JPWO2018074458A1 - 方法及び診断薬 - Google Patents
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Abstract
Description
このように、HBV感染後の経過は多岐にわたり、主として慢性肝炎、肝がんに関与するウイルス側の遺伝要因が調べられてきた。しかしながら、近年では、宿主側の遺伝要因の探索も進み、日本人を含むアジア人サンプルを用いたゲノムワイド関連解析(Genome Wide Association Study: GWAS)により、B型慢性肝炎(CHB)に関連する新たな遺伝要因が報告されている。HBV持続感染やウイルス排除にはHLA−DPA1及びHLA−DPB1の関連が示唆されており(非特許文献1、非特許文献2)、HLA−DRと連鎖不平衡のあるHLA−DQの関与も示唆された(非特許文献3)。しかしながら、GWASを用いた解析では、慢性化に関与するそれ以外の強い遺伝要因は見つかっていない。また、がん化についても近年のGWASにより、中国から幾つかの宿主遺伝要因が報告されている(非特許文献4及び5)。
(1)被検者のHLA型を、B型肝炎ウイルス関連疾患に罹患した場合の病態進展のしやすさの第1の基準と比較する工程を含む、被検者がB型肝炎ウイルス関連疾患に罹患した場合の病態進展のしやすさを試験する方法。
(2)前記被検者に感染したB型肝炎ウイルス集団の変異の頻度を、B型肝炎ウイルス関連疾患に罹患した場合の病態進展のしやすさの第2の基準と比較する工程を更に含む、前記(1)の方法。
(3)前記病態進展が、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合の肝がんへの進展であり、前記第1の基準が、前記HLA型がHLA−DPB1*02:01を含む場合には、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合に肝がんに進展しにくいという基準である、前記(1)に記載の方法。
(4)前記病態進展が、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合の肝がんへの進展であり、前記第1の基準が、前記HLA型がHLA−DPB1*02:01を含む場合には、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合に肝がんに進展しにくいという基準である、前記(2)に記載の方法。
(5)前記変異が前記B型肝炎ウイルス集団由来のHBs抗原タンパク質における変異であり、前記第2の基準が、前記HBs抗原タンパク質の第166番目の最頻出アミノ酸がロイシンでない場合には、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合に肝がんに進展しにくいという基準であるか、前記HBs抗原タンパク質の第236番目の最頻出アミノ酸がグルタミンでない場合には、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合に肝がんに進展しにくいという基準であるか、前記HBs抗原タンパク質の第251番目の最頻出アミノ酸がアルギニンでない場合には、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合に肝がんに進展しにくいという基準であるか、前記HBs抗原タンパク質の第275番目の最頻出アミノ酸がロイシンでない場合には、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合に肝がんに進展しにくいという基準である、前記(4)に記載の方法。
(6)前記病態進展が、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合の肝がんへの進展であり、前記第1の基準が、前記HLA型がHLA−A*33:03を含む場合には、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合に肝がんに進展しやすいという基準である、前記(1)又は前記(2)に記載の方法。
(7)前記病態進展が、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合のB型慢性肝炎への進展であり、前記第1の基準が、前記HLA型がHLA−DPB1*09:01、HLA−DRB1*15:02及びHLA−DQB1*06:01を含む場合には、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合にB型慢性肝炎に進展しやすいという基準である、前記(1)又は前記(2)に記載の方法。
