JPWO2015037681A1 - 抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスクを判定するための検査方法及び判定用キット - Google Patents
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Classifications
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Abstract
Description
HLA領域は、染色体のテロメア側からセントロメア側に向かって、主に、(1)HLA-A、B、C抗原系などを支配するクラスI領域、(2)補体成分などを支配するクラスIII領域、及び(3)HLA-DP、DQ、DR抗原系などを支配するクラスII領域に分類される。
現在までに、症例・対照研究(case-control study)によって、特定のHLAアレルが、特定の疾患の患者集団で有意に増加或いは減少していることが明らかにされており、とりわけ免疫関連疾患に関する報告が多くなされている。
具体的には、ゲノム上の2,635,435箇所のSNPをマーカーとして患者検体115例をタイピングし、また対照群としては、地域ベースのゲノムコホートで収集された一般的な日本人のDNA検体(1,798検体)のタイピング情報を用い、各SNPについてジェノタイプ頻度を比較する症例・対照研究を実施した。
その結果、ヒト第6染色体短腕部6p21.3上のヒトHLA領域に、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症と極めて強い関連を示す191個のSNPを同定した。それらは、ClassI領域にある2領域(HLA-A領域上流側及びHLA-B領域周辺)とClassII領域にある2領域(HLA-DR領域周辺の2領域)の合計4領域に大きく分類された。そのうち最も強い関連はHLA-DR領域周辺で得られ(最も強い関連多型:rs6457580)、続いて、HLA-B領域周辺(最も強い関連多型:rs41560220)であった。各領域内において有意差を示すSNPの多くは強い連鎖不平衡の関係にあり、また4領域間では互いに連鎖不平衡は見られず、独立したものであることがわかった。
上記で得られた多型マーカーは全てHLA遺伝子領域に存在するため、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症がHLA遺伝子そのものと関係する可能性がある。そのため、極めて強い関連の見られたHLA-DR領域及びHLA-B領域周辺にターゲットを絞って、患者検体を用いてHLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DPB1及びHLA-DQB1遺伝子のジェノタイピングを実施した。その結果、HLA-B*39:01及びHLA-B*38:02、並びにHLA-DRB1*08:03、HLA-DRB1*14:03及びHLA-DRB1*08:02のHLAアレルが、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症と相関していた。また、HLA-B*39:01及びHLA-B*38:02はrs41560220と、HLA-DRB1*08:03及びHLA-DRB1*08:02はrs6457580と、それぞれ連鎖不平衡の関係にあった。
HLA-B及びHLA-DRB1遺伝子の両方において複数のアレルが無顆粒球症と相関があったので、これらの感受性HLAアレルには重要なアミノ酸残基が存在する可能性が考えられた。そこで、HLAアミノ酸配列のアライメントを使って、set up多重ロジスティック回帰分析を実施した。その結果、HLA-Bタンパク質の116位のフェニルアラニン残基(B-Phe116)、並びにHLA-DRB1タンパク質の74位のロイシン残基(DRB1-Leu74)が、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症と強く相関した。また、HLA-Bタンパク質における158位におけるアラニン残基の不存在は、B-Phe116の存在と連鎖不平衡(r2=0.92)であることが見出された。
本発明者らは、これらの知見に基づき更に検討を進め、これら多型について試験することにより、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスクを判定できることを確認し、本発明を完成するに至った。
[1](1)被験者由来のサンプルを使用し、HLA領域に存在する多型であって、
A)配列番号:1で表わされる塩基配列中第501番目の塩基における多型(G>T*)、
B)配列番号:2で表わされる塩基配列中第201番目の塩基における多型(C>T*)、
C)配列番号:3で表わされる塩基配列中第501番目の塩基における多型(C>T*)、
D)配列番号:4で表わされる塩基配列中第501番目の塩基における多型(T*>G)、
E)配列番号:5で表わされる塩基配列中第501番目の塩基における多型(C>T*)、
(但し、カッコ内はリファレンスアレル>バリアントアレルを示し、*はリスクアレルを示し、G、A、T及びCは、それぞれ、グアニン、アデニン、チミン及びシトシンを示す。)及び
F)上記A)〜E)のいずれかの多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型、
からなる群から選択される少なくとも1つの多型を試験する工程、及び
(2)(1)の試験結果に基づいて、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスクを判定する工程
を含む、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスクを判定するための検査方法;
[2]上記A)の多型もしくは該多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型、及び/又はB)の多型もしくは該多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型を試験する工程を含む、上記[1]記載の検査方法;
