＴプローブの蛍光色素を切断する。蛍光色素はクエンチャーから離れるため、蛍光が発生する。アレルプローブが鋳型ＤＮＡとマッチしない場合は、Ｃｌｅａｖａｓｅが認識する、上記特異的な構造が形成されないため、フラップは切断されない。
ＳＮＰの検出にプライマーを用いる場合は、増幅する領域及びタイピング方法に即したプライマーとなるように設計する。例えば、上記領域を完全に増幅できることが好ましく、上記領域の両端付近の配列に基づいて配列を設計できる。プライマーの設計手法は当技術分野で周知であり、本実施形態の方法において使用可能なプライマーは、特異的なアニーリングが可能な条件を満たす、例えば特異的なアニーリングが可能な長さ及び塩基組成（融解温度）を有するように設計される。増幅する領域の長さは、タイピングに支障がない限り制限はないし、検出方法により適宜増減してよい。また、増幅される領域の一部にはＳＮＰ部位が含まれるが、増幅される領域内における当該部位の位置に制限はなく、検出方法（タイピング方法）にしたがって適切な位置に配置してよい。そのためプライマーの設計にあたり、プライマーとＳＮＰ部位との位置関係は、検出方法にあわせて自由に設計でき、検出しようとするＳＮＰを含む領域（例えば、連続した５０塩基長以上５００塩基長以下）にハイブリダイズする限り、タイピング方法の特性を考慮しながら、プライマーを設計できる。プライマーとしての機能を発揮する長さとしては、１０塩基以上１００塩基以下が好ましく、１５塩基以上５０塩基以下がより好ましく、１５塩基以上３０塩基以下がさらに好ましい。また設計の際には、任意の核酸鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度であるプライマーの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。鋳型となるＤＮＡとプライマーとが二本鎖を形成してアニーリングするためには、アニーリングの温度を最適化する必要があるが、その一方で、この温度をより低すぎると非特異的な反応がおこるため、好ましくないからである。Ｔｍの確認には、公知のプライマー設計用ソフトウェアを利用することができる。
ＳＮＰの検出にプローブを用いる場合は、プローブがＳＮＰ部位を認識するように設計する。プローブ設計において、ＳＮＰ部位は、タイピング方法にあわせて、プローブ内のいずれかの場所で認識されればよく、タイピング方法によっては、プローブの末端で認識されてもよい。ＳＮＰ検出用ポリヌクレオチドをプローブとする場合、ゲノムＤＮＡに相補的な塩基配列の長さは、通常１５塩基以上２００塩基以下であり、１５塩基以上１００塩基以下が好ましく、１５塩基以上５０塩基以下がより好ましいが、タイピング方法によってはこれより長くても短くてもよい。
本実施形態の方法において、検体中にＣＥＬＦ２遺伝子座の１以上の上記ＳＮＰが検出された場合に、当該検体がＨＢワクチンに対する免疫応答性を有することを示す。また、当該検体がＨＢワクチンを接種した後である場合には、当該検体がＨＢｓ抗体を有する可能性があることを示す。
また、診断実用性の計算に用いて、ＨＢワクチンに対する免疫応答性の陽性率を解析することもできる。ここでいう陽性率とは、検体全体のうち、ＣＥＬＦ２遺伝子座の１以上の上記ＳＮＰがある検体の割合を意味する。例えば、本明細書の実施例に記載した日本人成人１１９３人については、ＣＥＬＦ２遺伝子座の１以上の上記ＳＮＰを有する検体は６６７人であり、ＣＥＬＦ２遺伝子座の１以上の上記ＳＮＰを有さない検体は５２６人であり、陽性率は５５．９％となる。
ＨＢワクチンに対する免疫応答性の有無は、ＨＢワクチンをこれから接種する健常者やＨＢワクチンを接種した健常者だけでなく、ＨＢＶ感染者にとっても重要な情報であり、例えば、Ｂ型肝炎の治療方法や治療薬の選定及びＢ型肝炎の予防及び発症防止に関する重要な情報となる。特に、ＨＢＶ感染者においては、免疫力が低下等することでＨＢＶが再活性化して肝炎が劇症化することを予防するために重要な情報となり得る。
なお、ＣＥＬＦ２遺伝子座の上記ＳＮＰの存在は、ホモ又はヘテロのいずれでもよい。
本実施形態の方法において、ＣＥＬＦ２遺伝子座の上記ＳＮＰの検出に加えて、他のＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の有無に関連するＳＮＰやハプロタイプを検出してもよい。後述する実施例に示すように、ＣＥＬＦ２遺伝子座の上記ＳＮＰの検出と組み合わせてこれらＳＮＰやハプロタイプを検出することで、Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の有無をより精度が高く判断することができ、診断の信頼度がより高まる。
他のＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の有無に関連するＳＮＰとしては、例えば、ＢＴＮＬ２遺伝子座におけるＳＮＰ（ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ４２４８１６６等）、ＩＬ１ＲＬ１遺伝子座におけるＳＮＰ（ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ９６４６９４４等）、ＳＴＯＸ２遺伝子材におけるＳＮＰ（ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ２８７１３８５等）、ＭＣＰＨ１遺伝子座におけるＳＮＰ（ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ２７３２９７７等）、ＯＸＡ１Ｌ遺伝子座におけるＳＮＰ（ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ３１３２９６９等）、ＢＣＬ１１Ｂ遺伝子座におけるＳＮＰ（ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１９５１１２２等）が挙げられる。これらのＳＮＰを１種単独で検出対象としてもよく、２種以上組み合わせて検出対象としてもよい。検体中にこれらのＳＮＰが検出された場合に、当該検体がＨＢワクチンに対する免疫応答性を有すると判定することができる。
Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の有無に関連するハプロタイプとしては、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ遺伝子のハプロタイプ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３－ＤＱＢ１＊０６：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４：０６－ＤＱＢ１＊０３：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１－ＤＱＢ１＊０６：０２、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１－ＤＱＢ１＊０５：０１等）等が挙げられる。これらのハプロタイプを１種単独で検出対象としてもよく、２種以上組み合わせて検出対象としてもよい。検体中にＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３－ＤＱＢ１＊０６：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１－ＤＱＢ１＊０６：０２のうち少なくともいずれか一方のハプロタイプが検出された場合に、当該検体がＨＢワクチンに対する免疫応答性を有すると判定することができる。一方で、検体中にＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４：０６－ＤＱＢ１＊０３：０１のうち少なくともいずれか一方のハプロタイプが検出された場合に、当該検体がＨＢワクチンに対する免疫応答性を有さない、又は免疫応答性が低いと判定することができる。
また、検体中に、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３－ＤＱＢ１＊０６：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１－ＤＱＢ１＊０６：０２のうち少なくともいずれか一方のハプロタイプ、及び、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４：０６－ＤＱＢ１＊０３：０１のうち少なくともいずれか一方のハプロタイプ、の両方が検出された場合には、ワクチンへの高反応性が有意となることから、当該検体がＨＢワクチンに対する免疫応答性を有すると判定することができる。
また、検体中に、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３－ＤＱＢ１＊０６：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１－ＤＱＢ１＊０６：０２のうち少なくともいずれか一方のハプロタイプ、及び、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４：０６－ＤＱＢ１＊０３：０１のうち少なくともいずれか一方のハプロタイプ、の両方が検出された場合には、ワクチンへの高反応性が有意となることから、当該検体がＨＢワクチンに対する免疫応答性を有すると判定することができる。
これらＳＮＰやハプロタイプの検出方法としては、上述したＣＥＬＦ２遺伝子座の上記ＳＮＰの検出と同様の方法が挙げられる。
＜Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出するキット＞