(8)前記病態進展が、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合のB型慢性肝炎への進展であり、前記第1の基準が、前記HLA型がHLA−DPB1*04:01、HLA−DRB1*13:02及びHLA−DQB1*06:04を含む場合には、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合にB型慢性肝炎に進展しにくいという基準である、前記(1)又は前記(2)に記載の方法。
(9)HLA−A*33:03又はHLA−DPB1*02:01のHLA型を検出するプライマーセットを含む、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合の肝がんへの進展のしやすさを試験するための診断薬。
(10)B型肝炎ウイルス集団の変異の頻度を決定するプライマーセット、又はB型肝炎ウイルス集団の変異の頻度を決定する特異的結合物質、を更に含む、前記(9)に記載の診断薬。
(11)HLA−DPB1*09:01、HLA−DRB1*15:02及びHLA−DQB1*06:01のHLA型を検出するプライマーセット、又はHLA−DPB1*04:01、HLA−DRB1*13:02及びHLA−DQB1*06:04のHLA型を検出するプライマーセットを含む、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合のB型慢性肝炎への進展のしやすさを試験するための診断薬。
(12)B型肝炎ウイルス集団の変異の頻度を決定するプライマーセット、又はB型肝炎ウイルス集団の変異の頻度を決定する特異的結合物質、を更に含む、前記(11)に記載の診断薬。
(1)B型肝炎ウイルス関連疾患が病態進展することによるがん化に関連のあるアリル 第1の実施形態では、B型肝炎ウイルス関連疾患が病態進展することによるがん化に関連のあるアリルに関して説明する。
以下の説明において、「B型肝炎の慢性化」とは、HBVが持続感染している状態をいい、発症要因としては、以下の:HBV持続感染者からの母児感染(垂直感染);乳幼児期の医療行為等の理由で、HBV持続感染者の血液や体液が体内に侵入した場合;体の免疫力が低下するような免疫抑制剤や抗がん剤の使用中にHBVに感染した結果、HBVを体内から排除できずに持続感染を起こす場合;及び健常者が近年ジェノタイプA型という欧米型やアジア・アフリカ型等の外来種HBVに感染した場合等があげられる。このように、HBVに感染すると、8〜9割が無症候キャリアとなるが、1〜2割は慢性肝炎に移行する。さらにその中の一部が肝硬変や肝がんへ移行する。「肝硬変」とは、B型肝炎ウイルス感染により損傷した肝臓が修復されるときにできる線維が肝臓に拡がった状態をいい、肝臓が硬くなったために腹水や食道静脈瘤が生じたり、肝臓機能が低下するために肝性脳症や黄疸が生じたりする原因となる。「肝がん」とは、B型肝炎ウイルスの感染が原因で生じる肝細胞がんをいう。
なお、上記のアリルHLA−A*33:03及びHLA−DPB1*02:01を「B型肝炎ウイルス関連疾患が病態進展することによるがん化に関連のあるアリル」、「本実施形態に係るアリル」、また、アリルにかえてHLA型、多型、SNPという場合がある。
本実施形態の方法で用いる試料は、B型肝炎ウイルス関連疾患が病態進展することによるがん化に感受性であるか又は抵抗性であるかを検査しようとする検体から採取した生物学的試料をもとに、当業者に周知の方法で調製したゲノムDNA又はmRNAを用いることができる。本実施形態の方法で用いる検体から採取する生物学的試料は、例えば、血球検体の細胞又は組織、毛髪、便、尿、唾液、細胞、鼻腔粘膜からこすりとった細胞、口腔粘膜からこすりとった細胞等を用いることができるが、これらに限定されない。
上記のように調製したゲノムDNA又はmRNAにおけるHLA−A*33:03及び/又はHLA−DPB1*02:01アリルの検出方法は特に限定されない。例えば、直接配列決定法、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、制限酵素断片長多型(RFLP)、ハイブリダイゼーション法、プライマー伸長反応、質量分光法、ルミネックス法、直接シークエンス法、HLA Imputation法、マイクロSSP法等を用いる方法があげられるが、これらに限定されない。