[3]上記A)の多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型が、HLA-DRB1*08:03又はHLA-DRB1*08:02の74位のアミノ酸をコードする位置における多型であり、上記B)の多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型が、HLA-B*39:01又はHLA-B*38:02の116位又は158位のアミノ酸をコードする位置における多型である、[2]記載の検査方法;
[4]被験者由来のサンプルがゲノムDNAを含む、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の検査方法;
[5]被験者が東アジア人である、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の検査方法;
[6]HLA領域に存在する多型であって、
A)配列番号:1で表わされる塩基配列中第501番目の塩基における多型(G>T*)、
B)配列番号:2で表わされる塩基配列中第201番目の塩基における多型(C>T*)、
C)配列番号:3で表わされる塩基配列中第501番目の塩基における多型(C>T*)、
D)配列番号:4で表わされる塩基配列中第501番目の塩基における多型(T*>G)、
E)配列番号:5で表わされる塩基配列中第501番目の塩基における多型(C>T*)、
(但し、カッコ内はリファレンスアレル>バリアントアレルを示し、*はリスクアレルを示し、G、A、T及びCは、それぞれ、グアニン、アデニン、チミン及びシトシンを示す。)及び
F)上記A)〜E)のいずれかの多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型、
からなる群から選択される少なくとも1つの多型において、リスクアレルを検出し得るポリヌクレオチドを含んでなる、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスク判定用キット;
[7]上記A)の多型もしくは該多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型、及び/又はB)の多型もしくは該多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型において、リスクアレルを検出し得るポリヌクレオチドを含んでなる、上記[6]記載のキット;
[8]上記A)の多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型が、HLA-DRB1*08:03又はHLA-DRB1*08:02の74位のアミノ酸をコードする位置における多型であり、上記B)の多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型が、HLA-B*39:01又はHLA-B*38:02の116位又は158位のアミノ酸をコードする位置における多型である、[7]記載のキット;
[9]非リスクアレルを検出し得るポリヌクレオチドをさらに含む、上記[6]〜[8]記載のキット;
[10]上記アレルを検出し得るポリヌクレオチドが、該アレルを含む10〜200の連続した塩基配列若しくはその相補鎖配列からなる断片と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るプローブ、及び/又は該断片を増幅し得るプライマーである、上記[6]〜[9]のいずれかに記載のキット;
[11]東アジア人に対して、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスクを判定するために用いられる、上記[6]〜[10]のいずれかに記載のキット;
[12](1)被験者由来のサンプルを使用し、以下の(a)及び/又は(b):
(a)HLA-DRB1タンパク質の74位のアミノ酸がLeuであるか否か
(b)HLA-Bタンパク質の116位のアミノ酸がPheであるか否か、又は158位のアミノ酸がAlaであるか否か
を試験する工程、及び
(2)(1)の試験結果に基づいて、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスクを判定する工程
を含む、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスクを判定するための検査方法;
[13]以下の(a)及び/又は(b):
(a)HLA-DRB1タンパク質の74位のアミノ酸がLeuであること
(b)HLA-Bタンパク質の116位のアミノ酸がPheであること、又は158位のアミノ酸がAlaであること
を同定し得る物質を含んでなる、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスク判定用キット;
に関する。
(1)被験者由来のサンプルを使用し、HLA領域に存在する多型であって、
A)配列番号:1で表わされる塩基配列中第501番目の塩基における多型(G>T*)、
B)配列番号:2で表わされる塩基配列中第201番目の塩基における多型(C>T*)、
C)配列番号:3で表わされる塩基配列中第501番目の塩基における多型(C>T*)、
D)配列番号:4で表わされる塩基配列中第501番目の塩基における多型(T*>G)、
E)配列番号:5で表わされる塩基配列中第501番目の塩基における多型(C>T*)、
(但し、カッコ内はリファレンスアレル>バリアントアレルを示し、*はリスクアレルを示し、G、A、T及びCは、それぞれ、グアニン、アデニン、チミン及びシトシンを示す。)及び
F)上記A)〜E)のいずれかの多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型、
からなる群から選択される少なくとも1つの多型を試験する工程、及び
(2)(1)の試験結果に基づいて、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスクを判定する工程
を含む、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスクを判定するための検査方法(以下、本発明の検査方法とも記す。)を提供する。
