JP6521382B2 - Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の遺伝要因の検出方法 - Google Patents
Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の遺伝要因の検出方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルを含む、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の素因の検出方法、慢性Ｂ型肝炎又はその病態進展の検査を行う方法、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の素因の検出のための試薬及び当該試薬を含むＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の検査キットに関する。
世界人口の１／３にあたる人々がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染しているといわれている。Ｂ型肝炎は、一過性に終息する一過性感染と慢性肝炎に大別される。急性肝炎は感染後１〜６か月後の潜伏期間を経て症状が出現し、数週間で回復過程に入る。しかし急性肝炎を発症した患者のうち１〜２％の人は劇症肝炎を発症する危険性があり、劇症肝炎を発症した人の７０〜８０％は死亡する。
一方、感染したＨＢＶが体内から排除されず６か月以上にわたって肝臓の中に住み着くことでキャリアとなる。キャリアの８〜９割は無症候期、一過性の肝炎期、肝炎沈静期を経て、その後は無症候キャリアのまま経過する。しかし、１〜２割は慢性肝炎に移行し、さらに、その一部が肝硬変や肝がんへと移行する。Ｂ型肝炎ウイルス慢性保菌者は東南アジアや東太平洋地域に多く分布し、特に、日本にはおよそ１５０万人のＢ型肝炎感染者がいるといわれている。
このように、ＨＢＶ感染後の経過は多岐にわたり、主として慢性肝炎、肝がんに関与するウイルス側の遺伝要因が調べられてきた。しかしながら、近年では、宿主側の遺伝要因の探索も進み、日本人を含むアジア人サンプルを用いたゲノムワイド関連解析（Genome Wide Association Study: ＧＷＡＳ）により、Ｂ型慢性肝炎（ＣＨＢ）に関連する新たな遺伝要因が報告されている。ＨＢＶ持続感染やウイルス排除にはHLA-DPA1及びHLA-DPB1の関連が示唆されており（非特許文献１、非特許文献２）、HLA-DRと連鎖不平衡のあるHLA-DQの関与も示唆された（非特許文献３）。しかしながら、ＧＷＡＳを用いた解析では、慢性化に関与するそれ以外の強い遺伝要因は見つかっていない。また、がん化についても近年のＧＷＡＳにより、中国から幾つかの宿主遺伝要因が報告されている（非特許文献４及び５）。
Kamatani Y, Wattanapokayakit S, Ochi H, Kawaguchi T, Takahashi A, et al. (2009) A genome-wide association study identifies variants in the HLA-DP locus associated with chronic hepatitis B in Asians. Nat Genet 41: 591-595.
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HLA-DPについては、アリル頻度をＢ型慢性肝炎患者群と比較対照群で比較した報告があるものの（非特許文献１）、当該アリル頻度の研究では、比較対照群として非肝炎患者群を用いているため、当該実験結果にはＢ型慢性肝炎患者群と健常者群との相違が反映されているか不明確であるという問題があった。また、病態進展に関してはHLA-DPBアリルとの関連は調べられていない。
そこで、本発明は、健常者群、ＨＢＶ患者群、Ｂ型慢性肝炎群及びＢ型肝炎病態進展群（肝硬変又は肝がん）を用いて解析を実施し、Ｂ型慢性肝炎及び病態進展に感受性及び抵抗性のアリルを同定することにより、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルを含む、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の遺伝素因の検出方法、慢性Ｂ型肝炎、肝硬変又は肝がんの検査を行う方法、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の素因の検出のための試薬及び当該試薬を含むＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の検査キットを提供することを目的とする。
本発明者らは、健常者群、ＨＢＶ患者群、Ｂ型慢性肝炎群及びＢ型肝炎病態進展群（肝硬変又は肝がん）を用いてHLA-DPに関するタイピングを実施し、Ｂ型肝炎の慢性化に関連するアリルを見出した。それにより、当該アリルを用いた、Ｂ型肝炎の慢性化及び病態進展の素因の検出方法、慢性Ｂ型肝炎、肝硬変又は肝がんの検査を行う方法、Ｂ型肝炎の慢性化及び病態進展の素因の検出のための試薬及び当該試薬を含むＢ型肝炎の慢性化及び病態進展の検査キットを構築するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１） Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の素因の検出方法であって、以下の：
ａ）Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルと、検体中の前記アリルに対応する塩基配列又はアミノ酸配列を比較する工程；
ｂ）検体の前記アリルに対応する部位の塩基又はアミノ酸残基が、アリルの塩基又はアミノ酸残基と一致するかを解析する工程；及び
ｃ）検体のＢ型肝炎が慢性化しているか及び／又は病態が進展しているかを特定する工程；を含む、方法。
（２） （１）記載の方法であって、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルがＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に感受性であるか又は抵抗性である、方法。
（３） （２）記載の方法であって、前記Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルの組み合わせが、前記感受性のあるアリルのみの組み合わせ、前記抵抗性のあるアリルのみの組み合わせ、又は前記感受性のあるアリルと前記抵抗性のあるアリルとの組み合わせのいずれかの組み合わせである、方法。
（４） （２）又は（３）記載の方法であって、前記Ｂ型肝炎の慢性化に感受性のあるアリルがHLA-DPB1*05:01及びHLA-DPB1*09:01であり、前記Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のあるアリルがHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01であり、前記Ｂ型慢性肝炎の病態進展に抵抗性のあるアリルがHLA-DPB1*02:01である、方法。
（５） （２）〜（４）いずれか１項記載の方法であって、前記Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のあるアリルの組み合わせが、HLA-DPB1*02:01、HLA-DPB1*04:01又はHLA-DPB1*04:02と、HLA-DPB1*05:01又はHLA-DPB1*09:01である、方法。
（６） （１）〜（５）記載の方法により、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の検査を行う方法。
（７） Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルを検出するプライマーを含む、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の素因の検出のための試薬。
（８） （７）記載の試薬であって、前記Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルがＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に感受性であるか又は抵抗性である、試薬。
（９） （８）記載の試薬であって、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルの組み合わせが、前記感受性のあるアリルのみの組み合わせ、前記抵抗性のあるアリルのみの組み合わせ、又は前記感受性のあるアリルと前記抵抗性のあるアリルとの組み合わせのいずれかの組み合わせである、試薬。
（１０） （８）又は（９）記載の試薬であって、前記Ｂ型肝炎の慢性化に感受性のあるアリルがHLA-DPB1*05:01及びHLA-DPB1*09:01であり、前記Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のあるアリルがHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01であり、前記Ｂ型慢性肝炎の病態進展に抵抗性のあるアリルがHLA-DPB1*02:01である、試薬。
（１１） （８）〜（１０）いずれか１項記載の試薬であって、前記Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のあるアリルの組み合わせが、HLA-DPB1*02:01、HLA-DPB1*04:01又はHLA-DPB1*04:02と、HLA-DPB1*05:01又はHLA-DPB1*09:01である、試薬。
（１２） （７）〜（１１）いずれか１項記載のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルを含む、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の素因の検出のための試薬を含むキット。
（１） Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の素因の検出方法であって、以下の：
ａ）Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルと、検体中の前記アリルに対応する塩基配列又はアミノ酸配列を比較する工程；
ｂ）検体の前記アリルに対応する部位の塩基又はアミノ酸残基が、アリルの塩基又はアミノ酸残基と一致するかを解析する工程；及び
ｃ）検体のＢ型肝炎が慢性化しているか及び／又は病態が進展しているかを特定する工程；を含む、方法。
（２） （１）記載の方法であって、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルがＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に感受性であるか又は抵抗性である、方法。
（３） （２）記載の方法であって、前記Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルの組み合わせが、前記感受性のあるアリルのみの組み合わせ、前記抵抗性のあるアリルのみの組み合わせ、又は前記感受性のあるアリルと前記抵抗性のあるアリルとの組み合わせのいずれかの組み合わせである、方法。
（４） （２）又は（３）記載の方法であって、前記Ｂ型肝炎の慢性化に感受性のあるアリルがHLA-DPB1*05:01及びHLA-DPB1*09:01であり、前記Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のあるアリルがHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01であり、前記Ｂ型慢性肝炎の病態進展に抵抗性のあるアリルがHLA-DPB1*02:01である、方法。
（５） （２）〜（４）いずれか１項記載の方法であって、前記Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のあるアリルの組み合わせが、HLA-DPB1*02:01、HLA-DPB1*04:01又はHLA-DPB1*04:02と、HLA-DPB1*05:01又はHLA-DPB1*09:01である、方法。
（６） （１）〜（５）記載の方法により、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の検査を行う方法。
（７） Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルを検出するプライマーを含む、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の素因の検出のための試薬。
（８） （７）記載の試薬であって、前記Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルがＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に感受性であるか又は抵抗性である、試薬。
（９） （８）記載の試薬であって、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルの組み合わせが、前記感受性のあるアリルのみの組み合わせ、前記抵抗性のあるアリルのみの組み合わせ、又は前記感受性のあるアリルと前記抵抗性のあるアリルとの組み合わせのいずれかの組み合わせである、試薬。