例えば、ゲノムDNA又はmRNA由来のcDNAを用いた直接配列決定法によりHLA−A*33:03及び/又はHLA−DPB1*02:01アリルを検出することができる。直接配列決定法は、上記で調製したゲノムDNA又はmRNAからcDNAを調製し;検出対象であるHLA−A*33:03及び/又はHLA−DPB1*02:01アリルを含む領域を、ベクターにクローニングするか又はPCRで増幅し;当該領域の塩基配列を決定することにより行う。例えば、適切なプライマーを用いてPCR反応により増幅し、適切なベクターに連結することによりクローニングすることができる。さらに、別のベクターにサブクローニングすることもできるが、これらに限定されない。ベクターとしては、例えば、pBlue−Script(商標)SK(+)(Stratagene)、pGEM−T(Promega)、pAmp(TM: Gibco−BRL)、p−Direct(Clontech)、pCR2.1−TOPO(Invitrogene)等の市販のプラスミドベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクターやコスミドベクターを用いることができる。塩基配列の決定は特に限定されず、例えば、放射性マーカーヌクレオチドを使用する手動式配列決定法や、ダイターミネーターを使用する自動配列決定法、次世代シークエンス法等があげられるが、これらに限定されない。このようにして得られた塩基配列に基づき、検体がHLA−A*33:03及び/又はHLA−DPB1*02:01アリルに相当する配列を有するか否かを決定する。
本実施形態に係るアリルは、PCR法を利用して検出することもできる。PCRは、本実施形態に係るアリルを有する配列又は他のアリルを有する配列にのみハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行う。このプライマーセットを使用して検体のゲノムDNA又はmRNA由来のcDNAを増幅する。本実施形態に係るアリル用プライマーのみがPCR産物を生成した場合には、検体は本実施形態に係るアリルをホモで有し、本実施形態に係るアリル用プライマーと他のアリル用プライマーからのPCR産物が生成された場合には、検体は本実施形態に係るアリルをヘテロで有することになる。他のアリル用プライマーのみがPCR産物を生成した場合には、検体には本実施形態に係るアリルがないことが示される。
本実施形態に係るアリルは、制限酵素断片長多型(Restriction Fragment Length Polymorphism;RFLP)を利用して検出することもできる。まず、検出対象の本実施形態に係るアリルを含む領域をPCRで増幅する。続いてこのPCR産物を、本実施形態に係るアリルに適する制限酵素で切断する。制限酵素により消化されたPCR産物は、ゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイド染色で可視化する。当該断片長を、分子量マーカー並びに他のアリル及び本実施形態に係るアリルの対照により生じた断片長と比較して、検体における本実施形態に係るアリルの存在を検出することができる。
本実施形態に係るアリルは、ハイブリダイゼーションを利用して検出することもできる。ハイブリダイゼーション法は、検体由来のゲノムDNA又はmRNAが、それに対し相補的なDNA分子(例えばオリゴヌクレオチドプローブ)とハイブリダイズする性質に基づき、本実施形態に係るアリルの有無を決定する方法である。コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション等のハイブリダイゼーション及び検出のための種々の技術を利用してこのハイブリダイゼーション法を行うことができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001);特にSection 6−7)、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987−1997);特にSection6.3−6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University(1995);ハイブリダイゼーション条件については特にSection2.10)等を参照することができる。さらに、ハイブリダイゼーションはDNAチップを利用して検出することもできる。当該方法としては、本実施形態に係るアリルに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを設計し、それを固相支持体に貼りつけたものを用いる。そして、検体由来のDNAサンプルを当該DNAチップと接触させて、ハイブリダイゼーションを検出する。