本実施形態のキットは、ＣＥＬＦ２遺伝子座の１以上のＳＮＰを検出する核酸プローブ又はプライマーを含む。本実施形態のキットは、Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の有無の検査用キットとして有用である。ＣＥＬＦ２遺伝子座の１以上のＳＮＰとしては、上記「Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。また、核酸プローブ又はプライマーについては、当業者であれば、上記「Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法」において、ＣＥＬＦ２遺伝子座の１以上のＳＮＰの検出方法に記載した方法を用いて適宜作製することができる。
本実施形態のキットは、ＣＥＬＦ２遺伝子座の１以上のＳＮＰを検出する核酸プローブ又はプライマーを含む。本実施形態のキットは、Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の有無の検査用キットとして有用である。ＣＥＬＦ２遺伝子座の１以上のＳＮＰとしては、上記「Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。また、核酸プローブ又はプライマーについては、当業者であれば、上記「Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法」において、ＣＥＬＦ２遺伝子座の１以上のＳＮＰの検出方法に記載した方法を用いて適宜作製することができる。
本実施形態のキットは、上記核酸プローブ又はプライマーに加えて、ＳＮＰタイピングに通常用いられる試薬、陽性コントロール、溶媒及び溶質を更に含むことができる。当該試薬としては、例えば、デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰｓ）やＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。溶媒及び溶質としては、例えば、蒸留水、ｐＨ緩衝試薬、塩、タンパク質、界面活性剤等が挙げられる。
上記核酸プローブ又はプライマーは、ＣＥＬＦ２遺伝子座の１以上のＳＮＰとは無関係な配列が含まれていてもよい。また、上記核酸プローブ又はプライマーは、ＤＮＡとＲＮＡのキメラであってもよい。また、上記核酸プローブ又はプライマーは、蛍光物質や、ビオチン又はジゴキシンのような結合親和性物質、酵素、放射性同位元素、発光物質等で標識されていてもよい。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセインイソチオシアネート等が挙げられる。酵素としては、例えば、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸脱水酵素、α－グルコシダーゼ、α－ガラクトシダーゼ等が挙げられる。放射性同位元素としては、例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ等が挙げられる。発光物質としては、例えば、ルシフェリン、ルシゲニン、ルミノール、ルミノール誘導体等が挙げられる。
本実施形態のキットは、上記核酸プローブ又はプライマーに加えて、比較基準とするためのあるいは検量線を作成するための照合サンプル、検出器等も含んでもよい。検出器としては、例えば、分光器、放射線検出器、光散乱検出器等の上記核酸プローブ又はプライマーの標識を検出可能なものが挙げられる。
本実施形態のキットは、ＣＥＬＦ２遺伝子座の１以上のＳＮＰを検出する核酸プローブ又はプライマーに加えて、他のＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の有無に関連するＳＮＰやハプロタイプを検出する核酸プローブ又はプライマーを含むことができる。当該ＳＮＰやハプロタイプとしては、上記「Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。また、これらＳＮＰやハプロタイプを検出する核酸プローブ又はプライマーについては、当業者であれば、上記「Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法」において、ＣＥＬＦ２遺伝子座の１以上のＳＮＰの検出方法に記載した方法を用いて適宜作製することができる。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜材料及び測定方法＞
［試料及び臨床データ］
本研究でビームゲンに対する免疫応答性の遺伝的要因の検出に使用された日本人成人１１９３例のゲノムＤＮＡサンプルは、全て組換え沈降ＨＢワクチン（ビームゲン、化学及血清療法研究所製）で、０、１及び６か月に３回（０．５ｍＬ）のワクチン接種を行った健康な成人ボランティア（１８歳以上）から得られたものである。ヘプタバックス－ＩＩワクチン（ＭＳＤ ＫＫ製）の予防接種を受けた個人は上記１１９３例のゲノムＤＮＡサンプルには含まれない。
