WO2010047240A1 - 滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測方法 - Google Patents

滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2010047240A1
WO2010047240A1 PCT/JP2009/067638 JP2009067638W WO2010047240A1 WO 2010047240 A1 WO2010047240 A1 WO 2010047240A1 JP 2009067638 W JP2009067638 W JP 2009067638W WO 2010047240 A1 WO2010047240 A1 WO 2010047240A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
single nucleotide
risk
macular degeneration
allele
related macular
Prior art date
Application number
PCT/JP2009/067638
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
岳 岩田
聖 松野
Original Assignee
独立行政法人国立病院機構
参天製薬株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 独立行政法人国立病院機構, 参天製薬株式会社 filed Critical 独立行政法人国立病院機構
Publication of WO2010047240A1 publication Critical patent/WO2010047240A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for predicting the risk of wet age-related macular degeneration. More specifically, the present invention relates to a method for predicting the risk of wet age-related macular degeneration by detecting a single nucleotide polymorphism associated with wet age-related macular degeneration, and a kit used for the prediction method.
  • Age-related macular degeneration is a disease characterized by damage to the retinal tissue of the macular region with age, causing visual impairment, and one of the causes of visual impairment in the elderly that can lead to blindness It is. Age-related macular degeneration is the leading cause of blindness in the elderly in the Caucasian race. On the other hand, the frequency of Orientals represented by Japanese, that is, Mongoloid, is lower than that of Westerners.
  • Age-related macular degeneration can be classified into two main types. That is, atrophic age-related macular degeneration that is essentially caused by atrophy degeneration of retinal pigment epithelial cells in the macular region and atrophy degeneration of retinal photoreceptor cells secondary to atrophy degeneration of retinal pigment epithelial cells, and the choroid under the retina of the macular region It can be classified into exudative age-related macular degeneration, in which new blood vessels originated from the blood and cause bleeding and cell exudation. These two age-related macular degeneration initially show very similar pathologies: drusen formation and pigmentation or depigmentation.
  • a single nucleotide polymorphism is a substitution mutation in which one base changes to another base in the base sequence of an individual's genome. Present at a frequency of 1% or more. Single nucleotide polymorphisms exist in introns, exons, or other genomic regions on genes.
  • a fundus test for example, a method of inspecting the fundus by intravenously injecting a fluorescent dye is used.
  • the burden on the patient is not necessarily light, such as that the mydriatic state persists for several hours after the examination.
  • a test is a test for determining leakage of a fluorescent dye from a blood vessel, it cannot be used for diagnosis unless a certain degree of symptoms has progressed.
  • the present inventors focused on polymorphisms on the genome, especially single nucleotide polymorphisms, in order to find genes related to wet age-related macular degeneration.
  • An object of the present invention is to provide a method for predicting the risk of wet age-related macular degeneration by detecting a single nucleotide polymorphism associated with wet age-related macular degeneration, and a kit used for the detection method. is there.
  • the present inventors have known polymorphic sites present on the genome (especially, autosome) of wet age-related macular degeneration patients (wAM patients) and non-wet age-related macular degeneration patients (non-wAM patients).
  • the single nucleotide polymorphism related to wet age-related macular degeneration was found, and furthermore, the risk allele and the non-risk allele that is the opposite allele were found in the single nucleotide polymorphism, and the present invention was completed. .
  • the present invention [1] A nucleic acid molecule in a sample derived from a subject, which is present in the 17th position of the base sequence in at least one base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1-124 or a complementary sequence thereof A step of detecting in vitro a single nucleotide polymorphism allele to be detected (detection step), and a step of determining whether at least one of the detected alleles is a risk allele (determination step) A method for predicting the risk of wet age-related macular degeneration, and [2] at least one selected from the group consisting of base sequences represented by SEQ ID NOs: 1-124 for nucleic acid molecules in a sample derived from a subject Prediction of risk of wet age-related macular degeneration comprising a nucleic acid molecule for detecting in vitro the allele of the single nucleotide polymorphism present at position 17 in the base sequence or its complementary sequence Related to the kit.
  • the sample provider can take preventive measures for wet age-related macular degeneration or receive regular diagnosis by taking regular visits and start appropriate treatment at an early stage when the disease does not progress .
  • a sample provider suspected of wet age-related macular degeneration can be determined to have a high probability of being diagnosed as wet age-related macular degeneration, and treatment is started at an early stage. be able to.
  • FIG. 1 is an example of a diagram showing an LD block structure to which a single nucleotide polymorphism of the present invention belongs.
  • FIG. 2 is an example of a diagram showing an LD block structure to which the single nucleotide polymorphism of the present invention belongs.
  • FIG. 3 is an example of a diagram showing an LD block structure to which the single nucleotide polymorphism of the present invention belongs.
  • FIG. 4 is an example of a diagram showing an LD block structure to which the single nucleotide polymorphism of the present invention belongs.
  • FIG. 5 is an example of a diagram showing an LD block structure to which the single nucleotide polymorphism of the present invention belongs.
  • FIG. 6 is an example of a diagram showing an LD block structure to which the single nucleotide polymorphism of the present invention belongs.
  • the present invention specifies a nucleic acid molecule in a sample derived from a subject in a method for predicting the risk of wet age-related macular degeneration based on a single nucleotide polymorphism of a gene (hereinafter sometimes referred to as SNP).
  • the present invention finds single nucleotide polymorphisms related to wet age-related macular degeneration (also referred to as single nucleotide polymorphisms of the present invention), further finds risk alleles and their alleles in the single nucleotide polymorphisms, and uses these In particular, it has a great feature. Therefore, using the risk allele and / or using the odds ratio calculated based on the frequency of the risk allele and its allele as an index, predicting the onset of such exudative age-related macular degeneration The prediction method can also be used as a method for measuring or determining a factor for the onset of wet age-related macular degeneration.
  • the polymorphism means that there is diversity in the sequence at a specific position of the genome in a certain biological species, and the site where the polymorphism exists (hereinafter also referred to as polymorphic site) The site on the genome where a single nucleotide polymorphism exists.
  • an allele refers to each type having different bases that can be taken at a certain polymorphic site.
  • the genotype refers to an arbitrary combination of a specific allele (also referred to as one allele) and an allele opposite to the allele (also referred to as the other allele) at a certain polymorphic site.
  • the same allele combination is called a homotype and the different allele combination is called a heterotype.
  • an allele that conflicts refers to another allele that corresponds to the specified allele that constitutes a single nucleotide polymorphism.
  • the single nucleotide polymorphism associated with wet age-related macular degeneration is between a wet age-related macular degeneration patient (wAM patient) and a non-wet age-related macular degeneration patient (non-wAM patient).
  • the single nucleotide polymorphism in which the ratio of the frequency of each allele in the single nucleotide polymorphism is statistically significantly different by a certain p value.
  • the risk of wet age-related macular degeneration refers to the risk of wet age-related macular degeneration.
  • the risk of wet age-related macular degeneration in the present invention includes the possibility of developing wet age-related macular degeneration in the future.
  • risk prediction means that the presence or absence of a future risk is determined at the present time, or the magnitude of the future risk is determined at the present time.
  • the risk allele means that the odds ratio obtained for each allele of the alleles of single nucleotide polymorphisms related to wet age-related macular degeneration is greater than 1.
  • a non-risk allele is an allele whose risk ratio is 1 or less because it is a confrontation allele of a risk allele.
  • the odds ratio obtained for each allele that is, the odds ratio obtained for one allele is the ratio of the frequency of one allele to the frequency of the other allele (opposite allele) in the wAMD patient group. Divided by the ratio of the frequency of the one allele to the frequency of the other allele in the group.
  • the odds ratio obtained for one allele is the reciprocal of the odds ratio obtained for the other allele. Details of the odds ratio will be described later.
  • the allele frequency means the ratio of a specific allele to the whole in a certain group.For example, the allele of each individual belonging to a certain group is determined by the method described in the examples. Can be obtained. Other matters not described in this specification include the introduction to genetic statistics (Naoya Kamatani; Iwanami Shoten 2007) or bioinformatics 2nd edition (written by Mount DW, translated by Koji Okazaki et al .; Medical Science International, 2005). You can refer to the booklet.
  • Single nucleotide polymorphisms associated with wet age-related macular degeneration are determined from the blood of wAM patients diagnosed with wet age-related macular degeneration and non-wAM patients diagnosed with no wet age-related macular degeneration. DNA is extracted, and about 150,000 known single nucleotide polymorphisms on the human genome are used as an index, and individual single nucleotide polymorphism alleles are specific to wAMD patients or non-wAMD patients, more specifically, statistics It was found by analyzing whether it existed significantly.
  • the non-wAMD patient as a control may be any person who is not exudative age-related macular degeneration.
  • patients diagnosed as not having wet age-related macular degeneration and diagnosed with other diseases such as glaucoma and / or cataract may be used as controls.
  • patients (group) with other diseases used as controls and patients (group) with wet age-related macular degeneration It is preferable to use a single nucleotide polymorphism such that a comparison is performed for a plurality of diseases, and in common it is determined that there is a significant difference at a certain p value.
  • the risk of wet age-related macular degeneration can be predicted.
  • Total DNA is extracted from the blood of a wAMD patient diagnosed with wet age-related macular degeneration and a non-wAMD patient diagnosed with no wet age-related macular degeneration.
  • Total DNA in blood can be extracted by any known method, but can be extracted by a known method such as a phenol extraction method (Methods in Enzymology, 152, 181 pages, 1987).
  • the type of base in the single nucleotide polymorphism in the extracted DNA sample that is, the identification of the allele at each polymorphic site is performed by, for example, a method using a solidified probe (microarray) described later, PCR such as TaqMan (registered trademark) method, etc. It can be performed by an arbitrary method such as an applied method. In that case, the probe used for detection can be designed based on the target single nucleotide polymorphism and its peripheral sequence information.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • Genbank Genbank provided by NCBI, etc. It is also possible to refer to information such as sequences obtained from these databases using known database of sequence information.
  • the probe used for detecting a single nucleotide polymorphism can be detected by either a probe complementary to the genomic sense strand or a probe complementary to the antisense strand.
  • kits that can detect a large number of single nucleotide polymorphism alleles in the same procedure by solidifying a large number of probes capable of detecting single nucleotide polymorphisms existing on the human genome. It is also possible to detect alleles in a sample efficiently. Many of such kits are configured to detect each opposing allele contained in one sample by the same operation, and can determine the genotype.
  • a microarray type single nucleotide polymorphism analysis kit (Affymetrix, Genechip Human Mapping 250K Nsp / Sty array (GeneChip (registered trademark) Human Mapping 250K Nsp / Sty Array) ].
  • Single nucleotide polymorphisms related to wet age-related macular degeneration are performed by identifying alleles present in DNA from wAMD patients and non-wAMD patients in the manner described above, and determining the frequency of each allele from wAMD patients and non-wAMD. It is possible to make a judgment based on whether or not there is a significant difference in the allele frequency between the p-values described later by statistical comparison between patients.
  • Fisher's exact test or chi-square test can be used.
  • a known method such as Bonferroni, Holm, or Benjamini and Hofburg (False Discovery Rate; FDR), etc. It can be corrected by this method.
  • based on Bonferroni's correction it is related to wet age-related macular degeneration by dividing the desired significance level, eg, 5 ⁇ 10 -2 significance level, by the number of iterations, ie, the number of polymorphic sites used in the analysis.
  • a single nucleotide polymorphism associated with wet age-related macular degeneration is determined at a risk rate of at most 5 ⁇ 10 -2 even if maximum error of the first type is considered can do.
  • a single nucleotide polymorphism lower than the significance level set in this way can be selected as a more preferable single nucleotide polymorphism.
  • the significance level when repeatedly analyzing 500,000 single nucleotide polymorphisms is preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 2 , more preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 3 , and 1 ⁇ 10 ⁇ 4 is more preferable, 1 ⁇ 10 ⁇ 5 is more preferable, 3 ⁇ 10 ⁇ 6 is more preferable, 1 ⁇ 10 ⁇ 6 is more preferable, 3 ⁇ 10 ⁇ 7 is further preferable, and 1 ⁇ 10 ⁇ 7 is more preferable.
  • the first type of error and the statistical power are inversely proportional.
  • One method of maintaining power while reducing the first type of error is to perform single nucleotide polymorphism analysis in two stages (Skol AD et al., Nature Genetics. 2006: 38: 209-213). For example, first, a large number of single nucleotide polymorphism analyzes over the entire genome are performed as a primary analysis, and then an analysis is performed using a single nucleotide polymorphism narrowed down to some extent in the primary analysis as a secondary analysis. In this case, a single nucleotide polymorphism that has a relatively low p value in any analysis may be selected.
  • a single nucleotide polymorphism that is a candidate in the first analysis is a desired p value, for example, 0.001 to What is less than 0.05 is selected, and the selected single nucleotide polymorphism may be further analyzed in consideration of multiplicity.
  • a region where SNPs related to a disease are continuously present at a relatively low p value is found in a certain region on the genome. SNPs belonging to such areas are highly related to diseases.
  • a region in which single nucleotide polymorphisms related to a disease are continuously present in this manner may have a so-called linkage disequilibrium state in which the recombination rate of genomic DNA is 0 or extremely low. High nature.
  • a region on the genome in linkage disequilibrium is called an LD block.
  • Whether or not the region is in a linkage disequilibrium state is determined by a known method based on the analysis result of the region or a database of linkage disequilibrium, for example, a database of known LD block structures provided by the HapMap project. This can be confirmed.
  • any single nucleotide polymorphism in the linkage disequilibrium state preferably any single nucleotide polymorphism, preferably the pairwise tagging method
  • a single nucleotide polymorphism determined by narrowing down by the so-called tag SNP, a plurality of single nucleotide polymorphisms in the linkage disequilibrium state can be represented.
  • the periphery of the single nucleotide polymorphism related to wet age-related macular degeneration of the present invention for example, by reanalyzing the single nucleotide polymorphism using TaqMan (registered trademark) SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems) ⁇ ⁇ New disease-related single nucleotide polymorphisms may be found that are in linkage disequilibrium with the polymorphism.
  • a combination of genotypes in each single nucleotide polymorphism that is, the homotype of one allele A genotype that is a heterotype and a homotype of the other allele, a homotype of one allele + a heterotype of the other allele, a homotype of one allele vs. a heterotype of the other allele + a homotype of the other allele, And three statistical models of one allele homotype versus heterotype versus the other allele homozygous group for the wAMD patient group vs.
  • Comparative A glaucoma patient group
  • Comparative B wAMD patient group vs. cataract patient Fisher's exact test
  • comparison A and comparison B 508 single nucleotide polymorphisms with the lowest p value of the three statistical models obtained as described above, which are both less than 0.01 in comparison A and comparison B, are exudative aging. It was selected as a single nucleotide polymorphism candidate associated with macular degeneration.
  • cataract patients and glaucoma patients are collectively used as a control group, and the above-mentioned single nucleotide polymorphism candidate related to wet age-related macular degeneration is again applied to the pAM values of the wAMD patient group and the control group.
  • the minimum p value obtained by applying three statistical models was used as the p value representing the single nucleotide polymorphism.
  • Single nucleotide polymorphisms used to detect alleles or genotypes associated with wet age-related macular degeneration are those that are related to wet age-related macular degeneration when the multiplicity is adjusted by Bonferroni correction.
  • Bonferroni correction is performed on the number of single nucleotide polymorphisms that are candidates for nucleotide polymorphism, and a significance level for selecting a suitable single nucleotide polymorphism can be set. Specifically, the desired significance level of 5 ⁇ 10 ⁇ 2 is divided by the number of repetitions of 508, and a single nucleotide polymorphism with a p value of 9.84 ⁇ 10 ⁇ 4 or less is converted to a single base related to wet age-related macular degeneration. Among the polymorphisms, a more preferable single nucleotide polymorphism was used.
  • Bonferroni correction is known to be an overcorrection, and therefore, it is one to two orders of magnitude higher than the above-mentioned significance level, for example, a single base number having a p value of less than 1 ⁇ 10 ⁇ 3.
  • the mold can be considered related to wet age-related macular degeneration.
  • the quality of the detection result is confirmed in advance for the single nucleotide polymorphism used in the analysis, and the single nucleotide polymorphism detected at a reasonable quality is analyzed. It is desirable to provide. Elements used for such quality confirmation include call rate, Hardy-Weinberg equilibrium and minor allele frequency.
  • each single nucleotide polymorphism in all samples that is, the polymorphic site having a low call rate has a high rate of occurrence of typing errors and is not highly reliable. For this reason, it is desirable to analyze using a single nucleotide polymorphic site having a sufficiently high call rate.
  • a call rate as a criterion for accepting or rejecting a single nucleotide polymorphism, for example, a single nucleotide polymorphism showing a call rate of 70%, preferably 75%, more preferably 80%, still more preferably 85%, more preferably 90% or more. It is desirable to adopt a mold.
  • Hardy-Weinberg equilibrium means that in a genetically uniform population with no sufficient variation or selection pressure and a sufficient number of individuals formed by random mating, the distribution frequency of alleles at a given locus Say that it is constant. Whether or not the Hardy-Weinberg equilibrium is established can be statistically tested by several known methods such as the Chi-square test and Fisher's exact test. In general, Hardy-Weinberg equilibria are established in a sufficient number of human populations, so generally genotyping errors are detected on the assumption that Hardy-Weinberg equilibria are established in the population. The study of Hardy-Weinberg equilibrium is used for this purpose. When statistically testing the establishment of the Hardy-Weinberg equilibrium, 0.0001 is used as the significance level, for example.
  • the minor allele frequency is the frequency of the lower allele of the two alleles in the case of single nucleotide polymorphisms contained in the two alleles.
  • the threshold value can be set arbitrarily. As described above, since the concept of single nucleotide polymorphism has a minor allele frequency exceeding about 1%, it is desirable to reject single nucleotide polymorphisms having a minor allele frequency of less than 1%. In addition, in the search for polymorphisms that cause multifactor diseases such as the present invention, it is considered that a plurality of polymorphisms having relatively low relative involvement in the disease are involved. It is desirable to reject single nucleotide polymorphisms with a certain frequency, for example, less than 5%.
  • Single nucleotide polymorphisms related to wet age-related macular degeneration are known sequences such as Genbank provided by NCBI or databases such as dbSNP or HapMap project provided by NCBI.
  • SNP ID especially dbSNP ID
  • sequence information around the single nucleotide polymorphism A gene having a nucleotide polymorphism or a gene in the vicinity of a single nucleotide polymorphism, and if present on a gene, distinguishing whether the position where the single nucleotide polymorphism exists is an intron or an exon, the function of the gene
  • information such as homologous genes can be obtained, nucleic acid molecules used in the present invention can be obtained based on these information, and probes used in the present invention can be designed.
  • the odds ratio can be determined. Odds is the value of the probability of an event occurring in a group divided by the probability that the event does not occur.
  • the odds ratio is the ratio of odds in two different groups.
  • the odds ratio that is a disease when having an allele that is, the ratio of the frequency of one allele in the wAMD patient group to the frequency of the other allele that opposes the one allele Is divided by the ratio of the frequency of one allele to the other frequency in the non-wAMD patient group.
  • the obtained odds ratio is referred to as the obtained odds ratio for the “one allele”.
  • the odds ratio can be approximated using an appropriate number instead of 0. .
  • an appropriate number used in place of 0 for example, a real number exceeding 0 such as 0.5 or 0.1 can be used.
  • the risk allele is determined using the odds ratio obtained for the allele.
  • the odds ratio obtained for one allele is the reciprocal of the odds ratio obtained for the other allele.
  • an allele whose odds ratio obtained for an allele is greater than 1 is called a risk allele, and an allele that opposes the risk allele is called a non-risk allele.
  • the term “allele odds ratio” refers to the odds ratio obtained for the risk allele, that is, the odds ratio of wet age-related macular degeneration when the risk allele is present.
  • the risk of wet age-related macular degeneration can be predicted from these indices.
  • a certain single nucleotide polymorphism risk allele is an allele observed more frequently in the wAMD patient group than in the non-wAMD patient group, that is, an allele involved in the risk of wet age-related macular degeneration.
  • the reciprocal of the odds ratio of the allele by using the reciprocal of the odds ratio of the allele, it is possible to predict the disease risk of the non-risk allele. That is, as the reciprocal of the odds ratio of the allele is smaller than 1, it can be used for predicting that the disease risk of the non-risk allele is low.
  • the risk of wet age-related macular degeneration may be predicted using a genotype in addition to or instead of an allele, that is, a genotype that is a combination of one allele and its allele. it can.
  • the risk allele may be used as a reference in the same manner as in the case of the allele, and the genotype considered to be at risk of wet age-related macular degeneration can be determined in consideration of the odds ratio.
  • the odds ratio of dominant type and recessive type odds ratio are obtained based on the risk allele.
  • the dominant type odds ratio is the odds ratio of wet age-related macular degeneration when there is at least one risk allele (that is, when the risk allele is homozygous or heterozygous), that is, a wAMD patient
  • the recessive odds ratio is the odds ratio of wet age-related macular degeneration when the risk allele is homozygous, that is, the frequency of the risk allele homotype in the wAMD patient group
  • the ratio of the non-risk allele homozygous frequency to the sum of the heterozygous frequencies is calculated as follows: Divided by the ratio to the sum of the frequencies.
  • genotypes that are considered to be at risk of wet age-related macular degeneration the following are determined in consideration of the dominant-type odds ratio and the recessive-type odds ratio obtained as described above. be able to.