該サンプルは、例えば、被験者の生体組織、具体的には、例えば、糞便・尿・喀痰・唾液などの排泄物、血液などの体液、口腔粘膜・皮膚などの細胞、体毛などを直接使用してもよく、或いは当業者に周知の方法により被験者の生体組織からゲノムDNAを単離し、これを用いてもよい。例えば、ヒトから採取した血液、唾液、皮膚などの検体からフェノール抽出法などによりゲノムDNAを単離することができる。その際、市販のゲノムDNA抽出キットや装置を用いてもよい。
ヒトSNPアレイを用いたGWASによる症例・対照研究の結果、Tアレルのアレル頻度は、対照群よりも症例群において有意に高いことが示された。ここで、「有意」とは、カイ二乗検定又はフィッシャーの正確確率検定におけるp値が5.0×10-8未満であることを意味する。従って、Tアレルは、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症のリスクアレルである。
ヒトSNPアレイを用いたGWASによる症例・対照研究の結果、Tアレルのアレル頻度は、対照群よりも症例群において有意に高いことが示された。従って、Tアレルは、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症のリスクアレルである。
ヒトSNPアレイを用いたGWASによる症例・対照研究の結果、Tアレルのアレル頻度は、対照群よりも症例群において有意に高いことが示された。従って、Tアレルは、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症のリスクアレルである。
ヒトSNPアレイを用いたGWASによる症例・対照研究の結果、Tアレルのアレル頻度は、対照群よりも症例群において有意に高いことが示された。従って、Tアレルは、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症のリスクアレルである。
ヒトSNPアレイを用いたGWASによる症例・対照研究の結果、Tアレルのアレル頻度は、対照群よりも症例群において有意に高いことが示された。従って、Tアレルは、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症のリスクアレルである。
D'=(PABPab-PAbPaB)/Min[(PAB+PaB)(PaB+Pab),(PAB+PAb)(PAb+Pab)]
[式中、Min[(PAB+PaB)(PaB+Pab),(PAB+PAb)(PAb+Pab)]は、(PAB+PaB)(PaB+Pab)と(PAB+PAb)(PAb+Pab)とのうち、値の小さい方をとることを意味する。]
r2=(PABPab-PAbPaB)2/(PAB+PaB)(PaB+Pab)(PAB+PAb)(PAb+Pab)
TaqMan PCR法は、蛍光標識したアレル特異的オリゴヌクレオチド(TaqManプローブ)とTaq DNAポリメラーゼによるPCRとを利用した方法である。TaqManプローブとしては、上記したいずれかの多型部位の塩基を含む約15〜約30塩基の連続した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが用いられる。該プローブは、その5’末端がFAMやVICなどの蛍光色素で、3’末端がTAMRAなどのクエンチャー(消光物質)でそれぞれ標識されており、そのままの状態ではクエンチャーが蛍光エネルギーを吸収するため蛍光は検出されない。プローブは双方のアレルについて調製し、一括検出のために互いに蛍光波長の異なる蛍光色素(例えば、一方のアレルをFAM、他方をVIC)で標識することが好ましい。また、TaqManプローブからのPCR伸長反応が起こらないように3’末端はリン酸化されている。TaqManプローブとハイブリダイズする領域を含むゲノムDNAの部分配列を増幅するように設計されたプライマー及びTaq DNAポリメラーゼとともにPCRを行うと、TaqManプローブが鋳型DNAとハイブリダイズし、同時にPCRプライマーからの伸長反応が起こるが、伸長反応が進むとTaq DNAポリメラーゼの5’ヌクレア−ゼ活性によりハイブリダイズしたTaqManプローブが切断され、蛍光色素が遊離してクエンチャーの影響を受けなくなり、蛍光が検出される。鋳型の増幅により蛍光強度は指数関数的に増大する。
例えば、上記1)の多型の検出においては、多型部位の塩基を含むアレル特異的オリゴヌクレオチド(約15〜約30塩基長;GアレルはFAMで、TアレルはVICでそれぞれ5’末端標識し、3’末端はいずれもTAMRAで標識)をTaqManプローブとして用いた場合、被験者のジェノタイプがGG、あるいはTTであれば、それぞれFAMあるいはVICの強い蛍光強度を認め、他方の蛍光はほとんど認められない。一方、被験者のジェノタイプがGTであれば、FAM及びVIC両方の蛍光が検出される。
インベーダー法では、TaqMan PCR法と異なり、アレル特異的オリゴヌクレオチド(アレルプローブ)自体は標識されず、多型部位の塩基の5’側に鋳型DNAと相補性のない配列(フラップ)を有し、3’側には鋳型に特異的な相補配列を有する。インベーダー法では、さらに鋳型の多型部位の3’側に特異的な相補配列を有するオリゴヌクレオチド(インベーダープローブ;該プローブの5’末端である多型部位に相当する塩基は任意である)と、5’側がヘアピン構造をとり得る配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に5’末端の塩基と対をなす塩基から3’側に連続する配列がアレルプローブのフラップと相補的な配列であることを特徴とするFRET(fluorescence resonance energy transfer)プローブとが用いられる。FRETプローブの5’末端は蛍光標識(例えば、FAMやVICなど)され、その近傍にはクエンチャー(例えば、TAMRAなど)が結合しており、そのままの状態(ヘアピン構造)では蛍光は検出されない。