（１０） （８）又は（９）記載の試薬であって、前記Ｂ型肝炎の慢性化に感受性のあるアリルがHLA-DPB1*05:01及びHLA-DPB1*09:01であり、前記Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のあるアリルがHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01であり、前記Ｂ型慢性肝炎の病態進展に抵抗性のあるアリルがHLA-DPB1*02:01である、試薬。
（１１） （８）〜（１０）いずれか１項記載の試薬であって、前記Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のあるアリルの組み合わせが、HLA-DPB1*02:01、HLA-DPB1*04:01又はHLA-DPB1*04:02と、HLA-DPB1*05:01又はHLA-DPB1*09:01である、試薬。
（１２） （７）〜（１１）いずれか１項記載のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルを含む、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の素因の検出のための試薬を含むキット。
本発明のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連するアリルをＨＢＶ患者群に対して解析することにより、Ｂ型肝炎慢性化及び／又は病態進展の分子機構の解明や創薬ターゲット候補分子の同定が可能になる。また、ＨＢＶキャリアに対して解析することにより、当該キャリアを慢性化及び病態進展がおきやすい群と慢性化及び病態進展がおきにくい群とに分類することが可能となり、その後の治療方針の決定に役立つ情報を提供できるという利点がある。それにより、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展を予防し、進行を防止し、適切な治療を行うことが可能となる。
また、Ｂ型肝炎慢性化及び病態進展の遺伝要因に関しては、日本人を含むアジア人と欧米人の間で同様な傾向があるか否かということが明らかではない。本発明のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連するアリルにより、日本人を含むアジア人に特化したＢ型肝炎慢性化及び／又は病態進展の治療方針の決定や創薬ターゲット候補分子の同定が可能となる。
さらに、当該アリルに加えて、他の免疫関連遺伝子のＳＮＰも含むより精度の高い検査キットの開発も可能となるという効果がある。
本発明は、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルを含む、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の遺伝素因の検出方法、慢性Ｂ型肝炎／又はその病態進展の検査を行う方法、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の素因の検出のための試薬及び当該試薬を含むＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の検査キットに関する。以下に本発明を説明する。
（１）本発明に係るＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリル
本発明はＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルに関する。Ｂ型肝炎の慢性化、病態進展に関連のあるアリルとは、Ｂ型肝炎の慢性化、病態進展に感受性である（Ｂ型肝炎が慢性化しやすく、病態進展しやすい）か又は抵抗性である（Ｂ型肝炎が慢性化しにくく、病態進展しにくい）アリルをいう。
本発明はＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルに関する。Ｂ型肝炎の慢性化、病態進展に関連のあるアリルとは、Ｂ型肝炎の慢性化、病態進展に感受性である（Ｂ型肝炎が慢性化しやすく、病態進展しやすい）か又は抵抗性である（Ｂ型肝炎が慢性化しにくく、病態進展しにくい）アリルをいう。
本発明において、「Ｂ型肝炎の慢性化」とは、ＨＢＶが持続感染している状態をいい、発症要因としては、以下の：ＨＢＶ持続感染者からの母児感染(垂直感染)；乳幼児期の医療行為等の理由で、ＨＢＶ持続感染者の血液や体液が体内に侵入した場合；体の免疫力が低下するような免疫抑制剤や抗がん剤の使用中にＨＢＶに感染した結果、ＨＢＶを体内から排除できずに持続感染を起こす場合；及び健常者が近年ジェノタイプＡ型という欧米型やアジア・アフリカ型等の外来種ＨＢＶに感染した場合等があげられる。このように、ＨＢＶに感染すると、８〜９割が無症候キャリアとなるが、１〜２割は慢性肝炎に移行する。さらにその中の一部が肝硬変や肝がんへ移行する。そこで、ＨＢＶの慢性化から肝硬変や肝がんに移行する群を、本発明の「Ｂ型肝炎の病態進展」という。「肝硬変」とは、肝炎ウイルス感染により損傷した肝臓が修復されるときにできる線維が肝臓に拡がった状態をいい、肝臓が硬くなったために腹水や食道静脈瘤が生じたり、肝臓機能が低下するために肝性脳症や黄疸が生じたりする原因となる。「肝がん」とは、肝炎ウイルスの感染が原因で生じる肝細胞がんをいう。
Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルの検索は、慢性Ｂ型肝炎患者、肝硬変又は肝がん患者又は健常人から採取した生物学的試料からゲノムＤＮＡを調製し、ダイレクトシークエンス法等によって遺伝子配列を解析することによって行う。このようにして得られた新規アリルは、慢性Ｂ型肝炎患者又は肝硬変又は肝がん患者から見出されたものであるため、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展との関連性が高い、本発明に係るアリルとして有望な候補である。上記のように選択したアリルとＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展との関連性を確認するには、統計的な検定によって行うことができる。例えば、Ｂ型肝炎の慢性化を有する群と健常人群における該候補アリルの出現率をそれぞれ算出し、当該候補アリルとＢ型肝炎の慢性化との関連を統計的に検定する。検定は、χ2検定、フィッシャーの正確確率検定（Fischer’s exact test）等、統計学上適当な方法によって行うことができ、必要に応じて有意水準の補正を行ってもよい。
上記アリルを検出する方法は、特に制限はなく、当業者にとって公知の方法の中から選択することができる。例えば、TaqMan PCR法、MALDI-TOF/MS法、ASO (allele-specific oligonucleotide)法、直接シークエンス法、RFLP法、インベーダー法、TGGE, DGGE法、MutY 酵素法、マイクロアレイ、Protein truncation test (PTT)法、Snipper法等の公知のタイピング方法の中から、目的等に応じて選択することができる。PCR法を応用した方法が多いが、PCR法によらない方法もある。
本発明者らは、日本人のＨＢＶ患者群４８９検体と健常対照群４６７検体、韓国人のＨＢＶ患者群３４０検体と健常対照群１４０検体についてHLA-DPB1のタイピングを行い、Ｂ型肝炎の慢性化に感受性のあるアリルとしてHLA-DPB1*05:01及びHLA-DPB1*09:01を、Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のあるアリルとしてHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01を同定した。また、Ｂ型慢性肝炎の病態進展に抵抗性のあるアリルとしてHLA-DPB1*02:01を同定した。HLAはヒトの主要組織適合性複合体（MHC; Major Histocompatibility Complex）であり、移植片や細菌、ウイルス等の外来抗原ペプチドと結合してＴ細胞に提示する膜タンパク質である。HLAには多くのアリルが存在することが知られており、これらの情報についてはHLA nomenclature (http://hla.alleles.org/announcement.html)等に記載がある。なお、本明細書のアリルや多型の表記は、HLA nomenclatureによる表記方法に基づく。
上記アリルに関するシークエンスデータは、例えばGenBank（NIH genetic sequence database）や、ＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）等のデータベースに登録されているデータを用いてよい。ここで、例えば、HLA-DPB1*05:01のｃＤＮＡは９１７塩基でありGenBankにAY804138（配列番号１）と、アミノ酸は２５８残基でAAW78743（配列番号２）と登録されている。HLA-DPB1*09:01のｃＤＮＡは９０７塩基でありGenBankにAY804139（配列番号３）と、アミノ酸は２５８残基でAAW78744（配列番号４）と登録されている。HLA-DPB1*04:02のｃＤＮＡは９１７塩基でありGenBankにAY804137（配列番号５）と、アミノ酸は２５８残基でAAW78742（配列番号６）と登録されている。HLA-DPB1*04:01のｃＤＮＡは８８３塩基でありGenBankにAY804136（配列番号７）と、アミノ酸は２５８残基でAAW78741（配列番号８）と登録されている。HLA-DPB1*02:01のｃＤＮＡは９０８塩基でありGenBankにAY804134（配列番号９）と、アミノ酸は２５８残基でAAW78739（配列番号１０）と登録されている。DPB1*01:01:01のアミノ酸配列を配列番号１１（AAW78748）に示し、本発明の上記アリルとのアラインメントを示したのが図１である。
なお、上記のアリルHLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01を「本発明のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリル」、「本発明のＢ型肝炎の慢性化に関連のあるアリル」「本発明に係るアリル」、また、アリルにかえて多型やＳＮＰという場合がある。
なお、上記のアリルHLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01を「本発明のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリル」、「本発明のＢ型肝炎の慢性化に関連のあるアリル」「本発明に係るアリル」、また、アリルにかえて多型やＳＮＰという場合がある。
本発明で用いられるアリルは、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡのほか、そのＲＮＡ相補体も含み、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。ＤＮＡには、例えば、ゲノムＤＮＡや、前記ゲノムＤＮＡに対応するｃＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせや、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドがあげられるがこれらに限定されない。なお、本発明においてポリヌクレオチドとは、ヌクレオチドが２以上結合しているものをいい、一般にオリゴヌクレオチドと言われる長さのものを含む。また本発明におけるポリヌクレオチドは、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。
これらの塩基配列は、当業者に公知の方法で適当な断片を用いてプローブを作製し、このプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリー等から得ることができる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001)；特にSection 6-7) 、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)；特にSection6.3-6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University (1995)；ハイブリダイゼーション条件については特にSection2.10) 等を参照することができる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001)；特にSection 6-7) 、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)；特にSection6.3-6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University (1995)；ハイブリダイゼーション条件については特にSection2.10) 等を参照することができる。
（２）本発明に係るアリルを用いたＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の素因の検出方法