  • each single nucleotide polymorphism related to wet age-related macular degeneration if the dominant odds ratio is larger than the recessive odds ratio, the risk allele of the single nucleotide polymorphism is related to the dominant odds ratio.
  • the recessive odds ratio is larger than the dominant odds ratio, the single nucleotide polymorphism risk allele is related to the recessive odds ratio.
  • the genotype that is considered to be at risk for wet age-related macular degeneration in the single nucleotide polymorphism is the risk allele homozygous or heterozygous, and the risk allele is When related to the type odds ratio, the genotype considered to be at risk of wet age-related macular degeneration in the single nucleotide polymorphism is a homozygous risk allele.
  • the odds ratio can be approximately calculated using an appropriate number instead of the zero.
  • an appropriate number used in place of 0 for example, a real number exceeding 0 such as 0.5 or 0.1 can be used.
  • the sample provider is predicted to be at risk for wet age-related macular degeneration be able to. In either case, the higher the odds ratio, the higher the risk of wet age-related macular degeneration.
  • the prediction accuracy can be improved by using the magnitude of the odds ratio. That is, it has many genotypes that are considered to be at risk for risk alleles or wet age-related macular degeneration and / or is not a genotype that is considered to be at risk for non-risk alleles or wet age-related macular degeneration.
  • the risk of exudative age-related macular degeneration in a sample provider with a small number is higher than the risk of a sample provider who does not, and in this case, the exudation occurs when there are more alleles or genotypes with a higher odds ratio.
  • the risk of type age-related macular degeneration is expected to be higher.
  • the odds ratio used as an index indicating the relationship between the allele or genotype and the degree of disease or the odds ratio used for risk prediction of wet age-related macular degeneration is a single base determined to be statistically significant.
  • the odds ratio calculated for the polymorphism is a single base determined to be statistically significant.
  • the single nucleotide polymorphism of the present invention may exist in any gene region such as an intron or exon on the genome, or may exist in any region that is not a gene on the genome.
  • the gene may be one of the causative genes for wet age-related macular degeneration.
  • the gene in the vicinity of the single nucleotide polymorphism and the single nucleotide polymorphism are linked, and the gene in the vicinity May be one of the causative genes of wet age-related macular degeneration, or the region containing the single nucleotide polymorphism or its vicinity is transcribed to mRNA, and other events through phenomena such as RNA interference. It may be involved in gene expression.
  • a gene to which the single nucleotide polymorphism of the present invention belongs on the genome, or a gene present in the vicinity of the single nucleotide polymorphism of the present invention on the genome is included in the scope of the present invention.
  • intron type single nucleotide polymorphism means that a single nucleotide polymorphism exists in an intron.
  • Translational region type single nucleotide polymorphism is a region where single nucleotide polymorphism exists in the region translated into protein, and the codon containing the single nucleotide polymorphism is a codon encoding another amino acid or a stop codon. It means a change in the amino acid sequence such as mutation.
  • Silent single nucleotide polymorphism refers to one having a single nucleotide polymorphism in the translation region and not accompanied by a change in amino acid sequence.
  • Genomic single nucleotide polymorphism means that a single nucleotide polymorphism exists in a region that does not encode a gene on the genome.
  • Transcriptional regulatory polymorphism refers to a single nucleotide polymorphism present at a site considered to be involved in transcriptional regulation on an exon.
  • the single nucleotide polymorphism may exist at any position on the genome, and in any case, it may have an association with a disease.
  • the presence of single nucleotide polymorphisms in introns or untranslated regions may affect gene expression control, splicing that occurs after gene transcription, and mRNA stability. If there is a single nucleotide polymorphism in the translation region, the substitution of the base changes the codon corresponding to one amino acid to a codon corresponding to another amino acid, or changes to a stop codon. Changes may occur in the structure of the protein encoded by. These changes cause changes in the expression level and function of the gene, and in turn the expression level or function of the protein encoded by the gene, which can cause various diseases.
  • a genomic single nucleotide polymorphism When a genomic single nucleotide polymorphism is associated with a disease, the region containing the polymorphic site is actually translated and may have some influence on the expression of other genes.
  • a silent single nucleotide polymorphism When a silent single nucleotide polymorphism is associated with a disease, there is another polymorphism associated with the disease around the single nucleotide polymorphism, and the polymorphism and the silent single nucleotide polymorphism are in a linkage disequilibrium state. In some cases, an association with a disease may be observed.
  • the single nucleotide polymorphism itself is not a direct cause of exudative age-related macular degeneration, but the exudative age-related macular present in the vicinity Even in the state of linkage disequilibrium with the polymorphism that is the true cause of degeneration, an association between these single nucleotide polymorphisms and wet age-related macular degeneration may be observed.
  • nucleic acid molecules containing alleles related to wet age-related macular degeneration In another aspect of the invention, a nucleic acid molecule comprising a single nucleotide polymorphism associated with wet age-related macular degeneration, and a sequence complementary to a nucleic acid molecule comprising a single nucleotide polymorphism associated with wet age-related macular degeneration A nucleic acid molecule is provided.
  • a nucleic acid molecule containing a nucleic acid sequence containing a single nucleotide polymorphism described in Tables 1 to 11 and / or a nucleic acid molecule containing a complementary sequence of the sequence is a nucleic acid molecule used for allele detection in the present invention.
  • the nucleic acid molecule used for allele detection in the present invention is preferably a nucleic acid molecule containing a single nucleotide polymorphism described in Tables 1 to 10 or a fragment thereof, and at least one of the nucleic acid molecules or the nucleic acid molecule concerned A nucleic acid molecule or a fragment thereof, more preferably a nucleic acid molecule comprising a single nucleotide polymorphism described in Table 1 or Tables 2 to 4, or a fragment thereof, wherein at least any one of said nucleic acids A nucleic acid molecule complementary to the molecule or the nucleic acid molecule or a fragment thereof, and more preferably a nucleic acid molecule or a fragment thereof comprising the single nucleotide polymorphism described in Table 1, and at least one of the nucleic acid molecules Alternatively, it is a nucleic acid molecule complementary to the nucleic acid molecule or a fragment thereof.
  • nucleic acid molecules containing single nucleotide polymorphisms described in Tables 1 to 11 or nucleic acid molecules complementary to the nucleic acid molecules nucleic acid molecules containing risk alleles or nucleic acid molecules complementary to the nucleic acid molecules It is desirable to be.
  • Nucleic acid molecules containing a single nucleotide polymorphism associated with wet age-related macular degeneration or nucleic acid molecules having a sequence complementary to the nucleic acid molecule may be used as a marker for determining the level of wet age-related macular degeneration risk. it can. Furthermore, these nucleic acid molecules can be used as a probe for detecting a risk allele or its allele in the single nucleotide polymorphism or determining a genotype. Further, when the single nucleotide polymorphism is present on an exon, these nucleic acid molecules can be used for detection of a gene transcript.
  • a more preferable nucleic acid molecule can be selected by the same method as described in the section of identifying a single nucleotide polymorphism associated with wet age-related macular degeneration.
  • Nucleic acid molecules constituting the eukaryotic genome are composed of a double strand of a sense strand and an antisense strand complementary to the sense strand. That is, a single nucleotide polymorphism is also composed of a sense strand and an antisense strand, and detecting any single nucleotide polymorphism has the same meaning, so the nucleic acid molecule of the present invention includes any of these. .
  • nucleic acid molecule in the present invention is deoxyribonucleic acid or ribonucleic acid
  • a nucleic acid molecule having both of these in the same nucleic acid molecule is also included in the present invention.
  • the nucleoside defined by thymidine (T) in the sequence of the present invention can be read as uridine '(U).
  • uridine '(U) the nucleoside defined by thymidine
  • these nucleic acid molecules can be chemically modified as necessary within the range not impairing the function for use in the present invention.
  • the function in this case refers to the function of achieving the purpose of using the nucleic acid molecule.
  • the nucleic acid molecule in the present invention is based on the sequence information disclosed in the present specification or the sequence information obtained by searching information such as the database ID disclosed in the present specification in a database such as dbSNP, HapMap or Genbank. Can be synthesized using a known method such as the phosphoramidite method. It is also possible to synthesize using a commercially available DNA synthesizer.
  • the nucleic acid molecule in the present invention is obtained from a sample containing human-derived DNA, by a known method such as PCR method, or for some nucleic acid molecules from a sample containing human-derived RNA, such as RT-PCR method. It can be obtained by a known method.
  • Primers necessary for acquisition can be designed by those skilled in the art based on sequence information disclosed in the present specification or sequence information that can be searched from information such as database IDs disclosed in the present specification.
  • a primer of about 10 to 30 bases having a sequence homologous to a partial sequence of the target nucleic acid molecule can be used, and when using the RT-PCR method, A reverse transcription reaction is performed using an oligo dT primer, random hexamer or the like to prepare a complementary DNA (cDNA), and the target sequence in the cDNA can be amplified by the PCR method described above.
  • the nucleic acid molecule preferably has a length of 16 to 50 bases, more preferably 23 to 27 bases, and even more preferably 25 bases, and is complementary to the above-described polymorphic site and its peripheral sequence, or a complementary sequence thereto. Desirably, the nucleic acid molecule comprises a sequence.
  • the nucleic acid molecule can be subjected to any chemical modification as long as its function is not impaired. The function in this case refers to the function of achieving the purpose of using the nucleic acid molecule.
  • nucleic acid molecules used for allele detection are represented by SEQ ID NOs: 1-124
  • SEQ ID NOs: 1-124 In at least one base sequence selected from a group consisting of base sequences (each of which corresponds to one single nucleotide polymorphism in a pair of odd-numbered and even-numbered base sequences) or a complementary sequence thereof, or a partial sequence thereof
  • a nucleic acid molecule comprising a sequence having an allele corresponding to the 17th base sequence of SEQ ID NOs: 1-124, More preferably, at least one base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 14 or a complementary sequence thereof, or a partial sequence thereof, the base sequences represented by the above-mentioned SEQ ID NOs: 1 to 14
  • each set of base sequences is a base sequence containing one single nucleotide polymorphism of each other in the 17th base.
  • f SEQ ID NO: 11 and / or SEQ ID NO: 12
  • the partial sequence means a fragment of a nucleic acid sequence, and the sequence length is not limited as long as it has an allele corresponding to the 17th of the sequence.
  • a fragment of a nucleic acid sequence containing a single nucleotide polymorphism of the present invention obtained by searching a single nucleotide polymorphism of the present invention in a database of known single nucleotide polymorphisms such as dbSNP or a database of known sequence information is also a partial sequence of the present invention. include.
  • nucleic acid molecule containing any one of the above single nucleotide polymorphisms, among them, the sequence represented by the odd-numbered sequence number of the set of sequences containing each single nucleotide polymorphism, or a complementary sequence thereof, or these It is preferable to use a nucleic acid molecule comprising a single nucleotide polymorphism allele present at the 17th position of the selected nucleotide sequence in the nucleotide sequence consisting of the partial sequence of The nucleic acid molecule is preferably composed of a sequence containing the allele. These are base sequences containing risk alleles at each polymorphic site.
  • a probe capable of detecting an allele associated with wet age-related macular degeneration is provided.
  • the probe in the present invention can be prepared in the same manner as the nucleic acid molecule of the present invention described above.
  • the probe is capable of hybridizing with a nucleic acid sequence containing each single nucleotide polymorphism allele described in Tables 1 to 11 below or a complementary sequence thereof under stringent conditions (also referred to as high stringency conditions). Anything can be used.
  • the probe of the present invention is a probe capable of detecting a risk allele and / or a non-risk allele included in at least one single nucleotide polymorphism described in Tables 1 to 10, more preferably Table 1 A probe capable of detecting a risk allele and / or a non-risk allele included in at least one single nucleotide polymorphism described in 1 to 4, more preferably at least one single nucleotide described in Table 1 A probe capable of detecting a risk allele and / or a non-risk allele included in a polymorphism.
  • a risk allele can be detected as one of preferred embodiments.
  • a probe by using both a probe capable of detecting a risk allele and a probe capable of detecting a non-risk allele in one single nucleotide polymorphism, the genotype of the single nucleotide polymorphism can be determined.
  • hybridization means that a nucleic acid molecule having a certain sequence and a nucleic acid molecule complementary to at least a part of the nucleic acid molecule associate with each other through hydrogen bonds based on complementary base sequences.
  • the types of complementary nucleic acid molecules associated with the original nucleic acid molecule may be the same or different, and the types of nucleic acid molecules constituting these nucleic acid molecules may be deoxyribonucleic acid, ribonucleic acid, or the same nucleic acid It may have both in the molecule.
  • stringent conditions or high stringency conditions mean conditions under which a nucleic acid molecule having a sequence complementary to a partial sequence of the nucleic acid molecule specifically hybridizes to a nucleic acid molecule having a certain sequence.
  • a solid-phase probe consisting of a 25-base long DNA molecule examples include, for example, 0.056M 2- (N-Morpholino) ethanesulfonic acid, 5% DMSO, 2.5 ⁇ Denhardt's solution, 5.77 mM EDTA, 0.0115%
  • the conditions include denaturation at 95 ° C. for 10 minutes and hybridization at 49 ° C. in the presence of Tween-20, 2.69M Tetrametyl Ammonium Chloride. It is known that such conditions may vary depending on the sequence length of nucleic acid molecules used as probes and the degree of chemical modification. Optimizing hybridization and / or washing conditions that allow specific hybridization This is possible with the ordinary creative ability of those skilled in the art.
  • allele-specific means that the allele is contained in a nucleic acid molecule containing the polymorphic site, or that a certain nucleic acid molecule contains the allele in the polymorphic site.
  • the probe in the present invention has a sequence specific to the allele of the sense strand. Any nucleic acid molecule having a complementary sequence, ie a sequence specific to the antisense strand allele, and a sequence complementary to the sequence specific to the antisense strand allele, ie a sequence specific to the sense strand allele included.
  • the probe of the present invention can also be used for detection of cDNA or mRNA containing the single nucleotide polymorphism of the present invention. When used for detection of cDNA or mRNA, the single nucleotide polymorphism that is present in the exon or in the vicinity thereof is preferably used.
  • the probe in the present invention is composed of nucleic acid molecules containing allele-specific sequences or their complementary strands or partial sequences thereof described in Tables 1 to 11 below.
  • the probe in the present invention has any number of bases not derived from the sequence for the purpose of providing a spacer or stabilization at the end, as long as it can hybridize to the allele-specific sequence or its complementary strand under stringent conditions. Sequences can be added. Preferably, the sequence contributing to allele-specific hybridization in the probe of the present invention comprises only an allele-specific sequence or its complementary strand.
  • the probe can be given any label for use in detection. Any label used for the probe can be used, but in general, fluorescent labels such as FITC and Cy3, biotin, or enzyme labels such as alkaline phosphatase and horseradish peroxidase are generally used. When a biotin label is used, streptavidin or avidin that specifically binds to biotin is further subjected to a detectable label, and the labeled streptavidin or the like is used as a secondary label.
  • a labeled anti-biotin antibody can be used instead of labeled streptavidin or the like.
  • the detection sensitivity can be improved by using a labeled anti-streptavidin antibody as a tertiary label for streptavidin bound to biotin.
  • a labeled anti-streptavidin antibody as a tertiary label for streptavidin bound to biotin.
  • Any known method can be used for labeling the probe, and this method is well known to those skilled in the art.
  • Arbitrary sequences serving as the spacers described above can be added to the probe, and the spacers can be labeled.
  • Reagents for labeling probes, labeled streptavidin, labeled anti-biotin antibodies, and the like are commercially available as reagents and can be purchased and used.
  • the probe in the present invention can specifically hybridize to a nucleic acid molecule having the target allele, it is a nucleic acid having both of them in the same nucleic acid molecule regardless of whether it is deoxyribonucleic acid or ribonucleic acid.
  • Molecular probes are also included in the present invention.
  • the nucleoside defined by thymidine (T) in the sequence of the present invention can be read as uridine '(U).
  • the probe in the present invention can be chemically modified as necessary as long as it can specifically hybridize to a nucleic acid molecule having the target allele under stringent conditions. Any known method can be used for chemical labeling.
  • the probe for detection can be detected by a known method by reacting with a sample in a solution state, or can be solidified on a carrier in advance.
  • the probe corresponding to each allele of several to several hundred thousand different single nucleotide polymorphisms is solidified at a predetermined position on a solid support in advance of one to ten or more probes for each single nucleotide polymorphism.
  • a so-called microarray which is a solidified probe in which a sample is reacted with this, a signal generated from the hybridized probe is scanned and analyzed using a computer.
  • the maximum number of probes to be solidified is limited by the solidification density of the probe and the area of the solidified site.
  • the nucleic acid molecule in the sample should be labeled by a known method and bound to the solidified unlabeled probe of the present invention or detected.
  • the solid layer derived from the labeled nucleic acid molecule having the allele to be detected by binding the nucleic acid molecule having the allele to the unlabeled probe of the present invention which has been solidified and then labeling by a known method. Signal can be detected.
  • Solidification can be carried out by any known method, and for example, synthetic oligo prints, spotting photolithographs and the like can be used.
  • carrier Generally used materials, for example, polymers, such as a polycarbonate and a polystyrene, glass, a silicon crystal, etc. are used.
  • a coating such as cationization may be applied to the carrier in advance before solidification.
  • blocking can be performed with a known blocking agent after solidification.
  • Any blocking agent can be used as long as it can suppress adsorption of non-specific nucleic acid to the carrier.
  • Any blocking agent can be used as long as it can suppress adsorption of non-specific nucleic acid to the carrier.
  • Anionic surfactants such as nonionic surfactants such as polyoxyethylene sorbitan monolaurate can be used.
  • each opposing allele contained in one sample can be operated by the same operation. It can also be set as the structure to detect. In such a configuration, not only the allele of the sample but also the genotype can be determined by the same operation.
  • the preferred sequence length of the probe for detection varies depending on the detection method, but may be any one that can specifically detect the single nucleotide polymorphism allele or genotype associated with wet age-related macular degeneration of the present invention.
  • the probe when a solid-phase probe is used for detection of an allele, the probe preferably has a length of 16 to 50 bases, more preferably 23 to 27 bases, more preferably 25 bases, and the polymorphism described above.
  • a probe comprising a nucleic acid molecule comprising a site and its surrounding sequence or a sequence complementary thereto, and the probe for detecting an allele in a solution state is preferably 16 to 50 bases, more preferably 23 to 27.
  • the probe used for allele detection is a base represented by SEQ ID NOs: 1-124 It consists of at least one base sequence selected from a group consisting of sequences (each of which corresponds to one single nucleotide polymorphism in a pair of odd-numbered and even-numbered base sequences, or a complementary sequence thereof, or a partial sequence thereof.
  • a probe containing a base sequence having an allele corresponding to the 17th position of the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1-124 Preferably, at least one base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 14, or a complementary sequence thereof, or a base sequence consisting of a partial sequence thereof, is represented by the aforementioned SEQ ID NOs: 1 to 14
  • a probe containing a base sequence having an allele corresponding to the 17th base sequence More preferably, in the following, at least one base sequence selected from the group consisting of a base sequence set comprising a single nucleotide polymorphism of a to g, or a complementary sequence thereof, or a base sequence consisting of a partial sequence thereof: A probe containing a base sequence having an allele corresponding to the 17th base sequence of the base sequences included in the set of a to g.
  • each set of base sequences is a base sequence containing one single nucleotide polymorphism of each other in the 17th base.
  • f SEQ ID NO: 11 and / or SEQ ID NO: 12
  • a probe containing any one of the above-mentioned single nucleotide polymorphisms among them, a sequence represented by an odd-numbered sequence number or a complementary sequence thereof among a set of sequences containing each single nucleotide polymorphism, or these It is preferable to use a probe containing a single nucleotide polymorphism allele present at the 17th position of the selected base sequence in the base sequence consisting of the partial sequence. These are base sequences containing risk alleles at each polymorphic site.
  • a method for detecting whether a sample containing nucleic acid molecules has an allele or genotype that is frequent in wAMD patients.
  • Samples include nucleic acid molecules, that is, those capable of extracting genome-derived nucleic acid molecules (DNA and / or RNA), or mRNA or cDNA containing a gene present in the vicinity of the single nucleotide polymorphism of the present invention
  • Any substance can be used as long as it can be extracted, for example, blood, white blood cells, hair roots, hair, saliva, oral mucosal cells, nasal mucosal cells, skin, or tissues such as muscles or organs obtained by biopsy are used. .
  • the nucleic acid molecules constituting the eukaryotic genome are composed of complementary sense strands and antisense strands, and the single nucleotide polymorphism allele of the present invention is detected in the nucleic acid molecules contained in the sample. Can be performed by detecting either the sense strand or the antisense strand of the polymorphic site.
  • the nucleic acid sequence of 33 base length containing a single nucleotide polymorphism related to wet age-related macular degeneration disclosed in the present invention is a base consisting of two base sequences that differ only in the center (i.e., the 17th base). It consists of a set of sequences (that is, a set with an odd number and an even number), and the 17th base is a polymorphic site.
  • the base sequence including the risk allele in the polymorphic site is the previous (that is, odd-numbered) sequence in the set of base sequences. Risk alleles are described in Tables 1 to 11 below.
  • the risk of wet age-related macular degeneration of the sample provider can be predicted. That is, when at least one risk allele in the single nucleotide polymorphism exists in the nucleic acid molecule in the sample, it may be predicted that there is a risk of wet age-related macular degeneration.