鋳型であるゲノムDNAにアレルプローブ及びインベーダープローブを反応させると、三者が相補結合した際に多型部位にインベーダープローブの3’末端が侵入する。この多型部位の構造を認識する酵素(cleavase)を用いてアレルプローブの一本鎖部分(即ち、多型部位の塩基から5’側のフラップ部分)を切り出すと、フラップはFRETプローブと相補的に結合し、フラップの多型部位がFRETプローブのヘアピン構造に侵入する。この構造をcleavaseが認識して切断することにより、FRETプローブの末端標識された蛍光色素が遊離してクエンチャーの影響を受けなくなって蛍光が検出される。多型部位の塩基が鋳型とマッチしないアレルプローブはcleavaseによって切断されないが、切断されないアレルプローブもFRETプローブとハイブリダイズすることができるので、同様に蛍光が検出される。但し、反応効率が異なるため、多型部位の塩基がマッチするアレルプローブでは、マッチしないアレルプローブに比べて蛍光強度が顕著に強い。
通常、3種のプローブ及びcleavaseと反応させる前に、鋳型DNAはアレルプローブ及びインベーダープローブがハイブリダイズする部分を含む領域を増幅し得るプライマーを用いてPCRにより増幅しておくことが好ましい。
それゆえ、別の実施態様において、本発明の抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスクを判定する工程には、被験者における本発明の多型ジェノタイプがリスクアレルのホモ接合体、リスクアレルと非リスクアレルとのヘテロ接合体、非リスクアレルのホモ接合体の順に、該被験者は抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスクが高いと判定する工程が含まれる。
本発明の検査方法の好ましい一実施態様においては、上記A)の多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型、及び/又は上記B)の多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型が試験される。上記A)の多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型としては、例えば、上述のA)の多型と完全連鎖した多型等が挙げられるが、HLA-DRB1*08:03やHLA-DRB1*08:02の74位のアミノ酸(即ち、Leu)をコードする位置における多型を試験することが特に好ましい。一方、上記B)の多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型としては、例えば、上述のB)の多型と完全連鎖した多型等が挙げられるが、HLA-B*39:01やHLA-B*38:02の116位のアミノ酸(即ち、Phe)又は158位のアミノ酸(即ち、Alaではない)をコードする位置における多型を試験することが特に好ましい。
被験者がHLA-B*39:01、HLA-B*38:02、HLA-DRB1*08:03、HLA-DRB1*14:03、又はHLA-DRB1*08:02を有するか否かを試験する方法は、HLA-B*39:01、HLA-B*38:02、HLA-DRB1*08:03、HLA-DRB1*14:03、又はHLA-DRB1*08:02アレルとそれ以外のHLAアレルとを区別できる限り特に限定されず、例えば、上記した多型検出方法を使用することができる。
HLAアレルの解析においては、該当する遺伝子配列全体を解析しても、遺伝子配列の一部のみを解析してもよい。また、HLAアレルの解析に用いる試料は、上記した「被験者由来のサンプル」と同様のものを好適に使用することができる。
従って、本発明はまた、
(1)被験者由来のサンプルを使用し、以下の(a)及び/又は(b):
(a)HLA-DRB1タンパク質の74位のアミノ酸がLeuであるか否か
(b)HLA-Bタンパク質の116位のアミノ酸がPheであるか否か、又は158位のアミノ酸がAlaであるか否か
を試験する工程、及び
(2)(1)の試験結果に基づいて、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスクを判定する工程
を含む、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスクを判定するための検査方法;
(以下、本発明の検査方法(2)という場合もある)を提供する。
検出対象となる(a)HLA-DRB1タンパク質の74位のアミノ酸がLeuであるアレルとしては、上述のHLA-DRB1*08:03、HLA-DRB1*14:03、及びHLA-DRB1*08:02の他、例えば、HLA-DRB1*08:09等が挙げられる。また、(b) HLA-Bタンパク質の116位のアミノ酸がPheである(158位のアミノ酸がAlaでない)アレルとしては、HLA-B*39:01及びHLA-B*38:02の他、例えば、HLA-B*37:01、HLA-B*39:04、HLA-B*67:01等が挙げられる。これらのリスクアレルの頻度はモンゴロイドのみならず、コーカソイドやニグロイドにおいても無視できない程度であるので、本発明の検査方法(2)は、人種を問わず広く使用可能である。
試験の結果、(a)HLA-DRB1タンパク質の74位のアミノ酸がLeuであった場合、及び/又は(b)HLA-Bタンパク質の116位のアミノ酸がPheであるか、もしくは158位のアミノ酸がAlaでなかった場合、被験者は抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスクが高いと判定することができる。
A)配列番号:1で表わされる塩基配列中第501番目の塩基における多型(G>T*)、
B)配列番号:2で表わされる塩基配列中第201番目の塩基における多型(C>T*)、
C)配列番号:3で表わされる塩基配列中第501番目の塩基における多型(C>T*)、
D)配列番号:4で表わされる塩基配列中第501番目の塩基における多型(T*>G)、
E)配列番号:5で表わされる塩基配列中第501番目の塩基における多型(C>T*)、
(但し、カッコ内はリファレンスアレル>バリアントアレルを示し、*はリスクアレルを示し、G、A、T及びCは、それぞれ、グアニン、アデニン、チミン及びシトシンを示す。)及び
F)上記A)〜E)のいずれかの多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型、