例えば、TaqMan PCR法は、アレル特異的なTaqmanプローブとTaqポリメラーゼを用い、SNPの検出とSNPを含む領域の増幅とを同時並行で行う方法である。Taqmanプローブは、5’末端が蛍光物質、3’末端がクエンチャーで標識されている約20塩基前後のオリゴヌクレオチドであり、目的のSNP部位にハイブリダイズするよう設計されている。Taqポリメラーゼは5’−3’ヌクレアーゼ活性がある。これらのTaqmanプローブ及びTaqポリメラーゼ存在下で目的のアリルを含む領域を増幅するよう設計されたPCRプライマーを用いて該アリル領域を増幅すると、増幅と並行して、Taqmanプローブが鋳型DNAの目的アリル部位にハイブリダイズする。フォワードプライマー側からの伸長反応が、鋳型にハイブリダイズしたTaqmanプローブに到達すると、Taqポリメラーゼの5’ヌクレアーゼ活性により、Taqmanプローブの5’末端に結合していた蛍光物質が切断される。その結果、遊離した蛍光物質はクエンチャーの影響を受けなくなり、蛍光を発生する。蛍光強度の測定により、SNP検出が可能となる。
アリルを検出するポリヌクレオチドについて以下に説明する。
アリルの検出にプライマーを用いる場合は、増幅する領域及びタイピング方法に即したプライマーとなるように設計する。例えば、上記領域を完全に増幅できることが好ましく、上記領域の両端付近の配列に基づいて配列を設計できる。プライマーの設計手法は当技術分野で周知であり、本実施形態において使用可能なプライマーは、特異的なアニーリングが可能な条件を満たす、例えば特異的なアニーリングが可能な長さ及び塩基組成(融解温度)を有するように設計される。増幅する領域の長さは、タイピングに支障がない限り制限はないし、検出方法により適宜増減してよい。また、増幅される領域の一部にはアリル部位が含まれるが、増幅される領域内における当該部位の位置に制限はなく、検出方法(タイピング方法)にしたがって適切な位置に配置してよい。そのためプライマーの設計にあたり、プライマーとアリル部位との位置関係は、検出方法にあわせて自由に設計でき、検出しようとするアリルを含む塩基配列の一部領域(例えば、連続した50塩基長以上500塩基長以下)にハイブリダイズする限り、タイピング方法の特性を考慮しながら、プライマーを設計できる。プライマーとしての機能を発揮する長さとしては、10〜100塩基以上が好ましく、通常15〜50塩基、好ましくは15〜30塩基である。また設計の際には、任意の核酸鎖の50%がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度であるプライマーの融解温度(Tm)を確認することが好ましい。鋳型となるDNAとプライマーとが二本鎖を形成してアニーリングするためには、アニーリングの温度を最適化する必要があるが、その一方で、この温度をより低すぎると非特異的な反応がおこるため、好ましくないからである。Tmの確認には、公知のプライマー設計用ソフトウェアを利用することができる。
ても短くてもよい。
本実施形態の方法として好ましいアリルの検出方法としては、PCRを用いたPCR−SSOP(Sequence Specific Oligonucleotide probe)法、ルミネックス法、直接シークエンス法、HLA Imputation法、マイクロSSP法等が挙げられる。PCR−SSOP法では具体的には、まず、ビオチン標識したプライマーを用いてPCRで検体の上記アリルを含む領域を増幅する。続いて、増幅DNAを1本鎖DNAとし、特異的な配列であるプローブと特異的に結合させる。例えば、プローブを蛍光色素で色分けされたマイクロビーズに固定し、増幅DNAが結合したマイクロビーズからビオチンを介した蛍光標識ストレプトアジピンの結合による蛍光シグナルが得られるので、この蛍光シグナルの種類と増幅DNAの結合による蛍光を識別して同時に検出することで増幅DNAが結合したビーズの種類から遺伝子タイプが決定できる。当該方法には、市販のキットを用いてもよい。当該キットとしては、例えば、多数の多型を一度に判別できるxMAP(登録商標)テクノロジー(Luminex社)等があげられるが、これらに限定されない。アリルの検出方法は、ルミネックス法、本方法を用いた本実施形態の方法の概要を以下に説明する。
変性温度:90〜100℃
アニーリング温度:40〜70℃
伸長温度:60〜75℃、
上記のサイクル数:30〜50回程度
増幅の特異性を高めるために、2組以上のプライマーを用いて2回以上増幅反応を行ってもよい。その際、各増幅反応で用いるプライマーを、同じ位置に設計してもよく、最初の増幅におけるプライマーの位置よりも内側に設計してもよい。このようにして、検体のゲノムDNAを鋳型として、本実施形態に係るアリルの塩基配列を含む領域の核酸断片を特異的に増幅することができる。