  • each allele that opposes a specific allele contained in one sample can be detected to determine the genotype. That is, when only a certain allele is detected, it is a homotype having the allele as a homozygote, and when two alleles are detected, it is a heterotype having the two alleles as heterogeneous.
  • the genotype of the single nucleotide polymorphism contained in the nucleic acid molecule in the sample is determined, and the genes of the wAMD patient group and the control group described in Tables 1 to 11 described below Based on the type frequency data, a genotype considered to be at risk of wet age-related macular degeneration may be determined by the above-described method, and risk prediction may be similarly performed by comparing these genotypes. Note that the determination of the genotype of a single nucleotide polymorphism contained in a nucleic acid molecule in a sample does not necessarily require identification of the risk allele.
  • the risk of wet age-related macular degeneration can be predicted by comparing with a genotype considered to be present.
  • Any method can be used to detect the presence of these alleles in a sample containing nucleic acid molecules, but each can be detected by hybridizing using a probe specific for each of the aforementioned alleles and detecting the signal. Can detect alleles. By comparing the detected allele with the risk allele in the single nucleotide polymorphism disclosed in the present invention, it is possible to determine whether or not the risk allele in the single nucleotide polymorphism is present in the nucleic acid molecule in the sample.
  • the nucleic acid molecule of the present invention and / or the probe of the present invention is a method for detecting a single nucleotide polymorphism related to wet age-related macular degeneration of the present invention and a risk prediction method for wet age-related macular degeneration.
  • a risk prediction method for wet age-related macular degeneration Can be suitably used to determine the genotype considered to be at risk for risk alleles or exudative age-related macular degeneration.
  • a microarray in which probes corresponding to each allele to be opposed, that is, a risk allele and a non-risk allele included in a single nucleotide polymorphism, are respectively labeled, or each opposing allele is solidified
  • the solidified probe it is possible to detect each of the opposing alleles contained in the same sample. In such a configuration, not only the allele of the sample but also the genotype can be determined.
  • a solid-phase probe such as a microarray in which each opposing allele is solid-layered on the same carrier, it can be configured such that hybridization is performed by the same operation and detected by the same operation.
  • any known method can be used in addition to the method described above.
  • the following can be used.
  • the method of hybridizing using a probe include the TaqMan (registered trademark) method and the Invader (registered trademark) method, and any of these can be used. Even in the case of probes for detecting the same allele, a more preferable probe may differ depending on the method used for detection.
  • the determination of the single nucleotide polymorphism allele or genotype of the present invention does not depend on the detection method, but it is desirable to use a probe suitable for the detection method. Examples of the method that does not perform hybridization with a probe include a direct sequencing method for directly determining a base sequence.
  • allele-specific or “allele-specific” means that a nucleic acid molecule or base sequence containing the polymorphic site contains the allele, or that a certain nucleic acid molecule is In the polymorphic site, it is possible to hybridize specifically to a nucleic acid molecule having a sequence containing the allele under stringent conditions, i.e., so that alleles that are opposite to the allele can be identified. To tell.
  • the person who provided the sample will be exposed to wet age-related macular degeneration.
  • a person who is predicted to be at high risk and suspected wet age-related macular degeneration who provided the sample is likely to be diagnosed with wet age-related macular degeneration.
  • the risk of wet age-related macular degeneration can be predicted using the odds ratio.
  • the size of the risk can be predicted using as an index the number of risk alleles detected in the sample or the number of genotypes considered to be a risk of wet age-related macular degeneration or the odds ratio thereof. If the risk allele or the number of genotypes that are considered to be at risk for wet age-related macular degeneration or the odds ratio of these is greater, or if these numbers exceed a certain threshold, the risk is higher Can be determined.
  • nucleic acid molecules in the sample are listed in Tables 1 to 11 described later. Determination of alleles and / or genotypes of any single nucleotide polymorphism described in 1., single nucleotide polymorphism alleles and / or genotypes in the sample and the single nucleotide polymorphism disclosed in the present invention It includes any type of risk allele and / or a comparison of genotypes considered to be at risk for wet age-related macular degeneration disclosed in the present invention.
  • the method for predicting the risk of wet age-related macular degeneration comprises determining the allele and / or genotype of at least one single nucleotide polymorphism described in Tables 1 to 10; Alleles and / or genotypes of nucleotide polymorphisms and the risk alleles of the single nucleotide polymorphisms disclosed in the present invention and / or genotypes considered to be at risk of wet age-related macular degeneration disclosed in the present invention Performing at least one of the comparisons, More preferably, the method for predicting the risk of wet age-related macular degeneration of the present invention comprises determining the allele and / or genotype of at least one single nucleotide polymorphism described in Tables 1 to 4, Allele and / or genotype of single nucleotide polymorphism and the risk allele of the single nucleotide polymorphism disclosed in the present invention and / or genotype considered to be a risk of wet
  • the single nucleotide polymorphism used for detection is represented by SEQ ID NOs: 1-124.
  • Each base sequence in at least one base sequence or a complementary sequence thereof selected from the group consisting of base sequences (each corresponding to one single nucleotide polymorphism in a pair of odd-numbered and even-numbered base sequences, respectively) Is the 17th single nucleotide polymorphism of More preferably, in the at least one base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 14 or a complementary sequence thereof, a single nucleotide polymorphism present at the 17th position of each base sequence, More preferably, it is present in the 17th position of each base sequence in at least one base sequence selected from the group consisting of a base sequence set including a single nucleotide polymorphism of a to g below or a complementary sequence thereof.
  • each set of base sequences is a base sequence containing one single nucleotide polymorphism of each other in the 17th base.
  • b SEQ ID NO: 3 and / or SEQ ID NO: 4
  • c SEQ ID NO: 5 and / or SEQ ID NO: 6
  • d SEQ ID NO: 7 and / or SEQ ID NO: 8
  • e SEQ ID NO: 9 and / or SEQ ID NO: 10
  • f SEQ ID NO: 11 and / or SEQ ID NO: 12
  • g SEQ ID NO: 13 and / or SEQ ID NO: 14
  • the single nucleotide polymorphisms described in Tables 1 to 11 are preferably the single nucleotide polymorphisms described in Tables 1 to 10, more preferably the single nucleotide polymorphisms described in Tables 1 to 4, and more preferably in Table 1.
  • kits for detecting single nucleotide polymorphisms associated with wet age-related macular degeneration are provided.
  • the kit of the present invention includes all nucleic acid molecules in a sample that can detect any single nucleotide polymorphism risk allele described in Tables 1 to 11 described later.
  • the kit of the present invention is a kit capable of detecting at least one single nucleotide polymorphism risk allele and / or non-risk allele described in Tables 1 to 10, more preferably Table 1 to 4.
  • kits of the present invention in addition to any one single nucleotide polymorphism as described above, in addition to the single nucleotide polymorphism, at least one single nucleotide polymorphism risk allele described in Tables 1 to 11 and / or Alternatively, a kit capable of detecting a non-risk allele or determining a genotype is also one aspect of the present invention.
  • kits for determining a plurality of single nucleotide polymorphism alleles or genotypes in addition to any one single nucleotide polymorphism described above, preferably a single nucleotide polymorphism risk allele described in Tables 1 to 10 And / or a kit capable of detecting a non-risk allele or determining a genotype, more preferably further detecting or genotype of a single nucleotide polymorphism risk allele and / or non-risk allele described in Tables 1 to 4 More preferably, the kit can detect a single nucleotide polymorphism risk allele and / or a non-risk allele described in Table 1 or determine a genotype.
  • kits capable of detecting a risk allele and / or non-risk allele of at least one single nucleotide polymorphism in Tables 1 to 11 or determining a genotype
  • one of the preferred embodiments includes the single nucleotide polymorphism of the single nucleotide polymorphism. Kits that can detect risk alleles.
  • the kit of the present invention may detect either the single-stranded polymorphic sense strand or the antisense strand, or may detect both of them. good.
  • the detection method exemplified in the section of the probe is used.
  • kits for detecting a single nucleotide polymorphism associated with wet age-related macular degeneration using the above-described nucleic acid molecule of the present invention and / or the above-described probe of the present invention is included in the present invention. That is, the kit of the present invention contains the nucleic acid molecule of the present invention and / or the probe of the present invention so that the allele or genotype of a single nucleotide polymorphism associated with wet age-related macular degeneration can be determined. It is.
  • a kit for detecting both the above-described risk allele and non-risk allele is also a preferred embodiment of the present invention. Using such a kit, it is also possible to determine the genotype of each allele as already described.
  • kit of the present invention By using the kit of the present invention to detect the presence of a risk allele or genotype at risk of wet age-related macular degeneration in a sample, future wet ageing of non-wAM patients
  • the risk of macular degeneration can be predicted, or the diagnosis of wet age-related macular degeneration in a person who is suspected of wet age-related macular degeneration can be performed.
  • kits used for detection or risk prediction is represented by SEQ ID NOs: 1-124.
  • At least one base sequence selected from the group consisting of base sequences (each corresponding to one single nucleotide polymorphism in a pair of odd-numbered and even-numbered base sequences), or a complementary sequence thereof, or a partial sequence thereof
  • at least one base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 14, or a complementary sequence thereof, or a base sequence consisting of a partial sequence thereof is represented by the aforementioned SEQ ID NOs: 1 to 124.
  • kits that can determine the allele or genotype of a single nucleotide polymorphism corresponding to the 17th of each nucleotide sequence, More preferably, in the following, at least one base sequence selected from the group consisting of a base sequence set comprising a single nucleotide polymorphism of a to g, or a complementary sequence thereof, or a base sequence consisting of a partial sequence thereof:
  • each set of base sequences is a base sequence containing one single nucleotide polymorphism of each other in the 17th base.
  • f SEQ ID NO: 11 and / or SEQ ID NO: 12
  • the kit capable of determining any single nucleotide polymorphism allele or genotype of any of the above, among them, a sequence represented by an odd-numbered sequence number or a complement thereof among a set of sequences containing each single nucleotide polymorphism It is preferable that the kit is capable of determining an allele of a single nucleotide polymorphism corresponding to the 17th position of each of the nucleotide sequences represented by the set a to g in a target sequence or a nucleotide sequence consisting of these partial sequences. These are base sequences containing risk alleles at each polymorphic site.
  • the single nucleotide polymorphism related to wet age-related macular degeneration used in the present invention is used in any race as long as it has the polymorphism, but the preferred race is Mongoloid, more preferably East Asian. Yes, more preferably a Japanese or a person who has Japanese as an ancestor.
  • those who have a risk allele disclosed in the present invention or a genotype that is considered to be at risk of wet age-related macular degeneration may develop risk of developing wet age-related macular degeneration in the future.
  • Those who do not have a risk allele or a genotype that is considered to be at risk of wet age-related macular degeneration can be determined to have a low risk of developing wet age-related macular degeneration in the future.
  • those who have a risk allele disclosed in the present invention or a genotype considered to be at risk of wet age-related macular degeneration on the genome and who are suspected of early wet age-related macular degeneration are difficult to detect. Since there is a possibility that early wet age-related macular degeneration has developed, detection of the single nucleotide polymorphism of the present invention can be used for diagnosis of wet age-related macular degeneration or for assisting diagnosis.
  • total DNA is extracted from the blood of patients diagnosed with wet age-related macular degeneration, patients diagnosed with glaucoma, and patients diagnosed with cataract, and a known single base on the human genome is obtained.
  • a known single base on the human genome is obtained.
  • Example 1 Extraction of DNA from a sample Extraction of DNA from a sample was performed according to the phenol extraction method (Methods in Enzymology, vol. 152, page 181 (1987)).
  • Leukocytes were purified by adding a sufficient amount of hypotonic hemolysis buffer containing ammonium salt and EDTA to the blood sample to which citrate had been added. After several washes, the cells were lysed with a lysis buffer containing Proteinase K and SDS. After confirming that the suspended cells were lysed and clear, phenol was added and shaken at room temperature for 1 to 3 hours. The phenol layer was discarded and only the aqueous layer was centrifuged to further separate impurities.
  • aqueous layer was dialyzed against TE buffer (10 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA, Teknova), and then DNA was collected by ethanol precipitation and dissolved in TE buffer.
  • TE buffer 10 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA, Teknova
  • DNA was collected by ethanol precipitation and dissolved in TE buffer.
  • 7.5 ⁇ M NH 4 OAc 10 ⁇ L, 20 mg / mL Glycogen 0.5 ⁇ L and 100% ice-cold ethanol 50 ⁇ L were added and left at -20 ° C. for 1 hour. After centrifugation at 12,000 ⁇ g for 20 minutes, the supernatant was removed.
  • Example 2 Analysis of Single Nucleotide Polymorphism Single nucleotide polymorphism analysis is performed by using a commercially available microarray single nucleotide polymorphism analysis kit (Affymetrix) capable of analyzing about 500,000 known single nucleotide polymorphisms on the human genome.
  • GeneChip Human Mapping 250K Nsp / Sty Array GeneChip (registered trademark) Human Mapping 250K Nsp / Sty Array) (hereinafter referred to as microarray) was used.
  • the total DNA ⁇ (genomic DNA) ⁇ ⁇ extracted in Example 1 is processed according to the instruction manual of the kit and equipment, and applied to the microarray to analyze the single nucleotide polymorphism present in the DNA extracted from the specimen. Specifically, the following operation is performed.
  • Each 250 ng of genomic DNA is cut with Sty I (New England Biolabs) or Nsp I (New England Biolabs) restriction enzymes, respectively, according to the following procedure. That is, 5 ⁇ L of genomic DNA solution, 11.5 ⁇ L of commercially available molecular biology grade ultrapure water (AccuGENE® molecular biology-grade water, Cambrex), 2 ⁇ L of buffer solution attached to each restriction enzyme, 10 mg / mL Restriction enzyme treatment was performed by adding 0.2 ⁇ L of BSA and 1 ⁇ L of 10 U / mL restriction enzyme. The reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours and then incubated at 65 ° C. for 20 minutes to inactivate the restriction enzyme.
  • Sty I New England Biolabs
  • Nsp I New England Biolabs
  • the adapter sequence is added to the sample after the restriction enzyme treatment by the following procedure.
  • 50 ⁇ M Adaptor Nsp I or Adapter Sty I 0.75 ⁇ L corresponding to the cleaved restriction enzyme, T4 DNA ligase buffer (New England Biolabs) 2.5 ⁇ L and T4 DNA ligase (New England Biolabs) 2 ⁇ L was added and reacted at 16 ° C. for 3 hours to add an adapter sequence, and then reacted at 70 ° C. for 20 minutes to inactivate T4 DNA ligase.
  • the sample after the addition of the adapter was diluted by adding 75 ⁇ L of cooled AccuGENE water.
  • the gene to which the adapter sequence is added is amplified by PCR using the TITANIUM TM (registered trademark) DNA Amplification kit (Clontech) according to the following procedure. That is, AccuGENE water 39.5 ⁇ L, TITANIUM TM (registered trademark) taq PCR buffer 10 ⁇ L, 5 M GC-Melt (Clonetech) 20 ⁇ L, 2.5 mM dNTP (Takara Bio) 4.5 ⁇ L, 100 ⁇ M PCR primer002 (Affymetrix, GeneChip ( (Registered Trademark) 4.5 ⁇ L (included in Mapping 250K Nsp / Sty Assay Kit) and TITANIUM TM (registered trademark) taq DNA polymerase 2 ⁇ L were added and reacted.
  • TITANIUM TM registered trademark
  • the reaction temperature and time are as follows. First, after standing at 94 ° C. for 3 minutes, the reaction was carried out for 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds ⁇ 60 ° C. for 30 seconds ⁇ 68 ° C. for 15 seconds and left at 68 ° C. for 7 minutes. With this as a series of reaction operations, the same PCR reaction operation was performed three times for each sample. The PCR product was subjected to 2% agarose gel electrophoresis, and it was confirmed that a gene fragment of 200 bp to 1000 bp was amplified. Three PCR products were combined into one and purified using a DNA amplification Clean-Up kit (Clontech).
  • PCR primer 002 used as a primer for the PCR reaction is as follows: 5′-attatgagcacgacagacgcctgatct-3 ′ (SEQ ID NO: 125).
  • the amplified gene is fragmented by the following procedure using GeneChip (registered trademark) Mapping 250K Nsp / Sty Assay Kit (Affymetrix) reagent. That is, the absorbance of the purified PCR product at 260 nm was measured using a spectrophotometer (Biophotometer, Eppendorf), and 90 ⁇ g of the PCR product was diluted with RB buffer (Clontech) to a total volume of 45 ⁇ L. Fragmentation buffer 5 ⁇ L and 0.05 U / ⁇ L Fragmentation Reagent 5 ⁇ L included in the kit were added to the diluted sample, reacted at 37 ° C.
  • GeneChip registered trademark Mapping 250K Nsp / Sty Assay Kit (Affymetrix) reagent. That is, the absorbance of the purified PCR product at 260 nm was measured using a spectrophotometer (Biophotometer, Eppendorf), and 90 ⁇ g of the PCR product was diluted with RB
  • Fragmentation Reagent was diluted with 10 ⁇ fragmentation buffer and AccuGENE water so that the final concentration was 0.05 U / ⁇ L Fragmentation Reagent, 1 ⁇ fragmentation buffer.
  • the fragmented product was subjected to 4% agarose gel electrophoresis to confirm that the gene was fragmented.
  • a biotin label is added to the fragmented gene by GeneChip (registered trademark) Mapping 250K Assay Kit (Affymetrix) according to the following procedure.
  • Hybridization cocktail master mix to 70 ⁇ L of biotin-labeled sample (composition is as follows; 0.056M 2- (N-Morpholino) ethanesulfonic acid, 5% DMSO, 2.5 ⁇ Denhard'ts solution (Sigma), 5.77 mM EDTA pH 8. 0, 0.115 mg / mL Herring Sperm DNA (Promega), 1 ⁇ Oligo Control Reagent 0100 (Affymetrix), 11.5 ⁇ g / mL Human Cot-1 DNA (Invitrogen), 0.0115% Tween-20, 2.69 M Tetrametyl Ammonium Chloride (Sigma) ) 190 ⁇ L was added, denatured at 95 ° C.
  • GeneChip registered trademark Human Mapping 250K Nsp / Sty Array (hereinafter also referred to as microarray) 200 ⁇ L sample applied to a hybrid oven (GeneChip Hybridization Oven 640, Affymetrix) set at a temperature of 49 ° C and a rotation speed of 60 r / min For 16 to 18 hours. The sample was removed from the microarray, and Array Holding Buffer (1 mM MES, 1M NaCl, 0.01% Tween-20) was filled inside the microarray.
  • GCOS GeneChip Operating Software 1.4
  • Primary staining and tertiary staining were each performed with 10 ⁇ g / mL Streptavidin-Phycoerythrin (Invitrogen) prepared with Stain Buffer, and secondary staining was performed with 5 ⁇ g / mL biotinylated Anti-Streptavidin Antibody (Vector Lab.). Detection was performed with GeneChip (registered trademark) Scanner 3000 7G using GCOS.
  • the specific protocol for the staining / washing process and the composition of the washing solution are as follows. (Dyeing and washing process protocol (FS-450 Fluidics Protocol-Mapping 500Kv1_450)) -Post Hyb Wash # 1: 6 cycles of 5 mixes / cycle with Wash Buffer A at 25 °C -Post Hyb Wash # 2: 24 cycles of 5 mixes / cycle with Wash Buffer B at 45 °C -Stain: Stain the probe array for 10 minutes in SAPE solution at 25 °C -Post Stain: Wash 6 cycles of 5 mixes / cycle with Wash Buffer A at 25 °C -2nd Stain: Stain the probe array for 10 minutes in Antibody Stain Solution at 25 °C -3rd Stain: Stain the probe array for 10 minutes in SAPE solution at 25 °C -Final Wash: 10 cycles of 6 mixes / cycle with Wash Buffer A at 30 °C The final holding temperature is 25 °C [Solution composition] ⁇ Wash A:
  • ⁇ Wash B Stringent Wash Buffer (0.6X SSPE, 0.01% Tween 20) For 1000 mL: 30 mL of 20X SSPE, 1.0 mL of 10% Tween-20, 969 mL of water Filter through a 0.2 ⁇ m filter.Store at room temperature. The pH should be 8. ⁇ Stain Buffer: (6X SSPE, 0.01% Tween 20, 1X Denhardt's solution) For 1188 ⁇ L: 360 ⁇ L of 20X SSPE, 3.6 ⁇ L of 3% Tween-20, 24 ⁇ L 50X Denhardt's solution, 800.04 ⁇ L of water
  • Genotyping analysis SNP Genotyping analysis was performed using Affymerix Power Tools ver.1.10.0 from Affymetrix. The included BRLMM genotype calling algorithm was used for analysis.
  • Example 3 Comparison of single nucleotide polymorphisms of wAM patients and non-wAM patients on autosomes Comparison of disease-related single nucleotide polymorphisms was performed according to the method of Klein et al. (Science 308, 385 pages, 2005) as follows. Went so.
  • the single nucleotide polymorphism candidates related to wet age-related macular degeneration thus selected were analyzed in more detail. That is, the patients adopted in the glaucoma patient group and the patients adopted in the cataract patient group were collectively used as a control group, and the wAM patient group and the control group were compared as follows.
  • the odds ratio of the allele was calculated by the following formula as an index of how strong a relationship exists between the presence or absence of the risk allele and the presence or absence of wet age-related macular degeneration.