からなる群から選択される少なくとも1つの多型(すなわち、本発明の多型)において、リスクアレルを検出し得るポリヌクレオチドを含んでなる、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスク判定用キット(以下、本発明の判定用キットとも記す。)を提供する。
本発明の判定用キットの好ましい一実施態様においては、上記A)の多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型、及び/又は上記B)の多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型において、リスクアレルを検出し得るポリヌクレオチドが含まれる。上記A)の多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型としては、例えば、上述のA)の多型と完全連鎖した多型等が挙げられるが、HLA-DRB1*08:03やHLA-DRB1*08:02の74位のアミノ酸(即ち、Leu)をコードする位置における多型を検出し得るポリヌクレオチドを含むことが特に好ましい。一方、上記B)の多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型としては、例えば、上述のB)の多型と完全連鎖した多型等が挙げられるが、HLA-B*39:01やHLA-B*38:02の116位のアミノ酸(即ち、Phe)又は158位のアミノ酸(即ち、Alaではない)をコードする位置における多型を検出し得るポリヌクレオチドを含むことが特に好ましい。
本発明の多型を検出し得るポリヌクレオチドがプライマーである場合、当該プライマーは、本発明の多型部位の塩基を含むゲノムDNA(もしくはmRNA)の領域を特異的に増幅し得るよう設計されたものであればいかなるものであってもよい。本発明の多型を検出し得るポリヌクレオチドがプローブである場合、当該プローブは、本発明の多型部位の塩基を含むゲノムDNA(もしくはmRNA)の領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るよう設計されたものであればいかなるものであってもよい。
本発明のポリヌクレオチドをプライマーとして用いる場合には、10〜200 bp、好ましくは15〜100 bp、より好ましくは15〜35 bpの塩基長を有するものが例示できる。プライマーが増幅することができるDNAの長さは、例えば15〜1000 bp、好ましくは20〜500 bp、より好ましくは20〜200 bpである。
本発明のポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合には、10〜200 bp、好ましくは15〜100 bp、より好ましくは15〜35 bpの塩基長を有するものが例示できる。
また、該プライマーは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素(例、125I、131I、3H、14Cなど)、酵素(例、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素など)、蛍光物質(例、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート、Cy3、Cy5など)、発光物質(例、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど)などで標識されていてもよい。
本発明の多型を検出し得るポリヌクレオチドがプローブとして用いられる場合、該プローブは多型の検出に適した付加的配列(ゲノムDNA(若しくはmRNA)と相補的でない配列)を含んでいてもよい。例えば、Invaderプローブ法に用いられるプローブは、多型部位の塩基の5’末端にフラップと呼ばれる付加的配列を有し得る。
また、該プローブは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素(例、125I、131I、3H、14Cなど)、酵素(例、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素など)、蛍光物質(例、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート、Cy3、Cy5など)、発光物質(例、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど)などで標識されていてもよい。或いは、蛍光物質(例、FAM、VICなど)の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー(消光物質)がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。
上記プローブ及び/又はプライマーは、各々別個に(或いは可能であれば混合した状態で)水若しくは適当な緩衝液(例、TEバッファーなど)中に適当な濃度(例、2〜20×の濃度で1〜50μMなど)となるように溶解し、約-20℃で保存することができる。
上記ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号:1〜5で表される各塩基配列の情報に基づいて、DNA/RNA自動合成機を用いて常法に従って合成することができる。
(a)HLA-DRB1タンパク質の74位のアミノ酸がLeuであること
(b)HLA-Bタンパク質の116位のアミノ酸がPheであること、又は158位のアミノ酸がAlaであること
を同定し得る物質を含んでなる、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスク判定用キット(本発明の判定用キット(2))を提供する。