本発明は、上記本発明のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリル（以下の記載では、「多型」「ＳＮＰ」という場合もある）を用いてＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の素因を検出する方法（タイピング方法）に関する。具体的には、以下の工程：ａ）Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルと、検体中の前記アリルに対応する塩基配列又はアミノ酸配列を比較する工程；ｂ）検体の前記アリルに対応する部位の塩基又はアミノ酸残基が、アリルの塩基又はアミノ酸残基と一致するかを解析する工程；及びｃ）検体のＢ型肝炎が慢性化しているか及び／又は病態が進展しているかを特定する工程；を含む。本発明の上記方法は、「（１）本発明のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリル」に記載したとおり、Ｂ型肝炎の慢性化に感受性のあるアリルはHLA-DPB1*05:01及びHLA-DPB1*09:01であり、Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のあるアリルはHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01であり、Ｂ型慢性肝炎の病態進展に抵抗性のあるアリルはHLA-DPB1*02:01であるという知見に基づく。上記方法について以下に詳細に説明する。
本発明は、上記本発明のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリル（以下の記載では、「多型」「ＳＮＰ」という場合もある）を用いてＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の素因を検出する方法（タイピング方法）に関する。具体的には、以下の工程：ａ）Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルと、検体中の前記アリルに対応する塩基配列又はアミノ酸配列を比較する工程；ｂ）検体の前記アリルに対応する部位の塩基又はアミノ酸残基が、アリルの塩基又はアミノ酸残基と一致するかを解析する工程；及びｃ）検体のＢ型肝炎が慢性化しているか及び／又は病態が進展しているかを特定する工程；を含む。本発明の上記方法は、「（１）本発明のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリル」に記載したとおり、Ｂ型肝炎の慢性化に感受性のあるアリルはHLA-DPB1*05:01及びHLA-DPB1*09:01であり、Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のあるアリルはHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01であり、Ｂ型慢性肝炎の病態進展に抵抗性のあるアリルはHLA-DPB1*02:01であるという知見に基づく。上記方法について以下に詳細に説明する。
「ａ）Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に関連のあるアリルと、検体中の前記アリルに対応する塩基配列又はアミノ酸配列を比較する工程」は、換言すれば配列番号１〜１０で示される塩基配列及びアミノ酸配列のアリルの検出である。
本発明では、アリルの検出は、遺伝子レベル又はタンパク質レベルで行うことができる。例えば、検体からゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを調製し、塩基配列に基づいて、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおける本発明のＢ型肝炎の慢性化に関連のあるアリルを検出することができる。また、検体からヒトHLA-DP分子タンパク質を調製し、例えば抗体等を用いてDP分子におけるHLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリルを検出することができる。これらの方法について、以下簡単に説明する。
（２−１）検体からのゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ調製
本発明の方法で用いる試料は、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に感受性であるか又は抵抗性であるかを検査しようとする検体から採取した生物学的試料をもとに、当業者に周知の方法で調製したゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを用いることができる。本発明の方法で用いる検体から採取する生物学的試料は、例えば、検体の細胞又は組織、毛髪、便、尿、唾液、細胞、鼻腔粘膜からこすりとった細胞等を用いることができるが、これらに限定されない。
本発明の方法で用いる試料は、Ｂ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に感受性であるか又は抵抗性であるかを検査しようとする検体から採取した生物学的試料をもとに、当業者に周知の方法で調製したゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを用いることができる。本発明の方法で用いる検体から採取する生物学的試料は、例えば、検体の細胞又は組織、毛髪、便、尿、唾液、細胞、鼻腔粘膜からこすりとった細胞等を用いることができるが、これらに限定されない。
ゲノムＤＮＡは、いかなる公知の方法によっても調製することができ、例えば、フェノール／クロロホルム法、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）法等があげられる。また、ｍＲＮＡの調製もいかなる公知の方法によっても調製することができ、例えば、グアニジンイソチオシアネート法等があげられる。ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡの調製には、市販のキットを用いてもよい。当該キットとしては、例えば、ゲノムＤＮＡの調製用としては、Wizard Genomic DNA Purification Kit （Promega）、ｍＲＮＡの調製用としては、NucleoTrap(登録商標)mRNA Kit（Clontech）等があげられる。なお、以下で説明するアリルの検出のために、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成してもよい。ｃＤＮＡの合成方法は当技術分野で公知のいかなる方法をも用いてよい。例えば、ランダムプライマー又はポリＴプライマーを用いて、ＲＮＡから逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりｃＤＮＡを合成することができる。
（２−２）アリルの検出
上記のように調製したゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるHLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリルの検出は、当技術分野で公知のいかなる遺伝子多型検出手段を用いて検出することができる。例えば、直接配列決定法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、ハイブリダイゼーション法、プライマー伸長反応、質量分光法等を用いる方法があげられるが、これらに限定されない。ただし、HLA-DRB1遺伝子では、特に第２エクソン内に多型部位が多数あるため、これらのアリルを検出するために、多数の多型を判別する必要がある。以下に当該方法について説明する。
（２−２−１）直接配列決定法
本発明では、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを用いた直接配列決定法によりHLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリルを検出することができる。直接配列決定法は、上記で調製したゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製し；検出対象であるHLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリルを含む領域を、ベクターにクローニングするか又はＰＣＲで増幅し；当該領域の塩基配列を決定する；ことにより行う。クローニングの方法としては、適切なプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングすることにより、クローニングすることができる。また、適切なプライマーを用いてＰＣＲ反応により増幅し、適切なベクターに連結することによりクローニングすることができる。さらに、別のベクターにサブクローニングすることもできるが、これらに限定されない。ベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅ−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）ＳＫ（＋）（Stratagene）、ｐＧＥＭ−Ｔ（Promega）、ｐＡｍｐ（TM: Gibco-BRL）、ｐ−Ｄｉｒｅｃｔ（Clontech）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Invitrogene）等の市販のプラスミドベクター、ウイルスベクター、人口染色体ベクターやコスミドベクターを用いることができる。塩基配列の決定としては、公知のいかなる方法をも用いることができ、例えば、放射性マーカーヌクレオチドを使用する手動式配列決定法や、ダイターミネーターを使用する自動配列決定法があげられるが、これらに限定されない。このようにして得られた塩基配列に基づき、検体がHLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリルアリルに相当する配列を有するか否かを決定する。
（２−２−２）ＰＣＲ法
本発明に係るアリルは、ＰＣＲ法を利用して検出することもできる。ＰＣＲは、本発明に係るアリルを有する配列又は他のアリルを有する配列にのみハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行う。このプライマーセットを使用して検体のゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを増幅する。本発明に係るアリル用プライマーのみがＰＣＲ産物を生成した場合には、検体は本発明に係るアリルをホモで有し、本発明に係るアリル用プライマーと他のアリル用プライマーからのＰＣＲ産物が生成された場合には、検体は本発明に係るアリルをヘテロで有することになる。他のアリル用プライマーのみがＰＣＲ産物を生成した場合には、検体には本発明に係るアリルがないことが示される。
（２−２−３）ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法
本発明に係るアリルは、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism；ＲＦＬＰ）を利用して検出することもできる。まず、検出対象の本発明に係るアリルを含む領域をＰＣＲで増幅する。続いてこのＰＣＲ産物を、本発明に係るアリルに適する制限酵素で切断する。制限酵素により消化されたＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイド染色で可視化する。当該断片長を、分子量マーカー並びに他のアリル及び本発明に係るアリルの対照により生じた断片長と比較して、検体における本発明に係るアリルの存在を検出することができる。
（２−２−４）ハイブリダイゼーション法
本発明に係るアリルは、ハイブリダイゼーションを利用して検出することもできる。ハイブリダイゼーション法は、検体由来のゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡが、それに対し相補的なＤＮＡ分子（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）とハイブリダイズする性質に基づき、本発明に係るアリルの有無を決定する方法である。コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション等のハイブリダイゼーション及び検出のための種々の技術を利用してこのハイブリダイゼーション法を行うことができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001)；特にSection 6-7)、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)；特にSection6.3-6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University(1995)；ハイブリダイゼーション条件については特にSection2.10)等を参照することができる。さらに、ハイブリダイゼーションはＤＮＡチップを利用して検出することもできる。当該方法としては、本発明に係るアリルに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを設計し、それを固相支持体に貼りつけたものを用いる。そして、検体由来のＤＮＡサンプルを当該ＤＮＡチップと接触させて、ハイブリダイゼーションを検出する。