  • the risk allele was set so that the odds ratio was greater than 1 when the odds ratio of the allele was calculated by substituting the number of detected alleles constituting the single nucleotide polymorphism into the above formula.
  • the odds ratio is a reciprocal relationship with each other, that is, if one odds ratio is smaller than 1, the other odds ratio is larger than 1. It is clear from the definition formula.
  • genotype p value The genotype p value of each SNP was calculated by Fisher's exact method for the wAMD patient group versus the control group. At that time, Genotype model (risk allele homotype vs heterotype vs non-risk allele homotype), Dominant model (risk allele homotype + heterotype vs non-risk allele homotype), Recessive model (risk allele homotype vs non-risk allele) The p value was calculated for three types of statistical models (homo type + hetero type), and the one with the lowest p value was used as the p value representing the single nucleotide polymorphism.
  • Bonferroni correction that is, p value less than or equal to the corrected significance level (9.84 ⁇ 10 -5 ) obtained by dividing the significance level 0.05 by 508 iterations with the overall significance level set to 0.05
  • a single nucleotide polymorphism whose genotype is related to wet age-related macular degeneration was extracted from (p value representative of the single nucleotide polymorphism).
  • the Dominant odd ratio and the Recessive odd ratio were determined by the following equations.
  • the dominant type odds ratio is an odds ratio indicating that it is wet age-related macular degeneration when it has at least one risk allele (that is, when it is a risk allele homotype or heterotype).
  • the recessive odds ratio is the odds ratio of wet age-related macular degeneration when the risk allele is homozygous.
  • Table 1 shows single nucleotide polymorphisms of p ⁇ 1.0 ⁇ 10 ⁇ 6
  • Tables 2 to 4 show 1.0 ⁇ 10 ⁇ 6 ⁇ p ⁇ 9.84 ⁇ 10 -5 single nucleotide polymorphism, SNP ID, chromosome number and physical position where single nucleotide polymorphism exists, gene to which single nucleotide polymorphism belongs or single nucleotide polymorphism of single nucleotide polymorphism Name of the gene present in the vicinity, relative position (if the single nucleotide polymorphism is present on the intron of the gene indicated by the gene name, this is indicated, and the single nucleotide polymorphism does not exist on the intron of the gene.
  • the SNP ID is the dbSNP database ID.
  • each p value is displayed in an exponential format with 10 as the base.
  • the numerical values described before and after the symbol E indicate the mantissa part and the exponent part when the p-value is displayed in an exponential format (the same applies to the tables in the following examples).
  • single nucleotide polymorphisms with 9.84 ⁇ 10 ⁇ 5 ⁇ p ⁇ 1.0 ⁇ 10 ⁇ 4 are shown in Tables 5 to 10.
  • Table 11 shows single nucleotide polymorphisms that are significant under Bonferroni correction and exist on the same gene as single nucleotide polymorphisms known to be associated with glaucoma.
  • the risk allele frequency, the non-risk allele frequency, the risk allele homotype frequency, the hetero frequency, and the non-risk allele homotype frequency are shown in Tables 12 to 18 for the wAMD patient group and the control group, respectively.
  • Tables 19 to 27 list the genotype odds ratio of each single nucleotide polymorphism, the related genotype odds ratio, and the genotype at risk.
  • the genotype odds ratio is the Dominant odds ratio or Recessive odds ratio obtained for the single nucleotide polymorphism having a large value (that is, the genotype related to the single nucleotide polymorphism). Odds ratio) value is described, and the related odds ratio indicates whether the odds ratio of the genotype related to the single nucleotide polymorphism is a Dominant odds ratio or a Recessive odds ratio.
  • Example 4 Analysis of peripheral region of single nucleotide polymorphism
  • the LD block structure to which the single nucleotide polymorphism of the present invention belongs was estimated.
  • the single nucleotide polymorphisms including the single nucleotide polymorphism related to wet age-related macular degeneration determined in Example 3 the single nucleotide polymorphism having a minor allele frequency of less than 0.05 was used for the method of Gabriel et al. (Science 21 June 2002: Vol. 296. no. 5576, pp. 2225-2229), the LD block structure was estimated using the confidence interval of the D ′ value as the LD measurement.
  • single nucleotide polymorphisms contained in the LD block are shown in bold, and regions that are considered to be in linkage disequilibrium with the single nucleotide polymorphisms of the present invention are shown with a frame.
  • the genes present on or near the LD block are also displayed.
  • Example 5 Reanalysis of single nucleotide polymorphisms on the LD block Any single nucleotide polymorphism belonging to the LD block estimated in Example 4 can be reanalyzed as follows. This example illustrates a reanalysis method using TaqMan (registered trademark) SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems).
  • the patient group and the control group may be the same as or different from the patient group and patient group of Example 3.
  • total DNA was extracted by the method described in Example 1, and the single nucleotide polymorphisms contained in the LD block were compared with patient groups according to the protocol of Applied Biosystems. Perform comparative analysis of groups.
  • Reagents, thermal cyclers, and detectors for the real-time PCR reaction can be those specified by Applied Biosystems.
  • StepOne® Software® V2.0.1 can be used for detection of the single nucleotide polymorphism allele in the PCR product.
  • the allele odds ratio is calculated in the same manner as in Example 3 to determine the risk allele, and the genotype p-value is calculated.
  • Example 6 Analysis of single nucleotide polymorphisms related to wet age-related macular degeneration using a sample containing genomic DNA
  • Tables 1 to 11 The frequency of alleles described in 1 is statistically different between the wAMD patient group and the control group.
  • a single nucleotide polymorphism risk allele associated with wet age-related macular degeneration is included in the sample Determined.
  • the allele it is also possible to determine the genotype considered to be at risk for the aforementioned wet age-related macular degeneration.
  • Example 7 Determination of risk of wet age-related macular degeneration in patients with non-wetting age-related macular degeneration and diagnostic assistance for those suspected of wet age-related macular degeneration As in Example 3, provided by a non-wAM patient Using a sample containing genomic DNA, the risk of wet age-related macular degeneration of the sample provider can be accurately determined.
  • the risk of wet age-related macular degeneration of the sample provider can be accurately determined.
  • wet age Determined to be at risk for macular degeneration when at least one of the risk allele or genotype considered to be at risk of wet age-related macular degeneration is detected in the sample.
  • the risk is predicted using the risk allele detected in the sample or the sum of the number of genotypes considered to be at risk of wet age-related macular degeneration, or the odds ratio thereof as an index. Depending on the magnitude of these numerical values, the risk of wet age-related macular degeneration is predicted, or if it exceeds a certain threshold, it is determined that the risk of wet age-related macular degeneration is high.
  • diagnosis assistance can be performed for persons suspected of wet age-related macular degeneration. If a sample provided by a person suspected of wet age-related macular degeneration is used, and at least one of the risk alleles or a genotype that is considered to be at risk of wet age-related macular degeneration is detected in the sample, the wet type There is a high probability that it should be judged as age-related macular degeneration.
  • a risk allele or exudation-type aging detected in a sample can be detected by combining two or more single nucleotide polymorphisms of the present invention in combination with a plurality of probes that detect single nucleotide polymorphisms related to a disease.
  • the sample provider determines the presence and / or level of risk of wet age-related macular degeneration in the future. can do. Based on this risk, the sample provider will be diagnosed early with wet age-related macular degeneration by taking precautions against wet age-related macular degeneration and / or regularly undergoing tests for wet age-related macular degeneration. Can start treatment.
  • a sample provider who has a risk allele of the single nucleotide polymorphism of the present invention or a genotype considered to be at risk of wet age-related macular degeneration and suspected wet age-related macular degeneration This is useful because there is a high probability that macular degeneration should be diagnosed and treatment can be started early.

Abstract

　被験者由来のサンプル中の核酸分子について、配列番号1～124で示される塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列又はその相補的配列において、前記塩基配列の17番目に存在する一塩基多型のアレルをin vitroで検出する工程(検出工程)、及び、前記検出されたアレルの少なくとも１つがリスクアレルであるか否かを判定する工程(判定工程)を含む、滲出型加齢黄斑変性のリスクを予測する方法。本発明の方法により、サンプル中の本発明の一塩基多型のアレル又は遺伝子型を分析することにより、サンプル提供者が将来的に滲出型加齢黄斑変性のリスクの有無及び／又は高低を判定することができる。

Description

滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測方法
　本発明は、滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測方法に関する。さらに詳しくは、滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型を検出することによる、滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測方法、及び該予測方法に用いるキットに関する。
　加齢黄斑変性は、加齢に伴い黄斑部の網膜組織に障害が生じ、視力障害を来たすことを特徴とする疾患であり、失明にいたることもある、高齢者の視力障害の原因の一つである。加齢黄斑変性はコーカサス人種では高齢者の失明原因の首位である。一方、日本人に代表される東洋人、すなわち、モンゴロイドでは、その頻度は欧米人に比べて低いとされている。
　加齢黄斑変性は２つの主要な病型に分類できる。即ち、黄斑部の網膜色素上皮細胞の萎縮変性、及び、網膜色素上皮細胞の萎縮変性に続発する網膜視細胞の萎縮変性を本態とする萎縮型加齢黄斑変性と、黄斑部の網膜下に脈絡膜由来の新生血管が発育し、出血や細胞の滲出を来す滲出型加齢黄斑変性とに分類できる。これら二つの加齢黄斑変性は初期には非常に類似した病態、即ち、ドルーゼンの形成と色素沈着又は色素脱落を示す。
　萎縮型加齢黄斑変性の治療法について様々な研究が行われているが、臨床上極めて有効と言える治療法は未だ確立されていない。一方、滲出型加齢黄斑変性については、新生血管が中心窩に達していない比較的早期の場合にはレーザー光を照射して新生血管を凝固させる光凝固術によって治療が選択されることもある。新生血管が中心窩に達している場合には、光線感受性の薬剤を投与しておき、弱いレーザー光を照射して薬剤を励起させ治療に用いる、いわゆる光力学的療法(PDT)が行われるが、PDTの効果は視力の低下を抑制するに留まり、完治が期待できるような臨床上有効な治療法は未だ見出されていない。これに対し、早期に滲出型加齢黄斑変性と診断され治療を開始した場合には、視力の低下を避けることが可能な場合もあることが知られており、滲出型加齢黄斑変性の治療を行ううえで、早期の診断は極めて重要である(以上、非特許文献１参照)。
　滲出型加齢黄斑変性の原因は十分解明されていない。喫煙などが原因として指摘されているが、遺伝的な要素の関与も古くから示唆されている。
　一方、一塩基多型とは、個体のゲノムの塩基配列において、一つの塩基が別の塩基に変化する置換変異が見られ、当該変異がその生物種の集団においてある程度の頻度、一般的に約1％以上の頻度で存在する。一塩基多型は遺伝子上のイントロン、エクソン、あるいはこれら以外のゲノムの領域のいずれにも存在する。
Schachat AP et al.: Retina, Second edition,　Mosby-Year Book, Inc. (1994)
　一般に、滲出型加齢黄斑変性（以下、ｗＡＭＤということもある）の検査として、眼底検査、例えば、蛍光色素を静注しておいて眼底を検査する方法が用いられるが、散瞳薬を投与する必要があり、検査後数時間は散瞳状態が持続することなど、患者への負担は必ずしも軽くはない。また、このような検査は蛍光色素の血管からの漏出を判定する検査であることから、ある程度の症状が進行した段階でなければ診断に用いることが出来ない。滲出型加齢黄斑変性の治療において早期診断は極めて重要であり、より早い時期に滲出型加齢黄斑変性の診断を受け、又は、滲出型加齢黄斑変性を将来発症するリスクを知ることは重要な未解決ニーズである。
　一方、前述のように、滲出型加齢黄斑変性の発症には遺伝的要因の関与が疑われているが、日本人集団において滲出型加齢黄斑変性の支配的な原因遺伝子は未だ同定されていない。また、単一の遺伝子の変異又は多型による疾患への関与が説明できなくとも、滲出型加齢黄斑変性への関与が比較的穏やかな遺伝子の変異又は多型が多数存在し、それぞれが組み合わせられて作用することによって滲出型加齢黄斑変性の発症への遺伝的要因の関与が説明できると考えられる。
　本発明者らは、滲出型加齢黄斑変性に関連する遺伝子を見出すため、ゲノム上の多型、なかでも一塩基多型に着目した。
　滲出型加齢黄斑変性に関連する多型を見出すことにより、当該多型を有するか否かで滲出型加齢黄斑変性のリスクの判断が可能となり、該多型を有する者は、発症前であっても将来的に滲出型加齢黄斑変性のリスクがあることを知り、又は、初期の滲出型加齢黄斑変性の診断の補助に用いることが可能となる。即ち、滲出型加齢黄斑変性のリスクを知ることによりサンプル提供者は滲出型加齢黄斑変性の発症予防措置を講ずることが可能となり、また、早期の確定診断により、早期の治療を開始することができるため、滲出型加齢黄斑変性に関与する多型を見出すことは、意義深い。
　本発明の課題は、滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型を検出することにより、滲出型加齢黄斑変性のリスクを予測する方法、及び該検出方法に用いるキットを提供することにある。
　本発明者らは、滲出型加齢黄斑変性患者（ｗＡＭＤ患者）と滲出型加齢黄斑変性患者でない者（非ｗＡＭＤ患者）のゲノム(なかでも、常染色体)上に存在する公知の多型部位を網羅的に解析し、滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型を見出し、さらに、当該一塩基多型においてリスクアレルとその対立アレルである非リスクアレルを見出し、本発明を完成した。
　即ち、本発明は、
〔１〕被験者由来のサンプル中の核酸分子について、配列番号1～124で示される塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列又はその相補的配列において、前記塩基配列の17番目に存在する一塩基多型のアレルをin vitroで検出する工程(検出工程)、及び
前記検出されたアレルの少なくとも１つがリスクアレルであるか否かを判定する工程(判定工程)
を含む、滲出型加齢黄斑変性のリスクを予測する方法、ならびに
〔２〕　被験者由来のサンプル中の核酸分子について、配列番号1～124で示される塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列又はその相補的配列において、前記塩基配列の17番目に存在する一塩基多型のアレルをin vitroで検出するための核酸分子を含有してなる、滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測キット