HLA-DRB1タンパク質の74位のアミノ酸がLeuであること、HLA-Bタンパク質の116位のアミノ酸がPheであること、又は158位のアミノ酸がAlaであることを同定し得る物質としては、例えば、HLA-DRB1遺伝子又はmRNA中の、HLA-DRB1タンパク質の74位のアミノ酸をコードするコドンを含む部分ヌクレオチド配列を検出し得るポリヌクレオチド、HLA-B遺伝子又はmRNA中の、HLA-Bタンパク質の116位又は158位のアミノ酸をコードするコドンを含む部分ヌクレオチド配列を検出し得るポリヌクレオチド等を挙げることができる。これらのポリヌクレオチドは、上記「本発明の判定用キット」において詳述したのと同様の方法により、デザインし、調製することができる。
HLA-DRB1タンパク質の74位のアミノ酸がLeuであること、HLA-Bタンパク質の116位のアミノ酸がPheであること、又は158位のアミノ酸がAlaであることを同定し得る他の物質として、例えば、HLA-DRB1タンパク質の74位のLeuを含む部分ペプチドに対して特異的に結合する抗体もしくはアプタマー、HLA-Bタンパク質の116位のPheを含む部分ペプチドもしくは158位のAlaを含む部分ペプチドに対して特異的に結合する抗体もしくはアプタマー等を挙げることができる。そのような抗体もしくはアプタマーは、周知の方法によりそれぞれ取得することができる。
抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症と相関するSNPの探索
(1)被験者
抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症(500/μL以下)と診断された患者のDNAサンプルを隈病院(神戸、日本)から63例、伊藤病院(東京、日本)から52例の計115例収集した。115例のうち113例はバセドウ病と、残り2例は無痛性甲状腺炎及び甲状腺中毒症と診断され、抗甲状腺薬による治療を受けていた。治療に使用された抗甲状腺薬は、メチマゾール(95例)及びプロピルチオウラシル(以下、PTUとも記す。20例)であった。年齢、性別、顆粒球数などの患者臨床情報は、各機関における甲状腺専門医により収集された。
対照群としては、滋賀県長浜市のゲノムコホート研究(以下、長浜コホートとも記す)で収集された1,937例のDNAサンプルを使用した。本試験に採用した患者の特徴を以下の表1に示す。
GWASは、2つのセットで実施した。第一セットでは、症例群として隈病院から得た63例のDNAサンプルを使用し、Illumina infinium HumanOmni 2.5-8 v1.0 DNA分析キット(Illumina社)を用いてジェノタイピングした。対照群としては、長浜コホートにより得た1,562例のDNAサンプルをIllumina infinium HumanOmni 2.5-4 v1.0 DNA分析キット(Illumina社)によりジェノタイピングした。
第二セットでは、症例群として伊藤病院から得た52例のDNAサンプルを使用し、対照群として長浜コホートより得た375例のDNAサンプルを使用し、いずれもIllumina infinium HumanOmni 2.5-8 v1.0 DNA分析キット(Illumina社)を用いてジェノタイピングした。
SNPアレイを用いたジェノタイピングの後、コール成功率95%未満のDNAサンプル(12例)、他の検体と高い血縁関係(PLINKソフトウェアによるPI_HAT≧0.35)にあるDNAサンプル(122例)、主成分分析によりアジア人クラスターから外れているDNAサンプル(5例)を除外した。結果として、クオリティコントロール後の第一セットのDNAサンプルは、症例群:63例と対照群:1,445例からなり、第二セットのDNAサンプルは、症例群:52例と対照群:353例からなった。
SNPマーカーとしては、2つのアレイに共通する2,635,435個のSNPに着目し、これらのうち、コール成功率95%以上、症例群又は対照群におけるマイナーアレル頻度0.01以上、Hardy-Weinberg平衡検定p値>1.0×10-7であるSNPマーカーを選択した。結果として、計1,223,017個のSNP(第一セット)及び1,246,969個のSNP(第二セット)を解析に使用した。
バセドウ病患者のDNAサンプルは、3730xl DNA分析装置(Life Technologies社)を用いたキャピラリーシーケンシングにより無顆粒球症と関連するSNPをジェノタイピングするために使用した。
2セットのGWAS及び統合評価の統計解析は、PLINKソフトウェア又はRソフトウェアを用いた、カイ二乗検定又はフィッシャーの正確確率検定(Fisher’s exact test)により実施した。試験間の不均一性テストは、ブレスロー・デイ検定(Breslow-Day test)を用いて行った。フィッシャーの正確確率検定は、2×2分割表の期待値に5以下のものがある場合に使用した。HLA領域におけるSNPの独立性を調べるために多重ロジスティック回帰分析を実施した。多重検定におけるボンフェローニ補正(Bonferroni’s correction)後のGWAS有意水準は5.0×10-8に設定した。関連するSNP間の相互作用は、従来公知の方法(Andersson et al., European journal of epidemiology 2005; 20: 575-9)により評価した。SNP間のLD値の解析及び連鎖不平衡地図の作成には、Haploview version 4.1ソフトウェアを用いた。
第一セット(症例群:63例及び対照群:1,445例)及び第二セット(症例群:52例及び対照群:353例)について、症例・対照研究を行ったところ、ヒト第6染色体短腕部6p21.3上のヒトHLA領域に、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症と極めて強い関連を示すSNPが191個同定された(図1)。集団の構造化は観察されなかった。同定した191個のSNPを2つのセットの統合解析により得られたp値、オッズ比(OR)、95%信頼区間(CI)とともに以下の表2〜6に示す。
抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症と関連するHLAアレルの探索
(1)HLAジェノタイピング