（２−２−５）その他の方法
例えば、TaqMan PCR法は、アレル特異的なTaqmanプローブとTaqポリメラーゼを用い、ＳＮＰの検出とＳＮＰを含む領域の増幅とを同時並行で行う方法である。Taqmanプローブは、５’末端が蛍光物質、３’末端がクエンチャーで標識されている約20塩基前後のオリゴヌクレオチドであり、目的のＳＮＰ部位にハイブリダイズするよう設計されている。Taqポリメラーゼは５’-３’ヌクレアーゼ活性がある。これらのTaqmanプローブ及びTaqポリメラーゼ存在下で目的のアリルを含む領域を増幅するよう設計されたＰＣＲプライマーを用いて該アリル領域を増幅すると、増幅と並行して、Taqmanプローブが鋳型ＤＮＡの目的アリル部位にハイブリダイズする。フォワードプライマー側からの伸長反応が、鋳型にハイブリダイズしたTaqmanプローブに到達すると、Taqポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により、Taqmanプローブの５’末端に結合していた蛍光物質が切断される。その結果、遊離した蛍光物質はクエンチャーの影響を受けなくなり、蛍光を発生する。蛍光強度の測定により、ＳＮＰ検出が可能となる。
（２−２）アリルの検出
上記のように調製したゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡにおけるHLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリルの検出は、当技術分野で公知のいかなる遺伝子多型検出手段を用いて検出することができる。例えば、直接配列決定法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、ハイブリダイゼーション法、プライマー伸長反応、質量分光法等を用いる方法があげられるが、これらに限定されない。ただし、HLA-DRB1遺伝子では、特に第２エクソン内に多型部位が多数あるため、これらのアリルを検出するために、多数の多型を判別する必要がある。以下に当該方法について説明する。
（２−２−１）直接配列決定法
本発明では、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを用いた直接配列決定法によりHLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリルを検出することができる。直接配列決定法は、上記で調製したゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製し；検出対象であるHLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリルを含む領域を、ベクターにクローニングするか又はＰＣＲで増幅し；当該領域の塩基配列を決定する；ことにより行う。クローニングの方法としては、適切なプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングすることにより、クローニングすることができる。また、適切なプライマーを用いてＰＣＲ反応により増幅し、適切なベクターに連結することによりクローニングすることができる。さらに、別のベクターにサブクローニングすることもできるが、これらに限定されない。ベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅ−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）ＳＫ（＋）（Stratagene）、ｐＧＥＭ−Ｔ（Promega）、ｐＡｍｐ（TM: Gibco-BRL）、ｐ−Ｄｉｒｅｃｔ（Clontech）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Invitrogene）等の市販のプラスミドベクター、ウイルスベクター、人口染色体ベクターやコスミドベクターを用いることができる。塩基配列の決定としては、公知のいかなる方法をも用いることができ、例えば、放射性マーカーヌクレオチドを使用する手動式配列決定法や、ダイターミネーターを使用する自動配列決定法があげられるが、これらに限定されない。このようにして得られた塩基配列に基づき、検体がHLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリルアリルに相当する配列を有するか否かを決定する。
（２−２−２）ＰＣＲ法
本発明に係るアリルは、ＰＣＲ法を利用して検出することもできる。ＰＣＲは、本発明に係るアリルを有する配列又は他のアリルを有する配列にのみハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行う。このプライマーセットを使用して検体のゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを増幅する。本発明に係るアリル用プライマーのみがＰＣＲ産物を生成した場合には、検体は本発明に係るアリルをホモで有し、本発明に係るアリル用プライマーと他のアリル用プライマーからのＰＣＲ産物が生成された場合には、検体は本発明に係るアリルをヘテロで有することになる。他のアリル用プライマーのみがＰＣＲ産物を生成した場合には、検体には本発明に係るアリルがないことが示される。
（２−２−３）ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法
本発明に係るアリルは、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism；ＲＦＬＰ）を利用して検出することもできる。まず、検出対象の本発明に係るアリルを含む領域をＰＣＲで増幅する。続いてこのＰＣＲ産物を、本発明に係るアリルに適する制限酵素で切断する。制限酵素により消化されたＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイド染色で可視化する。当該断片長を、分子量マーカー並びに他のアリル及び本発明に係るアリルの対照により生じた断片長と比較して、検体における本発明に係るアリルの存在を検出することができる。
（２−２−４）ハイブリダイゼーション法
本発明に係るアリルは、ハイブリダイゼーションを利用して検出することもできる。ハイブリダイゼーション法は、検体由来のゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡが、それに対し相補的なＤＮＡ分子（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）とハイブリダイズする性質に基づき、本発明に係るアリルの有無を決定する方法である。コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション等のハイブリダイゼーション及び検出のための種々の技術を利用してこのハイブリダイゼーション法を行うことができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001)；特にSection 6-7)、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)；特にSection6.3-6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University(1995)；ハイブリダイゼーション条件については特にSection2.10)等を参照することができる。さらに、ハイブリダイゼーションはＤＮＡチップを利用して検出することもできる。当該方法としては、本発明に係るアリルに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを設計し、それを固相支持体に貼りつけたものを用いる。そして、検体由来のＤＮＡサンプルを当該ＤＮＡチップと接触させて、ハイブリダイゼーションを検出する。
（２−２−５）その他の方法
例えば、TaqMan PCR法は、アレル特異的なTaqmanプローブとTaqポリメラーゼを用い、ＳＮＰの検出とＳＮＰを含む領域の増幅とを同時並行で行う方法である。Taqmanプローブは、５’末端が蛍光物質、３’末端がクエンチャーで標識されている約20塩基前後のオリゴヌクレオチドであり、目的のＳＮＰ部位にハイブリダイズするよう設計されている。Taqポリメラーゼは５’-３’ヌクレアーゼ活性がある。これらのTaqmanプローブ及びTaqポリメラーゼ存在下で目的のアリルを含む領域を増幅するよう設計されたＰＣＲプライマーを用いて該アリル領域を増幅すると、増幅と並行して、Taqmanプローブが鋳型ＤＮＡの目的アリル部位にハイブリダイズする。フォワードプライマー側からの伸長反応が、鋳型にハイブリダイズしたTaqmanプローブに到達すると、Taqポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により、Taqmanプローブの５’末端に結合していた蛍光物質が切断される。その結果、遊離した蛍光物質はクエンチャーの影響を受けなくなり、蛍光を発生する。蛍光強度の測定により、ＳＮＰ検出が可能となる。
MALDI-TOF/MS法を応用したＳＮＰタイピング方法として、プライマー伸長法と組み合わせた方法もあげられる。この方法はハイスループットな解析が可能であり、１）ＰＣＲ、２）ＰＣＲ産物の精製、３）プライマー伸長反応、４）伸長産物の精製、５）質量分析、６）ジェノタイプ決定、のステップにより解析する。まずＰＣＲによって、目的とするＳＮＰ部位を含む領域をゲノムＤＮＡから増幅する。ＰＣＲプライマーは、アリル部位塩基と重複しないように設計する。そして、エキソヌクレアーゼとエビのアルカリホスファターゼ（shrimp alkaline phosphatase）を用いて酵素的除去方法により精製するかエタノール沈殿法を用いて精製する。次に、３’末端がＳＮＰ部位に直接隣接するように設計したジェノタイピングプライマーを用いて、プライマー伸長反応を行う。ＰＣＲ産物を高温で変性し、過剰のジェノタイピングプライマーを加えて、アニールさせる。ddNTPとＤＮＡポリメラーゼを反応系に添加し、サーマルサイクル反応させると、ジェノタイピングプライマーよりも1塩基長いオリゴマーが生じる。この伸長反応で生じる1塩基長いオリゴマーは、ジェノタイピングプライマーの上記設計により、アリルに応じて異なる。精製した伸長反応産物について質量分析を行い、マススペクトルから解析する。
ハイスループットが可能なＳＮＰタイピング法として、1分子蛍光分析法を応用した方法があげられる。例えば、MF20/10S(オリンパス)は、当該方法を採用したシステムである。具体的には、共焦点レーザー光学系と高感度光検出器を用いて、約1フェムトリットル（1000兆分の１リットル）の超微小領域中で、相補的・非相補的なプライマーを用いたＰＣＲ法によって増幅した蛍光ラベルプライマーの1分子レベルの並進拡散時間を計測及び解析するものである。
またＤＮＡチップによる方法も、ハイスループットが可能なタイピングの1つである。ＤＮＡチップは、基板上に多種類のＤＮＡプローブを整列して固定したもので、標識したＤＮＡ試料をチップ上でハイブリダイゼーションし、プローブによる蛍光シグナルを検出する。
ＰＣＲ法以外の遺伝子増幅法を利用したＳＮＰタイピング方法の例として、Snipper法があげられる。当該方法は、環状一本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼがその上を移動しながら相補鎖ＤＮＡを合成するＤＮＡ増幅方法であるＲＣＡ（rolling circle amplification）法を応用したＳＮＰタイピング法である。プローブは８０-９０塩基長のオリゴＤＮＡで、標的ＳＮＰの５’及び３’末端近傍のそれぞれに相補的な１０-２０塩基長の配列を両末端に含んでおり、標的ＤＮＡにアニールして環状になるように設計されている。また、プローブの３’末端が標的アレルに相補的配列となるよう設計されている。プローブの3’末端が標的アレルと完全に相補的であれば、プローブは環状化されるが、プローブの3’末端がミスマッチであるとプローブは環状化されない。またプローブには、４０-５０塩基長のバックボーン配列があり、２種類のＲＣＡ増幅プライマーと相補的な配列が含まれる。
ＰＣＲ法以外の遺伝子増幅法を利用したＳＮＰタイピング方法としては、例えば、UCAN法やLAMP法を利用したタイピング方法があげられる。UCAN法は、タカラバイオが開発した遺伝子等温増幅法であるICAN法を応用した方法である。UCAN法では、プライマー前駆体としてDNA-RNA-DNAキメラオリゴヌクレオチド（DRD）を用いる。このDRDプライマー前駆体は、ＤＮＡポリメラーゼによる鋳型ＤＮＡの複製が起こらないように、３'末端のＤＮＡが修飾してあり、ＳＮＰサイトにRNA部分が結合するように設計されている。このDRDプライマー前駆体を鋳型とインキュベートすると、DRDプライマーと鋳型が完全にマッチしている場合のみ、共存するRNase Hが対合したDRDプライマーのＲＮＡ部分を切断する。これにより、プライマー3'末端は修飾ＤＮＡが外れて新しくなるため、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進み、鋳型ＤＮＡが増幅される。一方、DRDプライマーと鋳型ＤＮＡがマッチしない場合、RNase HはDRDプライマーを切断せず、ＤＮＡ増幅も起こらない。パーフェクトマッチしたDRDプライマー前駆体がRNase Hによって切断されたあとの増幅反応は、ICAN反応メカニズムによって進行する。