に関する。
　本発明の方法により、サンプル中に存在するゲノム由来の核酸分子に含まれる本発明の一塩基多型のアレルを分析することにより、サンプル提供者の滲出型加齢黄斑変性リスクの有無及び／又はリスクの大小を予測することができる。このリスクに基づきサンプル提供者は滲出型加齢黄斑変性の予防措置を講じ、又は定期的に診察を受けることにより早期の診断を受け、病状が進行しない早期に適切な治療を開始することができる。また、本発明の方法により、滲出型加齢黄斑変性が疑われるサンプル提供者は、滲出型加齢黄斑変性と診断されるべき蓋然性が高いと判断されることができ、早期に治療を開始することができる。
図１は、本発明の一塩基多型が属するＬＤブロック構造を示す図の一例である。 図２は、本発明の一塩基多型が属するＬＤブロック構造を示す図の一例である。 図３は、本発明の一塩基多型が属するＬＤブロック構造を示す図の一例である。 図４は、本発明の一塩基多型が属するＬＤブロック構造を示す図の一例である。 図５は、本発明の一塩基多型が属するＬＤブロック構造を示す図の一例である。 図６は、本発明の一塩基多型が属するＬＤブロック構造を示す図の一例である。
　本発明は、遺伝子の一塩基多型(以下、SNPと記載することもある)に基づいて、滲出型加齢黄斑変性のリスクを予測する方法において、被験者由来のサンプル中の核酸分子について、特定の塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列又はその相補的配列における、前記塩基配列の17番目に存在する一塩基多型のアレルをin vitroで検出する工程(検出工程)、及び前記検出されたアレルがリスクアレルであるか否かを判定する工程(判定工程)を含む、滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測方法である。本発明は滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型(本発明の一塩基多型ともいう)を見出し、さらに、当該一塩基多型においてリスクアレルとその対立アレルを見出し、これらを用いることに大きな特徴を有する。従って、前記リスクアレルを用い、及び／又は、前記リスクアレルとその対立アレルの存在頻度に基づき計算されたオッズ比を指標とすることにより、このような滲出型加齢黄斑変性発症の予測を行うことも可能であり、前記予測方法は、滲出型加齢黄斑変性発症因子の測定方法、又は決定方法としても使用可能である。なお、本明細書において多型とは、ある生物種におけるゲノムの特定の位置の配列に多様性が存在することを言い、多型が存在する部位(以下、多型部位ともいう)とは、一塩基多型が存在するゲノム上の部位を言う。
　また、本明細書においてアレルとは、ある多型部位において取りうる、互いに異なる塩基を有するそれぞれの型を言う。本明細書において遺伝子型とは、ある多型部位において、特定のアレル(一方のアレルともいう)と、前記アレルに対立するアレル(他方のアレルともいう)との任意の組み合わせを言う。さらに、ある多型部位において、前記組み合わせである遺伝子型には３つの型があり、同じアレルの組み合わせをホモ型とよび、異なるアレルの組み合わせをヘテロ型とよぶ。
　本明細書において、対立するアレル(対立アレルともいう)とは、ある一塩基多型を構成するアレルのうち、特定されたものに対応する他のアレルを言う。
　本明細書において、滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型とは、滲出型加齢黄斑変性患者(ｗＡＭＤ患者)と滲出型加齢黄斑変性患者でない者(非ｗＡＭＤ患者)の間で、当該一塩基多型におけるそれぞれのアレルの頻度の比が統計学的にあるｐ値で有意に異なる一塩基多型をいう。
　本発明において、滲出型加齢黄斑変性のリスクとは、滲出型加齢黄斑変性に関するリスクを言う。本発明における滲出型加齢黄斑変性のリスクには、将来的に滲出型加齢黄斑変性を発症する可能性が含まれる。本発明において、リスクの予測とは、将来のリスクの有無を現時点で判定し、又は、将来のリスクの大小を現時点で判定することを言う。
　詳細は後述するが、本発明において、リスクアレルとは、前記滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の各アレルのうち、前記各アレルについて求めたオッズ比が１より大となるようなアレルを言う。また、非リスクアレルは、リスクアレルの対立アレルであることから、前記オッズ比が１以下となるようなアレルを言う。ここで、各アレルについて求めたオッズ比、即ち、一方のアレルについて求めたオッズ比とは、ｗＡＭＤ患者群における一方のアレルの頻度と他方のアレル(対立アレル)の頻度の比を、非ｗＡＭＤ患者群における前記一方のアレルの頻度と前記他方のアレルの頻度の比で除したものである。即ち、一方のアレルについて求めたオッズ比は他方のアレルについて求めたオッズ比の逆数である。尚、オッズ比についての詳細は後述する。また、本明細書においてアレルの頻度(アレル頻度)とは、ある集団において、特定のアレルが全体に占める割合を意味し、例えば実施例に記載した方法によって一定集団に属する各個体のアレルを決定することにより求めることができる。その他、本明細書に記載のない事項は、遺伝統計学入門（鎌谷直之；岩波書店 2007）又はバイオインフォマティクス第２版（Mount DW著、岡崎康司ら監訳；メディカル・サイエンス・インターナショナル、2005）等の成書を参考にすることができる。
　以下に、滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の同定方法を説明する。
　滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型は、滲出型加齢黄斑変性と診断されたｗＡＭＤ患者、及び、滲出型加齢黄斑変性ではないと診断された非ｗＡＭＤ患者それぞれの血液から総DNAを抽出し、ヒトゲノム上の公知の一塩基多型約50万個を指標として、個々の一塩基多型のアレルがｗＡＭＤ患者又は非ｗＡＭＤ患者に特異的に、より具体的には、統計学的に有意に存在するか否かを解析することにより見出した。ここで、対照となる非ｗＡＭＤ患者は滲出型加齢黄斑変性でない者であれば良い。例えば、滲出型加齢黄斑変性でないと診断され、かつ、他の疾患、例えば緑内障及び／又は白内障であると診断された患者を対照として用いても良い。この場合、滲出型加齢黄斑変性に特異的に関連する一塩基多型を見出すために、対照として用いられる他の疾患の患者（群）と滲出型加齢黄斑変性の患者（群）との比較を複数の疾患について行い、共通して、あるｐ値で有意な差があると判定されるような一塩基多型を用いることが好ましい。かかる一塩基多型のアレルを用いることにより、滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測が可能となる。詳細は実施例の項にて説明するが、以下のような方法により、本発明で開示された滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型を同定することができる。
(滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の同定)
　まず、滲出型加齢黄斑変性と診断されたｗＡＭＤ患者、及び、滲出型加齢黄斑変性ではないと診断された非ｗＡＭＤ患者それぞれの血液から総DNAを抽出する。血液中の総DNAは公知の任意の方法によって抽出することができるが、例えばフェノール抽出法(Methods in Enzymology、152巻、181ページ、1987年)などの公知の方法によって抽出することができる。
　抽出したDNAサンプル中の一塩基多型における塩基の種類、すなわち各多型部位におけるアレルの同定は、例えば後述の固層化プローブ（マイクロアレイ）を用いる方法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）法などのＰＣＲを応用する方法など、任意の方法で行うことができる。その際、検出に用いるプローブは、目的とする一塩基多型及びその周辺の配列情報を元に設計することができる。設計に当たっては、例えば米国の国立バイオテクノロジー情報センター (NCBI)が提供するdbSNPもしくはHapMapプロジェクトが提供するSNP情報のデータベースのような公知の一塩基多型のデータベース、又はNCBIが提供するGenbankのような公知の配列情報のデータベースを用い、これらのデータベースから得られる配列等の情報を参考にすることもできる。一塩基多型の検出に用いるプローブは、ゲノムのセンス鎖に相補的なプローブであっても、アンチセンス鎖に相補的なプローブであっても、いずれによっても検出できる。ヒトのゲノム上に存在する一塩基多型を検出できるプローブを大量に固層化し、同一操作で多数の一塩基多型のアレルを検出可能なキットも市販されており、このようなキットを用いて効率よくサンプル中のアレルを検出することも可能である。また、このようなキットの多くは、一つのサンプルに含まれる対立する各々のアレルを同一操作で検出する構成になっており、遺伝子型を決定することができる。このようなキットの市販品の好適例としては、マイクロアレイ型の一塩基多型分析キット〔アフィメトリックス社、ジーンチップ　ヒューマンマッピング 250K Nsp/Sty アレイ(GeneChip(登録商標) Human Mapping 250K Nsp/ Sty Array)〕が挙げられる。
　滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型は、前述のような方法でｗＡＭＤ患者及び非ｗＡＭＤ患者由来のDNAに存在するアレルを同定しておき、各アレルの頻度をｗＡＭＤ患者と非ｗＡＭＤ患者で統計学的に比較し、アレル頻度が後述のｐ値で有意な差が生じるか否かをもって判定することができる。
　統計学的な解析には、例えばFisherの正確確率検定又はカイ二乗検定を用いることができる。また、比較を繰り返し行うことに起因する第一種の過誤の発生リスクの増大を補正する必要がある場合は公知の方法、例えばボンフェローニ、ホルム、又はベンジャミニとホフバーグ(False Discovery Rate; FDR)などの方法によって補正することができる。
　ボンフェローニの補正に基づく場合を例示すると、所望の有意水準、例えば5×10-2の有意水準を繰り返し回数、即ち、解析に用いる多型部位の個数で割って滲出型加齢黄斑変性に関連するSNPの選択に用いる有意水準とすることにより、第一種の過誤を最大に考慮しても高々5×10-2の危険率で滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型を判定することができる。このようにして設定した有意水準を下回る一塩基多型をより好ましい一塩基多型として選択することができる。但し、本発明のような全ゲノムに亘る一塩基多型の解析において、ボンフェローニの補正は過剰補正であり、著しくｐ値が低下することから疾患に関連する一塩基多型を見落とす可能性が高まるとの報告もなされている(Schymick J C et al., Lancet Neurology. 2007：6: 322-8, Van Steen K et al., Nature Genetics. 2005： 37: 683-691)。学術的に望ましい多重性の補正方法は未だ確立されていないが、これらの方法で多重性の補正を行うと過剰補正になる場合には、当該補正方法によって調整される有意水準を下回らない範囲の任意の適切な水準に有意水準を設定することができる。任意の適切な水準を設定する場合、例えば50万個の一塩基多型を繰り返し解析する場合の有意水準は、1×10-2が好ましく、1×10-3がより好ましく、1×10-4がさらに好ましく、1×10-5がさらに好ましく、3×10-6がさらに好ましく、1×10-6がさらに好ましく、3×10-7がさらに好ましく、1×10-7がさらに好ましい。また、一般に、第一種の過誤と統計学的な検出力は反比例することが知られている。第一種の過誤を低下させつつ検出力を保つ方法としては、一塩基多型の解析を二段階に分割して実施することが挙げられる(Skol A.D. et al., Nature Genetics. 2006：38: 209-213)。例えば、まず、一次解析として、全ゲノムに亘る多数の一塩基多型解析を行い、次いで、二次解析として、一次解析である程度絞り込んだ一塩基多型を用いて解析を行う。この場合、いずれの解析においても比較的低いｐ値となるような一塩基多型を選択すればよく、好ましくは、最初の解析において候補となる一塩基多型を所望のｐ値、例えば0.001～0.05を下回るものを選択し、当該選択された一塩基多型について、多重性を考慮してさらに解析すればよい。
　また、ゲノム上の一定の領域に、比較的低いｐ値で疾患との関連を持つSNPが連続して存在する領域が見出される場合がある。このような領域に属するSNPは疾患との関連が高い。一方、このように疾患との関連を持つ一塩基多型が連続して存在する領域は、当該領域においてゲノムDNAの組み換え率が0であるか又は著しく低い、いわゆる連鎖不平衡の状態にある可能性が高い。連鎖不平衡状態にあるゲノム上の領域をＬＤブロックという。当該領域が連鎖不平衡状態にあるか否かは当該領域の解析結果に基づき公知の方法によって、又は、連鎖不平衡のデータベース、例えばHapMapプロジェクトによって提供される公知のＬＤブロック構造のデータベースを参照することにより確認することができる。連鎖不平衡状態にある一塩基多型は同じ挙動を示す蓋然性が極めて高いため、連鎖不平衡状態にある複数の一塩基多型について、任意の一つの一塩基多型、好適にはpairwise tagging法による絞込み等を行い決定した一塩基多型、いわゆるタグSNPを用いて前記連鎖不平衡状態にある複数の一塩基多型を代表することができる。さらに、本発明の滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の周辺を再解析、例えば、TaqMan(登録商標) SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems) を用いて再解析することにより、当該一塩基多型と連鎖不平衡状態にある新たな疾患関連一塩基多型が見出される場合がある。
　本発明においては、常染色体上の滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の解析において、一次解析として、個々の一塩基多型における遺伝子型の組合せ、即ち、一方のアレルのホモ型、ヘテロ型、他方のアレルのホモ型である遺伝子型について、一方のアレルのホモ型＋ヘテロ型対他方のアレルのホモ型、一方のアレルのホモ型対ヘテロ型＋他方のアレルのホモ型、及び、一方のアレルのホモ型対ヘテロ型対他方のアレルのホモ型の３通りの統計モデルについて、ｗＡＭＤ患者群対緑内障患者群(以下、比較Ａと呼ぶ)、及び、ｗＡＭＤ患者群対白内障患者群(以下、比較Ｂと呼ぶ)のそれぞれにFisherの正確確率検定を適用して、３通りの統計モデルを適用した場合のｐ値を求めた。次に、滲出型加齢黄斑変性以外の疾患に特異的に関連する一塩基多型を排除し滲出型加齢黄斑変性に特異的に関連する一塩基多型を選択するため、比較Ａ及び比較Ｂの両者において、前述のように求めた３通りの統計モデルのp値のうち最小となるp値が比較Ａ及び比較Ｂで共通して0.01を下回る一塩基多型５０８個を滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の候補として選択した。さらに、二次解析として、白内障患者と緑内障患者を纏めて対照群とし、前述の滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の候補について、再度同様にｗＡＭＤ患者群と対照群についてp値を求め、３通りの統計モデルを適用して求めたp値のうち最小のものを当該一塩基多型を代表するp値とした。滲出型加齢黄斑変性に関連するアレル又は遺伝子型の検出に用いられる一塩基多型は、ボンフェローニ補正によって多重性の調整を行う場合には、前述の滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の候補とされた一塩基多型の個数についてボンフェローニ補正を行い、好適な一塩基多型を選択するための有意水準を設定することができる。具体的には、所望の有意水準5×10-2を繰り返し回数５０８回で除算し、9.84×10-4以下のp値の一塩基多型を、滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型のうち、より好ましい一塩基多型とした。しかしながら、前述のように、ボンフェローニ補正は過剰補正であることが知られているため、上記有意水準より概ね１～２桁高い水準、例えば、p値が1×10-3を下回る一塩基多型は滲出型加齢黄斑変性に関連すると考えることができる。
　解析にあたり、信頼性の高い結果を得るためには、解析に用いる一塩基多型に対し、予め、検出結果の品質の確認を行い、妥当な品質で検出されている一塩基多型を解析に供することが望ましい。このような品質の確認に用いられる要素としては、コールレート、ハーディー・ワインバーグ平衡及びマイナーアレル頻度がある。
　全サンプルに対する各一塩基多型の判定率、すなわちコールレートが低い多型部位はタイピングエラーが発生している率が高く、信頼性が高くない。このため、コールレートが十分に高い一塩基多型部位を用いて解析することが望ましい。一塩基多型の採否の基準とするコールレートとしては、例えば70％、好ましくは75％、より好ましくは80％、さらに好ましくは85％、さらに好ましくは90％以上のコールレートを示す一塩基多型を採用することが望ましい。
　ハーディー・ワインバーグ平衡とは、変異や淘汰圧がなく、任意交配により形成された十分な個体数を持つ遺伝的に均一な集団においては、ある遺伝子座における各対立遺伝子の分布頻度は世代を重ねても一定であることを言う。ハーディー・ワインバーグ平衡が成立しているか否かは、いくつかの公知の方法、例えばカイ二乗検定やフィッシャーの正確確率検定によって統計学的に検定することができる。十分な数のヒト集団では、通常ハーディー・ワインバーグ平衡は成立していることから、一般的には、母集団におけるハーディー・ワインバーグ平衡の成立を前提に、標本の遺伝子型判定のエラーを検出する目的でハーディー・ワインバーグ平衡の検討が用いられる。ハーディー・ワインバーグ平衡の成立を統計学的に検定する場合、有意水準としては例えば0.0001が用いられる。
　マイナーアレル頻度とは、２つのアレルに含まれる一塩基多型の場合では、２つのアレルの頻度の内、頻度が低い方のアレルの頻度のことを言う。閾値は任意に設定することが可能である。前述のように一塩基多型の概念は、マイナーアレル頻度が約1％を上回るものであるから、マイナーアレル頻度が1％を下回る一塩基多型は棄却することが望ましい。また、本発明のような多因子疾患の原因となる多型の探索においては、疾患への相対的な関与が比較的低い多型が複数個関与していると考えられるため、マイナーアレル頻度が一定頻度、例えば5％を下回る一塩基多型を棄却することが望ましい。
　このようにして得た滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型は、NCBIが提供するGenbankのような公知配列のデータベース、あるいは、NCBIが提供するdbSNP又はHapMapプロジェクトのデータベースのような公知一塩基多型のデータベースを参照することにより、データベース上のSNP ID(特に、dbSNP ID)、その一塩基多型が存在するゲノム上の物理的位置、一塩基多型の周辺の配列情報、一塩基多型が存在する遺伝子又は一塩基多型の近傍に存在する遺伝子、遺伝子上に存在する場合には一塩基多型の存在する位置がイントロン又はエクソンのいずれであるかの区別、遺伝子の機能、相同遺伝子などの情報を得ることができ、これらの情報を元に本発明において用いる核酸分子を取得し、本発明に用いるプローブなどを設計することができる。これらの情報をデータベースで検索する際の一塩基多型を特定するための情報としては、これらデータベースに収録された情報の１つ又は複数を使用することができる。
　このようにして決定された滲出型加齢黄斑変性と関連する一塩基多型において、一方のアレルと滲出型加齢黄斑変性発症の有無との間にどの程度強い関連が存在するかの指標として、オッズ比を求めることができる。オッズとは、ある群においてある事象が起こる確率を当該事象が起こらない確率で割った値であり、オッズ比とは、2つの異なる群におけるオッズの比である。アレルについてオッズ比を求める場合、あるアレルを持つ場合に疾患であるオッズ比、即ち、ｗＡＭＤ患者群における、一方のアレルの頻度と、前記一方のアレルに対立する、他方のアレルの頻度との比を、非ｗＡＭＤ患者群における一方のアレルの頻度と他方の頻度との比で除したものである。このとき、求められたオッズ比を本発明では前記「一方のアレル」について求めたオッズ比と呼ぶ。
　アレルのオッズ比を求める際に、ある頻度が0になり、よってオッズ比が無限大となるような場合には、当該0の代わりに適当な数を用いてオッズ比を近似計算することができる。0の代わりに用いる適当な数としては、例えば、0.5や0.1などの0を超える実数を用いることができる。
　さらに、本発明においては、前記アレルについて求めたオッズ比を用いてリスクアレルが決定される。前述の定義から明らかなように、一方のアレルについて求めたオッズ比は他方のアレルについて求めたオッズ比の逆数となっている。アレルについて求めたオッズ比が１より大となるようなアレルを本発明ではリスクアレルと呼び、リスクアレルに対立するアレルを非リスクアレルと呼ぶ。なお、本発明において「アレルのオッズ比」と称する場合、リスクアレルについて求めたオッズ比、即ち、リスクアレルを持つ場合に滲出型加齢黄斑変性であることのオッズ比を意味する。
　本発明においては、これらの指標により、滲出型加齢黄斑変性のリスクを予測することができる。ある一塩基多型のリスクアレルはｗＡＭＤ患者群において非ｗＡＭＤ患者群よりも高頻度に認められるアレルであり、即ち、滲出型加齢黄斑変性のリスクに関与するアレルである。アレルを用いて滲出型加齢黄斑変性リスクを予測する場合、当該一塩基多型のリスクアレルを少なくとも１つ持つことにより滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると予測される。この場合、オッズ比が大きいほどリスクアレルを有するサンプル提供者の滲出型加齢黄斑変性のリスクは高い。一方、オッズ比の定義から明らかなように、本発明においてはアレルのオッズ比の逆数を使用することにより、非リスクアレルを持つものの疾患リスクを予測することができる。即ち、アレルのオッズ比の逆数が１より小さいほど、非リスクアレルを持つものの疾患リスクが低いことの予測に用いることができる。
　本発明においては、アレルに加え、又は、アレルの代わりに遺伝子型、即ち、一方のアレルとその対立アレルとの組合せである遺伝子型を用いて滲出型加齢黄斑変性のリスクを予測することができる。この場合にも、アレルの場合と同様にリスクアレルを基準とすればよく、滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型は、オッズ比を考慮して決定することができる。
　遺伝子型のオッズ比を求めて滲出型加齢黄斑変性のリスクを判定する場合、まず、リスクアレルを基準にdominant型オッズ比とrecessive型オッズ比の２通りのオッズ比を求める。
　本発明において、dominant型オッズ比は、リスクアレルを少なくとも１つ持つ場合(即ち、リスクアレルホモ型又はヘテロ型である場合)に滲出型加齢黄斑変性であることのオッズ比、即ち、ｗＡＭＤ患者群におけるリスクアレルホモ型頻度とヘテロ型頻度の和と、非リスクアレルホモ型の頻度との比を、非ｗＡＭＤ患者群におけるリスクアレルホモ型頻度とヘテロ型頻度の和と、非リスクアレルホモ型の頻度との比で除したものであり、recessive型オッズ比はリスクアレルをホモに持つ場合に滲出型加齢黄斑変性であるオッズ比、即ち、ｗＡＭＤ患者群におけるリスクアレルホモ型の頻度と、非リスクアレルホモ型頻度とヘテロ型頻度の和との比を、非ｗＡＭＤ患者群におけるリスクアレルホモ型の頻度と、非リスクアレルホモ型頻度とヘテロ型頻度の和との比で除したものである。
　次に、滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型を決定する場合、上記のようにして求められたdominant型オッズ比及びrecessive型オッズ比を考慮して以下のように決定することができる。
　滲出型加齢黄斑変性に関連する各一塩基多型において、dominant型オッズ比がrecessive型オッズ比より大である場合、当該一塩基多型のリスクアレルはdominant型オッズ比に関連する。一方、同様にrecessive型オッズ比がdominant型オッズ比より大である場合、当該一塩基多型のリスクアレルはrecessive型オッズ比に関連する。リスクアレルがdominant型オッズ比に関連する場合、当該一塩基多型における滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型は、リスクアレルのホモ型及びヘテロ型であり、リスクアレルがrecessive型オッズ比に関連する場合、当該一塩基多型における滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型は、リスクアレルのホモ型である。
　尚、遺伝子型のオッズ比を求める際に、いずれかの遺伝子型の頻度が０となり、オッズ比が無限大となり、よって、算出不能となってしまうことがある。このような場合、アレルのオッズ比の場合と同様に、当該0の代わりに適当な数を用いてオッズ比を近似計算することができる。0の代わりに用いる適当な数としては、例えば、0.5や0.1などの0を超える実数を用いることができる。
　このようにして決定された滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型がサンプル中に検出された場合、当該サンプル提供者は滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると予測されることができる。いずれの場合もオッズ比が大である程滲出型加齢黄斑変性のリスクは高いと予測される。
　さらに、本発明の一塩基多型の組み合わせによって滲出型加齢黄斑変性のリスクを予測する場合にも、オッズ比の大小を用いてその予測精度を向上することができる。即ち、リスクアレルもしくは滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型を多数持ち、及び／又は、非リスクアレルもしくは滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型でない遺伝子型を少数しか持たないサンプル提供者の滲出型加齢黄斑変性のリスクは、そうでないサンプル提供者のリスクより高く、この場合において、オッズ比がより大きいアレル又は遺伝子型をより多く持つ場合に、滲出型加齢黄斑変性のリスクはより高いと予測される。
　好ましくは、アレル又は遺伝子型と疾患の程度の関連性を表す指標となるオッズ比又は滲出型加齢黄斑変性のリスク予測に用いるオッズ比は、統計学的に有意であると判定された一塩基多型について算出されたオッズ比である、
　後述のように、本発明の一塩基多型はゲノム上のイントロンやエクソンなどの遺伝子領域に存在する場合、又は、ゲノム上の遺伝子でない領域のいずれにも存在する場合がある。イントロンやエクソンに存在する場合は当該遺伝子は滲出型加齢黄斑変性の原因遺伝子の一つである可能性がある。また、本発明の一塩基多型がゲノム上の遺伝子でない領域に存在する場合は、当該一塩基多型の近傍にある遺伝子と当該一塩基多型が連鎖しており、当該近傍に存在する遺伝子が滲出型加齢黄斑変性の原因遺伝子の一つである可能性があり、あるいは、当該一塩基多型を含む領域又はその近傍がmRNAなどに転写され、RNA干渉などの現象を介して他の遺伝子の発現に関与している可能性がある。即ち、ゲノム上で本発明の一塩基多型が属する遺伝子、又は、ゲノム上で本発明の一塩基多型の近傍に存在する遺伝子は本発明の範囲に含まれる。