上記で得られたSNPマーカーは全てHLA領域に存在するため、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症がHLA遺伝子そのものと関係する可能性がある。そのため、極めて強い関連の見られたHLA-DR領域及びHLA-B領域周辺にターゲットを絞って、患者検体を用いてHLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DPB1及びHLA-DQB1遺伝子のジェノタイピングを実施した。
具体的には、WAKFlowシステム(湧永製薬株式会社、大阪、日本)を用いた高解像度(4-digit)ジェノタイピングにより、実施例1記載の抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症患者115例についてHLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DPB1及びHLA-DQB1遺伝子のジェノタイプを決定した。一般的な日本人集団1,000人のHLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DPB1及びHLA-DQB1アレル頻度情報は、NPO法人HLA研究所(京都、日本)から得た。HLAジェノタイピングでは、症例群又は対照群のいずれかにおいて1%超のアレル頻度を有するHLAアレルを関連解析に使用した。
統計解析では、カイ二乗検定又はフィッシャーの正確確率検定により、症例群と対照群におけるHLAアレルの頻度を比較した。多重ロジスティック回帰分析を実施して、HLAアレルの独立性を検証した。多重検定におけるボンフェローニ補正後の有意水準は、6.9×10-4に設定した。
多重検定におけるボンフェローニ補正後、HLA-B*39:01、HLA-B*38:02、HLA-C*07:02、HLA-DRB1*08:03、HLA-DRB1*14:03、HLA-DRB1*08:02、HLA-DRB1*09:01及びHLA-DQB1*06:01が、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症と有意な関連を示した(表10)。
感受性HLAアレルと関連するアミノ酸の探索
(1)HLAアミノ酸のロジスティック回帰分析
ジェノタイピングした又はHLA研究所から得た、どちらか一方のHLAアレルと対応するアミノ酸配列をIMGTデータベース(http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)から検索し、各HLA遺伝子ごとにアライメントした。合計462のアミノ酸のバリアントが278箇所で同定された。HLA-DRB1及びHLA-Bタンパク質の3次元構造解析をUCSF chimeraソフトウェアにより行った。
(2)set up多重ロジスティック回帰分析
HLA-B及びHLA-DRB1遺伝子の両方において、複数のアレルが無顆粒球症と関連があったので、感受性HLAアレルにおける重要なアミノ酸残基が存在すると思われた。そこで、HLAアミノ酸配列のアライメントを使って、set up多重ロジスティック回帰分析を実施した。
赤池情報量基準(AIC)をアミノ酸分析のために算出した。アミノ酸変異は、変異を含むロジスティック回帰モデルが最少のAICを示す場合、他のアミノ酸変異を含むそれらと比較して7より大きいAIC(ΔAIC>7)で、他の変異に対して有意とみなした。並べ替え検定を1,000回実施し、アミノ酸変異によるAICの向上が偶然にもたらされたのかどうかと、有意なアミノ酸変異によるAICの向上は、有意なSNPマーカーによる向上と同等であるかどうかとを評価した。
HLA-DRB1タンパク質の74位のロイシン残基(DRB1-Leu74)は、他のアミノ酸変異に比べて21.0のΔAICと最も強い関連を示した(p=7.9x10-26、並べ替え p=0.001、図7A)。DRB1-Leu74のコンディショニングに続き、116位のフェニルアラニン(B-Phe116)は、14.1のΔAICと2番目に強い関連を示した(p<8.2x10-12、並べ替え p=0.001、図7B)。HLA-Bタンパク質における158位のアラニン残基の不存在は、B-Phe116の存在と連鎖不平衡(r2=0.92)であることが見出された。DRB1-Leu74及びB-Phe116におけるコンディショニング後、他のアミノ酸は有意な関連を示さなかった(p>0.00024、図7C)。重要なことには、HLA-B*39:01及びHLA-B*38:02はB-Phe116を有し、HLA-DRB1*08:03、HLA-DRB1*14:03及びHLA-DRB1*08:02はDRB1-Leu74を有した(表11)。HLA-Bにおけるrs41560220と、HLA-DRB1におけるrs6457580及びrs3135387は、それぞれB-Phe116と、DRB1-Leu74と比較して同等のAIC向上を示した。
本発明のSNPマーカーについてのハプロタイプ別オッズ比とシミュレーション
115人の抗甲状腺薬による無顆粒球症患者と1937人の健常人のサンプルを用いて、本発明のSNPマーカーである、rs41560220とD'=1の完全連鎖の関係にあるrs2596487と、rs17576984のハプロタイプ別オッズ比(OR)をSNPごとの関連解析により解析した。両方のSNPにつきリスクアレルを有する場合には多重ロジスティック回帰分析のORを適用した。1937人の健常人サンプル結果によるSNPのアレル頻度を基に、ハーディワインバーグ平衡が成立するとして、一般健常人集団における各ハプロタイプ頻度の割合を計算した。また、健常人におけるハプロタイプ頻度と上記のORから、当該ハプロタイプが発症に関与する割合を解析した。結果を以下の表12に示す。表12では、リスクアレルのホモ接合体をスコア2、リスクアレルと非リスクアレルとのヘテロ接合体をスコア1、非リスクアレルのホモ接合体をスコア0として表す。また、どちらのSNPについてもリスクアレルを有さない場合を対照として設定した。
本出願は、日本で出願された特願2013-188806(出願日:平成25年9月11日)を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
Claims (13)
- (1)被験者由来のサンプルを使用し、HLA領域に存在する多型であって、
A)配列番号:1で表わされる塩基配列中第501番目の塩基における多型(G>T*)、
B)配列番号:2で表わされる塩基配列中第201番目の塩基における多型(C>T*)、