本実施形態の方法において、タンパク質レベルで本実施形態に係るアリルを検出することもできる。具体的には、本実施形態に係るアリルを有するHLAタンパク質を特異的に認識することができる抗体を用いることにより、本実施形態に係るアリルを検出することができる。当該抗体は、HLA−A*33:03及び/又はHLA−DPB1*02:01アリルのアミノ酸配列のいずれかの領域からなるペプチドを抗原として免疫学的方法により作製できる。抗体の作製方法、及び抗体を用いた本実施形態に係るアリルの検出方法は、特に限定されない。
実施例において後述するように、本実施形態において、HLA−DPB1*02:01アリルは、当該検体がB型肝炎ウイルス関連疾患が病態進展することによるがん化に対して発症抵抗性を有することを示す。また、HLA−A*33:03アリルは当該検体がB型肝炎ウイルス関連疾患が病態進展することによるがん化に対して発症感受性を有することを示す。この意味で、本実施形態の方法は、本実施形態に係るアリルを用いてB型慢性肝炎ウイルス関連疾患が病態進展することによるがん化の検査を行う方法ともいえる。
つまり、HLA−DPB1*02:01アリルは、B型肝炎ウイルス関連疾患によって病態進展し慢性肝炎に進展した後にがん化する際に、強い抵抗性を示している。
ここで、オッズ比が1より小さい場合には、B型肝炎ウイルス関連疾患が病態進展することによるがん化に抵抗性があるといえる。この具体例においては、抵抗性アリルとしてHLA−DPB1*02:01を有するヒトは、B型肝炎ウイルス関連疾患が病態進展することによるがん化に抵抗性があるといえる。
本実施形態に係るアリルを用いてB型肝炎のウイルス関連疾患が病態進展することによるがん化の素因を検出することができる。したがって、上記アリルを検出する診断薬は、B型肝炎ウイルス関連疾患が病態進展することによるがん化の検査用診断薬として有用である。当該診断薬はB型肝炎ウイルス関連疾患が病態進展することによるがん化に対する発症抵抗性若しくは感受性又は病態進展を判定するためにも用いることができる。具体的には、上記の本実施形態に係るアリルや各種プライマーやプローブ、本実施形態に係るアリルに特異的に結合することができる抗体、SNPタイピングを行うときに同時に用いる診断薬類(例えば、デオキシヌクレオチド3リン酸(dNTPs)やDNAポリメラーゼ、緩衝液等)や陽性コントロール等に加えて、他の溶媒や溶質と組み合わせて診断薬とすることができる。たとえば、蒸留水、pH緩衝診断薬、塩、タンパク質、界面活性剤等を組み合わせることができる。
本実施形態に係るアリルを用いてB型肝炎ウイルス関連疾患が病態進展することによるがん化の素因を検出する場合、特別の条件、操作等は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作に準じて行なわれ、必要であれば若干の修飾を加えて好適な測定系を構築できる。
(1)HBV遺伝子配列
ここまでは、抵抗性アリルを保有する患者が、B型肝炎ウイルス関連疾患が病態進展することによりがん化しにくいことを説明した。しかし、上述した抵抗性アリルを保有していても、B型肝炎ウイルス関連疾患が病態進展することにより、がん化する患者も存在する。そこで、実施例において後述するように、本発明者らは、B型肝炎患者を対象として、HBVの遺伝子配列を解析することにより、B型肝炎ウイルス関連疾患に罹患した患者が病態進展することによるがん化についての予測を補強する因子の探索を行った。
本実施形態に係るB型肝炎ウイルス集団の変異の頻度を決定することによって、B型肝炎ウイルス関連疾患に罹患した場合に肝がんに進展しにくいという基準とすることができる。したがって、B型肝炎ウイルス集団の変異の頻度を検出する診断薬は、B型肝炎ウイルス関連疾患が病態進展することによるがん化の検査用診断薬として有用である。当該診断薬は、B型肝炎ウイルス関連疾患が病態進展することによるがん化に対する発症抵抗性若しくは感受性又は病態進展を判定するためにも用いることができる。具体的には、上記本実施形態に係るB型肝炎ウイルス集団の変異の頻度を測定するための各種プライマーやプローブ、B型肝炎ウイルス由来の変異タンパク質に特異的に結合することができる抗体や陽性コントロール等に加えて、他の溶媒や溶質と組み合わせて診断薬とすることができる。たとえば、蒸留水、pH緩衝診断薬、塩、タンパク質、界面活性剤等を組み合わせることができる。
ここまでは、B型肝炎ウイルス関連疾患が病態進展することによるがん化について説明した。次に、B型肝炎ウイルス関連疾患による持続感染からB型慢性肝炎への病態進展に関係のあるアリルについて説明する。