　本発明において、イントロン型一塩基多型(iSNP)とはイントロンに一塩基多型が存在することをいう。翻訳領域型一塩基多型(cSNP)とは、タンパクに翻訳される領域に一塩基多型が存在するもののうち、当該一塩基多型を含むコドンが他のアミノ酸をコードするコドンや終止コドンに変異するなど、アミノ酸配列に変化を伴うものをいう。サイレント型一塩基多型(sSNP)とは、翻訳領域に一塩基多型が存在するもののうち、アミノ酸配列の変化を伴わないものをいう。ゲノム型一塩基多型(gSNP)とは、ゲノム上の遺伝子をコードしない領域に一塩基多型が存在することをいう。転写調節型多型(rSNP)とは、エクソン上の転写調節に関与すると考えられる部位に存在する一塩基多型をいう。
　このように、一塩基多型はゲノム上のどのような位置にも存在することがあり、いずれの場合も疾患との関連を有し得る。イントロンあるいは非翻訳領域に一塩基多型が存在する場合は、遺伝子発現制御に影響する場合や、遺伝子の転写後に起こるスプライシングやmRNAの安定性に影響することがある。翻訳領域に一塩基多型が存在する場合は、その塩基の置換によってあるアミノ酸に対応するコドンが別のアミノ酸に対応するコドンに変化する、あるいは、終止コドンに変化するなどの変化が生じ、これによってコードされるタンパク質の構造に変化が生じることがある。これらの変化によって遺伝子の発現量や機能、ひいては当該遺伝子がコードするタンパクの発現量又は機能に変化が生じ、種々の疾患の原因になり得る。ゲノム型一塩基多型が疾患と関連する場合は、当該多型部位を含む領域が実際には翻訳され、他の遺伝子の発現に何らかの影響を及ぼしている可能性がある。サイレント型一塩基多型が疾患と関連している場合、その一塩基多型の周辺に疾患と関連する別の多型が存在し、当該多型とサイレント型一塩基多型が連鎖不平衡状態にある場合に疾患との関連が認められることが考えられる。同様に、サイレント型一塩基多型以外の一塩基多型であっても、当該一塩基多型自体は直接的な滲出型加齢黄斑変性の原因ではなく、周辺に存在する滲出型加齢黄斑変性の真の原因である多型と連鎖不平衡状態にある場合にも、これらの一塩基多型と滲出型加齢黄斑変性の関連が認められることがある。
(滲出型加齢黄斑変性に関連するアレルを含む核酸分子)
　本発明の別の態様では、滲出型加齢黄斑変性と関連する一塩基多型を含む核酸分子、及び、滲出型加齢黄斑変性と関連する一塩基多型を含む核酸分子に相補的な配列を有する核酸分子が提供される。
　後述の表１～１１に記載された一塩基多型を含む核酸配列を含む核酸分子及び／又は当該配列の相補的配列を含む核酸分子は、本発明でアレル検出に使用される核酸分子である。本発明でアレル検出に使用される核酸分子は、好ましくは表１～１０に記載された一塩基多型を含む核酸分子又はその断片であって、少なくともいずれか１つの前記核酸分子もしくは当該核酸分子に相補的な核酸分子又はこれらの断片であり、より好ましくは表１、又は表２～４に記載された一塩基多型を含む核酸分子又はその断片であって、少なくともいずれか１つの前記核酸分子もしくは当該核酸分子に相補的な核酸分子又はこれらの断片であり、さらに好ましくは表１に記載された一塩基多型を含む核酸分子又はその断片であって、少なくともいずれか１つの前記核酸分子もしくは当該核酸分子に相補的な核酸分子又はこれらの断片である。また、これらの表１～１１に記載された一塩基多型を含む核酸分子又は当該核酸分子に相補的な核酸分子のうち、リスクアレルを含む核酸分子又は当該核酸分子に相補的な核酸分子であることが望ましい。
　これらの滲出型加齢黄斑変性と関連する一塩基多型を含む核酸分子又は当該核酸分子に相補的な配列を有する核酸分子は滲出型加齢黄斑変性リスクの高低を判定するマーカーとして用いることができる。さらにこれらの核酸分子は、当該一塩基多型における、リスクアレルもしくはその対立アレルを検出し、又は、遺伝子型を決定するためのプローブとして用いることができる。また、当該一塩基多型がエクソン上に存在する場合には、これらの核酸分子は遺伝子の転写物の検出に用いることができる。
　本発明において、より好ましい核酸分子は、滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の同定の項で説明したのと同様の方法で選択することができる。
　真核生物のゲノムを構成する核酸分子はセンス鎖と、センス鎖に相補的なアンチセンス鎖の二重鎖で構成されている。即ち、一塩基多型もセンス鎖とアンチセンス鎖から構成されており、いずれの鎖の一塩基多型を検出することも同じ意味を持つから、本発明の核酸分子はこれらのいずれをも含む。
　本発明における核酸分子は、デオキシリボ核酸であるかリボ核酸であるかを問わず、これらの両方を同一の核酸分子中に持つ核酸分子もまた本発明に含まれる。尚、リボ核酸を含む核酸分子を用いる場合には、本発明の配列においてチミジン(T)で定義されたヌクレオシドはウリジン’(U)と読み替えることができる。相補鎖のヌクレオシドがチミジンとなる場合についても同様である。また、これらの核酸分子に本発明に用いるための機能を損なわない範囲で、必要に応じ化学修飾を施すことができる。この場合の機能とは、核酸分子を使用する目的を達成する機能を言う。
　本発明における核酸分子は、本明細書に開示された配列情報、又は、本明細書に開示されたデータベースID等の情報をdbSNP、HapMap又はGenbank等のデータベースで検索して得られる配列情報に基づき、公知の方法、例えばホスホロアミダイト法を用いて合成することができる。市販のDNA合成機を用いて合成することも可能である。また、本発明における核酸分子はヒト由来のDNAを含むサンプルから、PCR法などの公知の方法により、又は、一部の核酸分子についてはヒト由来のRNAを含むサンプルから、RT-PCR法などの公知の方法により取得することができる。取得に必要なプライマーは当業者であれば本明細書に開示された配列情報、又は、本明細書に開示されたデータベースのID等の情報から検索可能な配列情報に基づき設計することができる。例えばPCR法を用いる場合には、目的とする核酸分子の一部の配列と相同な配列を有するような約10～30塩基のプライマーが使用可能であり、RT-PCR法を用いる場合には、オリゴdTプライマー、又はランダムヘキサマーなどを用い、逆転写反応を行って相補DNA(cDNA)を作成し、当該cDNA中の目的の配列を前述のPCR法で増幅することによって得ることができる。
　核酸分子は、好ましくは16～50塩基、より好ましくは23～27塩基、さらに好ましくは25塩基の長さを有し、かつ、前述の多型部位とその周辺の配列、又はこれに相補的な配列を含む核酸分子であることが望ましい。なお、核酸分子には、その機能を損なわない範囲で、任意の化学修飾を施すことができる。この場合の機能とは、核酸分子を使用する目的を達成する機能を言う。
　本発明の滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の検出方法及び滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測方法において、アレル検出に用いられる核酸分子は、配列番号1～124で示される塩基配列からなる群(それぞれ、奇数番目と偶数番目の塩基配列の組で１つの一塩基多型に対応する)より選択される少なくとも１つの塩基配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列において、前記配列番号1～124で示される塩基配列の17番目に相当するアレルを有する配列を含有する核酸分子であり、
より好ましくは、配列番号１～14で示される塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列において、前記配列番号1～14で示される塩基配列の17番目に相当するアレルを有する配列を含有する核酸分子であり、
さらに好ましくは、以下の、a～gの一塩基多型を含む塩基配列の組からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列において、前記a～gの組に含まれる塩基配列の17番目に相当するアレルを有する配列を含有する核酸分子である。(ここで、前述のように、a～gで示される配列番号の組において、それぞれの塩基配列の組は１つの一塩基多型の互いに対立するアレルを17番目の塩基に含む塩基配列である)
a： 配列番号1及び／又は配列番号2、
b： 配列番号3及び／又は配列番号4、
c： 配列番号5及び／又は配列番号6、
d： 配列番号7及び／又は配列番号8、
e： 配列番号9及び／又は配列番号10、
f： 配列番号11及び／又は配列番号12、ならびに、
g： 配列番号13及び／又は配列番号14
なお、本明細書において、部分配列とは、核酸配列の断片のことを意味し、前記配列の17番目に相当するアレルを有するものであれば配列長には限定はないが、例えば、好ましくは16～50塩基、より好ましくは23～27塩基、さらに好ましくは25塩基の長さを有する断片である。本発明の一塩基多型をdbSNP等の公知一塩基多型のデータベース又は公知配列情報のデータベースで検索して得られる、本発明の一塩基多型を含む核酸配列の断片も本発明の部分配列に含まれる。
　上記のいずれかの一塩基多型を含む核酸分子を用いる場合、中でも、それぞれの一塩基多型を含む配列の組のうち、奇数番目の配列番号で示される配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列からなる塩基配列において、前記選択される塩基配列の17番目に存在する一塩基多型のアレルを含む核酸分子を用いることが好ましい。また、上記核酸分子は、上記アレルを含む配列からなるものが好ましい。なお、これらはそれぞれの多型部位において、リスクアレルを含む塩基配列である。
(滲出型加齢黄斑変性に関連するアレルを検出可能なプローブ)
　本発明の別の態様では、滲出型加齢黄斑変性に関連するアレルを検出可能なプローブが提供される。本発明におけるプローブは、前述の本発明の核酸分子と同様の方法で作ることができる。
　プローブは、後述の表１～１１に記載された一塩基多型の各アレルを含む核酸配列又はその相補的配列と、ストリンジェントな条件(高ストリンジェンシーな条件ともいう)でハイブリダイズし得るものであればいかなるものでも用いられる。好ましくは、本発明のプローブは、表１～１０に記載された少なくともいずれか１つの一塩基多型に含まれるリスクアレル及び／又は非リスクアレルを検出可能なプローブであり、より好ましくは表１～４に記載された少なくともいずれか１つの一塩基多型に含まれるリスクアレル及び／又は非リスクアレルを検出可能なプローブであり、さらに好ましくは表１に記載された少なくともいずれか１つの一塩基多型に含まれるリスクアレル及び／又は非リスクアレルを検出可能なプローブである。また、これらの表１～１１に記載されたいずれか１つの一塩基多型に含まれるリスクアレル及び／又は非リスクアレルを検出可能なプローブにおいて、好ましい態様の１つとしてリスクアレルを検出可能なプローブが挙げられる。一方、１つの一塩基多型においてリスクアレルを検出可能なプローブと非リスクアレルを検出可能なプローブの両方を用いることにより、当該一塩基多型の遺伝子型を決定することができる。
　本明細書において、ハイブリダイズとは、ある配列を有する核酸分子と、その核酸分子の少なくとも一部分に対し相補的な核酸分子が互いに相補的な塩基配列に基づき水素結合を介して会合することを意味する。元の核酸分子と会合する相補的な核酸分子の種類は同じでも異なっても良く、これらの核酸分子を構成する核酸分子の種類はデオキシリボ核酸であってもリボ核酸であっても、又は同一核酸分子内にその両方を持つものであっても良い。
　本明細書においてストリンジェントな条件又は高ストリンジェンシーな条件とは、ある配列を有する核酸分子に、前記核酸分子の部分配列と相補的な配列を有する核酸分子が特異的にハイブリダイズする条件を意味する(Fred M. Ausuble et al., Current Protocols in Molecular Biology p.2.10.1-2.10.16; John Wiley and Sons, Inc.)。25塩基長のDNA分子からなる固層化プローブを用いる場合の具体例としては、例えば、0.056M 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid、5％ DMSO、2.5×デンハルド液、5.77mM EDTA、0.0115％ Tween-20、2.69M Tetrametyl Ammonium Chlorideの存在下、95℃で10分変性後49℃でハイブリダイズするような条件が例示される。このような条件はプローブとして用いる核酸分子の配列長や化学修飾の程度によって異なる場合があることが知られており、特異的にハイブリダイズが可能となるようなハイブリダイズ及び／又は洗浄条件の最適化は当業者の通常の創作能力で可能である。
　本発明においてアレル特異的(又は、アレルに特異的)とは、当該多型部位を含む核酸分子において当該アレルを含むこと、又は、ある核酸分子が当該多型部位において、当該アレルを含む配列を有する核酸分子にストリンジェントな条件下で特異的に、即ち、当該アレルと対立するアレルを識別可能なようにハイブリダイズすることを言う。
　多型部位のアレルの決定は、ゲノムのセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれの多型部位を検出することによっても行うことができるため、本発明におけるプローブはセンス鎖のアレルに特異的な配列の相補的配列、すなわちアンチセンス鎖のアレルに特異的な配列、ならびにアンチセンス鎖のアレルに特異的な配列に相補的な配列、すなわちセンス鎖のアレルに特異的な配列を持つ核酸分子のいずれも含まれる。本発明のプローブは本発明の一塩基多型を含むcDNA又はmRNAの検出に用いることもできる。cDNA又はmRNAの検出に用いる場合、当該一塩基多型はエクソン又はその近傍に存在するものが好適に用いられる。
　本発明におけるプローブは、後述の表１～１１に記載された、アレル特異的な配列もしくはその相補鎖又はこれらの部分配列を含む核酸分子からなる。
　本発明におけるプローブには、アレル特異的な配列又はその相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る範囲において、末端にスペーサー又は安定化等に供する目的で当該配列に由来しない任意の数塩基の配列を付加することができる。好ましくは、本発明におけるプローブにおいてアレルに特異的なハイブリダイズに寄与する配列はアレル特異的な配列又はその相補鎖のみからなる。
　プローブには検出に用いるための任意の標識を施すことができる。プローブに施す標識は通常用いられるいかなるものでも用いうるが、一般的には例えばFITCやCy3などの蛍光標識、ビオチン、又は、アルカリホスフォターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素標識などが用いられる。ビオチン標識を用いる場合には、ビオチンに特異的に結合するストレプトアビジン又はアビジンにさらに検出可能な標識を施しておき、当該標識ストレプトアビジン等を二次標識として使用する。標識ストレプトアビジン等の代わりに標識抗ビオチン抗体を使用することもできる。ビオチンに結合したストレプトアビジンに対し、さらに標識抗ストレプトアビジン抗体を三次標識として使用することにより、検出感度を向上することも可能である。プローブに標識を施す方法は公知の如何なる方法でも用いられ、その方法は当業者にとって周知である。プローブに前述のスペーサーとなる任意の配列を付加し、スペーサーに標識を施すこともできる。プローブの標識化用の試薬、標識ストレプトアビジン、標識抗ビオチン抗体などは試薬として市販されており、購入して使用することもできる。
　本発明におけるプローブは、目的とするアレルを有する核酸分子に特異的にハイブリダイズし得るかぎり、デオキシリボ核酸であるかリボ核酸であるかを問わず、これらの両方を同一の核酸分子中に持つ核酸分子からなるプローブもまた本発明に含まれる。また、リボ核酸を含む核酸分子をプローブとして用いる場合には、本発明の配列においてチミジン(T)で定義されたヌクレオシドはウリジン’(U)と読み替えることができる。前記本発明の配列の相補鎖のヌクレオシドがチミジンとなる場合、又は、ｍＲＮＡの検出のために本発明のプローブを用いる場合についても同様である。また、本発明におけるプローブには、目的とするアレルを有する核酸分子にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズし得る限り、必要に応じ化学修飾を施すこともできる。化学標識を施す方法は公知のいかなる方法も用いられる。
　検出用のプローブは、溶液状態でサンプルと反応させ公知の方法で検出することも、あらかじめ担体上に固層化しておくことも可能である。数個乃至数十万個の異なる一塩基多型のそれぞれのアレルに対応するプローブを、一つの一塩基多型あたり一個乃至十数個ずつあらかじめ固体の担体上の定められた位置に固層化しておき、サンプルをこれに反応させ、ハイブリダイズしたプローブから生じるシグナルをスキャンしコンピューターを用いて解析する固層化プローブ、いわゆるマイクロアレイの形態を取ることも可能である。固層化プローブの形態を取る場合には、固層化するプローブの最大数はプローブの固層化密度と固層化部位の面積によって制限される。
　このような固層化プローブの形態を取る場合、サンプル中の核酸分子を公知の方法で標識化しておき、固層化された本発明の非標識プローブと結合させることにより、又は、検出すべきアレルを持つ核酸分子を固層化された本発明の非標識プローブと結合させた後に公知の方法で標識化することにより、標識された、前記検出すべきアレルを持つ核酸分子由来の固層上のシグナルを検出することができる。
　固層化は公知のいかなる方法によっても行うことができるが、例えば合成オリゴプリント、スポッティングフォトリソグラフなどの方法を用いることができる。また、担体の材質には制限がなく、一般的に用いられる材質、例えばポリカーボネートやポリスチレンなどの高分子、ガラス、シリコン結晶等が用いられる。また、核酸の接着力を高めるために、固層化の前に担体にあらかじめ陽イオン化などのコーティングを施しても良い。また、非特異的な核酸の担体への吸着を防ぐため、固層化を行った後に公知のブロッキング剤によりブロッキングを行うこともできる。このようなブロッキング剤には、非特異的な核酸の担体への吸着を抑制できるものであれば何でも用いられるが、例えばサケ精子ＤＮＡ、デンハルト溶液、胎盤から抽出したCot-I DNA、ドデシル硫酸ナトリウムなどの陰イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートなどの非イオン性界面活性剤などを用いることができる。
　また、プローブを固層化する場合には、同一担体上に対立する各々のアレルに特異的なプローブを固層化することにより、一つのサンプル中に含まれる対立する各々のアレルを同一操作で検出する構成とすることもできる。このような構成では、同一の操作によってサンプルのアレルのみならず遺伝子型を決定することも可能である。
　検出用のプローブの好適な配列長は検出方法によって異なるが、本発明の滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型のアレル又は遺伝子型を特異的に検出可能なものであればよい。例えば、アレルの検出に固層化プローブを用いる場合のプローブは、好ましくは16～50塩基、より好ましくは23～27塩基、さらに好ましくは25塩基の長さを有し、かつ、前述の多型部位とその周辺の配列、又はこれに相補的な配列を含む核酸分子からなるプローブであり、アレルの検出を溶液状態で行う場合のプローブは、好ましくは16～50塩基、より好ましくは23～27塩基、さらに好ましくは25塩基の長さの長さを有し、かつ、前述の多型部位とその周辺の配列、又はこれに相補的な配列を含む核酸分子からなるプローブである。
　本発明の滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の検出方法及び滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測方法において、アレル検出に用いられるプローブは、配列番号1～124で示される塩基配列からなる群(それぞれ、奇数番目と偶数番目の塩基配列の組で１つの一塩基多型に対応する)より選択される少なくとも１つの塩基配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列からなる塩基配列において、前記配列番号1～124で示される塩基配列の17番目に相当するアレルを有する塩基配列を含有するプローブであり、
好ましくは、配列番号１～14で示される塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列からなる塩基配列において、前記配列番号1～14で示される塩基配列の17番目に相当するアレルを有する塩基配列を含有するプローブであり、
より好ましくは、以下の、a～gの一塩基多型を含む塩基配列の組からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列からなる塩基配列において、前記a～gの組に含まれる塩基配列の17番目に相当するアレルを有する塩基配列を含有するプローブである。(ここで、前述のように、a～gで示される配列番号の組において、それぞれの塩基配列の組は１つの一塩基多型の互いに対立するアレルを17番目の塩基に含む塩基配列である)
a： 配列番号1及び／又は配列番号2、
b： 配列番号3及び／又は配列番号4、
c： 配列番号5及び／又は配列番号6、
d： 配列番号7及び／又は配列番号8、
e： 配列番号9及び／又は配列番号10、
f： 配列番号11及び／又は配列番号12、ならびに、
g： 配列番号13及び／又は配列番号14
　上記のいずれかの一塩基多型を含むプローブを用いる場合、中でも、それぞれの一塩基多型を含む配列の組のうち、奇数番目の配列番号で示される配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列からなる塩基配列において、前記選択される塩基配列の17番目に存在する一塩基多型のアレルを含むプローブを用いることが好ましい。なお、これらはそれぞれの多型部位において、リスクアレルを含む塩基配列である。
(サンプル中の滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の検出方法及び滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測方法)
　本発明のある態様では、核酸分子を含むサンプル中に、ｗＡＭＤ患者において頻度が高いアレル又は遺伝子型を有するか否かの検出方法が提供される。サンプルとしては、核酸分子を含むもの、即ち、ゲノム由来の核酸分子(DNA及び／又はRNA)を抽出可能なもの、又は、本発明の一塩基多型の近傍に存在する遺伝子を含むmRNA又はcDNAを抽出可能なものであれば何でも良いが、例えば、血液、白血球、毛根、毛髪、唾液、口腔粘膜細胞、鼻腔粘膜細胞、皮膚、又は、生検によって得た筋肉もしくは臓器などの組織が用いられる。
　前述のように、真核生物のゲノムを構成する核酸分子は互いに相補的なセンス鎖とアンチセンス鎖で構成されており、サンプルに含まれる核酸分子における本発明の一塩基多型のアレルの検出は、当該多型部位のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれの塩基を検出することによっても行うことができる。
　本発明で開示された、滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型を含む33塩基長の核酸配列は、その中央(即ち、17番目)の塩基のみが異なる2つの塩基配列からなる塩基配列の組(即ち、配列番号が奇数と偶数の組)からなり、当該17番目の塩基が多型部位である。多型部位におけるリスクアレルを含む塩基配列は、前記の塩基配列の組のうち先の(即ち、奇数番目の)配列である。また、リスクアレルは後述の表１～１１に記載されている。これらの一塩基多型の少なくとも１つについて、サンプルに含まれる核酸分子中のリスクアレルを検出することにより、サンプル提供者の滲出型加齢黄斑変性リスクを予測することができる。即ち、サンプル中の核酸分子に当該一塩基多型におけるリスクアレルが少なくとも一つ存在する場合に、滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると予測すればよい。
　また、上記で同定した滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型について、一つのサンプルに含まれる特定のアレルに対立する各々のアレルを検出し、遺伝子型を決定することができる。即ち、あるアレルのみが検出された場合は当該アレルをホモに有するホモ型であり、２つのアレルが検出された場合には当該２つのアレルをヘテロに有するヘテロ型である。これらの一塩基多型の少なくとも１つについて、サンプル中の核酸分子に含まれる当該一塩基多型の遺伝子型を決定し、後述の表１～１１に記載されたｗＡＭＤ患者群及び対照群の遺伝子型頻度データを基に、前述の方法によって滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型を決定し、これらを比較することにより、同様にリスク予測を行えばよい。尚、サンプル中の核酸分子に含まれる一塩基多型の遺伝子型の決定には、リスクアレルの特定は必ずしも必要でないことから、遺伝子型の決定は、サンプル中の核酸分子に当該一塩基多型のリスクアレルが少なくとも１つ存在するか否かを判定する前後のいずれにも行うことができ、該決定された遺伝子型と、リスクアレルに基づいて決定された滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型との比較を行って、滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測を行うことができる。
　核酸分子を含むサンプル中にこれらのアレルの存在を検出するには、如何なる方法でも用いうるが、前述のそれぞれのアレルに特異的なプローブを用いてハイブリダイズし、そのシグナルを検出することによりそれぞれのアレルを検出することができる。検出されたアレルと本発明で開示された当該一塩基多型におけるリスクアレルを比較することにより、サンプル中の核酸分子に当該一塩基多型におけるリスクアレルが存在するか否かを決定できる。例えば、前述の本発明の核酸分子及び／又は前述の本発明のプローブは、本発明の滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の検出方法及び滲出型加齢黄斑変性のリスク予測方法におけるリスクアレル又は滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型の決定に好適に用いることができる。
　また、対立する各々のアレル、即ち、ある一塩基多型に含まれるリスクアレル及び非リスクアレル、に対応するプローブにそれぞれ異なる標識を施し、又は、対立する各々のアレルを固層化したマイクロアレイなどの固層化プローブを用いることにより、同一サンプルに含まれる対立する各々のアレルを検出することができる。このような構成では、サンプルのアレルのみならず遺伝子型を決定することも可能である。また、対立する各々のアレルを同一担体上に固層化したマイクロアレイなどの固層化プローブを用いる場合には、同一操作でハイブリダイズを行い、同一操作で検出する構成とすることもできる。