一方、本研究でヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性の遺伝的要因の検出に使用された日本人成人５５５例のゲノムＤＮＡサンプルは、全て全て組換え沈降ＨＢワクチン（ヘプタバックス－ＩＩ、ＭＳＤ ＫＫ製）で、０、１及び６か月に３回（０．５ｍＬ）のワクチン接種を行った健康な成人ボランティア（１８歳以上）から得られたものである。ビームゲンワクチン（化学及血清療法研究所製）の予防接種を受けた個人は上記５５５例のゲノムＤＮＡサンプルには含まれない。
［試料及び臨床データ］
本研究でビームゲンに対する免疫応答性の遺伝的要因の検出に使用された日本人成人１１９３例のゲノムＤＮＡサンプルは、全て組換え沈降ＨＢワクチン（ビームゲン、化学及血清療法研究所製）で、０、１及び６か月に３回（０．５ｍＬ）のワクチン接種を行った健康な成人ボランティア（１８歳以上）から得られたものである。ヘプタバックス－ＩＩワクチン（ＭＳＤ ＫＫ製）の予防接種を受けた個人は上記１１９３例のゲノムＤＮＡサンプルには含まれない。
一方、本研究でヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性の遺伝的要因の検出に使用された日本人成人５５５例のゲノムＤＮＡサンプルは、全て全て組換え沈降ＨＢワクチン（ヘプタバックス－ＩＩ、ＭＳＤ ＫＫ製）で、０、１及び６か月に３回（０．５ｍＬ）のワクチン接種を行った健康な成人ボランティア（１８歳以上）から得られたものである。ビームゲンワクチン（化学及血清療法研究所製）の予防接種を受けた個人は上記５５５例のゲノムＤＮＡサンプルには含まれない。
血清抗ＨＢＶ表面抗体（ＨＢｓＡｂ）及び血清抗ＨＢＶコア抗体（ＨＢｃＡｂ）は、それぞれ、抗ＨＢｓキット及び抗ＨＢｃ ＩＩ キットを使用し、且つ、Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ ｉ２０００ＳＲアナライザー（Ａｂｂｏｔｔ Ｊａｐａｎ製）を使用した完全自動化学発光酵素免疫測定システムで、ワクチン接種前及び最終接種の１か月後に確認した。ＨＢｃＡｂ陽性（＞１．０ Ｓ／ＣＯ）の個人は、本研究には含まれない。
本研究では、上記ビームゲンに対する免疫応答性の遺伝的要因の検出に使用された日本人成人１１９３例を４つのグループに分類した：ｇｒｏｕｐ_０、低応答者、ＨＢｓＡｂ≦１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝１０７。ｇｒｏｕｐ_１、中間応答者、１０ｍＩＵ／ｍＬ＜ＨＢｓＡｂ≦１００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝３５１。ｇｒｏｕｐ_２、高応答者、１００ｍＩＵ／ｍＬ＜ＨＢｓＡｂ≦１０００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝５７５。ｇｒｏｕｐ_３、超高応答者、１０００ｍＩＵ／ｍＬ＜ＨＢｓＡｂ、ｎ＝１６０。１１９３例の個人の臨床情報は、グループ毎に以下のＵＲＬにまとめられている。（http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/hep.29876/suppinfo）
また、上記ヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性の遺伝的要因の検出に使用された日本人成人５５５例についても同様に、４つのグループに分類した：ｇｒｏｕｐ_０、低応答者、ＨＢｓＡｂ≦１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝６６。ｇｒｏｕｐ_１、中間応答者、１０ｍＩＵ／ｍＬ＜ＨＢｓＡｂ≦１００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝１２４。ｇｒｏｕｐ_２、高応答者、１００ｍＩＵ／ｍＬ＜ＨＢｓＡｂ≦１０００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝２４５。ｇｒｏｕｐ_３、超高応答者、１０００ｍＩＵ／ｍＬ＜ＨＢｓＡｂ、ｎ＝６０。
本研究では、上記ビームゲンに対する免疫応答性の遺伝的要因の検出に使用された日本人成人１１９３例を４つのグループに分類した：ｇｒｏｕｐ_０、低応答者、ＨＢｓＡｂ≦１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝１０７。ｇｒｏｕｐ_１、中間応答者、１０ｍＩＵ／ｍＬ＜ＨＢｓＡｂ≦１００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝３５１。ｇｒｏｕｐ_２、高応答者、１００ｍＩＵ／ｍＬ＜ＨＢｓＡｂ≦１０００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝５７５。ｇｒｏｕｐ_３、超高応答者、１０００ｍＩＵ／ｍＬ＜ＨＢｓＡｂ、ｎ＝１６０。１１９３例の個人の臨床情報は、グループ毎に以下のＵＲＬにまとめられている。（http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/hep.29876/suppinfo）