本発明者らは、日本人のHBV患者群1033検体と健常対照群942検体についてHLAのタイピングを行い、B型肝炎に罹患した場合の、B型慢性肝炎への病態進展に感受性のあるハプロタイプが、HLA−DPB1*09:01、HLA−DRB1*15:02及びHLA−DQB1*06:01を含むハプロタイプであり、B型肝炎の慢性化への病態進展に抵抗性のあるハプロタイプがHLA−DPB1*04:01、HLA−DRB1*13:02及びHLA−DQB1*06:04を含むハプロタイプであることを同定した。
本実施形態に係る、上記B型肝炎の慢性化への病態進展に関係のある素因の検出方法について説明する。本実施形態に係るB型肝炎の慢性化への病態進展に関係のある素因の検出の工程は、以下の工程:a)被検者のHLA型を、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合の病態進展のしやすさの第1の基準と比較する工程;を含む。
本実施形態の方法は、実施例において後述するように、B型肝炎の慢性化への病態進展に感受性のあるハプロタイプは、HLA−DPB1*09:01、HLA−DRB1*15:02及びHLA−DQB1*06:01のアリルの組み合わせを含むハプロタイプである。また、B型肝炎の慢性化への病態進展に抵抗性のあるハプロタイプは、HLA−DPB1*04:01、HLA−DRB1*13:02及びHLA−DQB1*06:04のアリルの組み合わせを含むハプロタイプである。この意味で、本実施形態の方法は、本実施形態に係るハプロタイプを用いてB型肝炎ウイルスに持続感染した患者が、慢性肝炎へ病態進展するか否かの検査を行う方法ともいえる。
一実施形態において、本発明は、(1)被検者からゲノムDNA試料を採取する工程と、(2)ゲノムDNA試料を用いて被検者のHLA型を決定する工程と、(3)被検者のHLA型がHLA−A*33:03を含む場合には、被検者はB型慢性肝炎に罹患した場合に肝がんに進展しやすいと診断する工程と、を備える、被検者がB型慢性肝炎に罹患した場合の肝がんへの進展のしやすさの診断方法を提供する。
(アリルの検出1)
本実施例は、HLA−A*33:03を検出することを目的とした。
日本人由来の各試料について、QIAamp(登録商標) DNA Mini kit(QIAGEN)を用いて以下のように調製した。まず、マイクロチューブにQIAGEN Protease20μlをピペッティングした後、各試料200μlを添加した。さらにBuffer ALを加えて15秒間混和した後、56℃で10分間インキュベートして試料を溶解した。その後、マイクロチューブを数秒間スピンダウンして蓋の内側についた溶液を収集した。さらに試料にエタノール(100%)200μlを添加し、再び15秒間ボルテックスした後、1.5ml マイクロチューブを数秒間スピンダウンして蓋の内側についた溶液を収集した。当該溶液をQIAamp(登録商標) Mini Spin Columnにカラムにアプライし、6,000×gで1分間遠心分離した。QIAamp(登録商標) Mini Spin Columnを開き、500μlのBuffer AW1を添加して6,000×gで1分間遠心分離した。QIAamp(登録商標) Mini Spin Columnを開き、500μlのBuffer AW2を添加して、20,000×gで3分間遠心分離した。QIAamp(登録商標) Mini Spin Column を開き、200μlのBuffer AE又は精製水を添加した。室温で1分間インキュベートした後、6,000×gで1分間遠心分離して、各検体由来のDNAを回収した。
変性温度:93℃(30秒)
アニーリング温度:60℃(30秒)
伸長温度:72℃(30秒)
上記のサイクル数:40回
上記サイクル前に93℃(3分)、上記サイクル後に72℃(5分)の反応を行い、終了後は4℃で保存した。
後、上清を除去して、洗浄液75μlを各ウエルに加えた。Luminex XYPのブロック温度を37℃に設定して、ビーズミックスのLot番号に対応したテンプレートファイルを用いて測定した。測定結果のCSVファイルをWAKFlow(登録商標)Typing Softwareで開き、各蛍光ビーズの陽性・陰性を判定表に記載しているカットオフ値をもとに自動判定した。当該自動判定では、蛍光強度がカットオフ値以上を示すビーズを陽性、カットオフ値以下を示すビーズを陰性とし、各ビーズの陽性・陰性のパターンからHLAの遺伝子型を決定した。
(アリルの検出2)
本実施例は、HLA−DPB1*02:01アリルを検出することを目的とした。