　本発明の一塩基多型を検出する方法としては、上述の方法以外に公知のいかなる方法も用いられるが、例えば、次のようなものが利用可能である。プローブを用いてハイブリダイズする方法の例としてはＴａｑＭａｎ(登録商標)法、インベーダー(Invader (登録商標))法などがあり、これらのいずれも用い得る。同一のアレルを検出するためのプローブであっても、検出に用いる方法によってより好ましいプローブが異なる場合がある。本発明の一塩基多型のアレル又は遺伝子型の判定は検出方法に依存しないが、検出方法に応じて適するプローブを使用することが望ましい。また、プローブによるハイブリダイズを行わない方法としては、直接塩基配列を決定するダイレクトシークエンス法などが挙げられる。
　なお、前述のように、本明細書において「アレル特異的」又は「アレルに特異的」とは、当該多型部位を含む核酸分子又は塩基配列において当該アレルを含むこと、又は、ある核酸分子が当該多型部位において、当該アレルを含む配列を有する核酸分子にストリンジェントな条件下で特異的に、即ち、当該アレルと対立するアレルを識別可能なようにハイブリダイズすることが可能であることを言う。
　このようにしてサンプルの分析を行い、サンプル中にリスクアレル又は滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型が存在する場合、当該サンプルを提供した者は滲出型加齢黄斑変性のリスクが高いと予測され、当該サンプルを提供した滲出型加齢黄斑変性が疑われる者は滲出型加齢黄斑変性と診断されるべき蓋然性が高い。滲出型加齢黄斑変性のリスクの大小はオッズ比の大小を用いて予測することができる。
　さらに、一つのサンプルを用いて、本発明の滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の、リスクアレル又は遺伝子型の二つ以上を検出することにより、将来的な滲出型加齢黄斑変性のリスクの判定の精度を向上することもできる。この場合、サンプル中に検出されるリスクアレルもしくは滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型の数又はこれらのオッズ比の大小を指標にリスクの大小を予測することができる。当該リスクアレルもしくは滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型の数又はこれらのオッズ比が大であるほど、あるいは、これらの数値がある閾値を超えた場合にリスクがより高いと判定することができる。
　前述のように、本発明の滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の検出方法及び滲出型加齢黄斑変性のリスク予測方法には、サンプル中の核酸分子に後述の表１～１１に記載されたいずれかの一塩基多型のアレル及び／又は遺伝子型の決定を行うこと、当該サンプル中の一塩基多型のアレル及び／又は遺伝子型と本発明で開示された当該一塩基多型のリスクアレル及び／又は本発明で開示された滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型の比較を行うこと、の少なくとも１つを含むものであれば全て含まれる。
　好ましくは本発明の滲出型加齢黄斑変性のリスク予測方法は表１～１０に記載された少なくともいずれか１つの一塩基多型のアレル及び／又は遺伝子型を決定すること、当該サンプル中の一塩基多型のアレル及び／又は遺伝子型と本発明で開示された当該一塩基多型のリスクアレル及び／又は本発明で開示された滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型の比較を行うこと、の少なくとも１つを含むものであり、
より好ましくは本発明の滲出型加齢黄斑変性のリスク予測方法は表１～４に記載された少なくともいずれか１つの一塩基多型のアレル及び／又は遺伝子型を決定すること、当該サンプル中の一塩基多型のアレル及び／又は遺伝子型と本発明で開示された当該一塩基多型のリスクアレル及び／又は本発明で開示された滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型の比較を行うこと、の少なくとも１つを含むものであり、
さらに好ましくは表１に記載された少なくともいずれか１つの一塩基多型のアレル及び／又は遺伝子型を決定すること、当該サンプル中の一塩基多型のアレル及び／又は遺伝子型と本発明で開示された当該一塩基多型のリスクアレル及び／又は本発明で開示された滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型の比較を行うこと、の少なくとも１つを含むものである。
　本発明の滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の検出方法及び滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測方法において、検出に用いられる一塩基多型は、配列番号1～124で示される塩基配列からなる群(それぞれ、奇数番目と偶数番目の塩基配列の組で１つの一塩基多型に対応する)より選択される、少なくとも１つの塩基配列又はその相補的配列において、各塩基配列の17番目に存在する一塩基多型であり、
より好ましくは、配列番号１～14で示される塩基配列からなる群より選択される、少なくとも１つの塩基配列又はその相補的配列において、各塩基配列の17番目に存在する一塩基多型であり、
さらに好ましくは、以下の、a～gの一塩基多型を含む塩基配列の組からなる群より選択される、少なくとも１つの塩基配列又はその相補的配列において、各塩基配列の17番目に存在する一塩基多型である。(ここで、前述のように、a～gで示される配列番号の組において、それぞれの塩基配列の組は１つの一塩基多型の互いに対立するアレルを17番目の塩基に含む塩基配列である)
a： 配列番号1及び／又は配列番号2、
b： 配列番号3及び／又は配列番号4、
c： 配列番号5及び／又は配列番号6、
d： 配列番号7及び／又は配列番号8、
e： 配列番号9及び／又は配列番号10、
f： 配列番号11及び／又は配列番号12、ならびに、
g： 配列番号13及び／又は配列番号14
　上記のいずれかの一塩基多型を用いる場合、中でも、それぞれの一塩基多型を含む配列の組のうち、奇数番目の配列番号で示される配列又はその相補的配列において、各塩基配列の17番目に存在する一塩基多型のアレルを用いることが好ましい。なお、これらはそれぞれの多型部位において、リスクアレルを含む塩基配列である。
　サンプル中のこれらの一塩基多型の検出を行うに当たり、上記いずれか１つの一塩基多型に加えて、該一塩基多型以外に、さらに表１～１１に記載された少なくともいずれか１つの一塩基多型のアレル又は遺伝子型を決定することを組み合わせることにより疾患判定の精度を向上させることができる。組み合わせに用いる一塩基多型は、好ましくは表１～１０に記載された一塩基多型であり、より好ましくは表１～４に記載された一塩基多型であり、さらに好ましくは表１に記載された一塩基多型である。
(滲出型加齢黄斑変性に関連するアレルを検出するためのキット)
　本発明の別の態様では、滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型を検出するためのキットが提供される。
　本発明のキットには、サンプル中の核酸分子に後述の表１～１１に記載されたいずれかの一塩基多型のリスクアレルを検出することができるものであれば全て含まれる。好ましくは、本発明のキットは、表１～１０に記載された少なくともいずれか１つの一塩基多型のリスクアレル及び／又は非リスクアレルの検出が可能なキットであり、より好ましくは表１～４に記載された少なくともいずれか１つの一塩基多型のリスクアレル及び／又は非リスクアレルの検出が可能なキットであり、さらに好ましくは表１に記載された少なくともいずれか１つの一塩基多型のリスクアレル及び／又は非リスクアレルの検出が可能なキットである。１つの一塩基多型に含まれるリスクアレル及び非リスクアレルの両方を検出可能なキットを用いることにより当該一塩基多型の遺伝子型を決定することができる。
　本発明のキットにおいて、上記いずれか１つの一塩基多型に加えて、該一塩基多型以外に、さらに表１～１１に記載された少なくともいずれか１つの一塩基多型のリスクアレル及び／又は非リスクアレルの検出あるいは遺伝子型の決定が可能なキットも本発明の態様の一つである。複数の一塩基多型のアレル又は遺伝子型の決定を行うキットの場合、上記いずれか１つの一塩基多型に加えて、好ましくはさらに表１～１０に記載された一塩基多型のリスクアレル及び／又は非リスクアレルの検出あるいは遺伝子型の決定が可能なキットであり、より好ましくはさらに表１～４に記載された一塩基多型のリスクアレル及び／又は非リスクアレルの検出あるいは遺伝子型の決定が可能なキットであり、さらに好ましくはさらに表１に記載された一塩基多型のリスクアレル及び／又は非リスクアレルの検出あるいは遺伝子型の決定が可能なキットである。
　これらの表１～１１の少なくとも１つの一塩基多型のリスクアレル及び／又は非リスクアレルの検出あるいは遺伝子型の決定が可能なキットのうち、好ましい態様の一つに、前記一塩基多型のリスクアレルの検出が可能なキットが挙げられる。
　プローブの項で説明したように、本発明のキットは一塩基多型のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれの塩基を検出するものであっても良く、これらの両者を検出するものであっても良い。一塩基多型の検出方法にも制限はなく、例えばプローブの項で例示した検出方法が用いられる。
　前述の本発明の核酸分子及び／又は前述の本発明のプローブを用いて滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型を検出するためのキットは、本発明に含まれる。即ち、本発明のキットは、滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型のアレル又は遺伝子型の決定が可能なように、本発明の核酸分子及び／又は本発明のプローブを含有するものである。
　前述のリスクアレルと、非リスクアレルの両方を検出するキットも本発明の好ましい実施態様の一つである。このようなキットを用い、既に説明したように各アレルの遺伝子型を決定することも可能である。
　本発明のキットを用いて、サンプル中にリスクアレル又は滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型が存在することを検出することにより、非ｗＡＭＤ患者の将来的な滲出型加齢黄斑変性のリスクを予測し又は滲出型加齢黄斑変性の疑いがある者の滲出型加齢黄斑変性の診断又は診断の補助を行うことができる。
　また、前述のように、対立するアレルにそれぞれ特異的なプローブを用い、かつ、プローブの標識を異なるものとすることにより、又は、前述の固層化プローブ（マイクロアレイ）の形態とすることにより、対立するアレルを同一操作で測定するキットとすることもできる。
　一つのサンプルを用いてこれらのアレル又は遺伝子座の複数を検出する構成のキットとすることにより、将来的な滲出型加齢黄斑変性のリスク予測や診断の精度を向上させることもできる。このような構成においても、異なる標識を施したプローブや前述のマイクロアレイの形態とすることにより、検出を同一操作で行う構成とすることもできる。
　本発明の滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の検出方法及び滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測方法において、検出又はリスク予測に用いられるキットは、配列番号1～124で示される塩基配列からなる群(それぞれ、奇数番目と偶数番目の塩基配列の組で１つの一塩基多型に対応する)より選択される少なくとも１つの塩基配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列からなる塩基配列において、前記配列番号1～124で示される各塩基配列の17番目に相当する一塩基多型のアレル又は遺伝子型の決定が可能なキットであり、
好ましくは、配列番号１～14で示される塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列からなる塩基配列において、前記配列番号1～124で示される各塩基配列の17番目に相当する一塩基多型のアレル又は遺伝子型の決定が可能なキットであり、
より好ましくは、以下の、a～gの一塩基多型を含む塩基配列の組からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列からなる塩基配列において、前記配列番号1～124で示される各塩基配列の17番目に相当する一塩基多型のアレル又は遺伝子型の決定が可能なキットである。(ここで、前述のように、a～gで示される配列番号の組において、それぞれの塩基配列の組は１つの一塩基多型の互いに対立するアレルを17番目の塩基に含む塩基配列である)
a： 配列番号1及び／又は配列番号2、
b： 配列番号3及び／又は配列番号4、
c： 配列番号5及び／又は配列番号6、
d： 配列番号7及び／又は配列番号8、
e： 配列番号9及び／又は配列番号10、
f： 配列番号11及び／又は配列番号12、ならびに、
g： 配列番号13及び／又は配列番号14
　上記のいずれかの一塩基多型のアレル又は遺伝子型の決定が可能なキットにおいて、中でも、それぞれの一塩基多型を含む配列の組のうち、奇数番目の配列番号で示される配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列からなる塩基配列において、前記a～gの組で示される各塩基配列の17番目に相当する一塩基多型のアレルの決定が可能なキットであることが好ましい。なお、これらはそれぞれの多型部位において、リスクアレルを含む塩基配列である。
(好ましい人種)
　本発明で用いられる滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型は、当該多型を有する限りいかなる人種においても用いられるが、好ましい人種はモンゴロイドであり、より好ましくは東アジア人であり、さらに好ましくは日本人又は日本人を祖先にもつ人である。
　本発明により、本発明で開示されたリスクアレル又は滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型をゲノム上に持つ者は、将来的に滲出型加齢黄斑変性を発症する危険性が高く、リスクアレル又は滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型を持たない者は、将来的に滲出型加齢黄斑変性を発症する危険性が低いと判定することが出来る。
　また、本発明で開示されたリスクアレル又は滲出型加齢黄斑変性のリスクあると考えられる遺伝子型をゲノム上に持つ、初期の滲出型加齢黄斑変性の疑いがある者は、検出が困難な初期の滲出型加齢黄斑変性を発症している恐れがあるため、本発明の一塩基多型の検出を行うことにより、滲出型加齢黄斑変性の診断又は診断の補助に用いることができる。
　以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、実施例は本発明をより良く理解するために例示するものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されることを意図するものではない。なお、以下の実施例では、特に詳細な説明がない一般的な分子生物学的手法については、モレキュラークローニング (Joseph Sambrook et al., Molexular Cloning - A Laboratory Manual, 3rdEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)などの成書に記載された方法及び条件が用いられ、試薬としては分子生物学グレードのものが用いられる。
　本発明では、滲出型加齢黄斑変性と診断された患者、緑内障であると診断された患者、及び、白内障と診断された患者それぞれの血液から総DNAを抽出し、ヒトゲノム上の公知の一塩基多型約50万個を指標として疾患に関連する遺伝子座を解析し、滲出型加齢黄斑変性に特異的に関連すると考えられる一塩基多型の検討を行った。
実施例１　検体からのDNAの抽出
　検体からのDNAの抽出は、フェノール抽出法(Methods in Enzymology、152巻、181ページ、1987年)に準じて実施した。クエン酸を加えた血液サンプルにアンモニウム塩及びEDTAを含む低張な溶血バッファーを十分量加えて白血球を精製した。数回の洗浄の後、Proteinase KとSDSを含む溶解バッファーで細胞を溶解させた。懸濁されていた細胞が溶解して透明になったのを確認した後、フェノールを加え、室温で1～3時間振盪した。フェノール層を廃棄し、水層のみを遠心分離してさらに不純物を分離した。水層をTE緩衝液(10mM Tris pH8.0、0.1mM EDTA, Teknova)で透析した後にエタノール沈殿法にてDNAを回収し、TE緩衝液に溶解した。このようにして得たゲノムDNA溶液20μLに7.5M NH4OAc 10μL、20mg/mL Glycogen 0.5μLと100％ 氷冷エタノール50μLを加え-20℃で1時間静置した。12,000×gで20分遠心後、上清を除いた。80％氷冷エタノール 500μLを加え12,000×gで5分遠心後、上清を除き沈殿を乾燥させた。沈殿をTE緩衝液に溶かし、濃度が50ng/μLになるよう調整した。尚、DNA濃度は分光光度計 (Biophotometer, Eppendorf)を用い、260nmの吸光度により測定した。また、一部のサンプルについては、自動核酸抽出装置(Magtration System 8Lx、プレシジョン・システム・サイエンス株式会社) を用い、装置の説明書に従ってDNAを抽出した。
実施例２　一塩基多型の分析
　一塩基多型の分析は、ヒトゲノム上の公知の一塩基多型約50万個の分析が可能な市販のマイクロアレイ型の一塩基多型分析キット(アフィメトリックス社、ジーンチップ　ヒューマンマッピング 250K Nsp/Sty アレイ(GeneChip(登録商標) Human Mapping 250K Nsp/ Sty Array))(以下、マイクロアレイと記載)を使用した。
　実施例１にて抽出した総DNA (ゲノムDNA) をキット及び機器の説明書に従って処理し、マイクロアレイ上に適用して検体から抽出したDNAに存在する一塩基多型を解析する。具体的には、以下の操作を行う。
(制限酵素処理)
　250ngずつのゲノムDNAを以下の手順によりそれぞれSty I(New England Biolabs)又はNsp I(New England Biolabs)制限酵素で切断する。即ち、ゲノムDNA溶液5μLに、市販の分子生物学グレードの超純水 (AccuGENE(登録商標) molecular biology-grade water, Cambrex)11.5μL、それぞれの制限酵素に添付された緩衝液 2μL、10mg/mL BSA 0.2μL、10U/mL 制限酵素 1μLを加え制限酵素処理を行った。反応は37℃で2時間反応させた後、65℃で20分インキュベートして制限酵素を失活させた。
(アダプター配列の付加)
　制限酵素処理が終了したサンプルに、以下の手順でアダプター配列を付加する。制限酵素処理サンプルに、切断した制限酵素に対応する50μM のAdaptor Nsp I又はAdaptor Sty I (New England Biolabs) 0.75μL、T4 DNA ligase緩衝液 (New England Biolabs) 2.5μLとT4 DNA ligase (New England Biolabs) 2μLを加え、16℃で3時間反応させてアダプター配列を付加させた後に、70℃で20分反応させてT4 DNA ligaseを失活させた。アダプター付加終了したサンプルには、冷却したAccuGENE water 75μLを加え希釈した。
(遺伝子断片の増幅と精製)
　以下の手順により、アダプター配列を付加した遺伝子をTITANIUMTM(登録商標) DNA Amplification kit (Clontech )を用いてPCR法で増幅する。即ち、希釈したサンプル5μLにAccuGENE water 39.5μL、TITANIUMTM(登録商標) taq PCR buffer 10μL、5M GC-Melt (Clonetech) 20μL、2.5mM dNTP(タカラバイオ) 4.5μL、100μM PCR primer002 (Affymetrix, GeneChip(登録商標) Mapping 250K Nsp/ Sty Assay Kitに含まれる) 4.5μL及びTITANIUMTM(登録商標) taq DNA polymerase 2μLを加えて反応させた。反応温度と時間は次の通りである。まず、94℃で3分放置後、94℃30秒→60℃30秒→68℃15秒を１サイクルとして30サイクル反応させ、68℃で7分放置した。これを１連の反応操作として、１つのサンプルにつき同じPCR反応操作を3回行った。PCR産物は2％アガロースゲル電気泳動を行い、200bpから1000bpの遺伝子断片が増幅されていることを確認した。3回分のPCR産物をひとつにまとめ、DNA amplification Clean-Up kit (Clontech)を用い精製した。精製したPCR産物は45μL RB buffer(Clontech)に溶かし回収した。尚、PCR反応のプライマーとして用いたPCR primer002の配列は以下の通りである；5’-attatgagcacgacagacgcctgatct-3’(配列番号125)。
(増幅遺伝子の断片化)
　GeneChip(登録商標) Mapping 250K Nsp / Sty Assay Kit (Affymetrix)試薬を用いて以下の手順により増幅遺伝子を断片化する。即ち、精製したPCR産物の260nmにおける吸光度を分光光度計 (Biophotometer、Eppendorf)を用いて測定し、90μgのPCR産物を総容量45μLになるようにRB buffer(Clontech)で希釈した。希釈したサンプルにキットに含まれるfragmentation buffer 5μL及び0.05U/μL Fragmentation Reagent 5μLを加え、37℃で35分反応させた後に95℃で15分放置してFragmentation reagentを失活させた。尚、Fragmentation Reagentは10×fragmentation bufferとAccuGENE waterによって、最終濃度が0.05U/μL Fragmentation Reagent、1×fragmentation bufferとなるよう希釈して用いた。断片化産物は4％アガロースゲル電気泳動を行い、遺伝子が断片化されていることを確認した。
(断片化遺伝子へのビオチンラベルの付加)
　断片化した遺伝子にGeneChip(登録商標) Mapping 250K Assay Kit (Affymetrix)を用いて以下の手順によりビオチンラベルを付加する。断片化サンプル50.5μLにキットに含まれるTerminal Deoxynucleotidyl Transferase buffer 14μL、30mM GeneChip DNA Labeling Reagent 2μL及び30U/μL Terminal Deoxynucleotidyl Transferase enzyme 3.5μLを加え、37℃で4時間反応させた後に、95℃で15分放置して酵素を失活させ、ハイブリダイゼーション用のサンプルとした。
(ハイブリダイゼーション)
　ビオチンラベルを付加したサンプル70μLにhybridization cocktail master mix (組成は以下の通り；0.056M 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid、5％ DMSO、2.5×Denhard'ts solution (Sigma)、5.77mM EDTA pH8.0、0.115mg/mL Herring Sperm DNA(Promega)、1×Oligo Control Reagent 0100 (Affymetrix)、11.5μg/mL Human Cot-1 DNA (Invitrogen)、0.0115％ Tween-20、2.69M Tetrametyl Ammonium Chloride(Sigma)) 190μLを加え、95℃で10分変性後、49℃で保持した。GeneChip(登録商標) Human Mapping 250K Nsp/ Sty Array (以下、マイクロアレイともいう) に200μLのサンプルを適用し、温度49℃、回転数60r/minに設定されたハイブリオーブン (GeneChip Hybridization Oven 640, Affymetrix) で16時間から18時間ハイブリダイズさせた。サンプルをマイクロアレイから取り出し、Array Holding Buffer(1mM MES、1M NaCl、0.01％ Tween-20)をマイクロアレイ内部に充填させた。
(染色及び検出)
　ハイブリダイゼーションが終了したマイクロアレイの染色をAffymetrix社のGeneChip(登録商標) Operating Software 1.4(以下GCOS)、protocol: MAP500Kv1_450により、同社のGeneChip Fluidics Station 450を用いて行った。一次及び三次染色はそれぞれStain Bufferで調製した10μg/mL Streptavidin-Phycoerythrin (Invitrogen)、二次染色は5μg/mL biotinylated Anti-Streptavidin Antibody (Vector Lab.)で行った。検出はGCOSを用いてGeneChip(登録商標) Scanner 3000 7Gで行った。尚、具体的な染色・洗浄工程のプロトコールと洗浄液等の組成は以下の通りである。
〔染色・洗浄工程プロトコール(FS-450 Fluidics Protocol - Mapping 500Kv1_450)〕
- Post Hyb Wash #1:  6 cycles of 5 mixes/cycle with Wash Buffer A at 25℃
- Post Hyb Wash #2:  24 cycles of 5 mixes/cycle with Wash Buffer B at 45℃
- Stain:  Stain the probe array for 10 minutes in SAPE solution at 25℃
- Post Stain:  Wash 6 cycles of 5 mixes/cycle with Wash Buffer A at 25℃
- 2nd Stain:  Stain the probe array for 10 minutes in Antibody Stain Solution at 25℃
- 3rd Stain:  Stain the probe array for 10 minutes in SAPE solution at 25℃
- Final Wash:  10 cycles of 6 mixes/cycle with Wash Buffer A at 30℃
The final holding temperature is 25℃
〔溶液の組成〕
・Wash A: Non-Stringent Wash Buffer　(6X SSPE, 0.01％ Tween 20)
For 1000 mL:
　300 mL of 20X SSPE, 1.0 mL of 10％ Tween-20, 699 mL of water
　Filter through a 0.2 μm filter. Store at room temperature.