LAMP法は、栄研化学によって開発された遺伝子等温増幅法で、標的遺伝子の６箇所の領域（3’末端側からF3c、F2c、F1c、5’末端側からB3、B2、B1）を規定し、当該６領域に対する４種類のプライマー（FIPプライマー、F3プライマー、BIPプライマー、B3プライマー）を用いて増幅する。タイピングを目的とする場合は、F1-B1間は標的ＳＮＰ部位（1塩基）のみでよく、FIPプライマー及びBIPプライマーを、その5'端にＳＮＰの1塩基がくるように設計する。WTアリルの場合、LAMP法の起点構造であるダンベル構造からＤＮＡの合成反応が起こり、増幅反応が連続的に進行する。アリルがある場合は、ダンベル構造からのＤＮＡ合成反応が起こらず、増幅反応は進行しない。
インベーダー(Invader)法は、核酸増幅法を用いず、２種類の非蛍光標識プローブ（アレルプローブ、インベーダープローブ）と１種類の蛍光標識プローブ（FRETプローブ）及びエンドヌクレアーゼであるcleavaseを用いる方法である。アレルプローブは、鋳型ＤＮＡに対しＳＮＰ部位から３’末端側に相補的な配列があり、プローブの５’側にフラップという鋳型ＤＮＡと無関係な配列がある。インベーダープローブは、鋳型ＤＮＡのＳＮＰ部位から５’側に相補的な配列があり、ＳＮＰ部位に相当する部分の塩基は任意の塩基がある。FRETプローブは、３’側にフラップ配列に相補的な配列がある。一方の５’側は蛍光色素及びクエンチャーで標識されているが、FRETプローブは分子内で２本鎖を形成するよう設計されており、通常は消光されている。これらを鋳型ＤＮＡと反応させると、アレルプローブが鋳型ＤＮＡと２本鎖を形成したときに、ＳＮＰ部位にインベーダープローブの３’末端（任意塩基部分）が侵入する。cleavaseは、当該塩基が侵入した構造を認識して、アレルプローブのフラップ部分を切断する。次に、この遊離したフラップがFRETプローブの相補配列と結合すると、フラップの３’末端がFRETプローブの分子内二本鎖部分に侵入する。cleavaseは、上記アレルプローブとインベーダープローブの場合と同様に、このFRETプローブにフラップの塩基が侵入した構造を認識し、FRETプローブの蛍光色素を切断する。蛍光色素はクエンチャーから離れるため、蛍光が発生する。アレルプローブがアレルとマッチしない場合は、cleavaseが認識する、上記特異的な構造が形成されないため、フラップは切断されない。
（２−２−６）アリルの検出に用いる物質
本発明の方法でアリルを検出するポリヌクレオチドについて以下に説明する。
アリルの検出にプライマーを用いる場合は、増幅する領域及びタイピング方法に即したプライマーとなるように設計する。例えば、上記領域を完全に増幅できることが好ましく、上記領域の両端付近の配列に基づいて配列を設計できる。プライマーの設計手法は当技術分野で周知であり、本発明において使用可能なプライマーは、特異的なアニーリングが可能な条件を満たす、例えば特異的なアニーリングが可能な長さ及び塩基組成（融解温度）を有するように設計される。増幅する領域の長さは、タイピングに支障がない限り制限はないし、検出方法により適宜増減してよい。また、増幅される領域の一部にはアリル部位が含まれるが、増幅される領域内における当該部位の位置に制限はなく、検出方法（タイピング方法）にしたがって適切な位置に配置してよい。そのためプライマーの設計にあたり、プライマーとアリル部位との位置関係は、検出方法にあわせて自由に設計でき、検出しようとするアリルを含む配列番号１、３、５、７及び９で示される塩基配列の一部領域（例えば、連続した５０塩基長以上５００塩基長以下）にハイブリダイズする限り、タイピング方法の特性を考慮しながら、プライマーを設計できる。プライマーとしての機能を発揮する長さとしては、１０〜１００塩基以上が好ましく、通常１５〜５０塩基、好ましくは１５〜３０塩基である。また設計の際には、任意の核酸鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度であるプライマーの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。鋳型となるＤＮＡとプライマーとが二本鎖を形成してアニーリングするためには、アニーリングの温度を最適化する必要があるが、その一方で、この温度をより低すぎると非特異的な反応がおこるため、好ましくないからである。Ｔｍの確認には、公知のプライマー設計用ソフトウェアを利用することができる。
本発明の方法でアリルを検出するポリヌクレオチドについて以下に説明する。
アリルの検出にプライマーを用いる場合は、増幅する領域及びタイピング方法に即したプライマーとなるように設計する。例えば、上記領域を完全に増幅できることが好ましく、上記領域の両端付近の配列に基づいて配列を設計できる。プライマーの設計手法は当技術分野で周知であり、本発明において使用可能なプライマーは、特異的なアニーリングが可能な条件を満たす、例えば特異的なアニーリングが可能な長さ及び塩基組成（融解温度）を有するように設計される。増幅する領域の長さは、タイピングに支障がない限り制限はないし、検出方法により適宜増減してよい。また、増幅される領域の一部にはアリル部位が含まれるが、増幅される領域内における当該部位の位置に制限はなく、検出方法（タイピング方法）にしたがって適切な位置に配置してよい。そのためプライマーの設計にあたり、プライマーとアリル部位との位置関係は、検出方法にあわせて自由に設計でき、検出しようとするアリルを含む配列番号１、３、５、７及び９で示される塩基配列の一部領域（例えば、連続した５０塩基長以上５００塩基長以下）にハイブリダイズする限り、タイピング方法の特性を考慮しながら、プライマーを設計できる。プライマーとしての機能を発揮する長さとしては、１０〜１００塩基以上が好ましく、通常１５〜５０塩基、好ましくは１５〜３０塩基である。また設計の際には、任意の核酸鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度であるプライマーの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。鋳型となるＤＮＡとプライマーとが二本鎖を形成してアニーリングするためには、アニーリングの温度を最適化する必要があるが、その一方で、この温度をより低すぎると非特異的な反応がおこるため、好ましくないからである。Ｔｍの確認には、公知のプライマー設計用ソフトウェアを利用することができる。
アリルの検出にプローブを用いる場合は、プローブがアリル部位を認識するように設計する。プローブ設計において、アリル部位は、タイピング方法にあわせて、プローブ内のいずれかの場所で認識されればよく、タイピング方法によっては、プローブの末端で認識されてもよい。アリル検出用ポリヌクレオチドをプローブとする場合、ゲノムＤＮＡに相補的な塩基配列の長さは、通常１５〜２００、好ましくは１５〜１００塩基、より好ましくは１５〜５０塩基であるが、タイピング方法によってはこれより長くても短くてもよい。
（２−２−７）本発明に好ましいアリルの検出方法
本発明の方法として好ましいアリルの検出方法はＰＣＲを用いたＰＣＲ−ＳＳＯＰ（Sequence Specific Oligonucleotide probe）法であってよく、当該方法を利用してHLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリルを検出することができる。ＰＣＲ−ＳＳＯＰは具体的には、ビオチン標識したプライマーを用いてＰＣＲで検体の上記アリルを含む領域を増幅する。増幅ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡとし、特異的な配列であるプローブと特異的に結合させる。例えば、プローブを蛍光色素で色分けされたマイクロビーズに固定し、増幅ＤＮＡが結合したマイクロビーズからビオチンを介した蛍光標識ストレプトアジピンの結合による蛍光シグナルが得られるので、この蛍光シグナルの種類と増幅ＤＮＡの結合による蛍光を識別して同時に検出することで増幅ＤＮＡが結合したビーズの種類から遺伝子タイプが決定できる。当該方法には、市販のキットを用いてもよい。当該キットとしては、例えば、多数の多型を一度に判別できるxMAP（登録商標）テクノロジー（Luminex社）等があげられるが、これらに限定されない。本方法を用いた本発明の方法の概要を以下に説明する。
（２−２−７）本発明に好ましいアリルの検出方法
本発明の方法として好ましいアリルの検出方法はＰＣＲを用いたＰＣＲ−ＳＳＯＰ（Sequence Specific Oligonucleotide probe）法であってよく、当該方法を利用してHLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリルを検出することができる。ＰＣＲ−ＳＳＯＰは具体的には、ビオチン標識したプライマーを用いてＰＣＲで検体の上記アリルを含む領域を増幅する。増幅ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡとし、特異的な配列であるプローブと特異的に結合させる。例えば、プローブを蛍光色素で色分けされたマイクロビーズに固定し、増幅ＤＮＡが結合したマイクロビーズからビオチンを介した蛍光標識ストレプトアジピンの結合による蛍光シグナルが得られるので、この蛍光シグナルの種類と増幅ＤＮＡの結合による蛍光を識別して同時に検出することで増幅ＤＮＡが結合したビーズの種類から遺伝子タイプが決定できる。当該方法には、市販のキットを用いてもよい。当該キットとしては、例えば、多数の多型を一度に判別できるxMAP（登録商標）テクノロジー（Luminex社）等があげられるが、これらに限定されない。本方法を用いた本発明の方法の概要を以下に説明する。
まず、最初にHLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリルを含む領域を増幅可能なプライマーやプローブ等のポリヌクレオチドを用いて、調製したゲノムＤＮＡを鋳型とした増幅反応を行い、上記塩基配列を有する核酸断片を増幅する。
アリルの検出に用いるポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７及び９で示される塩基配列をもとに、プライマー又はプローブの別及び適応する検出方法に合わせて、公知のオリゴヌクレオチド合成手法により化学合成することができ、市販の化学合成装置を用いて合成されてよい。当業者であれば、配列番号１、３、５、７及び９で示される塩基配列及びそれらの相補鎖並びに本発明に係るアリルの位置情報に基づいて、公知の方法を用いてポリヌクレオチドを合成することができる。さらに、当該オリゴヌクレオチドの合成において、蛍光色素やビオチン等で修飾されたヌクレオチド誘導体を利用して、ポリヌクレオチドを修飾したり、合成されたポリヌクレオチドに、蛍光色素等を結合したりしてもよく、その合成方法も公知である。
そして、検体から調製したゲノムＤＮＡに、上記プライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等を作用させてＰＣＲ反応を行う。上記方法は、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))』等に従い、当業者であれば容易に行うことができるが、本発明のＰＣＲ反応の条件としては、例えば、以下の条件があげられる。
変性温度：９０〜１００℃
アニーリング温度：４０〜７０℃
伸長温度：６０〜７５℃、
上記のサイクル数：３０〜５０回程度
増幅の特異性を高めるために、２組以上のプライマーを用いて２回以上増幅反応を行ってもよい。その際、各増幅反応で用いるプライマーを、同じ位置に設計してもよく、最初の増幅におけるプライマーの位置よりも内側に設計してもよい。このようにして、検体のゲノムＤＮＡを鋳型として、本発明に係るアリルの塩基配列を含む領域の核酸断片を特異的に増幅することができる。
変性温度：９０〜１００℃
アニーリング温度：４０〜７０℃
伸長温度：６０〜７５℃、
上記のサイクル数：３０〜５０回程度
増幅の特異性を高めるために、２組以上のプライマーを用いて２回以上増幅反応を行ってもよい。その際、各増幅反応で用いるプライマーを、同じ位置に設計してもよく、最初の増幅におけるプライマーの位置よりも内側に設計してもよい。このようにして、検体のゲノムＤＮＡを鋳型として、本発明に係るアリルの塩基配列を含む領域の核酸断片を特異的に増幅することができる。
続いて、増幅した核酸断片を精製した後、塩基配列を決定し、決定した塩基配列と、本発明に係るアリルの塩基配列とを比較する。これにより、検体が本発明に係るアリルを有するかを決定することができる。得られたＰＣＲ産物の精製には公知の方法を用いることができる。例えば、Wizard SV Gel and PCR clean-UP System (Promega)、GENECLEAN(フナコシ)、QIAquick PCR purification Kits(QIAGEN)、ExoSAP-IT（GEヘルスケアバイオサイエンス）等のキットを用いる方法、ＤＥＡＥ−セルロース濾紙を用いる方法、透析チューブを用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動を行い、塩基配列断片をアガロースゲルより切り出して、Wizard SV Gel and PCR clean-UP System (Promega)、GENECLEAN（フナコシ）、QIAquick Gel extraction Kits(QIAGEN)、フリーズ＆スクイーズ法等により精製することができる。配列決定は、当技術分野で公知のいかなる方法をも用いてよく、例えば、増幅した核酸断片をベクターにクローニングせずに配列を決定することができるダイレクト・シーケンス法があげられるが、これらに限定されない。当該配列決定法としては、例えばCEQTMDTCS Quick Start Kit（BECKMAN）、BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ABI310（Applied Biosystems）等の市販のキットを用いて簡易に行うことができる。上記のダイレクト・シーケンス法を行う場合には、本発明に係るアリルを含む領域の塩基配列を特異的に決定することができるプライマーを用いることが好ましい。用いるプライマーセットは公知の方法により設計できる。