また、上記ヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性の遺伝的要因の検出に使用された日本人成人５５５例についても同様に、４つのグループに分類した：ｇｒｏｕｐ_０、低応答者、ＨＢｓＡｂ≦１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝６６。ｇｒｏｕｐ_１、中間応答者、１０ｍＩＵ／ｍＬ＜ＨＢｓＡｂ≦１００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝１２４。ｇｒｏｕｐ_２、高応答者、１００ｍＩＵ／ｍＬ＜ＨＢｓＡｂ≦１０００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝２４５。ｇｒｏｕｐ_３、超高応答者、１０００ｍＩＵ／ｍＬ＜ＨＢｓＡｂ、ｎ＝６０。
［ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）］
上記ゲノムＤＮＡサンプルについて、製造元の指示に従い、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ａｘｉｏｍ Ｇｅｎｏｍｅ－Ｗｉｄｅ ＡＳＩ １ Ａｒｒａｙを使用して、ゲノムワイドＳＮＰ解析を実施した。
上記ゲノムＤＮＡサンプルについて、製造元の指示に従い、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ａｘｉｏｍ Ｇｅｎｏｍｅ－Ｗｉｄｅ ＡＳＩ １ Ａｒｒａｙを使用して、ゲノムワイドＳＮＰ解析を実施した。
［実施例１］
（ビームゲンに対する免疫応答性の遺伝的要因の検出）
上記１１９３例のゲノムＤＮＡサンプルを用いて、上記ゲノムワイドＳＮＰ解析を実施し、下記に示すＳｔａｔｕｓ－２、Ｓｔａｔｕｓ－１及びＳｔａｔｕｓ－４中の２群をそれぞれ比較するゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を行なった。具体的には、年齢及び性別を共変量として使用してゲノムワイド重回帰分析を実行した。また、下記に示すＳｔａｔｕｓ－２、Ｓｔａｔｕｓ－１及びＳｔａｔｕｓ－４の条件で、３段階のＧＷＡＳを実施した。各ＧＷＡＳの分析結果を図１～３に示す。各ＧＷＡＳにおいて、Ｐ＜０．０５となったＳＮＰを抽出後（表１参照）、オッズ比が強まった（又は弱まった）ＳＮＰを選択した。選択されたＳＮＰ数は４８６５であった。
（ビームゲンに対する免疫応答性の遺伝的要因の検出）
上記１１９３例のゲノムＤＮＡサンプルを用いて、上記ゲノムワイドＳＮＰ解析を実施し、下記に示すＳｔａｔｕｓ－２、Ｓｔａｔｕｓ－１及びＳｔａｔｕｓ－４中の２群をそれぞれ比較するゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を行なった。具体的には、年齢及び性別を共変量として使用してゲノムワイド重回帰分析を実行した。また、下記に示すＳｔａｔｕｓ－２、Ｓｔａｔｕｓ－１及びＳｔａｔｕｓ－４の条件で、３段階のＧＷＡＳを実施した。各ＧＷＡＳの分析結果を図１～３に示す。各ＧＷＡＳにおいて、Ｐ＜０．０５となったＳＮＰを抽出後（表１参照）、オッズ比が強まった（又は弱まった）ＳＮＰを選択した。選択されたＳＮＰ数は４８６５であった。
Ｓｔａｔｕｓ－２：ｇｒｏｕｐ_０（低応答者、ＨＢｓＡｂ≦１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝１０７）に対する、ｇｒｏｕｐ_１＋ｇｒｏｕｐ_２＋ｇｒｏｕｐ_３（中間応答者＋高応答者＋超高応答者、ＨＢｓＡｂ＞１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝１０８６）
Ｓｔａｔｕｓ－１：ｇｒｏｕｐ_０（低応答者、ＨＢｓＡｂ≦１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝１０７）に対する、ｇｒｏｕｐ_２＋ｇｒｏｕｐ_３（高応答者＋超高応答者、ＨＢｓＡｂ＞１００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝７３５）