B型慢性肝炎が病態進展することによるHCCあり患者、B型慢性肝炎に罹患してHCCを発症していない患者(以下、HCCなし群とも記載する)、及び健常者対照群由来の各試料についてHLAの遺伝子型を決定した。なお、この遺伝子型の決定の手順は、上述した本実施形態に係るアリルの検出における手順と同様であるため、説明を省略する。 その結果を表2〜表4に示す。
ここで、オッズ比が1より小さい場合には、B型肝炎ウイルス関連疾患が病態進展することによるがん化に抵抗性があるといえる。この具体例においては、抵抗性アリルとしてHLA−DPB1*02:01アリルを有するヒトは、B型肝炎ウイルス関連疾患が病態進展することによるがん化に抵抗性があるといえる。
(B型肝炎ウイルス集団の変異の頻度の検出)
本実施例は、HLA−DPB1*02:01アリルを有するB型肝炎関連疾患患者由来のHBV集団の変異の頻度を検出することを目的とした。日本人由来の各試料について、HBV由来の遺伝子配列上の各位置について1000以上の遺伝子配列データを収集した。また、HBV由来の遺伝子配列上の各位置について出現頻度が5%以上のアミノ酸を、解析の対象とした。
本発明者らは、HLA−DPB1*02:01アリルを保有しているB型肝炎ウイルス関連疾患患者由来のHBV遺伝子配列を解析した。当該解析には、HLA−DPB1*02:01を保有しているB型肝炎ウイルス関連疾患患者のうち、肝がんを発症した11例(以下単に、ケースとも記載する)由来のHBVと、肝がんを発症していない11例(以下単に、コントロールとも記載する)由来のHBVとを用いた。なお、解析対象患者の年齢と性別とは、それぞれ一致させている。
発明者らは、上述したPCR法による遺伝子増幅によって、22例由来のHBV試料から、66のPCR産物を取得した。
当該ディープシークエンス解析により、本発明者らは、HBs遺伝子上の各塩基について、1000以上のデータを取得した。
本発明者らは、取得したHBs遺伝子上の各塩基から、HBVの変異のバリエーションをリスト化することにより、HBV遺伝子におけるアミノ酸の変異のパターンを取得した。
HBV遺伝子の第166番目と、第310番目の位置のアミノ酸については、例外症例が無く、オッズ比を算出することができなかった。HBV遺伝子の第236番目と、第251番目と第275番目のオッズ比は、それぞれ0.01であり、がん化に対して抵抗性を示していた。
コンセンサスとは、HBV/Cの標準的なアミノ酸の配列である。
HLA−DPB1*02:01を保有しているB型肝炎ウイルス関連疾患患者のうち、肝がんを発症した11例由来のHBVのHBsタンパク質の変異のうち、第166番目の位置がロイシンに変異しているものが10.7%であり、第166番目がロイシン、第236番目がグルタミン、第251番目がアルギニン及び第275番目がロイシンに変異しているものが83.6%であった。
(ハプロタイプの検出)
B型肝炎の慢性化に感受性のある感受性アリルを有するヒトについて、HBV患者群と健常対照群由来の各試料についての95%信頼区間におけるオッズ比を求めた。表4に結果を示す。
つまり、B型肝炎の慢性化への病態進展に関係のあるハプロタイプのうち、HLA−DPB1*09:01である場合には、HLA−DRB1*15:02及びHLA−DQB1*06:01とのアリルの組み合わせが、より感受性が高いアリルの組み合わせであることが明らかとなった。
B型肝炎の慢性化への病態進展に関係のあるハプロタイプのうち、B型肝炎の慢性化への病態進展に抵抗性のある抵抗性アリルを有するヒトについて、HBV患者群と健常対照群由来の各試料についての95%信頼区間におけるオッズ比を求めた。表9に結果を示す。
つまり、B型肝炎の慢性化への病態進展に感受性のあるアリルがHLA−DPB1*04:01である場合には、HLA−DRB1*13:02及びHLA−DQB1*06:04とのアリルの組み合わせが、より抵抗性が高いアリルの組み合わせであることが明らかとなった。
Claims (12)
- 被検者のHLA型を、B型肝炎ウイルス関連疾患に罹患した場合の病態進展のしやすさの第1の基準と比較する工程を含む、被検者がB型肝炎ウイルス関連疾患に罹患した場合の病態進展のしやすさを試験する方法。
- 前記被検者に感染したB型肝炎ウイルス集団の変異の頻度を、B型肝炎ウイルス関連疾患に罹患した場合の病態進展のしやすさの第2の基準と比較する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記病態進展が、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合の肝がんへの進展であり、前記第1の基準が、前記HLA型がHLA−DPB1*02:01を含む場合には、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合に肝がんに進展しにくいという基準である、請求項1に記載の方法。