このように、検体における本発明に係るアリルに対応する領域の塩基配列を決定した後、その塩基配列と、本発明に係るアリルの塩基配列を比較する。
（２−３）Ｂ型肝炎の慢性化に関連のあるアリルと、検体から得られたアミノ酸配列中の前記アリルのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を比較する工程
本発明の方法としては、タンパク質レベルで本発明に係るアリルを検出することもできる。具体的には、本発明に係るアリルを有するＤＰ分子を特異的に認識することができる抗体を用いることにより、本発明に係るアリルを検出することができる。当該抗体は、配列番号２、４、６、８及び１０に示すアミノ酸配列のいずれの領域からなるペプチドを抗原として免疫学的方法により作製できる。抗体の作製方法、及び抗体を用いた本発明に係るアリルを有するＤＰ分子の検出方法は、当技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。
（２−４）Ｂ型肝炎の慢性化又は病態進展に対する発症抵抗性又は感受性の判定
本発明において、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01アリルは、当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対して発症抵抗性を有することを示し、HLA-DPB1*05:01及びHLA-DPB1*09:01アリルは当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対して発症感受性を有することを示し、HLA-DPB1*02:01アリルは当該検体がＢ型慢性肝炎の病態進展に抵抗性を有することを示す。この意味で、本発明の方法は、本発明に係るアリルを用いて慢性Ｂ型肝炎又は病態進展の検査を行う方法ともいえる。
（２−３）Ｂ型肝炎の慢性化に関連のあるアリルと、検体から得られたアミノ酸配列中の前記アリルのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を比較する工程
本発明の方法としては、タンパク質レベルで本発明に係るアリルを検出することもできる。具体的には、本発明に係るアリルを有するＤＰ分子を特異的に認識することができる抗体を用いることにより、本発明に係るアリルを検出することができる。当該抗体は、配列番号２、４、６、８及び１０に示すアミノ酸配列のいずれの領域からなるペプチドを抗原として免疫学的方法により作製できる。抗体の作製方法、及び抗体を用いた本発明に係るアリルを有するＤＰ分子の検出方法は、当技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。
（２−４）Ｂ型肝炎の慢性化又は病態進展に対する発症抵抗性又は感受性の判定
本発明において、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01アリルは、当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対して発症抵抗性を有することを示し、HLA-DPB1*05:01及びHLA-DPB1*09:01アリルは当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対して発症感受性を有することを示し、HLA-DPB1*02:01アリルは当該検体がＢ型慢性肝炎の病態進展に抵抗性を有することを示す。この意味で、本発明の方法は、本発明に係るアリルを用いて慢性Ｂ型肝炎又は病態進展の検査を行う方法ともいえる。
さらに、Ｂ型肝炎慢性化又は病態進展に対する発症感受性アリル及び発症抵抗性アリルを診断実用性の計算に用いて、Ｂ型肝炎患者におけるＢ型肝炎慢性化又は病態進展の陽性率を解析することにより評価することもできる。Ｂ型肝炎慢性化等に関する「陽性率」とは、患者全体のうち、Ｂ型肝炎慢性化等に関する感受性アリルが1又はそれ以上ある患者の割合又はＢ型肝炎化慢性化等に関する抵抗性アリルがないか１のみある患者の割合をいう。例えば、本明細書の実施例に記載した日本人ＨＢＶ患者４８８人については、Ｂ型肝炎慢性化に関する感受性アリルであるHLA-DPB1*05:01又はHLA-DPB1*09:01のいずれかを１又は２有する患者は４１０人であり、いずれもないのは78人であるので、陽性率は84.02%となる。さらに、Ｂ型肝炎慢性化に関する抵抗性アリルであるHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01、HLA-DPB1*02:01がないか又は1つだけ有する患者は４５０人であり、いずれかを２つ有するのは３８人であるので、陽性率は92.21%となる。また、Ｂ型肝炎の病態進展に関する「陽性率」については、肝硬変及び肝がん患者２０６人のうち、Ｂ型肝炎の病態進展に関する抵抗性アリルであるHLA-DPB1*02:01がないか又は1つだけ有する患者は２０３人であり、２つ有するのは３人であるので、陽性率は98.5%となる。ここで、Ｂ型肝炎の病態進展に関する「陽性率」とは、肝硬変及び肝がん患者に関する陽性率をいう。
Ｂ型肝炎の慢性化等に対する発症感受性の有無は、Ｂ型肝炎の慢性患者だけでなく非慢性患者にとっても重要な情報であり、例えば、慢性Ｂ型肝炎の治療方法や治療薬の選定及び慢性Ｂ型肝炎の予防・発症防止に関する重要な情報となる。なお、このHLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*04:01、HLA-DPB1*02:01アリルの存在は、ホモ又はヘテロのいずれでもよい。ヒトは各遺伝子について父親由来と母親由来の２種類を有するからである。
また、本発明者らは、Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のある抵抗性アリルと、Ｂ型肝炎の慢性化に感受性のある感受性アリルとのうち、ある特定の抵抗性アリルと感受性アリルとの組み合わせを有するヒトについて、ＨＢＶ患者群１３８０人と健常対照群１２２５人についての９５％信頼区間におけるオッズ比（ＯＲ；Odds Ratio）を求めた。ここで、オッズ比ＯＲとは、あるアリルの組み合わせを有するヒトの群についての、ＨＢＶ患者群のオッズＯｓＰと、健常対照群のオッズＯｓＣとの比である。このＨＢＶ患者群のオッズＯｓＰは、ＨＢＶ患者数のうち、ある特定のアリルの組み合わせを有するＨＢＶ患者数の比によって求められる。また、この健常対照群のオッズＯｓＣは、健常対照群の人数のうち、ある特定のアリルの組み合わせを有する健常対照群の人数の比によって求められる。以下、ある特定のアリルの組み合わせの具体例として、抵抗性アリルとしてHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01、またはHLA-DPB1*02:01のいずれかを１つだけ有し、感受性アリルとしてHLA-DPB1*05:01またはHLA-DPB1*09:01のいずれかを１つだけ有するヒトの群について説明する。
この具体例において、ＨＢＶ患者群１３８０人のうち、この具体例に示す特定のアリルの組み合わせを有するヒトは、４１１人である。すなわち、この具体例に示す特定のアリルの組み合わせを有するヒトについて、ＨＢＶ患者群のオッズＯｓＰは０．４２である。また、この具体例において、健常対照群１２２５人のうち、この具体例に示す特定のアリルの組み合わせを有するヒトは、４７７人である。すなわち、この具体例に示す特定のアリルの組み合わせを有するヒトについて、健常対照群のオッズＯｓＣは０．６３である。したがって、この具体例に示す特定のアリルの組み合わせを有するヒトについて、オッズ比ＯＲ、すなわち、ＨＢＶ患者群のオッズＯｓＰと健常対照群のオッズＯｓＣとの比は、０．６７である。
ここで、オッズ比ＯＲが１より小さい場合には、特定のアリルの組み合わせを有するヒトが、Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性があるといえる。この具体例においては、抵抗性アリルとしてHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01、またはHLA-DPB1*02:01のいずれかを１つだけ有し、感受性アリルとしてHLA-DPB1*05:01またはHLA-DPB1*09:01のいずれかを１つだけ有するヒトは、Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性があるといえる。
すなわち、父親由来と母親由来の２種類のHLA-DPB1アリルの存在が、抵抗性アリルと感受性アリルとのヘテロの場合において、少なくともHLA-DPB1アリルが上述の具体例に示す組み合わせの場合には、当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対する抵抗性を有することが明らかになった。
つまり、本発明者らは、抵抗性アリルを１つだけ有し、感受性アリルを１つだけ有するヒトは、Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性があるといえることを導いた。このことから、父親由来と母親由来の２種類のアリルが、抵抗性アリルと感受性アリルとを、それぞれ１つだけ有するヒトは、Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性があるといえる。つまり、本発明に係るアリルを用いることにより、父親由来と母親由来の２種類のアリルの組み合わせに基づいて、Ｂ型肝炎の慢性化又は病態進展に対する発症抵抗性又は感受性を判定することができる。
（３）本発明に係るアリルを含むＢ型肝炎の慢性化又は病態進展の素因の検出のための試薬
本発明に係るアリルを用いてＢ型肝炎の慢性化又は病態進展の素因を検出することができる。したがって、上記アリルを検出する試薬は、Ｂ型肝炎の慢性化又は病態進展の検査用試薬として有用である。当該試薬はＢ型肝炎の慢性化に対する発症抵抗性若しくは感受性又は病態進展を判定するためにも用いることができる。具体的には、上記の本発明に係るアリルや各種プライマーやプローブ、本発明に係るアリルに特異的に結合することができる抗体、ＳＮＰタイピングを行うときに同時に用いる試薬類（例えば、デオキシヌクレオチド3リン酸（dNTPs）やDNAポリメラーゼ、緩衝液等）や陽性コントロール等に加えて、他の溶媒や溶質と組み合わせて試薬とすることができる。たとえば、蒸留水、pH緩衝試薬、塩、タンパク質、界面活性剤等を組み合わせることができる。
また、タイピング法によっては、プローブ又はプライマー等の本発明に係るアリル検出用ポリヌクレオチドの一部に、HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリル等とは無関係な配列が含まれていてもよい。さらに本発明に係るアリル検出用ポリヌクレオチドはＤＮＡとＲＮＡのキメラであってもよい。また本発明に係るアリル検出用ポリヌクレオチドは、蛍光物質や、ビオチン又はジゴキシンのような結合親和性物質で標識されていてもよい。
本発明に係るアリルを用いてＢ型肝炎の慢性化又は病態進展の素因を検出することができる。したがって、上記アリルを検出する試薬は、Ｂ型肝炎の慢性化又は病態進展の検査用試薬として有用である。当該試薬はＢ型肝炎の慢性化に対する発症抵抗性若しくは感受性又は病態進展を判定するためにも用いることができる。具体的には、上記の本発明に係るアリルや各種プライマーやプローブ、本発明に係るアリルに特異的に結合することができる抗体、ＳＮＰタイピングを行うときに同時に用いる試薬類（例えば、デオキシヌクレオチド3リン酸（dNTPs）やDNAポリメラーゼ、緩衝液等）や陽性コントロール等に加えて、他の溶媒や溶質と組み合わせて試薬とすることができる。たとえば、蒸留水、pH緩衝試薬、塩、タンパク質、界面活性剤等を組み合わせることができる。
また、タイピング法によっては、プローブ又はプライマー等の本発明に係るアリル検出用ポリヌクレオチドの一部に、HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリル等とは無関係な配列が含まれていてもよい。さらに本発明に係るアリル検出用ポリヌクレオチドはＤＮＡとＲＮＡのキメラであってもよい。また本発明に係るアリル検出用ポリヌクレオチドは、蛍光物質や、ビオチン又はジゴキシンのような結合親和性物質で標識されていてもよい。
また、本発明の試薬には特定のアリルを検出する手段のほか、さらに、反応液を構成するバッファー、ｄＮＴＰ混合物、酵素類（ポリメラーゼ等）等の反応試薬を含めてよい。反応試薬とは適当な化学的又は物理的検出手段により検出可能な標識を有する試薬である。そのような標識物質を用いる測定法に使用される標識剤として、たとえば蛍光物質、酵素、放射性同位元素、発光物質等が用いられる。標識に酵素を用いたELISA法は広く利用されている。蛍光物質として、フルオレスカミン、フルオレッセインイソチオシアネート等、酵素として、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸脱水酵素、α-グルコシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ等、放射性同位元素として、125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃ等、発光物質として、ルシフェリン、ルシゲニン、ルミノール、ルミノール誘導体等が例示される。