Ｓｔａｔｕｓ－４：ｇｒｏｕｐ_０（低応答者、ＨＢｓＡｂ≦１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝１０７）に対する、ｇｒｏｕｐ_３（超高応答者、ＨＢｓＡｂ＞１０００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝１６０）
Ｓｔａｔｕｓ－１：ｇｒｏｕｐ_０（低応答者、ＨＢｓＡｂ≦１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝１０７）に対する、ｇｒｏｕｐ_２＋ｇｒｏｕｐ_３（高応答者＋超高応答者、ＨＢｓＡｂ＞１００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝７３５）
Ｓｔａｔｕｓ－４：ｇｒｏｕｐ_０（低応答者、ＨＢｓＡｂ≦１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝１０７）に対する、ｇｒｏｕｐ_３（超高応答者、ＨＢｓＡｂ＞１０００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝１６０）
選択された４８６５ＳＮＰｓのうち、Ｓｔａｔｕｓ－２、Ｓｔａｔｕｓ－１及びＳｔａｔｕｓ－４の順番に効果量が大きくなったＳＮＰであって、且つ、上記３段階のＧＷＡＳのいずれかでＰ＜０．００００１であったＳＮＰ数は３１５であった。そのうち、３０７個のＳＮＰはＨＬＡ領域に存在しており、ＨＬＡ領域以外に存在するＳＮＰは以下の表２に示す８個であった。中でも、ＣＥＬＦ２遺伝子座のｒｓ１１２５６８４０がトップヒットであり、Ｃｈｒ．６を除く４８６５ＳＮＰｓの中で一番低いＰ値であった。
次いで、年齢、性別及び上記８個のＳＮＰｓ（Ｍｏｄｅｌ １）、又は、年齢、性別及び上記８個のＳＮＰｓのうちＣＥＬＦ２遺伝子座の３個のＳＮＰｓを除いた５個のＳＮＰｓ（Ｍｏｄｅｌ ２）でロジスティクス回帰モデルを検討した。結果を図４（Ｍｏｄｅｌ １）及び図５（Ｍｏｄｅｌ ２）、並びに、表３に示す。表３において、「陽性的中率」はワクチン低応答者の的中率を意味する。
表３から、低応答者の検体数がｎ＝１０７と少ないことから、ＰＰＶは低く、ＮＰＶは高い結果となった。
また、図４及び図５から、ＣＥＬＦ２遺伝子座のＳＮＰｓを用いることで、ＡＵＣ＝０．８５０８と、ワクチン低応答者の予測能がより高いモデルが得られた。
また、図４及び図５から、ＣＥＬＦ２遺伝子座のＳＮＰｓを用いることで、ＡＵＣ＝０．８５０８と、ワクチン低応答者の予測能がより高いモデルが得られた。
次いで、正確なｐｐｖやｎｐｖを求めるために、３０歳以下の検体のみを用いて、年齢、性別、ＨＬＡ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４：０５－ＤＱＢ１＊０４：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０８：０３－ＤＱＢ１＊０６：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１４：０６－ＤＱＢ１＊０３：０１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０１－ＤＱＢ１＊０６：０２、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１－ＤＱＢ１＊０５：０１の５つのＤＲ－ＤＱ、及び、ＤＰＢ１＊０４：０２、ＤＰＢ１＊０５：０１の２つのＤＰ）、ＢＴＮＬ２及び上記８個のＳＮＰｓ（Ｍｏｄｅｌ ３）、又は、年齢、性別、ＨＬＡ（５つのＤＲ－ＤＱ、２つのＤＰ）、及びＢＴＮＬ２（Ｍｏｄｅｌ ４）でロジスティック回帰モデル検討した。結果を図６（Ｍｏｄｅｌ ３）及び図７（Ｍｏｄｅｌ ４）、並びに、表４に示す。表４において、「陽性的中率」はワクチン低応答者の的中率を意味する。
表４、図６及び図７から、ＣＥＬＦ２遺伝子座のＳＮＰｓを含む上記８個のＳＮＰｓを用いることで、ＡＵＣ＝０．９４８６と、ＡＵＣを０．０５４向上されることができ、ワクチン低応答者の予測能がさらに高いモデルが得られた。
次いで、ＧＴＥｘポータル（http://gtexportal.org/home/）を用いて、ＣＥＬＦ２のｍＲＮＡの発現に影響を与える可能性のあるＳＮＰを探索した。その結果、トップヒットとなったｒｓ１１２５６８４０に加えて、以下の表５に示すＳＮＰがＣＥＬＦ２遺伝子の発現に影響を与える可能性のあるＳＮＰとしてヒットした。
［実施例２］
（ヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性の遺伝的要因の検出）