- 前記病態進展が、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合の肝がんへの進展であり、前記第1の基準が、前記HLA型がHLA−DPB1*02:01を含む場合には、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合に肝がんに進展しにくいという基準である、請求項2に記載の方法。
- 前記変異が前記B型肝炎ウイルス集団由来のHBs抗原タンパク質における変異であり、
前記第2の基準が、
前記HBs抗原タンパク質の第166番目の最頻出アミノ酸がロイシンでない場合には、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合に肝がんに進展しにくいという基準であるか、 前記HBs抗原タンパク質の第236番目の最頻出アミノ酸がグルタミンでない場合には、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合に肝がんに進展しにくいという基準であるか、 前記HBs抗原タンパク質の第251番目の最頻出アミノ酸がアルギニンでない場合には、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合に肝がんに進展しにくいという基準であるか、 前記HBs抗原タンパク質の第275番目の最頻出アミノ酸がロイシンでない場合には、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合に肝がんに進展しにくいという基準である、
請求項4に記載の方法。 - 前記病態進展が、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合の肝がんへの進展であり、前記第1の基準が、前記HLA型がHLA−A*33:03を含む場合には、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合に肝がんに進展しやすいという基準である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記病態進展が、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合のB型慢性肝炎への進展であり、前記第1の基準が、前記HLA型がHLA−DPB1*09:01、HLA−DRB1*15:02及びHLA−DQB1*06:01を含む場合には、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合にB型慢性肝炎に進展しやすいという基準である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記病態進展が、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合のB型慢性肝炎への進展であり、前記第1の基準が、前記HLA型がHLA−DPB1*04:01、HLA−DRB1*13:02及びHLA−DQB1*06:04を含む場合には、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合にB型慢性肝炎に進展しにくいという基準である、請求項1又は2に記載の方法。
- HLA−A*33:03又はHLA−DPB1*02:01のHLA型を検出するプライマーセットを含む、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合の肝がんへの進展のしやすさを試験するための診断薬。
- B型肝炎ウイルス集団の変異の頻度を決定するプライマーセット、又は
B型肝炎ウイルス集団の変異の頻度を決定する特異的結合物質、
を更に含む、請求項9に記載の診断薬。 - HLA−DPB1*09:01、HLA−DRB1*15:02及びHLA−DQB1*06:01のHLA型を検出するプライマーセット、又はHLA−DPB1*04:01、HLA−DRB1*13:02及びHLA−DQB1*06:04のHLA型を検出するプライマーセットを含む、B型肝炎ウイルスに持続感染した場合のB型慢性肝炎への進展のしやすさを試験するための診断薬。
- B型肝炎ウイルス集団の変異の頻度を決定するプライマーセット、又は
B型肝炎ウイルス集団の変異の頻度を決定する特異的結合物質、
を更に含む、請求項11に記載の診断薬。
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