さらに、反応媒体として、反応の至適条件を与えるか、反応生成物質の安定化等に有用な緩衝液、反応物質の安定化剤等が含まれる。
（４）本発明に係るアリルを含むＢ型肝炎の慢性化又は病態進展の素因の検出のためのキット
本発明に係るアリルを用いてＢ型肝炎の慢性化又は病態進展の素因を検出する場合、特別の条件、操作等は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作に準じて行なわれ、必要であれば若干の修飾を加えて好適な測定系を構築できる。
本発明に係るアリルを用いてＢ型肝炎の慢性化又は病態進展の素因を検出する場合、特別の条件、操作等は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作に準じて行なわれ、必要であれば若干の修飾を加えて好適な測定系を構築できる。
そのためのもっとも簡便かつ効率的な測定を行なうことを可能とするのは、上記本発明の試薬をキット化することである。キット化により、通常の検査室又は実験室で、特殊な分析機器、熟練した操作、高度の知識は必要とせずに、効率的に定量を行なうことができる。アッセイキットの構成及び形態は、とくに限定されるものでなく所定の目的を達成できるものであればその内容は限定されない。一般には本発明に係るアリルを検出する手段に関する使用説明書、反応試薬、反応が行なわれる場となる反応媒体、アッセイの場を提供する基材等から構成される。さらに所望により、比較基準とするためのあるいは検量線を作成するための照合サンプル、検出器等も含んでもよい。本発明の遺伝子導入の検出確認手段としては、分光器、放射線検出器、光散乱検出器といった上記標識を検出可能なものがあげられる。
（５）他のアリルとの組み合わせ
本発明の上記方法は、他のＢ型肝炎の慢性化又は病態進展に関連のあるアリルと組み合わせて用いてよい。用いるアリルについては、HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリルに関するアリルでよく、さらにＢ型肝炎の慢性化又は病態進展に関連するのであれば、上記配列以外の配列中のアリルでもよい。本発明の方法は、換言すればアリルの検出による。一般にアリルとは、塩基の変化が人口の１％以上の頻度で存在しているものと定義され、１％未満のものでまれなバリエーションという。本発明として組み合わされるアリルとしては、上記アリルのほか、アリルとしての存在頻度を問わず、１％未満のものであってもよい。また本発明と組み合わされるアリルは、Ｂ型肝炎の慢性化に関する遺伝子中のどこに存在していてもよく、エクソン、イントロン、3’-UTR又は5’-UTR及びその隣接領域、及びプロモーター領域に存在してもよい。当該他のアリルを検出するためのポリヌクレオチドについては、当業者であれば、上記「（２−２）アリルの検出」に記載した方法等を用いて作製できる。また、アリルの数も特に制限はなく、１から数十の塩基の置換・欠失・挿入・付加のいずれであってもよい。また、一塩基多型（SNP:single nucleotide polymorphism）、制限酵素切断断片長多型(RFLP： restriction fragment length polymorphism)、VNTR(variable number of tandem repeat)、マイクロサテライト多型等の多型であってもよい。
本発明の上記方法は、他のＢ型肝炎の慢性化又は病態進展に関連のあるアリルと組み合わせて用いてよい。用いるアリルについては、HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及び／又はHLA-DPB1*02:01アリルに関するアリルでよく、さらにＢ型肝炎の慢性化又は病態進展に関連するのであれば、上記配列以外の配列中のアリルでもよい。本発明の方法は、換言すればアリルの検出による。一般にアリルとは、塩基の変化が人口の１％以上の頻度で存在しているものと定義され、１％未満のものでまれなバリエーションという。本発明として組み合わされるアリルとしては、上記アリルのほか、アリルとしての存在頻度を問わず、１％未満のものであってもよい。また本発明と組み合わされるアリルは、Ｂ型肝炎の慢性化に関する遺伝子中のどこに存在していてもよく、エクソン、イントロン、3’-UTR又は5’-UTR及びその隣接領域、及びプロモーター領域に存在してもよい。当該他のアリルを検出するためのポリヌクレオチドについては、当業者であれば、上記「（２−２）アリルの検出」に記載した方法等を用いて作製できる。また、アリルの数も特に制限はなく、１から数十の塩基の置換・欠失・挿入・付加のいずれであってもよい。また、一塩基多型（SNP:single nucleotide polymorphism）、制限酵素切断断片長多型(RFLP： restriction fragment length polymorphism)、VNTR(variable number of tandem repeat)、マイクロサテライト多型等の多型であってもよい。
アリルも多型として公知のものであっても新規な多型であってもよい。公知多型を検出対象とする場合は、例えば、公共データベース：GenBank等に公開されている公知多型の中から、検出対象候補となる多型を選択することができる。また、公的データ：ENSEMBL(http://www.ensembl.org/)を利用して、選択することもできるし、プロタイプも用いることができる。ハプロタイプを構成するＳＮＰの選択方法及びタイピング方法については上記のとおりである。当該ハプロタイプがＢ型肝炎慢性化又は病態進展に関連するか否かの評価は実施例にあるように、統計学的検定によって判断できる。
本発明に係るアリルと他のアリル等を組み合わせて用いるとＢ型肝炎慢性化又は病態進展をより迅速に精度よく判断できるため、診断の信頼度が高まる点でも好ましい。
次に、本発明を実施例によって説明するが、本発明は、これらの実施例によって限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。
（本発明に係るアリルの検出）
本実施例は、本発明を含むHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01を検出することを目的とする。
日本人のＨＢＶ患者４８８人と健常者４６４人、韓国人のＨＢＶ患者２５１人と健常者１４０人由来の各試料について、QIAamp DNA Mini kit（QIAGEN）を用いて以下のように調製した。まず、マイクロチューブにQIAGEN Protease20μlをピペッティングした後、各試料200μlを添加した。さらにBuffer ALを加えて１５秒間混和した後、５６℃で１０分間インキュベートして試料を溶解した。その後、マイクロチューブを数秒間スピンダウンして蓋の内側についた溶液を収集した。さらに試料にエタノール（100％）200μlを添加し、再び１５秒間ボルテックスした後、1.5ml マイクロチューブを数秒間スピンダウンして蓋の内側についた溶液を収集した。当該溶液をQIAamp Mini Spin Columnにカラムにアプライし、6,000×gで１分間遠心分離した。QIAamp Mini Spin Columnを開き、500μlのBuffer AW1を添加して6,000×gで１分間遠心分離した。QIAamp Mini Spin Columnを開き、500μlのBuffer AW2を添加して、20,000×gで３分間遠心分離した。QIAamp Mini Spin Column を開き、200μlのBuffer AE又は精製水を添加した。室温で１分間インキュベートした後、6,000×gで１分間遠心分離して、各検体由来のＤＮＡを回収した。
本実施例は、本発明を含むHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01を検出することを目的とする。
日本人のＨＢＶ患者４８８人と健常者４６４人、韓国人のＨＢＶ患者２５１人と健常者１４０人由来の各試料について、QIAamp DNA Mini kit（QIAGEN）を用いて以下のように調製した。まず、マイクロチューブにQIAGEN Protease20μlをピペッティングした後、各試料200μlを添加した。さらにBuffer ALを加えて１５秒間混和した後、５６℃で１０分間インキュベートして試料を溶解した。その後、マイクロチューブを数秒間スピンダウンして蓋の内側についた溶液を収集した。さらに試料にエタノール（100％）200μlを添加し、再び１５秒間ボルテックスした後、1.5ml マイクロチューブを数秒間スピンダウンして蓋の内側についた溶液を収集した。当該溶液をQIAamp Mini Spin Columnにカラムにアプライし、6,000×gで１分間遠心分離した。QIAamp Mini Spin Columnを開き、500μlのBuffer AW1を添加して6,000×gで１分間遠心分離した。QIAamp Mini Spin Columnを開き、500μlのBuffer AW2を添加して、20,000×gで３分間遠心分離した。QIAamp Mini Spin Column を開き、200μlのBuffer AE又は精製水を添加した。室温で１分間インキュベートした後、6,000×gで１分間遠心分離して、各検体由来のＤＮＡを回収した。
調製されたＤＮＡ試料を用いてPCR-SSOP法を利用したLABType SSO HLA DPA1/DPB1 kit (ワンラムダ)又はWAKFlow HLA-DPB1 typing kit (湧永製薬)を用いて、4桁のHLAタイピングを実施した。実験は説明書に従って行い、xMAPテクノロジーを利用したマルチプレックス測定システム（Luminex社）を利用した。具体的には、上記ＤＮＡ試料２μｌに増幅試薬24.5μｌ、ＤＮＡポリメラーゼ液0.5μｌを加えて以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
変性温度：９３℃（３０秒）
アニーリング温度：６０℃（３０秒）
伸長温度：７２℃（３０秒）
上記のサイクル数：４０回
上記サイクル前に９３℃（３分）、上記サイクル後に７２℃（５分）の反応を行い、終了後は４℃で保存した。
変性温度：９３℃（３０秒）
アニーリング温度：６０℃（３０秒）
伸長温度：７２℃（３０秒）
上記のサイクル数：４０回
上記サイクル前に９３℃（３分）、上記サイクル後に７２℃（５分）の反応を行い、終了後は４℃で保存した。
当該ＰＣＲ終了後の増幅ＤＮＡ５μｌを、変性液５μｌを分注した96穴ＰＣＲプレートの各ウエルに加えて、ボルテックスし、室温に５分間放置した。ハイブリダイゼーション溶液２０μｌ、ビーズミックス３μｌ及びSAPE２μｌを混合したハイブリミックス試薬２５μｌに上記の変性増幅ＤＮＡを加えてハイブリミックス溶液としてボルテックスで撹拌した。５５℃に設定したサーマルサイクラーに上記ハイブリミックス溶液をセットして、３０分間ハイブリダイゼーションを行った。洗浄液７５μｌを各ウエルに加え、1000×gで１分間遠心分離を行った。その後、上清を除去して、洗浄液７５μｌを各ウエルに加えた。Luminex XYPのブロック温度を37℃に設定して、ビーズミックスのLot番号に対応したテンプレートファイルを用いて測定した。測定結果のＣＳＶファイルをWAKFlow（登録商標）Typing Softwareで開き、各蛍光ビーズの陽性・陰性を判定表に記載しているカットオフ値をもとに自動判定した。当該自動判定では、蛍光強度がカットオフ値以上を示すビーズを陽性、カットオフ値以下を示すビーズを陰性とし、各ビーズの陽性・陰性のパターンからHLAの遺伝子型を決定した。
その結果を表１及び２に示す。
表１は、日本及び韓国におけるＨＢＶ患者群と健常者群のHLA-DPB1アリル頻度の比較を示す。これにより、日本人では、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01アリルは、当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対する発症抵抗性を有することが示され、HLA-DPB1*05:01及びHLA-DPB1*09:01アリルは当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対する発症感受性を有することが示された。韓国人ではHLA-DPB1*04:02アリルは、当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対する発症抵抗性を有することが示され、HLA-DPB1*05:01アリルは当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対する発症感受性を有することが示された。