上記５５５例のゲノムＤＮＡサンプルを用いて、上記ゲノムワイドＳＮＰ解析を実施し、下記に示すＳｔａｔｕｓ－２、Ｓｔａｔｕｓ－１及びＳｔａｔｕｓ－４中の２群をそれぞれ比較するゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を行なった。具体的には、年齢及び性別を共変量として使用してゲノムワイド重回帰分析を実行した。また、下記に示すＳｔａｔｕｓ－２、Ｓｔａｔｕｓ－１及びＳｔａｔｕｓ－４を条件として、３段階のＧＷＡＳを実施した。各ＧＷＡＳの分析結果を図８～１０に示す。各ＧＷＡＳにおいて、Ｐ＜０．０５となったＳＮＰを抽出後（表６参照）、オッズ比が強まった（又は弱まった）ＳＮＰを選択した。選択されたＳＮＰ数は４４８７であった。
（ヘプタバックス－ＩＩに対する免疫応答性の遺伝的要因の検出）
上記５５５例のゲノムＤＮＡサンプルを用いて、上記ゲノムワイドＳＮＰ解析を実施し、下記に示すＳｔａｔｕｓ－２、Ｓｔａｔｕｓ－１及びＳｔａｔｕｓ－４中の２群をそれぞれ比較するゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を行なった。具体的には、年齢及び性別を共変量として使用してゲノムワイド重回帰分析を実行した。また、下記に示すＳｔａｔｕｓ－２、Ｓｔａｔｕｓ－１及びＳｔａｔｕｓ－４を条件として、３段階のＧＷＡＳを実施した。各ＧＷＡＳの分析結果を図８～１０に示す。各ＧＷＡＳにおいて、Ｐ＜０．０５となったＳＮＰを抽出後（表６参照）、オッズ比が強まった（又は弱まった）ＳＮＰを選択した。選択されたＳＮＰ数は４４８７であった。
Ｓｔａｔｕｓ－２：ｇｒｏｕｐ_０（低応答者、ＨＢｓＡｂ≦１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝６６）に対する、ｇｒｏｕｐ_１＋ｇｒｏｕｐ_２＋ｇｒｏｕｐ_３（中間応答者＋高応答者＋超高応答者、ＨＢｓＡｂ＞１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝４８９）
Ｓｔａｔｕｓ－１：ｇｒｏｕｐ_０（低応答者、ＨＢｓＡｂ≦１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝１０７）に対する、ｇｒｏｕｐ_２＋ｇｒｏｕｐ_３（高応答者＋超高応答者、ＨＢｓＡｂ＞１００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝３０５）
Ｓｔａｔｕｓ－４：ｇｒｏｕｐ_０（低応答者、ＨＢｓＡｂ≦１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝１０７）に対する、ｇｒｏｕｐ_３（超高応答者、ＨＢｓＡｂ＞１０００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝６０）
Ｓｔａｔｕｓ－１：ｇｒｏｕｐ_０（低応答者、ＨＢｓＡｂ≦１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝１０７）に対する、ｇｒｏｕｐ_２＋ｇｒｏｕｐ_３（高応答者＋超高応答者、ＨＢｓＡｂ＞１００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝３０５）
Ｓｔａｔｕｓ－４：ｇｒｏｕｐ_０（低応答者、ＨＢｓＡｂ≦１０ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝１０７）に対する、ｇｒｏｕｐ_３（超高応答者、ＨＢｓＡｂ＞１０００ｍＩＵ／ｍＬ、ｎ＝６０）
選択された４４８７ＳＮＰｓのうち、Ｓｔａｔｕｓ－２、Ｓｔａｔｕｓ－１及びＳｔａｔｕｓ－４の順番に効果量が大きくなったＳＮＰであって、且つ、上記３段階のＧＷＡＳのいずれかでＰ＜０．００００１であったＳＮＰ数は１０であった。具体的には、以下の表７に示す１０個のＳＮＰｓである。そのうち、ＨＬＡ領域に存在するＳＮＰはなかった。また、表８に示すように、ＣＥＬＦ２遺伝子座に存在するＳＮＰｓについて、有意差は見られなかったが、ＣＥＬＦ２遺伝子座のｒｓ１１５９５３６６はＳｔａｔｕｓ－４においてＰ＝０．０００７８７であり、ビームゲンで検出されたｒｓ１１２５６８４０も効果量が大きくなっており、ＯＲの向きは同じであった。
本実施形態の方法及びキットによれば、被験者におけるＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を簡便且つ確実に検出することができる。
Claims (5)
- Ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｃ（ＨＢＶ／Ｃ）由来のＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出する方法であって、
被験者由来のＤＮＡ含有試料中のＣＥＬＦ２遺伝子座における１以上の一塩基多型を検出することを含み、
前記一塩基多型が、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１０９０５８２２、ｒｓ７９２１１０３及びｒｓ１１２５６８４０からなる群より選択される少なくとも１種であって、