・Wash B: Stringent Wash Buffer (0.6X SSPE, 0.01％ Tween 20)
For 1000 mL:
　30 mL of 20X SSPE, 1.0 mL of 10％ Tween-20, 969 mL of water
　Filter through a 0.2 μm filter. Store at room temperature.
　The pH should be 8.
・Stain Buffer: (6X SSPE, 0.01％ Tween 20, 1X Denhardt’s solution)
For 1188 μL:
　360 μL of 20X SSPE, 3.6 μL of 3％ Tween-20, 24 μL 50X Denhardt’s solution, 800.04 μL of water
(Genotyping解析)
　Affymetrix社のAffymerix Power Tools ver.1.10.0を用いてSNP Genotyping解析を行った。解析には同梱されているBRLMM genotype calling algorithmを用いた。
実施例３　常染色体上のｗＡＭＤ患者と非ｗＡＭＤ患者の一塩基多型の対比
　疾患関連一塩基多型の比較は、クラインらの方法(Science 308巻、385ページ、2005年)に準じて以下のように行った。
（試験群の設定）
（一塩基多型の分析）
　参加者の自由意志で得た同意の下に提供された血液を検体とし、実施例１に記載の方法で総DNAを抽出し、実施例２に記載の方法で一塩基多型の分析を行った。統計解析言語　R ver.2.7.0を用いて、以下に述べる解析を行った。即ち、コールレートが90％未満の一塩基多型、マイナーアレル頻度が5％未満の一塩基多型、及び、有意水準0.0001でハーディー・ワインバーグ平衡が成立していないと判定される一塩基多型をいずれも棄却し、さらに、目視によって正しくコールされていることを確認することにより、実験的な信頼性が高いと考えられる一塩基多型を選択した。なお、ハーディー・ワインバーグ平衡の成立の検定はカイ二乗検定を用いて行った。
（滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の一次解析）
　このようにして選択された一塩基多型について、滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の候補を抽出するため、（１）ｗＡＭＤ患者群対緑内障患者群、（２）ｗＡＭＤ患者群対白内障患者群の２通りの比較解析を行った。滲出型加齢黄斑変性に特異的に関連する一塩基多型の候補を抽出するために、（１）及び（２）で共通して、３種の遺伝子型(一方のアレルのホモ、ヘテロ、他方のアレルのホモ)ごとに比較した際のp値の最小値が0.01を下回る一塩基多型５０８個を抽出し、これらを滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の候補とした。尚、遺伝子型のp値の算出にはFisherの正確確率検定を用いた。
(滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の二次解析)
　このように選択された滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の候補について、さらに詳細に解析を行った。即ち、緑内障患者群に採用された患者及び白内障患者群に採用された患者をまとめて対照群とし、以下の通りｗＡＭＤ患者群と対照群の比較解析を行った。
(アレルのオッズ比)
　リスクアレルの有無と滲出型加齢黄斑変性の有無の間にどの程度強い関連が存在するかの指標として、アレルのオッズ比を以下の式によって求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　ここで、リスクアレルは、当該一塩基多型を構成する２つのアレルの検出数を上記数式に代入してアレルのオッズ比を求める際に、当該オッズ比が１より大になるように設定した。尚、一方のアレルと他方のアレルを入れ替えて計算するとオッズ比は互いに逆数の関係となる、即ち、一方のオッズ比が１より小であれば他方のオッズ比は１より大であることは前記定義式より明らかである。
（遺伝子型p値の算出）
　各SNPの遺伝子型p値の算出は、ｗＡＭＤ患者群対対照群についてFisherの正確確率法によって行った。その際、Genotypeモデル(リスクアレルホモ型対ヘテロ型対非リスクアレルホモ型)、Dominantモデル(リスクアレルホモ型＋ヘテロ型対非リスクアレルホモ型)、Recessiveモデル(リスクアレルホモ型対非リスクアレルホモ型＋ヘテロ型)の3種類の統計モデルについてp値の算出を行い、最も低いp値となるものを当該一塩基多型を代表するp値とした。
　以上のように解析を行い、ボンフェローニ補正、即ち、全体の有意水準を0.05とし、繰り返し回数５０８回で有意水準0.05を除して得た補正有意水準 (9.84×10-5)以下のp値(前記一塩基多型を代表するp値)で遺伝子型が滲出型加齢黄斑変性との関連を示す一塩基多型を抽出した。
(遺伝子型のオッズ比）
　さらに、これらの一塩基多型について、前述のように決定されたリスクアレルに基づき、以下の式によりDominant型オッズ比及びRecessive型オッズ比を求めた。ここで、ある一塩基多型について、いずれかの遺伝子型頻度が0であり、よっていずれかのオッズ比が無限大になってしまう場合には、当該遺伝子型頻度を0.5とおいて近似計算を行った。前述のように、本発明において、dominant型オッズ比は、リスクアレルを少なくとも１つ持つ場合(即ち、リスクアレルホモ型又はヘテロ型である場合)に滲出型加齢黄斑変性であることのオッズ比であり、recessive型オッズ比はリスクアレルをホモに持つ場合に滲出型加齢黄斑変性であることのオッズ比である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
(結果）
　このようにして得た滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型のうち、表１にはp＜1.0×10-6の一塩基多型について、表２～４には1.0×10-6≦p＜9.84×10-5の一塩基多型について、それぞれSNP ID、一塩基多型が存在する染色体番号及び物理的位置、当該一塩基多型が所属する遺伝子又は当該一塩基多型の近傍に存在する遺伝子名、相対位置(当該一塩基多型が前記遺伝子名で表示された遺伝子のイントロン上に存在する場合はその旨を示し、一塩基多型が前記遺伝子のイントロン上に存在しない場合は当該遺伝子と当該一塩基多型の間の距離を示す)、リスクアレルの塩基、非リスクアレルの塩基、遺伝子型のp値を算出するのに用いた統計モデル、遺伝子型のp値、アレルのオッズ比、ならびに、リスクアレルとその前後各16塩基ずつからなる33塩基長の配列に対応する配列番号(リスクアレルを含む配列１)及び、非リスクアレルとその前後各16塩基ずつからなる33塩基長の配列に対応する配列番号(非リスクアレルを含む配列２)を記載する。尚、SNP IDにはdbSNPデータベースのIDを記載した。これらの情報のうち染色体番号及び物理的位置、遺伝子名と相対位置、各アレルを含む配列情報はアフィメトリックス社が提供する技術資料ならびにNCBI SNP及びNCBI Nucleotideなどの公共データベースからdbSNP ID等をキーとして抽出した。また、ｐ値欄において、それぞれのｐ値は10を底とする指数形式で表示される。ここで、符号Eの前後に記載された数値はそれぞれｐ値を指数形式で表示した際の仮数部と指数部を示す(以下、実施例中の表について同じ）。
　同様に、9.84×10-5≦p＜1.0×10-4である一塩基多型を表５～１０に示す。また、表１１には、ボンフェローニ補正下で有意であり、かつ、緑内障と関連することが知られている一塩基多型と同一の遺伝子上に存在する一塩基多型を示す。
　さらに、これらの一塩基多型について、ｗＡＭＤ患者群及び対照群それぞれについて、表１２～１８にリスクアレル頻度、非リスクアレル頻度、リスクアレルホモ型頻度、ヘテロ型頻度、非リスクアレルホモ型頻度を記載する。また、表１９～２７に、それぞれの一塩基多型の遺伝子型オッズ比、関連する遺伝子型オッズ比、及び、リスクとなる遺伝子型を記載する。ここで、遺伝子型オッズ比は、当該一塩基多型について求めたDominant型オッズ比及びRecessive型オッズ比のうち、その値が大であるもの（すなわち、当該一塩基多型に関連する遺伝子型のオッズ比）の値を記載し、関連するオッズ比は、前記一塩基多型に関連する遺伝子型のオッズ比がDominant型オッズ比であるか、Recessive型オッズ比であるかを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
実施例４　一塩基多型の周辺領域の解析
　本発明の一塩基多型が属するＬＤブロック構造を推定した。実施例３にて決定した滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型を含む周辺の一塩基多型のうちマイナーアレル頻度が 0.05未満の一塩基多型について、Gabrielらの方法(Science 21 June 2002:Vol. 296. no. 5576, pp. 2225 - 2229)を参酌して、ＬＤ測定としてのD’値の信頼区間を用いてＬＤブロック構造を推定した。図１～６には、当該ＬＤブロックに含まれる一塩基多型を太字で記載し、さらに、本発明の一塩基多型と連鎖不平衡状態にあると考えられる領域を枠つきで示す。また、ＬＤブロック上又はその近傍に存在する遺伝子も併せて表示する。
実施例５　ＬＤブロック上の一塩基多型の再解析
　実施例４で推定したＬＤブロックに所属する任意の一塩基多型について、以下のように再解析を行うことができる。本実施例ではTaqMan(登録商標) SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems) を用いる再解析法を例示する。
　患者群及び対照群は、実施例３の患者群及び患者群と同じであっても全く異なるものであっても良い。これらの参加者より提供された血液を検体とし、例えば実施例１に記載の方法で総DNAを抽出し、Applied Biosystems社のプロトコールに従って上記ＬＤブロックに含まれる一塩基多型について、患者群と対照群の比較解析を行う。リアルタイムPCR反応の試薬、サーマルサイクラー及び検出器はそれぞれApplied Biosystems社によって指定されたものを用いることができる。サーマルサイクラー及び検出器にStepOnePlus リアルタイムPCRシステムを用いる場合、PCR産物中の一塩基多型のアレルの検出には、StepOne Software V2.0.1を使用することができる。
　得られた一塩基多型の検出結果を用い、実施例３と同様にアレルのオッズ比を計算してリスクアレルを決定し、遺伝子型ｐ値の算出を行う。
　このようにして当該ＬＤブロック内の任意の一塩基多型について疾患との関連を確認し、リスクアレル及び疾患のリスクとなる遺伝子型を決定することができる。
実施例６　ゲノムDNAを含むサンプルを用いる滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の分析
　本発明で開示された滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型において、表１～１１に記載したアレルの頻度は、ｗＡＭＤ患者群と対照群の間で統計学的に差がある。ゲノムDNAを含むサンプルに含まれるこれらの一塩基多型の少なくともいずれか一つについて、そのアレルを決定することにより、リスクアレルが存在するか否かを判定できる。サンプル中のゲノムDNAに本発明の一塩基多型の少なくとも１つについてリスクアレルが検出される場合、当該サンプル中に滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型のリスクアレルが含まれると判定される。アレルの代わりに、前述の滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型の決定を行うことも可能である。さらに、一つのサンプルを用いて、本発明の滲出型加齢黄斑変性に関連する一塩基多型の、疾患で高頻度に認められるアレル又は遺伝子型の二つ以上を検出することも可能である。
実施例７　非滲出型加齢黄斑変性患者の滲出型加齢黄斑変性のリスクの判定及び滲出型加齢黄斑変性が疑われる者の診断補助
　実施例３と同様にして、非ｗＡＭＤ患者によって提供されたゲノムDNAを含むサンプルを用い、サンプル提供者の滲出型加齢黄斑変性のリスクを精度よく判定することができる。本発明で開示された疾患に関連する一塩基多型について、サンプル中にリスクアレル又は滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型の少なくとも１つが検出された場合、滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると判定される。疾患に関連する一塩基多型を検出するプローブを複数組み合わせて本発明の一塩基多型の２つ以上を組み合わせて検出することにより、滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測精度を向上することができる。この場合、サンプル中に検出されたリスクアレルもしくは滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型の数の和、又は、これらのオッズ比を指標にリスクを予測する。これらの数値の大小により、滲出型加齢黄斑変性のリスクの大小が予測され、又は、ある閾値を超える場合は、滲出型加齢黄斑変性のリスクが高いと判定される。
　さらに、同様に、滲出型加齢黄斑変性が疑われる者の診断補助を行うことができる。滲出型加齢黄斑変性が疑われる者によって提供されたサンプルを用い、サンプル中にリスクアレル又は滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型の少なくとも１つが検出された場合、滲出型加齢黄斑変性と判断されるべき蓋然性が高い。また、疾患に関連する一塩基多型を検出するプローブを複数組み合わせて本発明の一塩基多型の２つ以上を組み合わせて検出することにより、サンプル中に検出されるリスクアレルもしくは滲出型加齢黄斑変性のリスクがあると考えられる遺伝子型の数の和、又は、これらのオッズ比を指標に滲出型加齢黄斑変性と判断されるべき蓋然性がどの程度増加するかを評価する。ある閾値を超える場合は、滲出型加齢黄斑変性であると診断することができる。
　本発明の方法により、サンプル中の本発明の一塩基多型のアレル又は遺伝子型を分析することにより、サンプル提供者が将来的に滲出型加齢黄斑変性のリスクの有無及び／又は高低を判定することができる。このリスクに基づきサンプル提供者は滲出型加齢黄斑変性の予防措置を講じ、及び／又は定期的に滲出型加齢黄斑変性の検査を受けることによって早期に滲出型加齢黄斑変性の診断を受け、治療を開始することができる。また、本発明の一塩基多型のリスクアレル又は滲出型加齢黄斑変性のリスクあると考えられる遺伝子型をゲノムに持つ、滲出型加齢黄斑変性が疑われるサンプル提供者は、滲出型加齢黄斑変性と診断されるべき蓋然性が高く、早期に治療を開始することができるため、有用である。

Claims (12)

  1. 　被験者由来のサンプル中の核酸分子について、配列番号1～124で示される塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列又はその相補的配列において、前記塩基配列の17番目に存在する一塩基多型のアレルをin vitroで検出する工程(検出工程)、及び
    前記検出されたアレルの少なくとも１つがリスクアレルであるか否かを判定する工程(判定工程)
    を含む、滲出型加齢黄斑変性のリスクを予測する方法。
  2. 　さらに、検出工程において検出されたアレルに基づき遺伝子型を決定する工程を含む、請求項１記載の滲出型加齢黄斑変性のリスクを予測する方法。
  3. 　配列番号1～124で示される塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列において、前記配列番号1～124で示される塩基配列の17番目に相当するアレルを有する配列を含有する核酸分子を用いて検出工程を行う、請求項１又は２記載の滲出型加齢黄斑変性のリスクを予測する方法。
  4. 　核酸分子をプローブとして用いる、請求項３記載の滲出型加齢黄斑変性のリスクを予測する方法。
  5. 　プローブが23～27塩基の長さである、請求項４記載の滲出型加齢黄斑変性のリスクを予測する方法。
  6. 　プローブが固層化されてなる、請求項４又は５記載の滲出型加齢黄斑変性のリスクを予測する方法。
  7. 　被験者由来のサンプル中の核酸分子について、配列番号1～124で示される塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列又はその相補的配列において、前記塩基配列の17番目に存在する一塩基多型のアレルをin vitroで検出するための核酸分子を含有してなる、滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測キット。
  8. 　核酸分子が、配列番号1～124で示される塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列において、前記配列番号1～124で示される塩基配列の17番目に相当するアレルを有する配列を含有する核酸分子である、請求項７記載の滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測キット。
  9. 　核酸分子が、配列番号1～124で示される塩基配列からなる群より選択される少なくとも１つの塩基配列もしくはその相補的配列、又はこれらの部分配列である、請求項８記載の滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測キット。
  10. 　核酸分子をプローブとして用いる、請求項７～９いずれか記載の滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測キット。
  11. 　プローブが23～27塩基の長さである、請求項１０記載の滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測キット。
  12. 　プローブが固層化されてなる、請求項１０又は１１記載の滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測キット。
PCT/JP2009/067638 2008-10-22 2009-10-09 滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測方法 WO2010047240A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008272161 2008-10-22
JP2008-272161 2008-10-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010047240A1 true WO2010047240A1 (ja) 2010-04-29

Family

ID=42119281

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2009/067638 WO2010047240A1 (ja) 2008-10-22 2009-10-09 滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2010119383A (ja)
WO (1) WO2010047240A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6082693B2 (ja) * 2011-04-25 2017-02-15 学校法人 埼玉医科大学 喫煙感受性加齢黄斑変性易罹患性の判定方法及び判定キット

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKIMOTO GOTO ET AL.: "Zen-genome-teki Shuho o Mochiita Karei Ohan Hensei Kanja no Takei Database ni yoru Sokan no Kento", JAPANESE REVIEW OF CLINICAL OPHTHALMOLOGY, vol. 101, no. 9, 2007, pages 62 *
ASAKO SEKI ET AL.: "Nipponjin ni Okeru Shinshutsugata AMD no Genomic Wide Sokan Kaiseki", DAI 113 KAI ANNUAL MEETING OF THE JAPANESE OPHTHALMOLOGICAL SOCIETY, March 2009 (2009-03-01), pages 218 *
CHEN, H. ET AL.: "Association of HTRAl polymorphism and bilaterality in advanced age-related macular degeneration.", VISION RESEARCH, vol. 48, June 2008 (2008-06-01), pages 690 - 694 *
KLEIN, RJ. ET AL.: "Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration.", SCIENCE, vol. 308, no. 5720, 2005, pages 385 - 389 *
KONDO, N. ET AL.: "LOC387715/HTRAl variants in polypoidal choroidal vasculopathy and age-related macular degeneration in a Japanese population.", AM. J. OPHTHALMOL., vol. 144, 2007, pages 608 - 612 *
LIN, JM. ET AL.: "Vascular endothelial growth factor gene polymorphisms in age-related macular degeneration.", AM. J. OPHTHALMOL., vol. 145, February 2008 (2008-02-01), pages 1045 - 1051 *
TAKESHI IWATA: "Tokushu Momyaku Rakumaku Hensei Shikkan no Update Karei Ohan Hensei no Identeki Kenkyu no Saizensen", THE JOURNAL OF THE EYE, vol. 23, no. 9, 2006, pages 1125 - 1131 *
TSAI, YY. ET AL.: "Interleukin gene polymorphisms in age-related macular degeneration.", INVEST. OPHTHALMOL. VIS. SCI., vol. 49, February 2008 (2008-02-01), pages 693 - 698 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2010119383A (ja) 2010-06-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6203217B2 (ja) 緑内障進行リスクの判定方法
US20110312534A1 (en) Method for prediction of human iris color
CA2993517A1 (en) Single nucleotide polymorphism in hla-b*15:02 and use thereof
JP5721150B2 (ja) 加齢黄斑変性症の発症リスクの予測方法
JP5706612B2 (ja) 加齢黄斑変性症易罹患性の判定マーカー並びに判定方法及び判定キット
KR20130041767A (ko) 정상 안압 녹내장 질환 감수성 유전자 및 그 이용
JP5757908B2 (ja) 多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効評価方法、疾患予測方法及び多型検出用試薬キット
KR20170007560A (ko) 코 표현형 판단용 조성물
WO2010044459A1 (ja) 緑内障のリスクの予測方法
JP5226256B2 (ja) 加齢黄斑変性症の発症リスクの予測方法
WO2010047240A1 (ja) 滲出型加齢黄斑変性のリスクの予測方法
US20160053333A1 (en) Novel Haplotype Tagging Single Nucleotide Polymorphisms and Use of Same to Predict Childhood Lymphoblastic Leukemia
JP5643933B2 (ja) Ｚｎｆ５１２ｂ遺伝子の一塩基多型に基づく筋萎縮性側索硬化症の検査方法
JP5809388B2 (ja) スティーブンス・ジョンソン症候群の発症リスクの判定方法
JP2011097933A (ja) ポリープ状脈絡膜血管症のリスクの予測方法
CN105765077B (zh) 测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症风险的检测方法以及测定用试剂盒
JP5071998B2 (ja) 本態性高血圧症の判定方法
US20220017963A1 (en) Methods, Compositions and Systems for Detecting PNPLA3 Allelic Variants
JP5130628B2 (ja) 脳梗塞の判定方法
JP6082693B2 (ja) 喫煙感受性加齢黄斑変性易罹患性の判定方法及び判定キット
KR20220141659A (ko) 피부색 판단용 유전자 다형성 마커 및 이의 용도
KR101167942B1 (ko) Ａｌｇ12 유전자로부터 유래된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이 및 진단키트, 및 이를 이용한 자폐 스펙트럼 장애 분석방법
JP2018134060A (ja) 側弯症の検査方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09821937

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 09821937

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1