C)配列番号:3で表わされる塩基配列中第501番目の塩基における多型(C>T*)、
D)配列番号:4で表わされる塩基配列中第501番目の塩基における多型(T*>G)、
E)配列番号:5で表わされる塩基配列中第501番目の塩基における多型(C>T*)、
(但し、カッコ内はリファレンスアレル>バリアントアレルを示し、*はリスクアレルを示し、G、A、T及びCは、それぞれ、グアニン、アデニン、チミン及びシトシンを示す。)及び
F)上記A)〜E)のいずれかの多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型、
からなる群から選択される少なくとも1つの多型を試験する工程、及び
(2)(1)の試験結果に基づいて、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスクを判定する工程
を含む、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスクを判定するための検査方法。 - 上記A)の多型もしくは該多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型、及び/又はB)の多型もしくは該多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型を試験する工程を含む、請求項1記載の検査方法。
- 上記A)の多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型が、HLA-DRB1*08:03又はHLA-DRB1*08:02の74位のアミノ酸をコードする位置における多型であり、上記B)の多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型が、HLA-B*39:01又はHLA-B*38:02の116位又は158位のアミノ酸をコードする位置における多型である、請求項2記載の検査方法。
- 被験者由来のサンプルがゲノムDNAを含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の検査方法。
- 被験者が東アジア人である、請求項1〜4のいずれか一項記載の検査方法。
- HLA領域に存在する多型であって、
A)配列番号:1で表わされる塩基配列中第501番目の塩基における多型(G>T*)、
B)配列番号:2で表わされる塩基配列中第201番目の塩基における多型(C>T*)、
C)配列番号:3で表わされる塩基配列中第501番目の塩基における多型(C>T*)、
D)配列番号:4で表わされる塩基配列中第501番目の塩基における多型(T*>G)、
E)配列番号:5で表わされる塩基配列中第501番目の塩基における多型(C>T*)、
(但し、カッコ内はリファレンスアレル>バリアントアレルを示し、*はリスクアレルを示し、G、A、T及びCは、それぞれ、グアニン、アデニン、チミン及びシトシンを示す。)及び
F)上記A)〜E)のいずれかの多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型、
からなる群から選択される少なくとも1つの多型において、リスクアレルを検出し得るポリヌクレオチドを含んでなる、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスク判定用キット。 - 上記A)の多型もしくは該多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型、及び/又はB)の多型もしくは該多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型において、リスクアレルを検出し得るポリヌクレオチドを含んでなる、請求項6記載のキット。
- 上記A)の多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型が、HLA-DRB1*08:03又はHLA-DRB1*08:02の74位のアミノ酸をコードする位置における多型であり、上記B)の多型と連鎖不平衡係数D'が0.8以上の連鎖不平衡状態にある多型が、HLA-B*39:01又はHLA-B*38:02の116位又は158位のアミノ酸をコードする位置における多型である、請求項7記載のキット。
- 非リスクアレルを検出し得るポリヌクレオチドをさらに含む、請求項6〜8のいずれか一項記載のキット。
- 上記アレルを検出し得るポリヌクレオチドが、該アレルを含む10〜200の連続した塩基配列若しくはその相補鎖配列からなる断片と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るプローブ、及び/又は該断片を増幅し得るプライマーである、請求項6〜9のいずれか一項記載のキット。
- 東アジア人に対して、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスクを判定するために用いられる、請求項6〜10のいずれか一項記載のキット。
- (1)被験者由来のサンプルを使用し、以下の(a)及び/又は(b):
(a)HLA-DRB1タンパク質の74位のアミノ酸がLeuであるか否か
(b)HLA-Bタンパク質の116位のアミノ酸がPheであるか否か、又は158位のアミノ酸がAlaであるか否か
を試験する工程、及び
(2)(1)の試験結果に基づいて、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスクを判定する工程
を含む、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスクを判定するための検査方法。 - 以下の(a)及び/又は(b):
(a)HLA-DRB1タンパク質の74位のアミノ酸がLeuであること
(b)HLA-Bタンパク質の116位のアミノ酸がPheであること、又は158位のアミノ酸がAlaであること
を同定し得る物質を含んでなる、抗甲状腺薬誘発性無顆粒球症リスク判定用キット。
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