前記試料中にＣＥＬＦ２遺伝子座の１以上の前記一塩基多型が検出された場合に、前記被験者が前記Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性を有することを示し、前記被験者が前記Ｂ型肝炎ワクチンを接種した後である場合には、前記被験者がＨＢｓ抗体を有する可能性があることを示す、方法。 - 前記一塩基多型が、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１１２５６８４０である、請求項１に記載の方法。
- 前記被験者由来のＤＮＡ含有試料中のＩＬ１ＲＬ１遺伝子座、ＳＴＯＸ２遺伝子座、ＭＣＰＨ１遺伝子座、ＯＸＡ１Ｌ遺伝子座及びＢＣＬ１１Ｂ遺伝子座からなる群より選ばれる少なくとも１種以上の遺伝子座における一塩基多型を検出することを更に含み、
前記ＩＬ１ＲＬ１遺伝子座における一塩基多型が、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ９６４６９４４であり、
前記ＳＴＯＸ２遺伝子座における一塩基多型が、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ２８７１３８５であり、
前記ＭＣＰＨ１遺伝子座における一塩基多型が、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ２７３２９７７であり、
前記ＯＸＡ１Ｌ遺伝子座における一塩基多型が、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ３１３２９６９であり、
前記ＢＣＬ１１Ｂ遺伝子座における一塩基多型が、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１９５１１２２であり、
前記試料中に前記ＩＬ１ＲＬ１遺伝子座、ＳＴＯＸ２遺伝子座、ＭＣＰＨ１遺伝子座、ＯＸＡ１Ｌ遺伝子座及びＢＣＬ１１Ｂ遺伝子座からなる群より選ばれる少なくとも１種以上の遺伝子座における一塩基多型が検出された場合に、前記被験者が前記Ｂ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性を有することを示し、前記被験者が前記Ｂ型肝炎ワクチンを接種した後である場合には、前記被験者がＨＢｓ抗体を有する可能性があることを示す、請求項１又は２に記載の方法。 - Ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｃ（ＨＢＶ／Ｃ）由来のＢ型肝炎ワクチンに対する免疫応答性の遺伝的要因を検出するキットであって、
ＣＥＬＦ２遺伝子座における１以上の一塩基多型を検出する１以上の核酸プローブ又はプライマーを含み、
前記一塩基多型が、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ１０９０５８２２、ｒｓ７９２１１０３及びｒｓ１１２５６８４０からなる群より選択される少なくとも１種である、キット。 - ＩＬ１ＲＬ１遺伝子座、ＳＴＯＸ２遺伝子座、ＭＣＰＨ１遺伝子座、ＯＸＡ１Ｌ遺伝子座及びＢＣＬ１１Ｂ遺伝子座からなる群より選ばれる少なくとも１種以上の遺伝子座における一塩基多型を検出する１以上の核酸プローブ又はプライマーを更に含み、
前記ＩＬ１ＲＬ１遺伝子座における一塩基多型が、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ９６４６９４４であり、
前記ＳＴＯＸ２遺伝子座における一塩基多型が、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ２８７１３８５であり、
前記ＭＣＰＨ１遺伝子座における一塩基多型が、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ２７３２９７７であり、
前記ＯＸＡ１Ｌ遺伝子座における一塩基多型が、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａｓｅにおける登録番号ｒｓ３１３２９６９であり、
前記ＢＣＬ１１Ｂ遺伝子座における一塩基多型が、ＮＣＢＩ ＳＮＰ Ｄａｔａｂａにおける登録番号ｒｓ１９５１１２２である、請求項４に記載のキット。
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| Title |
|---|
| Nishida, N. et al.，"Key HLA-DRB1-DQB1 haplotypes and role of the BTNL2 gene for response to a hepatitis B vaccine"，Hepatology，2018年，Vol. 68，pp. 848-858 |
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