表１に示されたＢ型肝炎慢性化に対する発症感受性アリル(HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*09:01)及び発症抵抗性アリル（HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01、HLA-DPB1*02:01）について、Ｂ型肝炎患者における陽性率を計算した。その結果、日本人ＨＢＶ患者４８８人で感受性アリルを有する場合を計算すると、HLA-DPB1*05:01又はHLA-DPB1*09:01のいずれかを１又は２つ有する患者は４１０人であったのに対し、当該アリルがない患者は７８人であった。したがって、陽性率は84.02%となった。同様に抵抗性アリルの場合について計算すると、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01、HLA-DPB1*02:01がないか又は1つ有するのは４５０人であったのに対し、いずれかを２つ有する患者は３８人であった。したがって、陽性率は92.21%となった。
表２は、日本及び韓国におけるＨＢＶ病態進展群とＢ型慢性肝炎群のHLA-DPB1アリル頻度の比較を示す。これにより、日本及び韓国共に、HLA-DPB1*02:01アリルはＢ型慢性肝炎の病態進展に抵抗性があることが示された。
表２に示されたＢ型肝炎の病態進展に対する抵抗性アリル（HLA-DPB1*02:01）について、肝硬変及び肝がん患者における陽性率を計算した。その結果、肝硬変及び肝がん患者２０６人のうち、HLA-DPB1*02:01がないか又は１つだけ有するのは２０３人であり、２つ有する患者は３人であった。したがって、陽性率は98.5%となった。
（本発明に係るアリルの検出；その２）
本実施例は、本発明を含む父親由来と母親由来の２種類のHLA-DPB1アリルの存在がヘテロの場合において、当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対する抵抗性を有するのか、感受性を有するのかという点を明らかにすることを目的とする。日本人のＨＢＶ患者１３８０人と健常者１２２５人由来の各試料についてHLAの遺伝子型を決定した。なお、この遺伝子型の決定の手順は、上述した本発明に係るアリルの検出における手順と同様であるため、説明を省略する。
その結果を表３〜５に示す。
本実施例は、本発明を含む父親由来と母親由来の２種類のHLA-DPB1アリルの存在がヘテロの場合において、当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対する抵抗性を有するのか、感受性を有するのかという点を明らかにすることを目的とする。日本人のＨＢＶ患者１３８０人と健常者１２２５人由来の各試料についてHLAの遺伝子型を決定した。なお、この遺伝子型の決定の手順は、上述した本発明に係るアリルの検出における手順と同様であるため、説明を省略する。
その結果を表３〜５に示す。
表３は、日本におけるＨＢＶ患者群と健常対照群との、単一のHLA-DPB1アリルについての保有頻度を示す。この表３のうち、左表（１ｓｔｓｅｔ）は、日本人のＨＢＶ患者４８８人と健常者４６４人についての結果を示し、右表（２ｎｄｓｅｔ）は、日本人のＨＢＶ患者８９２人と健常者７６１人についての結果を示す。
本発明者らは、１ｓｔｓｅｔにおいて、ＨＢＶ患者群と健常対照群とから１５種類のHLA-DPB1アリルを検出した。この１５種類のHLA-DPB1アリルには、HLA-DPB1*01:01、HLA-DPB1*02:01、HLA-DPB1*02:02、HLA-DPB1*03:01、HLA-DPB1*04:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*06:01、HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*13:01、HLA-DPB1*14:01、HLA-DPB1*17:01、HLA-DPB1*19:01、HLA-DPB1*29:01、及びHLA-DPB1*41:01が含まれる。これら、１５種類のHLA-DPB1アリルそれぞれについて、ある種類のHLA-DPB1アリルが検出されたヒトが、ＨＢＶ患者群と健常対照群とのいずれに含まれるかを計数した。一例として、HLA-DPB1*02:01アリルが検出されたヒトのうち、ＨＢＶ患者群には１８２人が含まれ、健常対照群には２２７人が含まれていた。すなわち、HLA-DPB1*02:01アリルが検出されたヒトのうち、ＨＢＶ患者数は１８２人であり、健常者数は２２７人であった。
また、本発明者らは、２ｎｄｓｅｔにおいて、ＨＢＶ患者群と健常対照群とから１８種類のHLA-DPB1アリルを検出した。この１８種類のHLA-DPB1アリルには、HLA-DPB1*01:01、HLA-DPB1*02:01、HLA-DPB1*02:02、HLA-DPB1*03:01、HLA-DPB1*04:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*06:01、HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*13:01、HLA-DPB1*14:01、HLA-DPB1*17:01、HLA-DPB1*19:01、HLA-DPB1*21:01、HLA-DPB1*29:01、HLA-DPB1*36:01、HLA-DPB1*38:01、及びHLA-DPB1*41:01が含まれる。これら、１８種類のHLA-DPB1アリルそれぞれについて、ある種類のHLA-DPB1アリルが検出されたヒトが、ＨＢＶ患者群と健常対照群とのいずれに含まれるかを計数した。一例として、HLA-DPB1*02:01アリルが検出されたヒトのうち、ＨＢＶ患者群には３３３人が含まれ、健常対照群には３６８人が含まれていた。すなわち、HLA-DPB1*02:01アリルが検出されたヒトのうち、ＨＢＶ患者数は３３３人であり、健常者数は３６８人であった。
また、本発明者らは、１ｓｔｓｅｔ及び２ｎｄｓｅｔのそれぞれについて、ＨＢＶ患者群と健常対照群についての９５％信頼区間におけるオッズ比（ＯＲ＊；Odds Ratio）を求めた。ここで、オッズ比ＯＲ＊とは、あるHLA-DPB1アリルを有するヒトの群についての、ＨＢＶ患者群のオッズＯｓＰ＊と、健常対照群のオッズＯｓＣ＊との比である。このＨＢＶ患者群のオッズＯｓＰ＊は、ＨＢＶ患者数のうち、ある特定のHLA-DPB1*アリルを有するＨＢＶ患者数の比によって求められる。また、この健常対照群のオッズＯｓＣ＊は、健常対照群の人数のうち、ある特定のHLA-DPB1*アリルを有する健常対照群の人数の比によって求められる。ここで、オッズ比ＯＲ＊が１より小さい場合には、当該検体が、Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性があるといえる。また、オッズ比ＯＲ＊が１以上の場合には、当該検体が、Ｂ型肝炎の慢性化に感受性があるといえる。
これにより、日本人では、HLA-DPB1*02:01、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*04:02アリルは、当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対する抵抗性を有することが示され、HLA-DPB1*05:01及びHLA-DPB1*09:01アリルは当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対する感受性を有することが示された。
さらに本発明者らは、上述したＢ型肝炎の慢性化に対する抵抗性を有するHLA-DPB1アリルと、Ｂ型肝炎の慢性化に対する感受性を有するHLA-DPB1アリルとの組み合わせについて、表４に示すようにして検討した。
表４は、日本におけるＨＢＶ患者群と健常対照群とにおける、父親由来と母親由来の２種類のHLA-DPB1アリルの組み合わせについての保有頻度を示す。この表４のうち、左表は、ＨＢＶ患者１３８０人についての結果を示し、右表は、健常者１２２５人についての結果を示す。ここで、本発明者らは、父親由来と母親由来の２種類のHLA-DPB1アリルの存在がヘテロの場合において、当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対する抵抗性を有するのか、感受性を有するのかという点に着目した。特に、Ｂ型肝炎の慢性化に対する抵抗性を有するHLA-DPB1アリルと、Ｂ型肝炎の慢性化に対する感受性を有するHLA-DPB1アリルとの組み合わせにおいて、当該検体がＢ型肝炎の慢性化に対する抵抗性を有するのか、感受性を有するのかという点に着目した。この結果を表５に示す。
表５は、日本におけるＨＢＶ患者群と健常対照群とにおける、父親由来と母親由来の２種類のHLA-DPB1アリルの組み合わせのうち、特に、Ｂ型肝炎の慢性化に対する抵抗性を有するHLA-DPB1アリルと、Ｂ型肝炎の慢性化に対する感受性を有するHLA-DPB1アリルとの組み合わせに着目した場合の、HLA-DPB1アリルの保有頻度を示す。
一例として、抵抗性アリルとしてHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01、またはHLA-DPB1*02:01のいずれかを１つ有し、感受性アリルとしてHLA-DPB1*05:01またはHLA-DPB1*09:01のいずれかを１つ有するヒトは、ＨＢＶ患者群には４１１人が含まれ、健常対照群には４７７人が含まれていた。ＨＢＶ患者群１３８０人のうち、この具体例に示すアリルの組み合わせを有するヒトは、４１１人である。また、健常対照群１２２５人のうち、この具体例に示す特定のアリルの組み合わせを有するヒトは、４７７人である。つまり、ＨＢＶ患者が、この具体例に示すアリルの組み合わせを有する確率Ｐｐは０．２９７であり、健常者が、この具体例に示すアリルの組み合わせを有する確率Ｐｈは０．３８８である。したがって、この具体例に示すアリルの組み合わせを有するヒトについて、ＨＢＶ患者群のオッズＯｓＰは０．４２であり、健常対照群のオッズＯｓＣは０．６３である。ここから、この具体例に示すアリルの組み合わせを有するヒトについて、ＨＢＶ患者群のオッズＯｓＰと健常対照群のオッズＯｓＣとの比、すなわち、オッズ比ＯＲは、０．６７であることが導出された。
以上、本発明者によってなされた発明をその実施の形態に基づき具体的に説明したが、本発明は前記実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で種々変更可能であることはいうまでもない。
本発明のＢ型肝炎の慢性化に関連するアリルをＨＢＶ患者群に対して解析することにより、特に、日本人を含むアジア人に特化したＢ型肝炎慢性化の分子機構の解明や創薬ターゲット候補分子の同定が可能になるという産業上利用可能性がある。また、ＨＢＶキャリアに対して解析することにより、当該キャリアを慢性化しやすい群と慢性化しにくい群とに分類することが可能となり、その後の治療方針の決定に役立つ情報を提供できるというという産業上利用性がある。さらに、当該アリルに加えて、他の免疫関連遺伝子のＳＮＰも含む検査キットの開発により医療費削減も可能となるという点で産業上利用可能性がある。
Claims (3)
- 日本人のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の遺伝要因の検出方法であって、以下の：
ａ）日本人のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に感受性であるか又は抵抗性であるアリルと、日本人の検体中の前記アリルに対応する塩基配列又はアミノ酸配列を比較する工程であって、
前記Ｂ型肝炎の慢性化に感受性のあるアリルがHLA-DPB1*05:01及びHLA-DPB1*09:01であり、前記Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のあるアリルがHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01であり、前記Ｂ型肝炎の病態進展に抵抗性のあるアリルがHLA-DPB1*02:01である工程；
ｂ）検体の前記アリルに対応する部位の塩基又はアミノ酸残基が、アリルの塩基又はアミノ酸残基と一致するかを解析する工程；及び
ｃ）前記検体が（ｉ）HLA-DPB1*02:01、HLA-DPB1*04:01又はHLA-DPB1*04:02と、（ｉｉ）HLA-DPB1*05:01又はHLA-DPB1*09:01のアリルの組み合わせを有することが、Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性であることを示す工程；
を含む、方法。 - 日本人のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展に感受性であるか又は抵抗性であるアリルを検出するプライマーを含み、
前記Ｂ型肝炎の慢性化に感受性のあるアリルがHLA-DPB1*05:01及びHLA-DPB1*09:01であり、前記Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のあるアリルがHLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01及びHLA-DPB1*02:01であり、前記Ｂ型肝炎の病態進展に抵抗性のあるアリルがHLA-DPB1*02:01であり、
Ｂ型肝炎の慢性化に抵抗性のあるアリルの組み合わせが、（ｉ）HLA-DPB1*02:01、HLA-DPB1*04:01又はHLA-DPB1*04:02と、（ｉｉ）HLA-DPB1*05:01又はHLA-DPB1*09:01のアリルの組み合わせである、日本人のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の遺伝要因の検出のための試薬。 - 請求項２に記載の試薬を含む、日本人のＢ型肝炎の慢性化及び／又は病態進展の遺伝要因の検出のためのキット。
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